Protokol za proteomiku: beskontaktna sonikacija poboljšava pripremu peptidnih uzoraka za MS
Proteomika temeljena na pristupu odozdo prema gore postala je temelj suvremenog otkrivanja biomarkera, strukturne biologije i kliničke dijagnostike. Razgradnjom proteina u peptide prije analize spektrometrijom masa (MS) istraživači mogu postići veću pokrivenost sekvence i pouzdaniju kvantifikaciju. Međutim, priprema vrlo složenih bioloških uzoraka za MS i dalje je tehnički zahtjevna. Nedavni metodološki napredak ističe kako kontrolirana ultrazvučna obrada – konkretno beskontaktnim sonikatorom za više epruveta VialTweeter i sonikatorom za mikropločice UIP400MTP – može znatno pojednostavniti ovaj radni postupak, poboljšati ponovljivost i spriječiti uobičajena uska grla u radu instrumenata.
Pronađite detaljan protokol pripreme uzoraka za dobivanje peptida prikladne veličine za analizu metodom MS.
Tko bi trebao koristiti beskontaktnu sonikaciju za pripremu peptidnih uzoraka?
- Laboratoriji za proteomiku pristupom odozdo prema gore i otkrivanje: Istraživači koji pripremaju vrlo složene uzorke za radne postupke LC-MS ili MALDI i kojima je potrebno dosljedno izdvajanje peptida uz visok prinos iz različitih bioloških matriksa.
- Korisnici tehnologije S-Trap™ i hvatanja u suspenziji: Timovi koji se oslanjaju na pročišćavanje mikrokolonama i kojima je potrebno kontrolirano smično fragmentiranje DNA kako bi se spriječilo začepljenje kolona te osiguralo neometano nanošenje i digestija uzoraka.
- Skupine za klinička i translacijska istraživanja: Laboratoriji koji obrađuju tkivo, stanice, plazmu, serum ili cerebrospinalnu tekućinu, pri čemu su ponovljivost između serija i cjelovitost uzoraka ključne.
- Timovi za kvantitativni i ciljani MS: Laboratoriji koji provode stroge usporedne studije u kojima sonikatori sa sondom uvode rizike od unakrsne kontaminacije koji bi mogli ugroziti kvantifikaciju peptida prisutnih u malim količinama.
- Središnje laboratorijske jedinice i obrada velikog broja uzoraka: Skupine koje istodobno obrađuju više bioloških replikata i kojima koristi sonikacija u bloku za više zatvorenih epruveta uređajem VialTweeter, koja uklanja potrebu za čišćenjem sonde, skraćuje vrijeme ručnog rada i održava aseptične uvjete.
- Istraživači posttranslacijskih modifikacija (PTM) i strukture proteina: Istraživači kojima je potrebna blaga obrada uz kontrolu temperature kako bi se očuvale labilne modifikacije i postigla najveća moguća pokrivenost sekvence tijekom lize stanica i homogenizacije.
Sonikator za više uzoraka “VialTweeter” za beskontaktnu pripremu uzoraka za proteomiku u više zatvorenih bočica
Pregled protokola: od tkiva i stanica do peptida spremnih za MS
Široko prihvaćen radni postupak proteomike pristupom odozdo prema gore koji su opisali Wojtkiewicz i sur. pruža robusnu, skalabilnu metodu pripreme peptidnih uzoraka iz različitih bioloških matriksa. Polazeći od 50–100 mg naglo zamrznutog tkiva ili 1–20 milijuna stanica, protokol uključuje tehnologiju hvatanja u suspenziji (S-Trap™) za učinkovito uklanjanje detergenata, soli i kontaminanata prije enzimske digestije.
Nakon lize, kvantifikacije proteina, redukcije i alkilacije uzorak se zakiseli i nanosi na centrifugalnu kolonu S-Trap™, u kojoj se odvija digestija tripsinom/lysC. Dobiveni peptidi eluiraju se, suše i podvrgavaju analizi LC-MS. Pri primjeni na 50 mg ljudskog srčanog tkiva ovaj radni postupak dosljedno daje dovoljno peptida za 30–40 injektiranja, uz identifikaciju više od 4.000 jedinstvenih proteina po analizi. Iako su kemijski postupci i pročišćavanje na kolonama jasno definirani, uspjeh cjelokupnog postupka uvelike ovisi o početnim koracima fizičkog razaranja i obrade DNA.
Protokol preporučuje uporabu sonikatora za više epruveta VialTweeter za lizu stanica i smično fragmentiranje DNA sonikacijom – oba su koraka ključna za analizu peptida.
VialTweeter sonificira zatvorene epruvete Eppendorf od 1,0, 1,5 i 2,0mL te različite bočice NUNC
Ultrazvučna liza stanica i tkiva za ekstrakciju proteina
U proteomičkom radnom postupku pristupom odozdo prema gore sonikacija je ključan korak u lizi staničnih uzoraka radi ekstrakcije proteina za naknadnu analizu masenom spektrometrijom. Nakon dodavanja pufera sa SDS-om za lizu stanica staničnom talogu, uzorci se podvrgavaju ultrazvučnoj obradi višeepruvetnim sonikatorom VialTweeter. U protokolu se upotrebljavaju mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 mL i propisuje se rad sonikatora pri 30% snage, s 10 sekundi uključenog i 10 sekundi isključenog rada, tijekom 3 ciklusa. Nakon čekanja od 1 minute ciklus se ponavlja još dva puta. Uzorci se neprekidno hlade ledom.
Ovaj postupak ne samo da pomaže u razaranju stanica nego je posebno potreban za fragmentaciju genomske DNA oslobođene tijekom lize djelovanjem smičnih sila. Učinkovita fragmentacija DNA smičnim silama ključna je za smanjenje viskoznosti uzorka i sprječavanje začepljenja kolona S-Trap™, čime se osiguravaju optimalan prinos proteina i pouzdana naknadna digestija peptida.
Ključna uloga ultrazvučne fragmentacije DNA smičnim silama
Jedan od najčešćih problema u radnim postupcima koji se temelje na tehnologiji S-Trap™ jest začepljenje kolone, koje gotovo isključivo uzrokuje genomska DNA velike molekulske mase oslobođena tijekom homogenizacije stanica ili tkiva. Cjelovita DNA drastično povećava viskoznost uzorka, zarobljava peptide i blokira mikroporozni sloj sorbensa S-Trap™.
Ultrazvučna obrada rješava taj problem mehaničkim fragmentiranjem DNA u male, topljive fragmente. Primjenom kontrolirane akustičke energije VialTweeter učinkovito fragmentira nukleinske kiseline smičnim silama, bez stvaranja prekomjerne topline ili unošenja stranih kontaminanata. Ovo smanjenje viskoznosti osigurava nesmetano nanošenje uzorka, ujednačene protoke kroz kolonu i neometanu kinetiku digestije.
Optimizirani parametri sonikacije uređajem VialTweeter
Protokol propisuje vrlo ponovljiv režim sonikacije optimiziran za očuvanje cjelovitosti bioloških uzoraka i kompatibilnost s naknadnom analizom metodom MS. Za uzorke u mikrocentrifugalnim epruvetama od 1,5mL koji se obrađuju beskontaktnim sonikatorom s blokom Hielscher VialTweeter sljedeći parametri osiguravaju lizu i optimalnu fragmentaciju DNA smičnim silama uz očuvanje strukture proteina:
- Amplituda: 30% snage
- Obrazac ciklusa: 10 sekundi UKLJUČENO / 10 sekundi ISKLJUČENO
- Trajanje: 3 ciklusa (10sec UKLJUČENO/10sec ISKLJUČENO) → 1 minuta mirovanja na ledu → ponoviti još 2 puta
- Upravljanje temperaturom: Uzorci se tijekom obrade stavljaju na led kako bi se spriječile toplinska denaturacija i preuranjena enzimska aktivnost
Ovaj pristup pulsnoj sonikaciji sprječava lokalno pregrijavanje, svodi oksidaciju peptida na najmanju moguću mjeru i osigurava ujednačenu izloženost akustičkoj energiji u svim bočicama. Sustav sa zatvorenim epruvetama također uklanja potrebu za čišćenjem sonde između uzoraka, drastično smanjujući vrijeme ručnog rada i varijabilnost među operaterima.
Ključne prednosti za suvremene proteomičke radne postupke
Uključivanje uređaja VialTweeter u vaš proteomički radni postupak pristupom odozdo prema gore donosi nekoliko operativnih i znanstvenih prednosti:
- Ujednačena fragmentacija DNA: Ujednačeno dovođenje akustičke energije u sve bočice osigurava ponovljivo smanjenje viskoznosti i sprječava varijabilnost među serijama pri nanošenju uzoraka na S-Trap™.
- Očuvanje labilnih modifikacija: Obrada pri niskoj temperaturi u ledenoj kupelji štiti posttranslacijske modifikacije (PTM) i sprječava toplinom izazvanu agregaciju proteina tijekom lize stanica.
- Pojednostavljena naknadna obrada: Lizati obrađeni uređajem VialTweeter mogu se izravno bistriti centrifugiranjem i kvantificirati bez dodatnih koraka pročišćavanja, čime se ubrzava postupak do digestije na S-Trap™.
- Skalabilnost i fleksibilnost: Iste postavke sonikacije primjenjuju se i na vrlo složene uzorke tkiva i na stanične suspenzije, podržavajući radne postupke otkrivačke proteomike, ciljane kvantifikacije i glikoproteomike. Hielscher sonikatori za mikrotitarske pločice omogućuju jednostavno povećanje opsega obrade na velik broj uzoraka u pločicama s više jažica.
Beskontaktni višeepruvetni sonikator VialTweeter može raditi u rashladnim ormarima
Sonikatori za pripremu proteomičkih uzoraka
Priprema visokokvalitetnih peptidnih uzoraka za spektrometriju masa zahtijeva više od učinkovite lize – zahtijeva preciznu kontrolu fragmentacije DNA smičnim silama, temperature i sprječavanja kontaminacije. Uključivanjem uređaja Hielscher VialTweeter u svoj radni postupak proteomike pristupom odozdo prema gore možete ukloniti začepljivanje kolona S-Trap™, osigurati ponovljivo izdvajanje proteina i održati čistoću potrebnu za osjetljive analize metodom MS. Bilo da obrađujete ljudsko tkivo, uzgojene stanice ili složene lizate, ultrazvučna obrada u bloku pruža pouzdanost, skalabilnost i kontrolu procesa koje zahtijevaju suvremeni proteomički laboratoriji.
Za povećanje broja uzoraka iskoristite Hielscher modele fokusiranih, beskontaktnih sonikatora za mikropločice UIP400MTP i UIP550MTP! Obrađujte bilo koju standardnu pločicu s više jažica za proteomiku s velikim kapacitetom obrade uzoraka!
Obrada u zatvorenim epruvetama u usporedbi s tradicionalnim sonikatorima sa sondom
Istraživači su se tradicionalno oslanjali na sonikatore sa sondom u izravnom kontaktu s uzorkom za fragmentaciju DNA smičnim silama. Iako su učinkoviti, sustavi sa sondom uvode nekoliko ključnih ograničenja u proteomičke radne postupke:
- Rizik od unakrsne kontaminacije: Ponovna uporaba sonde za više uzoraka uzrokuje prijenos aerosola i unosi kontaminante iz drugih uzoraka koji iskrivljuju kvantitativne rezultate analize metodom MS.
- Gubitak uzorka: Izravno uranjanje može dovesti do prskanja, isparavanja i prianjanja dragocjenih peptida na površinu sonde.
- Čišćenje: Temeljita dekontaminacija sonde između obrada oduzima mnogo vremena i često je nepotpuna, što ugrožava istraživanja proteina prisutnih u malim količinama.
Sonikator s blokom VialTweeter obrađuje uzorke u cijelosti unutar zatvorenih mikrocentrifugalnih epruveta. Ova izvedba zatvorenog sustava uklanja kontakt sonde s uzorkom, sprječava stvaranje aerosola i održava stroge aseptične uvjete tijekom cijele homogenizacije i lize. Za laboratorije koji obrađuju vrlo složene tkivne lizate ili više staničnih linija to znači čišće podatke analize metodom MS, veći prinos peptida i pouzdanije biološke replikate.
Povećanje kapaciteta za visokoprotočnu pripremu uzoraka u pločama s više jažica
Uz modele sonikatora za mikrotitarske ploče UIP400MTP i UIP550MTP, obrada u epruvetama može se jednostavno proširiti na visokoprotočnu obradu uzoraka u bilo kojoj standardnoj ploči s više jažica.
Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP za visokoprotočnu ekstrakciju proteina iz uzoraka
Često postavljana pitanja o sonikaciji za pripremu peptidnih uzoraka
Zašto je sonikacija potrebna prije obrade peptida tehnologijom S-Trap™?
Sonikacija je potrebna za fragmentaciju smičnim silama genomske DNA velike molekulske mase koja se oslobađa tijekom lize stanica ili tkiva. Cjelovita DNA drastično povećava viskoznost uzorka, što može začepiti mikrokolonu S-Trap™ i zarobiti peptide, znatno smanjujući prinos i kompatibilnost s metodom MS.
Kako blokovski sonikator VialTweeter poboljšava pripremu uzoraka u usporedbi s tradicionalnim sonikatorima sa sondom?
Za razliku od sonikatora sa sondom u izravnom kontaktu s uzorkom, koji zahtijevaju pažljivo čišćenje između obrada i nose rizik od prijenosa aerosola, VialTweeter obrađuje uzorke u cijelosti unutar zatvorenih bočica i mikrocentrifugalnih epruveta. Ova izvedba sa zatvorenim epruvetama uklanja unakrsnu kontaminaciju, sprječava gubitak uzorka i održava stroge aseptične uvjete tijekom cijele homogenizacije i lize stanica.
Koji su optimalni parametri sonikacije za pripremu proteomičkih uzoraka?
Za biološke uzorke poput stanica i tkiva preporučeni protokol primjenjuje sonikator VialTweeter pri 30% snage, uz ciklus od 10 sekundi rada / 10 sekundi stanke, ponovljen 3 puta. Uzorke treba držati na ledu tijekom obrade, a ciklus ponoviti još dva puta ako se obrađuje ≥5 milijuna stanica. (usp. Wojtkiewicz et al., 2021)
Što trebam učiniti ako se moja kolona S-Trap™ začepi tijekom nanošenja uzorka?
Začepljivanje kolone obično je uzrokovano visokom viskoznošću DNA ili nedovoljnim bistrenjem. Kako biste to riješili, temeljito centrifugirajte lizat prije pipetiranja i osigurajte da je DNA odgovarajuće fragmentirana smičnim silama sonikacijom.
Kako beskontaktna sonikacija koristi radnim postupcima kvantitativne proteomike?
U kvantitativnim istraživanjima čak i unakrsna kontaminacija između uzoraka u tragovima može iskriviti mjerenja peptida niske zastupljenosti. Obrada više bočica u zatvorenom sustavu uređajem VialTweeter uklanja potrebu za umetanjem sonde, osigurava ponovljivost između serija i održava cjelovitost uzoraka za točne usporedne analize.
Koji prinos proteina i koju dubinu MS analize mogu očekivati od ovog protokola?
Polazeći od 50 mg ljudskog srčanog tkiva ili 5 milijuna stanica, radni postupak S-Trap™ obično daje dovoljno peptida za 30–50 LC-MS injektiranja, pri čemu se dosljedno identificira više od 4.000 jedinstvenih proteina po analizi. (usp. Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatura / Reference
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics isporučuje snažne beskontaktne sonikatore za pripremu uzoraka i kliničku analizu. Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn i protočni sonikator GDmini2 obrađuju uzorke bez dodira s njima.