Sonikacija u mikropločicama u shotgun proteomici – aplikacijska bilješka

Shotgun proteomika ovisi o učinkovitoj, reproducibilnoj pripremi uzoraka kako bi se složeni biološki materijal pretvorio u peptide spremne za LC-MS/MS. Sonikator za mikropločice UIP400MTP podržava taj proces omogućujući standardiziranu, paralelnu sonikaciju uzoraka malog volumena, čime laboratorijima pomaže poboljšati razaranje, ekstrakciju i resolubilizaciju u radnim postupcima koji se temelje na mikropločicama. Ova aplikacijska bilješka opisuje kako se UIP400MTP može integrirati u pripremu uzoraka za proteomiku, koristeći objavljeni radni postupak za izvanstanične vezikule iz istraživanja PLA2G12A/Th17 kao laboratorijski ispitan primjer.

Sonikacija u mikropločicama za reproducibilniju shotgun proteomiku

Za istraživače u području proteomike reproducibilna priprema uzoraka ključna je za visokokvalitetne podatke LC-MS/MS. Sonikator za mikropločice UIP400MTP podržava standardiziranu, paralelnu sonikaciju u radnim postupcima koji se temelje na pločicama te u postupcima s malim volumenima i velikim kapacitetom obrade uzoraka.

Posebno je koristan za laboratorije koji rade sa:

• Skupovima s velikim brojem uzoraka koji zahtijevaju ujednačenu obradu u brojnim jažicama
• Ograničenim početnim količinama materijala, pri čemu se gubitak uzorka i varijabilnost moraju svesti na najmanju moguću mjeru
• Uzorcima bogatima lipidima, poput izvanstaničnih vezikula
• Složenim biološkim pripravcima koji zahtijevaju učinkovito razaranje, ekstrakciju ili resolubilizaciju
• Usporednom shotgun proteomikom, u kojoj je reproducibilnost između različitih uvjeta i replikata neophodna

Integriranjem sonikacije u mikropločicama prije digestije istraživači mogu poboljšati pripremljenost uzoraka za:

• Ekstrakciju i resolubilizaciju proteina
• Digestiju tripsinom/Lys-C
• Prikupljanje podataka metodom nano-LC/MS/MS
• Naknadnu kvantitativnu proteomičku analizu

Sonikacija u mikropločicama može koristiti:

• Središnjim laboratorijima za proteomiku
• Laboratorijima za istraživanje izvanstaničnih vezikula (EV)
• Laboratorijima za imunologiju i staničnu biologiju
• Skupinama za translacijska istraživanja
• Timovima u području znanosti o životu koji s pripreme pojedinačnih uzoraka prelaze na radne postupke s većim kapacitetom obrade uzoraka

Priprema uzoraka s velikim kapacitetom obrade za analizu proteoma izvanstaničnih vezikula

Što je shotgun proteomika?

Shotgun proteomika postala je središnja analitička strategija za karakterizaciju složenih bioloških uzoraka, od lizata cijelih stanica i tkivnih ekstrakata do pročišćenih organela, izvanstaničnih vezikula i kliničkih uzoraka dostupnih u malim početnim količinama. Njezina glavna prednost leži u povezivanju digestije proteina, tekućinske kromatografije spregnute s tandemskom spektrometrijom masa visoke razlučivosti te računalnog zaključivanja o proteinima na temelju peptida. Međutim, kvaliteta konačnog skupa proteomskih podataka određuje se mnogo prije nego što uzorak stigne do spektrometra masa. Učinkovito razaranje uzoraka, solubilizacija proteina, uklanjanje ometajućih tvari, reproducibilna enzimska digestija i pouzdano iskorištenje peptida presudni su za dubinu pokrivenosti i kvantitativnu pouzdanost.
Za istraživače u području proteomike i laboratorije u području znanosti o životu koji rade s uzorcima dostupnima u ograničenim količinama ili s dragocjenim uzorcima, priprema uzoraka često je usko grlo.

Izazov izvanstaničnih vezikula u proteomici

Izvanstanične vezikule (EV), primjerice, predstavljaju posebno zahtjevnu skupinu uzoraka. To su čestice nanometarskih dimenzija, obavijene membranom i bogate lipidima, s relativno malim prinosom proteina i velikom mogućnošću prijenosa lipida, soli, detergenata, serumskih proteina i drugih sastavnica matriksa u sljedeće korake obrade. Ta svojstva mogu ometati učinkovitost digestije, kromatografsku izvedbu, stabilnost elektroraspršivanja i identifikaciju peptida. Stoga radni postupak pripreme za proteomiku EV-a mora biti dovoljno učinkovit da razori strukture vezikula i solubilizira njihov proteinski sadržaj, a pritom ostane kompatibilan s naknadnom enzimskom digestijom i analizom LC-MS/MS.
U tom kontekstu ultrazvučna obrada kompatibilna s mikropločama nudi praktičan pristup ponovljivoj, paralelnoj obradi uzoraka. Hielscher modeli sonikatora za mikroploče UIP400MTP (400 W) i UIP550MTP (550 W) namijenjeni su sonikaciji uzoraka u pločama s više jažica i posudama malog volumena te podržavaju radne postupke s većim kapacitetom obrade uzoraka od konvencionalnih sonikatora s jednom sondom. Za proteomičke laboratorije taj je format privlačan jer može smanjiti varijabilnost ručne obrade, poboljšati paralelnu obradu više uzoraka i prirodnije se uklopiti u radne postupke pripreme uzoraka u pločama.

Primjer radnog postupka

Nedavni radni postupak za proteomiku izvanstaničnih vezikula u istraživanju biologije stanica Th17 pod utjecajem PLA2G12A pruža koristan, laboratorijski ispitan primjer kako se sonikator za mikropločice UIP400MTP može uključiti u pripremu uzoraka za shotgun proteomiku. U tom nizu istraživanja uzorci EV obrađeni su za analizu proteoma primjenom obrade metanolom, sonikacije uređajem UIP400MTP, centrifugiranja, sušenja, digestije tripsinom/Lys-C i tekućinske kromatografije s nanoprotokom (LC) spregnute s tandemskom spektrometrijom masa visoke razlučivosti (MS). Biološko istraživanje objavili su 2026. Mochizuki-Ono i suradnici, a proteomička analiza pomogla je karakterizirati kako PLA2G12A mijenja proteine sadržane u EV u kontekstu patogenih odgovora T-stanica.

Sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP

Zašto sonikacija u mikrotitarskim pločicama?
UIP400MTP omogućuje standardiziranu, paralelnu sonikaciju uzoraka malog volumena. To je korisno kada su važni reproducibilnost, mala ulazna količina uzorka i kapacitet obrade više uzoraka.


Kontrolni popis za kontrolu kvalitete

• Potvrdite jednaku ulaznu količinu EV-a izraženu proteinskim ekvivalentom u svim uzorcima.
• Primjenjujte randomizirane ili uravnotežene rasporede obrade uzoraka.
• Održavajte ujednačenima volumen metanola, trajanje sonikacije, trajanje sušenja i volumen digestije.
• Pratite prinos peptida i ukupan broj identificiranih proteina.
• Provjerite stopu propuštenih cijepanja i raspodjelu duljina peptida.
• Provjerite oblik kromatografskih pikova i reproducibilnost retencijskog vremena.
• Uključite slijepe uzorke radi praćenja prijenosa ostataka između uzoraka.
• Za veća istraživanja upotrebljavajte objedinjene uzorke za kontrolu kvalitete.
• Procijenite koeficijent varijacije među replikatima.
• Primijenite PCA ili srodne metode za prepoznavanje učinaka serije ili uzoraka koji odstupaju.

Preporuke za dokumentiranje

Pri objavljivanju ili dokumentiranju ovog radnog postupka navedite ulaznu količinu EV-a, format pločice, volumen metanola, amplitudu i trajanje sonikacije uređajem UIP400MTP, uvjete centrifugiranja, metodu sušenja, pufer za digestiju, koncentraciju enzima, trajanje digestije, uvjete zakiseljavanja, platformu LC-MS/MS, način prikupljanja podataka, verziju softvera, bazu podataka, prag FDR-a, metodu normalizacije i statistički radni postupak.
Svi Hielscher sonikatori za mikroploče automatski bilježe važne procesne parametre kao što su amplituda, trajanje sonikacije i temperatura, uz datumsku i vremensku oznaku, u obliku datoteke CVS na ugrađenu SD karticu. Bilježenje podataka radi ponovljivosti i kontrole kvalitete nikada nije bilo jednostavnije!

Detaljan prikaz istraživanja: shotgun proteomika EV-ova u istraživanju PLA2G12A

Studija o PLA2G12A pruža konkretan primjer uporabe uređaja UIP400MTP u radnom postupku shotgun proteomike. Biološko pitanje bilo je kako izlučena fosfolipaza PLA2G12A mijenja izvanstanične vezikule podrijetlom iz stanica Th17 i time utječe na diferencijaciju patogenih T-stanica. Autori su pokazali da PLA2G12A djeluje na membrane izvanstaničnih vezikula (EV) i pritom stvara lizofosfolipide, uključujući 1-oleoil-lizofosfatidiletanolamin, te da nizvodna signalizacija lizofosfatidnom kiselinom putem LPA2 pridonosi diferencijaciji stanica Th17. Osim lipidne signalizacije, istraživanja su obuhvatila i sadržaj izvanstaničnih vezikula, uključujući RNA i proteine, čime je shotgun proteomika postala važna sastavnica strategije karakterizacije.
U radnom postupku pripreme izvanstaničnih vezikula stanice Th17 uzgajane su u mediju koji je sadržavao fetalni goveđi serum iz kojeg su uklonjeni egzosomi. Supernatanti kultura najprije su centrifugirani radi uklanjanja stanica, filtrirani kroz filtar od 0,22 µm, koncentrirani ultrafiltracijom/ultracentrifugiranjem, isprani, resuspendirani u PBS-u i kvantificirani BCA testom za određivanje proteina. Ova prethodna priprema izvanstaničnih vezikula osigurala je da se u proteomički radni postupak može uvesti definirana količina materijala izvanstaničnih vezikula izražena proteinskim ekvivalentom.
Za shotgun proteomičku analizu autori su upotrijebili uzorke izvanstaničnih vezikula koji odgovaraju proteinskom ekvivalentu od 5 µg. Ti su uzorci osušeni u PCR epruvetama, a zatim je dodano 25 µL metanola. Uzorci su potom sonicirani 3 minute sonikatorom za mikroploče UIP400MTP. Nakon sonikacije uzorci su centrifugirani pri 4°C tijekom 20 minuta pri 19.000 × g. Nakon uklanjanja 20 µL supernatanta uzorci su centrifugirani do suha. Proteini su zatim otopljeni sonikacijom u 4 µL otopine tripsina/Lys-C koncentracije 100 ng/µL u 50 mM amonijevu bikarbonatu. Digestija je provedena tijekom 2 sata pri 37°C uz protresanje pri 300 rpm. Digest je zakiseljen s 1 µL 1,25% trifluoroctene kiseline i podvrgnut tekućinskoj kromatografiji s nanoprotokom spregnutoj s tandemskom spektrometrijom masa visoke razlučivosti.
Ovaj radni postupak ističe nekoliko korisnih načela za proteomiku izvanstaničnih vezikula s malom početnom količinom uzorka. Prvo, početna količina normalizirana je prema proteinskom ekvivalentu, što je važno pri usporedbi izvanstaničnih vezikula iz različitih genotipova ili nakon različitih tretmana. Drugo, metanol je upotrijebljen prije sonikacije, čime se potiču razaranje i ekstrakcija uz izbjegavanje sustava s deterdžentima koji mogu otežati LC-MS/MS. Treće, korak sonikacije bio je kratak i standardiziran, što je kompatibilno s paralelnom obradom uzoraka. Četvrto, digestija tripsinom/Lys-C provedena je u vrlo malom volumenu, čime se smanjuje razrjeđivanje i potiče iskorištenje peptida iz male početne količine uzorka. Naposljetku, izravnim prijelazom s digestije na zakiseljavanje i LC-MS/MS nepotrebni koraci rukovanja svedeni su na najmanju moguću mjeru.
U naknadnoj metodi LC-MS/MS upotrijebljeno je odjeljivanje obrnutim fazama s nanoprotokom spregnuto sa spektrometrom masa Q-Exactive HF Orbitrap. Uzorci su zadržani na C18 pretkoloni, a zatim odijeljeni na analitičkoj koloni unutarnjeg promjera 50 µm pri protoku od 200 nL/min i temperaturi od 40°C. Gradijent se tijekom 60 minuta mijenjao od niskog udjela organskog otapala do 35% otapala B, nakon čega su slijedili ispiranje visokim udjelom organskog otapala i ponovno uravnoteženje. Prikupljanje MS podataka provedeno je u načinu rada s pozitivnim ionima, uz prikupljanje podataka neovisno o podacima i kolizijsku disocijaciju pri višoj energiji. Datoteke sa sirovim DIA podacima analizirane su programom DIA-NN 1.8 uz spektralnu biblioteku predviđenu in silico.