Sonikacija mikroploča u shotgun proteomici – Napomena o primjeni

Shotgun proteomika ovisi o učinkovitoj, ponovljivoj pripremi uzorka za pretvaranje složenog biološkog materijala u peptide spremne za LC-MS/MS. UIP400MTP mikropločasti sonikator podržava ovaj proces omogućujući standardiziranu, paralelnu sonaciju uzoraka malih volumena, pomažući laboratorijima poboljšati poremećaje, ekstrakciju i resolubilizaciju u mikropločastim radnim procesima. Ova primjenska bilješka opisuje kako se UIP400MTP može integrirati u pripremu proteomskog uzorka, koristeći objavljeni tijek rada za ekstracelularne vezikule iz studija PLA2G12A/Th17 kao laboratorijski testirani primjer.

Microplate Sonication for More Reproducible Shotgun Proteomics

Za istraživače proteomike, ponovljiva priprema uzoraka ključna je za visokokvalitetne LC-MS/MS podatke. UIP400MTP mikroplaten sonikator podržava standardiziranu, paralelnu sonikaciju u radnim tokovima temeljenima na pločama i za male volumene/visoku propusnost.

Posebno je koristan za laboratorije koji rade s:

• Velikim skupovima uzoraka koji zahtijevaju dosljednu obradu kroz mnoge bunare
• Materijalom s ograničenim unosom, gdje je potrebno minimizirati gubitak uzoraka i varijabilnost
• Uzorcima bogatim lipidima, kao što su ekstracelularne vezikule
• Kompleksnim biološkim pripravcima koji zahtijevaju učinkovito razbijanje, ekstrakciju ili ponovno otapanje
• Komparativnom shotgun proteomikom, gdje je ponovljivost kroz uvjete i replikate od presudne važnosti

Integracijom mikroplaten sonikacije prije probave, istraživači mogu poboljšati spremnost uzorka za:

• Ekstrakciju i ponovno otapanje proteina
• Probava Trypsin/Lys-C
• Nano-LC/MS/MS akvizicija
• Kvantitativna analiza proteomike downstream

 

Uskalirajte svoju pripremu proteomskih uzoraka s povjerenjem!
Saznajte kako sonikacija u mikropločama pomaže smanjiti ručnu varijabilnost, poboljšati disruptivnost uzoraka i pripremiti složene biološke uzorke za pouzdanu LC-MS/MS analizu.

Zahtjev za informacije


Adresa e-pošte (obavezno)


Proizvod ili područje interesa



Slažem se s Politikom privatnosti









Zatražite informacije

Sonikacija u mikropločama može koristiti:

• Središtima za proteomiku
• Laboratorijima za istraživanje EV-a
• Laboratorijima za imunologiju i staničnu biologiju
• Grupama za translacijska istraživanja
• Timovima iz životnih znanosti koji skaliraju pripremu od pojedinačnih uzoraka do protokola veće propusnosti

Priprema uzoraka visoke propusnosti za analizu proteoma ekstracelularnih vezikula

Što je 'Shotgun' proteomika?

Shotgun proteomics has become a central analytical strategy for characterizing complex biological samples, from whole-cell lysates and tissue extracts to purified organelles, extracellular vesicles, and low-input clinical specimens. Its core strength lies in the coupling of protein digestion, high-resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and computational peptide-to-protein inference. However, the quality of the final proteome dataset is determined long before the sample reaches the mass spectrometer. Efficient sample disruption, protein solubilization, removal of interfering substances, reproducible enzymatic digestion, and robust peptide recovery are all decisive for depth of coverage and quantitative reliability.
Za istraživače proteomike i laboratorije bioloških znanosti koji rade s ograničenim ili dragocjenim uzorcima, priprema uzoraka često je usko grlo.

Izazov izvanstaničnih vezikula u proteomici

Extracellular vesicles (EVs), for example, represent a particularly demanding sample class. They are membrane-bound, lipid-rich, nanoscale particles with relatively low protein yield and a high potential for carry-over of lipids, salts, detergents, serum proteins, and other matrix components. These features can interfere with digestion efficiency, chromatographic performance, electrospray stability, and peptide identification. A preparation workflow for EV proteomics must therefore be strong enough to disrupt vesicle structures and solubilize protein cargo, while remaining compatible with downstream enzymatic digestion and LC-MS/MS analysis.
U ovom kontekstu, ultrazvučna obrada kompatibilna s mikropločama nudi praktičan pristup za reproducibilnu, paraleliziranu obradu uzoraka. Hielscher modeli mikrosonicatora za mikroploče UIP400MTP (400 W) i UIP550MTP (550 W) dizajnirani su za sonikaciju uzoraka u pločama s više jama i posudama malog volumena, podržavajući radne tokove većeg kapaciteta u usporedbi s konvencionalnim sonicatorima s jednim sondom. Za laboratorije za proteomiku, ovaj format je privlačan jer može smanjiti varijabilnost koja ovisi o ljudskom rukovanju, poboljšati paralelnu obradu više uzoraka i prirodnije se integrirati u pripremu uzoraka u pločama.

Primjer radnog toka

Nedavni tijek rada proteomike izvanstaničnih vezikula u PLA2G12A vođenoj biologiji Th17 stanica pruža koristan, laboratorijski testiran primjer kako se mikropločasti sonikator UIP400MTP može uključiti u pripremu uzoraka proteomike sačmarice. U toj seriji istraživanja, uzorci EV obrađeni su za analizu proteoma korištenjem metanolne obrade, UIP400MTP sonikaciju, centrifugaciju, sušenje, razgradnju tripsin/Lys-C i nano-flow LC-visokorezolucijski tandem MS. Isti biološki rad prvi je put objavljen kao bioRxiv preprint, a potom objavljen u Cell Reports, gdje je proteomska analiza pomogla karakterizirati kako PLA2G12A mijenja EV cargo proteine u kontekstu patogenih T-staničnih odgovora.

Sonikator ploče s više jažica UIP400MTP

Zašto sonikacija mikroploče?
The UIP400MTP enables standardized, parallel sonication of small-volume samples. This is useful when reproducibility, low sample input, and multi-sample throughput are important.


Kontrolni popis kvalitete

• Potvrdite jednak unos proteina EV ekvivalenata u svim uzorcima.
• Koristite nasumične ili uravnotežene rasporede obrade uzoraka.
• Održavajte isti volumen metanola, vrijeme sonikacije, vrijeme sušenja i volumen probave.
• Pratite prinos peptida i ukupnu identifikaciju proteina.
• Provjerite stopu propuštenih cepanja i distribuciju duljine peptida.
• Pregledajte oblik kromatografskog vrha i reproduktivnost vremena zadržavanja.
• Uključite prazne uzorke za praćenje prijenosa.
• Koristite objedinjene QC uzorke za veće studije.
• Procijenite koeficijent varijacije replikata.
• Koristite PCA ili povezane metode za identifikaciju učinaka serije ili odstupajućih uzoraka.

Preporuke za protokol

Prilikom objavljivanja ili dokumentiranja ovog radnog toka, navedite količinu EV ulaza, format ploče, volumen metanola, amplitudu i vrijeme sonikacije UIP400MTP, uvjete centrifugiranja, metodu sušenja, pufer za digestiju, koncentraciju enzima, vrijeme digestije, uvjete acidifikacije, LC-MS/MS platformu, način akvizicije, verziju softvera, bazu podataka, prag FDR-a, metodu normalizacije i statistički radni tok.
Svi Hielscher mikropločasti sonikatori automatski snimaju važne parametre procesa kao što su amplituda, trajanje sonikacije i temperatura s datumom i vremenom kao CVS datoteku na integriranu SD-kartu. Protokoliranje podataka za reproduktivnost i kontrolu kvalitete nikada nije bilo jednostavnije!

Studija u detalje: EV Shotgun proteomika u PLA2G12A studiji

The PLA2G12A study provides a concrete example of UIP400MTP use in a shotgun proteomics workflow. The biological question was how the secreted phospholipase PLA2G12A modifies Th17-cell-derived extracellular vesicles and thereby influences pathogenic T-cell differentiation. The authors showed that PLA2G12A acts on EV membranes to produce lysophospholipids, including 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, and that downstream lysophosphatidic acid signaling via LPA2 contributes to Th17 differentiation. Beyond lipid signaling, the studies also examined EV cargo, including RNA and protein content, making shotgun proteomics an important component of the characterization strategy.
In the EV preparation workflow, Th17 cells were cultured in medium containing exosome-depleted fetal bovine serum. Culture supernatants were first centrifuged to remove cells, filtered through a 0.22 µm filter, concentrated by ultrafiltration/ultracentrifugation, washed, resuspended in PBS, and quantified by BCA protein assay. This upstream EV preparation ensured that a defined protein-equivalent amount of EV material could be carried into the proteomics workflow.
For shotgun proteomic analysis, the authors used EV samples corresponding to 5 µg protein equivalents. These samples were dried in PCR tubes, and 25 µL methanol was added. The samples were then sonicated for 3 minutes using the UIP400MTP microplate sonicator. Following sonication, the samples were centrifuged at 4°C for 20 minutes at 19,000 × g. After removal of 20 µL supernatant, the samples were centrifuged to dryness. Proteins were then dissolved by sonication in 4 µL trypsin/Lys-C solution at 100 ng/µL in 50 mM ammonium bicarbonate. Digestion was performed for 2 hours at 37°C with shaking at 300 rpm. The digest was acidified with 1 µL of 1.25% trifluoroacetic acid and submitted to nano-flow LC-high-resolution tandem mass spectrometry.
This workflow highlights several useful principles for low-input EV proteomics. First, the input was normalized by protein equivalent, which is important when comparing EVs from different genotypes or treatments. Second, methanol was used before sonication, supporting disruption and extraction while avoiding detergent systems that may complicate LC-MS/MS. Third, the sonication step was short and standardized, which is compatible with parallel sample processing. Fourth, trypsin/Lys-C digestion was performed in a very small volume, reducing dilution and supporting low-input peptide recovery. Finally, direct transition from digestion to acidification and LC-MS/MS minimized unnecessary handling steps.
Metoda nizvodno LC-MS/MS koristila je nano-protok reverzne fazne separacije spojene s Q-Exactive HF Orbitrap masenim spektrometrom. Uzorci su zarobljeni na C18 predkoloni, a zatim razdvojeni na analitičkoj koloni promjera unutarnjeg promjera od 50 μm pri 200 nL/min i 40°C. Gradijent je išao od niskog udjela organskog otapala do 35% otapala B tijekom 60 minuta, nakon čega je uslijedilo pranje i ponovno izjednačavanje s visokim udjelom organskih otapala. Snimanje MS-a provedeno je u pozitivno-ionskom načinu korištenjem podatkovno neovisnog snimanja s disocijacijom sudara viših energija. DIA sirove datoteke analizirane su pomoću DIA-NN 1.8 s in silico predviđenom spektralnom bibliotekom.