Ekstrakcija proteina potpomognuta sonikacijom za fosfoproteomiku

U suvremenim znanostima o životu fosfoproteomika se etablirala kao temeljna tehnologija za dešifriranje staničnih signalnih putova i razumijevanje mehanizama bolesti na razini sustava. Budući da fosforilacija upravlja ključnim biološkim funkcijama – od aktivnosti enzima do interakcija između proteina – njezino je precizno mjerenje neophodno i za temeljna istraživanja i za translacijsku medicinu. Nedavni napredak u spektrometriji masa omogućio je identifikaciju desetaka tisuća događaja fosforilacije u jednom eksperimentu, naglašavajući potrebu za robusnim, skalabilnim i reproducibilnim radnim postupcima pripreme uzoraka.
Među najutjecajnijim pomacima u ovom području jest uvođenje ekstrakcije proteina potpomognute sonikacijom, koja znatno poboljšava kvalitetu uzoraka, kapacitet njihove obrade i reproducibilnost. Ultrazvučne tehnologije kao što su VialTweeter i UIP400MTP sada iznova definiraju način na koji laboratoriji obrađuju velike skupine uzoraka, osobito u fosfoproteomici s velikim kapacitetom obrade uzoraka.

Znanstvena važnost učinkovite pripreme uzoraka u fosfoproteomici

Fosforilacija proteina izrazito je dinamična i reverzibilna posttranslacijska modifikacija koja zahvaća većinu proteina u ljudskim stanicama. Regulira strukturu i lokalizaciju proteina te mreže njihovih interakcija, a poremećaji njezine regulacije povezani su s bolestima poput raka i neurodegeneracije.
Međutim, fosfoproteomska analiza donosi specifične tehničke izazove. Fosforilirani peptidi često su slabo zastupljeni te zahtijevaju pažljivo obogaćivanje i vrlo učinkovitu prethodnu pripremu uzoraka. Svaka neučinkovitost tijekom ekstrakcije ili razgradnje proteina može dovesti do gubitka signala, slabe reproducibilnosti i nepotpune pokrivenosti fosforilacijskih mjesta.
Upravo tu sonikacija postaje ključna.

Zašto sonikacija mijenja ekstrakciju proteina

Sonikacija upotrebljava ultrazvučne valove visokog intenziteta za mehaničko razaranje stanica i tkiva, omogućujući učinkovito oslobađanje proteina iz stanica, tkiva, bioloških tekućina i izvanstaničnih vezikula. U usporedbi s konvencionalnim tehnikama lize, sonikacija nudi nekoliko jasnih prednosti:

• Prvo, osigurava brzo i ujednačeno razaranje stanica, što je osobito važno za očuvanje prolaznih stanja fosforilacije. U fosfoproteomici čak i mala kašnjenja ili nepotpuna liza mogu promijeniti signalne profile, zbog čega je brza i reproducibilna ekstrakcija neophodna.
• Drugo, sonikacija poboljšava prinos i solubilizaciju proteina, osobito u uzorcima koje je teško lizirati, poput gustih tkiva ili stanica bogatih membranama. To izravno dovodi do bolje naknadne razgradnje proteina i većeg iskorištenja fosfopeptida.
• Treće, ultrazvučna obrada po svojoj je prirodi skalabilna. Uređaji poput uređaja VialTweeter omogućuju istodobnu sonikaciju više zatvorenih epruveta, osiguravajući identične uvjete obrade svih uzoraka. Time se uklanja varijabilnost uzrokovana ručnim rukovanjem.
• Za zahtjeve za još većim kapacitetom obrade uzoraka UIP400MTP predstavlja velik tehnološki iskorak. Omogućuje izravnu sonikaciju cijelih mikroploča ili stalaka s epruvetama, uključujući bočice za automatski uzorkivač, što ga čini idealnim za paralelnu obradu stotina uzoraka. Ta je mogućnost osobito vrijedna u sistemskoj biologiji i kliničkim istraživanjima, gdje su velike skupine uzoraka standard.

Sonikacija s velikim kapacitetom obrade uzoraka: VialTweeter i UIP400MTP u fokusu

Integracija naprednih ultrazvučnih uređaja u fosfoproteomske radne postupke nije samo praktično rješenje – ona predstavlja metodološko poboljšanje.
VialTweeter je osmišljen za sinkroniziranu ultrazvučnu obradu više zatvorenih bočica, čime se unakrsna kontaminacija svodi na najmanju moguću mjeru uz istodobno osiguravanje reproducibilnosti. Osobito je prikladan za primjene sa srednjim kapacitetom obrade uzoraka i standardizirane radne postupke.
 

Nasuprot tome, UIP400MTP optimiziran je za okruženja s velikim kapacitetom obrade uzoraka te omogućuje:

• Ujednačena sonikacija cijelih standardnih mikroploča, npr. ploča s 96 ili 384 jažice
• Izravna obrada stalaka za epruvete i bočica za automatski uzorkivač
• Znatno smanjenje vremena potrebnog za ručni rad
• Poboljšana ponovljivost u velikim skupovima podataka

Ta se skalabilnost savršeno uklapa u suvremene pristupe fosfoproteomici, u kojima se tijekom radnih postupaka rutinski paralelno obrađuju deseci do stotine uzoraka.

Opći protokol za pripremu fosfoproteomskih uzoraka potpomognutu sonikacijom

Robustan fosfoproteomski radni postupak objedinjuje učinkovitu ekstrakciju proteina, enzimsku razgradnju i obogaćivanje fosfopeptida. Sljedeći pregled odražava ustaljene najbolje prakse prilagođene pripremi temeljenoj na sonikaciji:

1. Brzo zaustavljanje reakcija u uzorcima i prikupljanje uzoraka
   Reakcije u stanicama ili tkivima brzo se zaustavljaju – obično naglim zamrzavanjem – kako bi se očuvala stanja fosforilacije. Taj je korak ključan zbog prolazne prirode fosforilacijskih događaja.
2. Ultrazvučna liza stanica i ekstrakcija proteina
   Uzorci se odmrzavaju i podvrgavaju sonikaciji, obično u kratkim ciklusima. Ultrazvučna energija razara stanične membrane i učinkovito oslobađa proteine. U validiranim radnim postupcima sonikacija se provodi u više ciklusa kako bi se osigurala potpuna liza.
   Primjer: Nakon odmrzavanja uzoraka na ledu, liza stanica postignuta je sonikacijom, npr. uređajem Vialtweeter tijekom 2 ciklusa, pri čemu je svaki ciklus trajao 1 min.
3. Bistrenje i kvantifikacija proteina
   Nakon lize uzorci se centrifugiraju radi uklanjanja ostataka. Supernatant koji sadržava topljive proteine prikuplja se te se određuje količina proteina kako bi se osigurao ujednačen unos proteina iz svih uzoraka.
4. Redukcija i alkilacija
   Disulfidne veze reduciraju se (npr. primjenom DTT-a) i alkiliraju (npr. primjenom IAA-a) kako bi se proteini stabilizirali i poboljšala učinkovitost razgradnje.
5. Proteolitička razgradnja
   Proteini se enzimski razgrađuju, obično tripsinom, pri čemu nastaju peptidi prikladni za analizu masenom spektrometrijom. Pročitajte više o ultrazvučno ubrzanoj razgradnji proteina!
6. Pročišćavanje i odsoljavanje peptida
   Peptidi se pročišćavaju metodama temeljenima na C18 kako bi se uklonile nečistoće koje bi mogle ometati analizu LC-MS.
7. Obogaćivanje fosfopeptida
   S obzirom na nisku zastupljenost fosforiliranih peptida, za selektivno izdvajanje fosfopeptida primjenjuju se tehnike obogaćivanja poput afinitetnih metoda s Fe-NTA ili TiO₂.
8. Analiza LC-MS/MS i obrada podataka
   Obogaćeni uzorci analiziraju se masenom spektrometrijom visoke razlučivosti, često uz prikupljanje podataka neovisno o podacima (DIA) radi poboljšane kvantifikacije i ponovljivosti.

Posebno valja istaknuti da se radni postupci velikog opsega mogu prilagoditi formatima ploča s 96 jažica, čime se omogućuje paralelna obrada do nekoliko stotina uzoraka – pristup potpuno kompatibilan sa sonikacijom uređajem UIP400MTP.
 

Optimizirani protokol za brzo zaustavljanje reakcija u fosfoproteomu, obogaćivanje fosfopeptida i Phos-DIA-MS.
Protokol i slika: ©Die et al. 2023

Poboljšanje ponovljivosti i kvalitete podataka sonikacijom

Jedan od glavnih izazova u fosfoproteomici jest postizanje dosljedne kvantifikacije u velikim skupovima podataka. Varijabilnost uvedena tijekom pripreme uzoraka može prikriti biološki značajne razlike.

Sonikacija rješava taj problem osiguravajući:

1. Standardiziran unos energije u sve uzorke
2. Smanjenu varijabilnost uzrokovanu ručnim radom
3. Poboljšanu ponovljivost ekstrakcije i razgradnje proteina

U kombinaciji s platformama za obradu velikog broja uzoraka poput uređaja UIP400MTP, laboratoriji mogu postići razinu dosljednosti koja je ključna za istraživanja u sistemskoj biologiji i otkrivanje kliničkih biomarkera.

Budućnost fosfoproteomike: automatizacija i skalabilnost

Kako se fosfoproteomika nastavlja širiti na primjene velikog opsega i kliničke primjene, potražnja za automatizacijom i kapacitetom obrade uzoraka samo će rasti. Priprema uzoraka temeljena na sonikaciji, osobito kada je integrirana sa sustavima kompatibilnima s mikropločicama, predstavlja ključnu tehnologiju koja to omogućuje.
Kombiniranjem učinkovite ultrazvučne lize, paralelne obrade i kompatibilnosti s automatiziranim radnim postupcima, uređaji kao što su VialTweeter i UIP400MTP postavljaju nove standarde u pripremi uzoraka za proteomiku.
Pročitajte više o integraciji uređaja UIP400MTP u automatizirane laboratorijske radne postupke!

Iskoristite prednosti pripreme uzoraka potpomognute sonikacijom u fosfoproteomici!

Ekstrakcija proteina potpomognuta sonikacijom postala je ključna sastavnica suvremene fosfoproteomike, pružajući nenadmašnu učinkovitost, skalabilnost i ponovljivost. Uz sve veću potrebu za analizom složenih bioloških sustava u velikim skupinama uzoraka, ultrazvučne tehnologije ne donose samo prednosti – one su neophodne.
Omogućujući standardizirane radne postupke s velikim kapacitetom obrade uzoraka, rješenja kao što su VialTweeter i UIP400MTP ubrzavaju otkrića u područjima stanične signalizacije, mehanizama bolesti i precizne medicine.

Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj

Ultrazvučni uređaji Hielscher poznati su po najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Ultrazvučni uređaji Hielscher lako se nose s teškim uvjetima i zahtjevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics je tvrtka s ISO certifikatom koja poseban naglasak stavlja na visokoučinkovite ultrazvučne uređaje s najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnim rukovanjem. Naravno, ultrazvučni uređaji Hielscher sukladni su sa zahtjevima CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Modeli ultrazvučnih uređaja Hielscher za više uzoraka UIP400MTP za mikropločice, VialTweeter i CupHorn: brza priprema uzoraka s velikim kapacitetom obrade