Hielscher Ultrasonics
Rado ćemo razgovarati o vašem procesu.
Nazovite nas: +49 3328 437-420
Pišite nam: [email protected]

Deparafinizacija i ekstrakcija proteina iz FFPE tkiva

Olakšajte ekstrakciju proteina iz rezova tkiva fiksiranog formalinom i uklopljenog u parafin (FFPE) primjenom optimizirane kombinacije deparafinizacije, solubilizacije i sonikacije višeepruvetnim ultrazvučnim uređajem VialTweeter. Ovaj protokol podržava daljnju proteomičku analizu temeljenu na spektrometriji masa te je kompatibilan s radnim postupcima pročišćavanja metodom SP3 i enzimske digestije.

Ovaj standardni operativni postupak (SOP) namijenjen je laboratorijskom osoblju koje provodi proteomičku analizu uzoraka FFPE tkiva primjenom visokoučinkovite sonikacije. Optimiziran je za do deset FFPE uzoraka koji se paralelno obrađuju višeepruvetnim sonikatorom VialTweeter.

Zahtjev za informacije



VialTweeter na ultrazvučnom procesoru UP200ST

Sonikator VialTweeter za istodobnu sonikaciju 10 uzoraka, npr. za lizu i ekstrakciju proteina iz FFPE uzoraka

Protokol: ekstrakcija proteina iz FFPE uzoraka uređajem VialTweeter

Materijali i reagensi

Reagensi

  • Ksilen (histološke čistoće)
  • Etanol (apsolutni 96%)
  • Pufer za lizu:

    • 6 M gvanidin hidroklorid
    50 mM Tris-HCl, pH 8,5
    10 mM TCEP (tris(2-karboksietil)fosfin)
    40 mM CAA (2-kloracetamid)

  • Inhibitor proteaza (neobavezno; npr. cOmplete™ mini EDTA-free)

 
 

Oprema

  • Višeepruvetni ultrazvučni uređaj VialTweeter
  • Mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 mL ili 2,0 mL s niskim vezanjem proteina
  • Grijaći blok ili inkubator (postavke 95°C i 80°C)
  • Mikrocentrifuga
  • Termomikser (neobavezan, ali preporučen)

Početna količina uzorka

  • 1–2 reza FFPE tkiva debljine 10 µm po uzorku (tj. po bočici)

    • ILI

  • Ukupno ~100 µg tkiva po uzorku (tj. po bočici)

Napomena: za mikrotomiju upotrebljavajte nove oštrice kako biste kontaminaciju ostacima parafina sveli na najmanju moguću mjeru.

Postupak

  1. Deparafinizacija
    1. Prenesite FFPE rezove u mikrocentrifugalne epruvete s niskim vezanjem proteina.
    2. Dodajte 1 mL ksilena i kratko promiješajte na vorteks-miješalici.
    3. Inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi.
    4. Centrifugirajte pri 14.000 × g tijekom 2 minute; odbacite supernatant.
    5. Ponovite ispiranje ksilenom još jednom (koraci 2–4).
    6. Isperite talog s 1 mL 96% etanola, promiješajte na vorteks-miješalici, a zatim centrifugirajte pri 14.000 × g tijekom 2 minute. Odbacite supernatant.
    7. Ponovite ispiranje etanolom još jednom (ukupno 2 ispiranja etanolom).
    8. Sušite talog na zraku 10 minuta na sobnoj temperaturi s otvorenim poklopcima kako bi preostali etanol ispario.
  2. Ekstrakcija proteina i sonikacija
    1. Svakom suhom talogu dodajte 200 µL pufera za lizu.

      Napomena: iako sonikator može primiti do 1 mL, 200 µL optimalno je za daljnju obradu.

    2. Promiješajte na vorteks-miješalici ili nježnim pipetiranjem.
  3. Prva toplinska inkubacija
    1. Inkubirajte epruvete na 95 °C tijekom 30 min, uz miješanje pri 400 rpm u termomikseru ili grijaćem bloku.
    2. Ostavite uzorke da se hlade na sobnoj temperaturi 5 min.
  4. Prva sonikacija uređajem VialTweeter
    1. Postavite epruvete u VialTweeter.
    2. Postavite VialTweeter UP200St na vrijednosti navedene u nastavku i provedite sonikaciju.
    5. Postavke sonikatora
    • Postavite amplitudu (A) na 100%
    • Postavite način pulsiranja (C) na 100%
    • Vremenski programator ciklusa: uključen
    • Vrijeme rada: 60s
    • Vrijeme stanke: 30s
    • Granična vrijednost: 15 min (odgovara 10 ciklusa)
    (Napomena o izračunu: (60 s rada + 30 s stanke) × 10 ciklusa = 900 s = 15 min)
  5. Druga toplinska inkubacija
    Izvadite epruvete i ponovno inkubirajte na 95 °C tijekom 15 min, pri 400 rpm.
  6. Druga sonikacija
    Ponovite sonikaciju na uređaju VialTweeter s istim postavkama (kao gore) tijekom dodatnih 10 ciklusa (ukupno 15 min).
  7. Bistrenje lizata
    1. Centrifugirajte uzorke pri 13.000 × g tijekom 10 min na 23°C (sobna temperatura).
    2. Pažljivo prenesite supernatant u novu epruvetu Eppendorf Safe-lock od 2,0 mL. Pazite da ne uzburkate talog.
  8. Daljnja obrada
    Lizat je sada spreman za pročišćavanje metodom SP3 i enzimsku digestiju.

 

UP200St s uređajem VialTweeter za sonikaciju zatvorenih bočicaVialTweeter je jedinstven ultrazvučni sustav za istodobnu sonikaciju do 10 bočica u potpuno jednakim uvjetima bez unakrsne kontaminacije.
VialTweeter je jedinstven ultrazvučni sustav za istodobnu sonikaciju do 10 bočica u potpuno jednakim uvjetima bez unakrsne kontaminacije.

 

VialTweeter s epruvetama Eppendorf od 2,0mL za pouzdanu pripremu uzoraka u sterilnim uvjetima

Hielscher VialTweeter s 10 epruveta Eppendorf

Zahtjev za informacije



Napomene i najbolje prakse

  1. Rizik od pregrijavanja tijekom sonikacije smanjuje se programiranim ciklusima uključivanja i isključivanja.
  2. Nakon sonikacije izbjegavajte miješanje na vorteks-miješalici kako biste spriječili agregaciju proteina.

Zbrinjavanje otpada i sigurnost

  • Ksilen i gvanidin hidroklorid opasne su kemikalije; rukujte njima u digestoru.
  • Sav otpad koji sadržava otapala i sav biološki otpad zbrinite u skladu s protokolima ustanove za biološku sigurnost i kemijsku higijenu.

    •  
     

    Tablica u nastavku daje pregled približnog kapaciteta obrade naših laboratorijskih ultrazvučnih uređaja:

    Preporučeni uređaji Volumen šarže Protok
    Sonikator UIP400MTP za pločice s 96 jažica pločice s više jažica / mikrotitarske pločice n.a.
    Ultrazvučni CupHorn CupHorn za bočice ili laboratorijsku čašu n.a.
    GDmini2 ultrazvučni mikroprotočni reaktor n.a.
    VialTweeter 0,5 do 1,5mL n.a.
    UP100H 1 do 500mL 10 do 200mL/min
    UP200Ht, UP200St 10 do 1000mL 20 do 200mL/min
    UP400St 10 do 2000mL 20 do 400mL/min
    Ultrazvučni tresač sita n.a. n.a.

    Zatražite više informacija

    Molimo upotrijebite obrazac u nastavku kako biste zatražili dodatne informacije o ultrazvučnim procesorima, primjenama i cijeni. Rado ćemo s Vama razgovarati o Vašem procesu i ponuditi Vam ultrazvučni sustav koji ispunjava Vaše zahtjeve!





    Ultrazvučni homogenizatori s visokim smičnim silama upotrebljavaju se za laboratorijsku obradu, obradu na stolnim uređajima te pilotnu i industrijsku obradu.

    Hielscher Ultrasonics proizvodi visokoučinkovite ultrazvučne homogenizatore za miješanje, dispergiranje, emulgiranje i ekstrakciju u laboratorijskom, pilotnom i industrijskom mjerilu.

    Povezane teme

    Literatura / reference

    Često postavljana pitanja

    Zašto se uzorci tkiva fiksiraju i pripremaju kao FFPE?

    Očuvanje tkiva fiksiranjem formalinom i uklapanjem u parafin (FFPE) stabilizira morfologiju tkiva i strukture proteina stvaranjem kovalentnih poprečnih veza djelovanjem formaldehida. Uklapanje u parafin omogućuje dugotrajno čuvanje na sobnoj temperaturi uz očuvanje histološkog i molekularnog integriteta za retrospektivne analize.

    Kako deparafinizirati FFPE uzorke?

    Deparafinizacija uključuje uzastopna ispiranja otapalima radi uklanjanja parafina: obično dvije inkubacije s ksilenom, nakon kojih slijede dva ispiranja etanolom (96%). Nakon centrifugiranja i sušenja tkivo je spremno za daljnju ekstrakciju. Ovaj postupak ponovno čini uzorak dostupnim za lizu i enzimsku digestiju.

    Koja je svrha toplinske inkubacije?

    Toplinska inkubacija podrazumijeva kontrolirano izlaganje uzorka određenoj temperaturi tijekom određenog razdoblja radi izazivanja biokemijskih ili fizikalnih promjena. U proteomici se često upotrebljava za denaturaciju proteina, raskidanje poprečnih veza nastalih djelovanjem formaldehida u FFPE tkivima ili povećanje učinkovitosti pufera za lizu. Temperatura i trajanje ključni su parametri koji se prilagođavaju ciljanoj reakciji ili vrsti uzorka.

    Što je digestija metodom SP3?

    Priprema uzoraka potpomognuta čvrstom fazom u jednoj posudi (SP3) proteomički je radni postupak temeljen na kuglicama. Upotrebljava paramagnetske kuglice za vezanje proteina, što omogućuje učinkovito pročišćavanje, koncentriranje i enzimsku digestiju na kuglicama u denaturirajućim uvjetima. SP3 svodi gubitak uzorka na najmanju moguću mjeru te je vrlo kompatibilan s uzorcima male početne količine i FFPE uzorcima.

    Visokoučinkovita ultrazvučna tehnologija! Asortiman proizvoda Hielscher obuhvaća cijeli raspon, od kompaktnog laboratorijskog ultrazvučnog uređaja preko stolnih jedinica do potpuno industrijskih ultrazvučnih sustava.

    Hielscher Ultrasonics proizvodi visokoučinkovite ultrazvučne homogenizatore od laboratorijskih do industrijskih veličina.

    Rado ćemo razgovarati o vašem procesu.

    ✕