Deparafinizacija i ekstrakcija proteina iz FFPE

Olakšajte ekstrakciju proteina iz formalinom fiksiranih parafinom ugrađenih (FFPE) dijelova tkiva pomoću optimizirane kombinacije deparafinizacije, solubilizacije i sonikacije s VialTweeter ultrazvučnim uređajem s više cijevi. Ovaj protokol podržava nizvodnu proteomiku temeljenu na spektrometriji mase i kompatibilan je s tijekovima rada čišćenja SP3 i enzimske probave.

Ovaj SOP namijenjen je laboratorijskom osoblju uključenom u proteomsku analizu FFPE uzoraka tkiva korištenjem sonikacije visokih performansi. Optimiziran je za do deset FFPE uzoraka koji se paralelno obrađuju pomoću VialTweeter Multi-Tube sonicatora.

Protokol: Ekstrakcija proteina iz FFPE uzoraka pomoću VialTweetera

Materijali i reagensi

reagensi

• Ksilen (histološki stupanj)
• Etanol (apsolutno 96%)
• Pufer za lizu:

6 M gvanidin hidroklorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfin)
40 mM CAA (2-kloroacetamid)

• Inhibitor proteaze (izborno; npr. cOmplete™ mini EDTA-free)

Oprema

• VialTweeter Ultrasonicator s više cijevi
• Mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 mL ili 2,0 mL za nisko vezivanje
• Toplinski blok ili inkubator (postavke 95°C i 80°C)
• Mikrocentrifuga
• Termomikser (opcionalno ali preporučljivo)

Unos uzorka

• 1–2 presjeka FFPE tkiva debljine 10 µm po uzorku (tj. po bočici)

ili

• Ukupno ~100 µg tkiva po uzorku (tj. po bočici)

Napomena: Koristite svježe oštrice za mikrotomiju kako biste smanjili kontaminaciju parafinskim ostacima.

Postupak

1. deparafinizacija
   1. Prenesite FFPE dijelove u mikrocentrifugalne epruvete s niskim vezivanjem.
   2. Dodajte 1 mL ksilena, kratko promiješajte.
   3. Inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi.
   4. Centrifugirajte na 14 000 x g 2 minute; odbaciti supernatant.
   5. Ponovite ispiranje ksilelom još jednom (koraci 2-4).
   6. Isperite talog s 1 mL 96% etanola, vorteksirajte, zatim centrifugirajte na 14 000 × g 2 minute. Odbaciti supernatant.
   7. Ponovite ispiranje etanolom još jednom (ukupno 2 ispiranja etanolom).
   8. Pelete sušite na zraku 10 minuta na sobnoj temperaturi s otvorenim poklopcima kako bi ispario preostali etanol.
2. Ekstrakcija proteina i sonikacija
   1. Dodajte 200 µL pufera za lizu svakoj suhoj peleti.
      Napomena: Iako sonikator prima do 1 mL, 200 µL je optimalno za daljnju obradu.

   2. Promiješajte vrtložnim miješanjem ili blagim pipetiranjem.
3. Prva toplinska inkubacija
   1. Inkubirajte epruvete na 95 °C 30 minuta, uz miješanje na 400 okretaja u minuti pomoću termomiksera ili termobloka.
   2. Pustite uzorke da se ohlade na sobnoj temperaturi 5 minuta.
4. Prva sonikacija s VialTweeterom
   1. Stavite cijevi u VialTweeter.
   2. Postavite VialTweeter UP200St na donje vrijednosti i sonicirate.
Postavke sonikatora
• Postavite amplitudu (A) na 100%
• Postavite pulsiranje (C) na 100%
• Sat mjesečnice: Uključeno
• Na vrijeme: 60s
• Vrijeme isključenja: 30s
• Granična vrijednost: 15 min (odgovara 10 ciklusa)
(Napomena za izračun: (60 s uključeno + 30 s isključeno) × 10 ciklusa = 900 s = 15 min)
5. Druga toplinska inkubacija
   Uklonite epruvete i ponovno inkubirajte na 95 °C 15 minuta, 400 okretaja u minuti.
6. Druga sonikacija
   Ponovite sonikaciju na VialTweeteru koristeći iste postavke (kao gore) za dodatnih 10 ciklusa (ukupno 15 minuta).
7. Bistrenje lizata
   1. Centrifugirajte uzorke na 13 000 × g 10 minuta na 23°C (sobna temperatura).
   2. Pažljivo sakupite supernatant u novu Safe-lock Eppendorf epruvetu od 2,0 ml. Izbjegavajte ometanje peleta.
8. Nizvodna obrada
   Lizat je sada spreman za SP3 čišćenje i enzimatsku probavu.

Bilješke i najbolji primjeri iz prakse

1. Rizik od pregrijavanja tijekom ultrazvuka ublažen je programiranim ciklusima UKLJUČIVANJE/ISKLJUČIVANJE.
2. Izbjegavajte vorteksiranje nakon sonikacije kako biste spriječili agregaciju proteina.

Zbrinjavanje otpada i sigurnost

Donja tablica daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja laboratorijske veličine: