Protokol za primjenu Hielscher sonikatora za više uzoraka u analizi biofilmova i proteomskoj analizi

Upotreba sonikatora za više uzoraka, kao što su VialTweeter Multi-Tube Sonicator i UIP400MTP Microplate Sonicator, pojednostavljuje laboratorijske radne postupke u primjenama s velikim kapacitetom obrade uzoraka. Oba uređaja omogućuju preciznu i ujednačenu ultrazvučnu obradu više uzoraka, smanjujući varijabilnost i poboljšavajući ponovljivost. To je osobito korisno u eksperimentima koji zahtijevaju ujednačenu lizu uzoraka, odvajanje biofilma, ekstrakciju proteina ili proteolitičku razgradnju, pri čemu su ručne metode ili metode obrade pojedinačnih uzoraka manje učinkovite i podložne neujednačenosti.

Pojednostavite radne postupke sonikatorima za više uzoraka

UIP400MTP, primjerice, omogućuje istodobnu ultrazvučnu obradu jažica mikrotitarske ploče, osiguravajući ujednačeno odvajanje biofilmova ili staničnog materijala. VialTweeter pak omogućuje preciznu lizu i homogenizaciju više uzoraka u epruvetama bez unakrsne kontaminacije. Ovi sonikatori znatno skraćuju vrijeme obrade, poboljšavaju ponovljivost eksperimenata i održavaju visok integritet uzoraka, što ih čini nezamjenjivim alatima u mikrobiološkim, proteomskim i molekularnobiološkim istraživanjima.
U nastavku je detaljan protokol koji prikazuje primjenu Hielscher modela sonikatora za više uzoraka, VialTweeter Multi-Tube Sonicator i Microplate Sonicator UIP400MTP, u istraživanju stvaranja biofilma bakterije E. coli i naknadne proteomske analize.

Protokol: stvaranje i odvajanje biofilma te proteomska analiza primjenom Hielscher sonikatora za više uzoraka

1. Priprema bakterijske kulture

• Uzgajajte bakterije E. coli (soj W3110) na 30°C, temperaturi pogodnoj za stvaranje biofilma bakterije E. coli, u hranjivoj podlozi s triptonskim bujonom (TB) koja sadrži:
  – 10 g/L triptona
  – 5 g/L NaCl
• Prema potrebi dodajte antibiotike kako biste osigurali zadržavanje plazmida.
• Za mikroskopiju i istraživanja aktivnosti promotora upotrijebite soj E. coli W3110 s genomskim reporterskim genom za poboljšani GFP (eGFP) pod kontrolom promotora rplL.
• Upotrijebite reporterske plazmide s GFP-om za različite promotore (npr., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) za mjerenje aktivnosti promotora.

2. Uzgoj i odvajanje biofilma

• U svaku jažicu ploče s 12 jažica (CellStar ploče s 12 jažica, Greiner Bio-One) nacijepite 1,5 mL razrijeđene bakterijske kulture.
• Inkubirajte kako biste omogućili stvaranje biofilma.
• Pažljivo uklonite planktonsku (neprianjajuću) kulturu.

– Isperite svaku jažicu s 500 µL PBS-a.
– Odvojite pričvršćene stanice sonikacijom ploče s 12 jažica u sonikatoru za mikrotitarske ploče UIP400MTP. UIP400MTP osigurava ujednačeno odvajanje dovodeći ujednačenu ultrazvučnu energiju u sve jažice.
– Postavke sonikacije: amplituda 60%, ciklički način rada: 60 sec UKLJUČENO / 30 sec ISKLJUČENO.

3. Prikupljanje i liza stanica

• Centrifugirajte odvojene stanice biofilma pri 4.500 g tijekom 5 minuta.
• Isperite istaložene stanice PBS-om.
• Resuspendirajte stanice u 100 µL 2% natrijeva lauroil sarkozinata (SLS) i inkubirajte na 95°C tijekom 15 minuta.
• Provedite sonikaciju uređajem VialTweeter Multi-Tube Sonicator kako biste osigurali potpunu lizu stanica.
  – Postavke sonikacije: amplituda 100%, 50 s UKLJUČENO / 10 s ISKLJUČENO tijekom ukupnog vremena rada od 10 min; držite uzorke na ledu.

4. Redukcija i alkilacija

• Dodajte 5 mM tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP) za redukciju disulfidnih veza i inkubirajte na 95°C tijekom 15 minuta.
• Alkilirajte proteine s 10 mM jodoacetamida tijekom 30 minuta na 25°C.

5. Kvantifikacija i razgradnja proteina

• Centrifugirajte lizate kako biste uklonili ostatke.
• Kvantificirajte ukupni sadržaj proteina kompletom Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Razgradite 50 µg ukupnih proteina s 1 µg tripsina u otopini koja sadrži 2% SLS-a i 100 mM amonijeva hidrogenkarbonata.
• Inkubirajte reakcijsku smjesu za razgradnju preko noći na 30°C.

6. Pročišćavanje peptida

• Istaložite SLS dodavanjem 1,5% trifluoroctene kiseline (TFA), a zatim centrifugirajte.
• Pročistite peptide pomoću mikrocentrifugalnih kolona C18.
• Osušite pročišćene peptide i resuspendirajte ih u 0,1% TFA.

7. Tekućinska kromatografija – masena spektrometrija (LC-MS/MS)

• Analizirajte peptide na masenom spektrometru Q-Exactive Plus spojenom sa sustavom Ultimate 3000 RSLC nano.
• Razdvojite peptide pomoću HPLC kolone s obrnutom fazom (75 µm × 42 cm) napunjene smolom C18 (2,4 µm).
• Primijenite gradijent od 2% do 35% otapala B (acetonitril s 0,15% mravlje kiseline) tijekom 140 minuta.
• Prikupite podatke MS snimanjima visoke razlučivosti, nakon kojih slijede tandemska MS/MS snimanja 10 iona najvećeg intenziteta.

8. Analiza podataka

• Obradite sirove LC-MS podatke softverom Progenesis.
• Izvezite datoteke .mgf i analizirajte ih pomoću MASCOT-a.
• Provedite kvantifikaciju peptida pomoću SafeQuant-a radi kontrole kvalitete i korekcije lažnih otkrića.
• Provedite sve eksperimente u dva ili tri ponavljanja kako biste osigurali ponovljivost.

Sonikatori za više uzoraka za pripremu uzoraka uz velik kapacitet obrade

Modeli sonikatora za više uzoraka VialTweeter i UIP400MTP znatno poboljšavaju preciznost i učinkovitost eksperimentalnih radnih postupaka, osobito u istraživanju biofilmova i proteomici. Njihova sposobnost ujednačene obrade više uzoraka osigurava velik kapacitet obrade bez narušavanja kvalitete podataka. Te prednosti, u kombinaciji s prethodno opisanim pojednostavljenim radnim postupcima, čine Hielscher sonikatore za više uzoraka ključnim alatima za suvremena biološka istraživanja.

Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj

Hielscher ultrazvučni uređaji poznati su po najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Hielscher ultrazvučni uređaji lako se nose s teškim uvjetima i zahtjevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics je tvrtka s ISO certifikatom koja poseban naglasak stavlja na ultrazvučne uređaje visokih performansi s najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnom upotrebom. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji sukladni su zahtjevima oznake CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.