Protokol koji koristi Hielscher sonikatore s više uzoraka u analizi biofilma i proteoma

Korištenje sonikatora za više uzoraka, kao što je VialTweeter Multi-Tube sonicator i UIP400MTP Microplate sonicator, pojednostavljuje laboratorijske radne tijekove za aplikacije visoke propusnosti. Oba uređaja omogućuju preciznu i ujednačenu ultrazvučnu obradu više uzoraka, smanjujući varijabilnost i povećavajući ponovljivost. Ovo je osobito korisno u eksperimentima koji zahtijevaju dosljednu lizu uzorka, odvajanje biofilma, ekstrakciju proteina ili proteolitičku probavu, gdje su ručne metode ili metode s jednim uzorkom manje učinkovite i sklone nedosljednosti.

Pojednostavite tijekove rada s sonikatorima s više uzoraka

UIP400MTP, na primjer, omogućuje istodobnu ultrazvučnu obradu jažica mikropločica, osiguravajući ravnomjerno odvajanje biofilmova ili staničnog materijala. U međuvremenu, VialTweeter nudi preciznu lizu i homogenizaciju višestrukih uzoraka iz epruvete bez unakrsne kontaminacije. Ovi sonikatori značajno skraćuju vrijeme obrade, poboljšavaju eksperimentalnu ponovljivost i održavaju visoku cjelovitost uzorka, što ih čini nezamjenjivim alatima u istraživanju mikrobiologije, proteomike i molekularne biologije.
U nastavku se nalazi detaljan protokol koji ilustrira upotrebu Hielscherovih modela sonikatora s više uzoraka, VialTweeter sonikatora s više cijevi i sonikatora za mikroploču UIP400MTP, u studiji koja uključuje stvaranje biofilma E. coli i naknadnu proteomsku analizu.

Protokol: Formiranje biofilma, odvajanje i proteomska analiza pomoću Hielscher sonikatora s više uzoraka

1. Priprema bakterijske kulture

• Kultura bakterija E. coli (soj W3110) na 30°C, temperatura povoljna za stvaranje biofilma E. coli, u mediju triptonske juhe (TB) koji sadrži:
  – 10 g/L triptona
  – 5 g/L NaCl
• Dodatak antibioticima prema potrebi kako bi se osiguralo zadržavanje plazmida.
• Za mikroskopiju i studije aktivnosti promotora, koristite soj W3110 E. coli s genomski poboljšanim GFP (eGFP) reporterom pod kontrolom rplL promotora.
• Koristite GFP reporterske plazmide za razne promotore (npr. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) za mjerenje aktivnosti promotora.

2. Uzgoj i odvajanje biofilma

• Posijte 1,5 mL razrijeđene bakterijske kulture po jažici u ploču s 12 jažica (CellStar ploče s 12 jažica, Greiner Bio-One).
• Inkubirajte kako biste omogućili stvaranje biofilma.
• Pažljivo uklonite planktonsku (neprianjajuću) kulturu.

– Isperite svaku jažicu s 500 µL PBS-a.
– Odvojite pričvršćene stanice sonikacijom ploče s 12 jažica u sonikatoru mikroploča UIP400MTP. UIP400MTP osigurava ravnomjerno odvajanje isporukom konzistentne ultrazvučne energije u svim jažicama.
– Postavke ultrazvuka: amplituda od 60%, način ciklusa: 60 sekundi UKLJUČENO / 30 sekundi isključeno.

3. Sakupljanje stanica i liza

• Centrifugirajte odvojene stanice biofilma na 4500 g 5 minuta.
• Isperite peletirane stanice s PBS-om.
• Resuspendirajte stanice u 100 µL 2% natrijevog lauroil sarkozinata (SLS) i inkubirajte na 95°C 15 minuta.
• Sonicirajte pomoću VialTweeter Multi-Tube sonicatora kako biste osigurali potpunu lizu stanica.
  – Postavke sonikacije: 100% amplituda, 50 s UKLJUČENO / 10 s ISKLJUČENO za 10 min ukupnog vremena rada; čuvati uzorke na ledu.

4. Redukcija i alkilacija

• Dodajte 5 mM Tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP) za smanjenje disulfidnih veza i inkubirajte na 95°C 15 minuta.
• Alkilatirajte proteine s 10 mM jodoacetamidom 30 minuta na 25°C.

5. Kvantifikacija i probava proteina

• Centrifugirajte lizate da očistite ostatke.
• Kvantificirajte ukupni sadržaj proteina koristeći Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Probavite 50 µg ukupnog proteina s 1 µg tripsina u otopini koja sadrži 2% SLS-a i 100 mM amonijevog bikarbonata.
• Inkubirajte reakciju probave preko noći na 30°C.

6. Pročišćavanje peptida

• Precipitirajte SLS dodavanjem 1,5% trifluorooctene kiseline (TFA), zatim centrifugirajte.
• Pročistite peptide koristeći C18 mikrospin kolone.
• Osušiti pročišćene peptide i resuspendirati u 0,1% TFA.

7. Tekuća kromatografija-masena spektrometrija (LC-MS/MS)

• Analizirajte peptide na Q-Exactive Plus masenom spektrometru spojenom s Ultimate 3000 RSLC nano sustavom.
• Odvojite peptide pomoću HPLC kolone reverzne faze (75 µm × 42 cm) napunjene smolom C18 (2,4 µm).
• Nanesite gradijent od 2% do 35% otapala B (acetonitril s 0,15% mravlje kiseline) tijekom 140 minuta.
• Prikupite podatke korištenjem MS skeniranja visoke razlučivosti nakon kojih slijede tandem MS/MS skeniranja 10 najintenzivnijih iona.

8. Analiza podataka

• Obradite neobrađene LC-MS podatke pomoću softvera Progenesis.
• Izvezite .mgf datoteke i analizirajte ih pomoću MASCOT-a.
• Izvršite kvantifikaciju peptida pomoću SafeQuant za kontrolu kvalitete i prilagodbu lažnog otkrića.
• Provedite sve pokuse u duplikatu ili triplikatu kako biste osigurali ponovljivost.

Sonikatori s više uzoraka za pripremu uzoraka visoke učinkovitosti

Modeli sonikatora za više uzoraka VialTweeter i UIP400MTP značajno poboljšavaju preciznost i učinkovitost eksperimentalnih radnih procesa, posebno u istraživanju biofilma i proteomici. Njihova sposobnost jednolike obrade više uzoraka osigurava visoku propusnost bez ugrožavanja kvalitete podataka. Ove prednosti, u kombinaciji s gore navedenim pojednostavljenim tijekovima rada, čine Hielscher sonikatore za više uzoraka bitnim alatima za moderna biološka istraživanja.

Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – Kvaliteta Proizvedeno u Njemačkoj

Hielscher ultrasonicators su poznati po svojim najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavan rad omogućuju glatku integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijske objekte. Teški uvjeti i zahtjevna okruženja lako se nose s Hielscher ultrasonicators.

Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana tvrtka i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne uređaje visokih performansi koji sadrže najsuvremeniju tehnologiju i jednostavnu su za korištenje. Naravno, Hielscher ultrasonicators sukladni su CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.