Ultrazvučna dezagregacija stanica u bakterijskim uzorcima
Bakterijski uzorci rijetko dolaze kao prave suspenzije pojedinačnih stanica. Kulture rastu u lancima i flokulama, izolati iz okoliša tvore agregate povezane izvanstaničnim polimernim tvarima, a centrifugirani talozi često se teško resuspendiraju unatoč temeljitom miješanju na vorteksu. Određivanje broja vijabilnih stanica, optička gustoća, protočna citometrija i profiliranje mikrobioma podrazumijevaju da jedna čestica odgovara jednoj stanici. Ultrazvučna dezagregacija stanica rješava taj nesklad: kratki, kontrolirani impulsi sonikacije razdvajaju agregate na pojedinačne stanice bez njihove lize.
Zašto agregacija stanica narušava vaše rezultate
Agregacija je biološko svojstvo, a ne pogreška pri pripremi. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces i mnoge vrste iz okoliša rastu u lancima, nakupinama ili fragmentima biofilma, a izvanstanična DNA i polisaharidi sljepljuju stanice u talozima i eluatima brisova. Analitičke posljedice sustavne su:
- Broj kolonija podcjenjuje se jer jedna nakupina stvara jednu koloniju bez obzira na to koliko stanica sadržava.
- Mjerenja optičke gustoće i brojači čestica bilježe agregate umjesto stanica, što iskrivljuje krivulje rasta.
- Protočna citometrija i sortiranje stanica pogrešno broje događaje koji odgovaraju nakupinama stanica i isključuju ih iz analize.
- Ekstrakcije DNA i proteina odražavaju samo stanice na površini agregata, što iskrivljuje podatke o mikrobiomu i podatke omičkih analiza.
Konvencionalni postupci spori su, nepotpuni ili uzrokuju kemijske promjene. Snažno pipetiranje i miješanje na vorteksu ostavljaju mikroagregate. Enzimsko dispergiranje ili dispergiranje kelatorima mijenja površinu stanica koju možda namjeravate analizirati. Mehanička dezagregacija kontroliranom kavitacijom djeluje u nekoliko sekundi i ne zahtijeva dodatke.
Jedan agregat odgovara jednoj koloniji – i jednom pogrešnom rezultatu. Pogledajte kako ultrazvučna dezagregacija stvara prave suspenzije pojedinačnih stanica bez lize, aerosola ili rukovanja sondom. Zatražite više informacija!
Sonikator za više epruveta VialTweeter za beskontaktnu pripremu uzoraka: razdvojite nakupine stanica u zatvorenim epruvetama
Kako sonikacija razdvaja agregate stanica bez njihove lize
Ultrazvučna dezagregacija stanica iskorištava razliku u mehaničkoj čvrstoći. Bakterijske agregate na okupu drže relativno slabe međustanične veze i izvanstanični matriks, dok neoštećena stanična ovojnica podnosi znatno veća smična naprezanja. Kada kalibrirani ultrazvuk uđe u suspenziju, akustična kavitacija stvara mikrostrujanja, tlačne impulse i smične sile koje najprije djeluju na dodirnim površinama agregata. Nakupine, lanci i fragmenti biofilma razdvajaju se smičnim djelovanjem (deaglomeracija) prije nego što se dosegne razina energije pri kojoj membrane pucaju (liza).
Ultrazvučna dezagregacija nakupina bakterijskih stanica
Dezagregacija ili liza – kako utječu parametri sonikacije
Praktična je posljedica toga da se dezagregacija i liza provode istim uređajem uz različite parametre rada. Pri umjerenoj amplitudi, kratkim impulsnim ciklusima i kontroliranoj temperaturi dobivate suspenziju pojedinačnih vijabilnih stanica. Povećanje amplitude, vremena izlaganja ili temperature uzorka usmjerava proces prema potpunom razaranju stanica radi dobivanja unutarstaničnih ciljnih sastavnica. Generatori Hielscher omogućuju precizno postavljanje amplitude, snage, impulsa i unosa energije te spremanje metode, pa je korak dezagregacije ponovljiv među uzorcima, rukovateljima i ciklusima obrade.
Učinkovita beskontaktna sonikacija
Sonikacija u kupelji ne može pružiti takvu kontrolu. Ultrazvučne kupelji i spremnici za čišćenje daju samo nisku ultrazvučnu energiju, što dovodi do nepotpune pripreme, a kavitacija se javlja neujednačeno, pa se svaka epruveta obrađuje ovisno o svojem položaju u kupelji. VialTweeter prenosi intenzivne, fokusirane ultrazvučne sile izravno kroz stijenku posude u do 10 zatvorenih uzoraka istodobno. Obrade koje u kupelji zahtijevaju dugo izlaganje promjenjivog trajanja provode se standardiziranim slijedom impulsa.
Hielscher beskontaktni sonikatori primjenjuju intenzivan, fokusiran ultrazvuk kroz stijenke zatvorenih bočica. VialTweeter istodobno obrađuje do 10 bočica jednakim intenzitetom, bez sonde u uzorku, bez unakrsne kontaminacije i bez oslobađanja aerosola. Kada to zahtijeva kapacitet obrade uzoraka, sonikatori za mikroploče UIP400MTP i UIP550MTP omogućuju isti kontrolirani prijenos energije i na pločama s više jažica.
VialTweeter istodobno sonicira do 10 manjih bočica i do 5 većih epruveta.
Prednosti beskontaktne ultrazvučne disagregacije
- Bez unakrsne kontaminacije: Budući da bočice ostaju trajno zatvorene i nijedna sonda nije uronjena u uzorak, unakrsna kontaminacija i gubitak uzorka potpuno su izbjegnuti. Između uzoraka ništa ne treba sterilizirati, a jedan ciklus obrade ne može utjecati na sljedeći.
- Zaštita od aerosola: Sonikacija sondom u otvorenoj posudi stvara infektivne aerosole i kontaminira površine instrumenta. Sonikacija u zatvorenim bočicama zadržava uzorak unutar njegove epruvete, što je važno pri rukovanju patogenim bakterijama kao što je Mycobacterium tuberculosis i drugim biološkim agensima razine BSL-2 ili BSL-3.
- Bez erozije vrha: Titanske sonde tijekom rada mogu otpuštati malu količinu mikročestica u uzorak. Te čestice mijenjaju optičku gustoću i broj čestica u daljnjoj analizi. Neizravna sonikacija kroz stijenku posude potpuno uklanja taj izvor čvrstih čestica.
- Ujednačen kapacitet obrade uzoraka: VialTweeter svakoj od do 10 bočica isporučuje ultrazvuk jednakog intenziteta, pa su rezultati sonikacije ujednačeni i ponovljivi. Nestaju učinci položaja koji otežavaju rad s kupeljima i sondama za pojedinačne uzorke, a početne vrijednosti ostaju usporedive među replikatima.
- Integritet uzorka: Epruvete ostaju zatvorene tijekom cijele obrade, pa se uzorak ne može kontaminirati, pokvariti ni ispariti. Mali volumeni mogu se obrađivati bez razrjeđivanja, uključujući dragocjene kliničke taloge koji ne dopuštaju dodatan korak prijenosa.
- Kontrola procesa: Amplituda je podesiva od 20 do 100%, impulsni način rada od 0 do 100%, a sustavi podržavaju praćenje temperature kako bi termosenzibilni sojevi i proteini ostali ispod pragova pri kojima dolazi do oštećenja.
Tipične primjene
- Analiza mikrobioma i crijevnog sadržaja: dispergiranje bakterija rodova Lactobacillus i Bifidobacterium te fekalnih uzoraka prije nasađivanja na ploče ili sekvenciranja, kako nakupine ne bi dovele do podcjenjivanja broja stanica.
- Mikrobiologija hrane i vode: disagregacija flokula u brisevima, tekućinama za ispiranje i bujonima za obogaćivanje radi točnog određivanja broja kolonija i vijabilnosti.
- Istraživanje biofilmova: izdvajanje stanica s nosača i površina u obliku suspenzija pojedinačnih stanica, bez enzimske obrade kojom bi se uklonili površinski proteini.
- Klinička dijagnostika: resuspendiranje sputuma, gnoja i eluata briseva u uvjetima biološkog zadržavanja.
- Stanična kultura: razdvajanje slijepljenih agregata stanica sisavaca, kukaca i CHO stanica prije brojanja i pasažiranja.
- Priprema za cjelokupan radni postupak: isti instrument koji provodi disagregaciju pri niskoj amplitudi pri višim postavkama provodi potpuno razaranje stanica, pa liza, ekstrakcija proteina i fragmentacija DNA slijede bez prijenosa između epruveta.
Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP za deaglomeraciju staničnih nakupina uz velik kapacitet obrade uzoraka
Osim ploča s više jažica, modeli sonikatora za mikroploče UIP400MTP i UIP550MTP obrađuju i stalke s epruvetama.
Pronađite odgovarajući sonikator za svoj postupak disagregacije
Sonikator VialTweeter za više epruveta
Metoda izbora za sterilnu dezagregaciju u zatvorenim bočicama. Pokretan procesorom UP200St snage 200 vata pri 26 kHz s automatskim ugađanjem, VialTweeter prenosi ultrazvuk neizravno kroz stijenke do 10 zatvorenih bočica istodobno, uz do 10 W po epruveti, za ujednačene i ponovljive rezultate bez unakrsne kontaminacije i gubitka uzorka. Titanijska sonotroda VialTweeter može se autoklavirati, a postavke amplitude i pulsiranja mogu se prilagođavati i spremati, čime se osigurava raspon upravljanja potreban za protokol deaglomeracije. Standardna sonotroda s 10 položaja prima bočice za automatsko uzorkovanje, mikrocentrifugalne epruvete te epruvete Eppendorf ili Nunc volumena od 1 do 5 mL. Stezni uređaj VialPress prihvaća do 5 većih posuda promjera do 20 mm.
Namjenski modeli VialTweeter za jednu epruvetu dostupni su za epruvete Falcon te za pojedinačne bočice, uz prilagodbu veličini posude. Uklonite blok-sonotrodu i osnovna jedinica UP200St radi kao konvencionalni sonikator sa sondom za izravnu obradu uzoraka malog do srednjeg volumena.
Sonikatori za mikroploče
Povećajte kapacitet pripreme uzoraka sonikacijom ploča s više jažica: u radnim postupcima s pločama sonikatori za mikroploče UIP400MTP i UIP550MTP proširuju beskontaktnu, ujednačenu sonikaciju s deset epruveta na cijelu ploču.
UIP400MTP snage 400 vata obrađuje standardne mikrotitarske ploče i ploče s više jažica, uključujući formate s 96 jažica, uz precizno upravljanje amplitudom, snagom i pulsiranjem te vremenski programator, temperaturnu sondu i hlađenje vodenom kupelji. Odvajanje biofilma i obrada bakterijskih kultura ustaljene su primjene sonikatora za mikroploče UIP400MTP.
UIP550MTP snage 550 vata snažnija je opcija – idealna za zahtjevnije primjene.
Oba sustava za beskontaktnu sonikaciju pouzdano obrađuju ploče sa 6, 12, 24, 48, 96 i 384 jažice, kao i stalke s epruvetama i Petrijeve zdjelice. Hielscher sonikatori za mikroploče rade s bilo kojom standardnom pločom, čime se izbjegava potreba za skupim potrošnim materijalom specifičnim za proizvođača. Uz programabilne temperaturne granice, sonikacija se automatski zaustavlja pri najvećoj dopuštenoj temperaturi uzorka i nastavlja nakon hlađenja, čuvajući vijabilnost tijekom ponovljenih ciklusa. Pametna i pouzdana priprema velikog broja uzoraka za ponovljive rezultate.
Tablica u nastavku daje pregled približnog kapaciteta obrade naših laboratorijskih sonikatora za uzorke koji se upotrebljavaju u znanostima o životu, genomici, proteomici i dijagnostici:
| Preporučeni uređaji | Volumen šarže | Protok |
|---|---|---|
| Sonikator za više epruveta VialTweeter | bočice od 0,5 do 1,5mL | nije primjenjivo |
| Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP (440 vata) | ploče s više jažica / mikrotitarske ploče | nije primjenjivo |
| Sonikator za ploče s više jažica UIP550MTP (550 vata) | ploče s više jažica / mikrotitarske ploče | nije primjenjivo |
| Ultrazvučni CupHorn | CupHorn za bočice ili laboratorijsku čašu | nije primjenjivo |
| Sonikator sa sondom UP100H snage 100 vata | 1 do 500mL | 10 do 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St modeli sonikatora sa sondom snage 200 vata | 10 do 1000mL | 20 do 200mL/min |
| Sonikator sa sondom UP400St snage 400 vata | 10 do 2000mL | 20 do 400mL/min |
| GDmini2 | sterilni ultrazvučni mikroprotočni reaktor | nije primjenjivo |
| Ultrazvučni tresač sita | nije primjenjivo | nije primjenjivo |
Često postavljana pitanja o ultrazvučnoj dezagregaciji stanica
Koja je razlika između dezagregacije stanica i lize stanica?
Dezagregacija, koja se naziva i deaglomeracijom, razdvaja slijepljene stanice u suspenziju pojedinačnih stanica, pri čemu stanice ostaju neoštećene i vijabilne. Liza razara staničnu ovojnicu i oslobađa unutarstanični sadržaj. Oba procesa pokreću smične sile nastale kavitacijom, a razlika je u unosu energije. Uz optimizirane postavke amplitude, pulsiranja i temperature, sonikacijom se postiže dezagregacija ispod praga lize.
Zašto ultrazvučne kupelji nisu prikladne za standardiziranu dezagregaciju?
Kupelji osiguravaju samo nisku ultrazvučnu energiju, što dovodi do nepotpune pripreme, a kavitacija se razvija vrlo neravnomjerno unutar spremnika, pa se svaki uzorak obrađuje drukčije ovisno o svojem položaju. Mikrobiološko određivanje broja stanica i usporedna istraživanja ovise o usporedivosti. Beskontaktni sonikatori poput sonikatora za više epruveta VialTweeter te modela sonikatora za mikroploče UIP400MTP i UIP550MTP obrađuju sve posude u prilagođenim ultrazvučnim uvjetima, čime se poboljšava ponovljivost među replikatima.
Može li sonikacija oštetiti stanice?
Da, ako parametri nisu pod kontrolom. Prekomjerna sonikacija ili nekontrolirano zagrijavanje mogu oštetiti stanice, a oslobođena DNA čini uzorke viskoznima i potiče ponovnu agregaciju. Zato postupak treba pažljivo razviti: umjerena amplituda, pulsni ciklusi, hlađenje i instrumenti s ograničenjem temperature zadržavaju obradu na dijelu krivulje koji odgovara dezagregaciji.
Svi digitalni sonikatori Hielscher nude precizno podesive parametre, priključive temperaturne senzore, programabilne postavke i automatsko bilježenje podataka za pouzdanu pripremu uzoraka.
Treba li uzorak prenijeti u drugu posudu?
Ne. Bočice i ploče obrađuju se u izvornim, zatvorenim spremnicima. Neizravnom sonikacijom izbjegavaju se i gubitci pri prijenosu i prijenos ostataka uzorka povezan s rukovanjem sondom.
Koje formate bočica može obrađivati VialTweeter?
Standardna sonotroda s 10 položaja prihvaća bočice za automatske uzorkivače, mikrocentrifugalne epruvete te epruvete Eppendorf ili Nunc volumena od 1 do 5 mL. Dodatak VialPress prima do 5 većih posuda promjera do 20 mm. Namjenski modeli VialTweeter za jednu epruvetu dostupni su za epruvete Falcon te za prilagođene formate pojedinačnih bočica ili veće formate.
Mogu li jednim instrumentom provoditi dezagregaciju i lizu?
Da. Isti sustav koji pri umjerenoj amplitudi provodi dezagregaciju pri višoj amplitudi i duljem izlaganju provodi potpuno razaranje stanica, pa se priprema suspenzije pojedinačnih stanica i naknadna ekstrakcija mogu provoditi uzastopno bez promjene platforme.
Upotrebljava li se sonikacija u testovima MBEC?
Sonikacija je ustaljena i uglavnom standardna sastavnica. U testu MBEC s poklopcem s klinovima, nakon uzgoja biofilmova na polistirenskim klinovima i izlaganja antibiotiku, klinovi se prenose u svježi medij te se podvrgavaju vrtložnom miješanju i sonikaciji kako bi se prianjajuće stanice biofilma odvojile i dezagregirale u planktonsku suspenziju prije serijskog razrjeđivanja i određivanja broja živih stanica (MBEC se očitava kao najniža koncentracija koja smanjuje broj oporavljenih stanica za ≥3 log10 u odnosu na netretirani biofilm). Sonikacija znatno poboljšava kvalitetu disperzije: nepotpuno oslobađanje stanica ugrađenih u matriks EPS-a dovodi do podcjenjivanja eradikacije i precjenjivanja vrijednosti MBEC. Ciljana sonikacija jažica koje prihvaćaju klinove na pločama za testiranje pomoću sonikatora za mikroploče UIP400MTP prevladava tradicionalne slabosti sonikacije u kupelji – odnosno neravnomjernu raspodjelu energije, zagrijavanje i rizik od nastanka aerosola i unakrsne kontaminacije.
Saznajte kako beskontaktni sonikator za mikroploče UIP400MTP olakšava testove MBEC!
Upotrebljava li se sonikacija u testovima MIC?
Sonikacija se primjenjuje u različitim radnim postupcima povezanima s testovima MIC radi poboljšanja učinkovitosti i ponovljivosti:
- u mikobakteriologiji, gdje se sputum i drugi viskozni uzorci rutinski dekontaminiraju i homogeniziraju, ponekad uz sonikaciju, prije ispitivanja osjetljivosti, a kratkotrajna disperzija mikobakterijskih inokuluma koji stvaraju nakupine pridonosi točnom određivanju vrijednosti MIC;
- kod organizama sklonih agregaciji (npr. streptokoka i stafilokoka u talozima), kod kojih mikroagregati narušavaju gustoću inokuluma; i
- u kombiniranoj dijagnostici, poput uzgoja kulture iz tekućine dobivene sonikacijom implantata, nakon čega slijedi ispitivanje osjetljivosti kod infekcije zglobne proteze (primjena slična testu MBEC, a ne klasičnom testu MIC).
Literatura / reference
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Odaberite vlastitu ploču! Sonikator za mikroploče UIP550MTP dezagregira bakterijske uzorke u bilo kojoj standardnoj ploči s više jažica.
Modeli sonikatora Hielscher za više uzoraka UIP400MTP za mikroploče, VialTweeter i CupHorn: brza priprema velikog broja uzoraka