Protokol MBEC testa korištenjem sonikatora ploča s 96 jažica UIP400MTP

MBEC test koristi se za određivanje koncentracije antimikrobnih sredstava potrebnih za uklanjanje biofilmova formiranih na poklopcima klinova. Kako bi se procijenila održivost biofilma, biofilm se prvo mora odvojiti od poklopca klinova ploče s 96 jažica. Sonikacija je najpouzdanija i najučinkovitija metoda za ovo odvajanje. Sonikator ploča s više jažica UIP400MTP posebno je dizajniran za obradu testnih ploča s maksimalnom učinkovitošću i praktičnošću, usmjeravajući i ubrzavajući MBEC testove visoke propusnosti.

Sonikacija za odvajanje biofilma

Sonikacija je ključni korak u ispitivanju minimalne koncentracije eradikacije biofilma (MBEC), koji omogućuje učinkovito uklanjanje stanica biofilma s njihovog površinskog pričvršćenja. Biofilmovi su inherentno strukturirane zajednice mikroorganizama obavijenih izvanstaničnim matriksom, što ih čini znatno otpornijima na antimikrobna sredstva u usporedbi s planktonskim stanicama. Tijekom MBEC testova, sonikacija koristi ultrazvučne valove za stvaranje kontrolirane kavitacije, ometajući matricu biofilma i oslobađajući ugrađene stanice u suspenziju. Ovaj korak osigurava da su stanice biofilma ravnomjerno raspršene u mediju za obnavljanje, olakšavajući točne procjene održivosti putem nanošenja, razrjeđivanja ili spektrofotometrijskih metoda. Bez pravilnog odvajanja biofilma, preostale komponente matriksa mogle bi zaštititi stanice, što dovodi do podcjenjivanja antimikrobne učinkovitosti. Stoga je ultrazvuk nezamjenjiv za dobivanje pouzdanih i ponovljivih MBEC vrijednosti, koje odražavaju pravi eradikacijski potencijal testiranih sredstava. Sonikator ploča s više jažica UIP400MTP omogućuje jednostavnu pripremu uzorka visoke propusnosti u pločama za ispitivanje.

Protokol ispitivanja minimalne koncentracije eradikacije biofilma (MBEC).

Korak 1: Stvaranje biofilma

1. Pripremite bakterijsku suspenziju:
   Uzgoj bakterija u odgovarajućem mediju do rasta u logaritamskoj fazi.
   Razrijedite bakterijsku kulturu do definirane optičke gustoće (npr. OD600 ~0,1).
2. Inokulirajte ploču s 96 jažica:
   Dodajte bakterijsku suspenziju (npr. 150–200 µL) u svaku jažicu standardne mikrotitarske ploče s 96 jažica.
3. Pričvrstite poklopac klinova:
   Postavite poklopac klina na inokuliranu ploču kako biste omogućili stvaranje biofilma na površinama klina.
4. Inkubirajte ploču:
   Inkubirajte postavku na odgovarajućoj temperaturi (npr. 37°C) 24-48 sati bez mućkanja kako biste pospješili rast biofilma.

Korak 2: Liječenje antimikrobnim sredstvima

• Pripremite antimikrobne otopine:
  Pripremite raspon antimikrobnih koncentracija u svježem mediju.
  Izložite biofilm antimikrobnim agensima:
  Uklonite poklopac klina s bakterijske kulture i isperite ga u sterilnoj fiziološkoj otopini ili PBS-u kako biste uklonili planktonske stanice.
  Stavite poklopac klina u novu ploču s 96 jažica koja sadrži antimikrobne otopine.
• Inkubirajte ploču:
  Inkubirajte određeno razdoblje (npr. 24 sata) kako biste omogućili antimikrobno izlaganje.

Korak 3: Sonikacija s sonikatorom ploča s 96 jažica UIP400MTP

Korak sonikacije je kritičan za odvajanje biofilmova od poklopaca klinova za procjenu održivosti. Slijedite ove korake za sonikator UIP400MTP:

1. Pripremite postavku:
   Napunite svježu ploču s 96 jažica s medijem za obnavljanje (npr. neutralizirajuću juhu ili svježi medij za rast) u svaku jažicu.
2. Prijenos poklopca klinova:
   Uklonite poklopac klina s ploče za antimikrobnu obradu.
   Isperite poklopac klina u sterilnoj fiziološkoj otopini ili PBS-u kako biste uklonili ostatke antimikrobnih sredstava.
3. Postavite ploču i sonikator:
   Pričvrstite poklopac klina na ploču s medijem za oporavak.
   Postavite ploču s medijem za oporavak na platformu sonikatora UIP400MTP, pazeći da je ploča centrirana i stabilna.
4. Podesite parametre sonikacije:
   Postavite parametre sonikacije na UIP400MTP (Postavke se mogu prilagoditi biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Vrijeme sonikacije: 1–3 minute (prilagodite na temelju otpornosti biofilma) u ciklusu.
5. Sonicate:
   Pokrenite proces sonikacije. Ultrazvučna vibracija će istisnuti biofilmove s površina klinova u medij za obnavljanje.
6. Pratite proces:
   Upotrijebite priključni temperaturni senzor za praćenje temperature uzorka u jažicama. UIP400MTP može se spojiti na laboratorijski rashladni uređaj za hlađenje.
7. Rukovanje nakon sonikacije:
   Odmah premjestite medij za oporavak (koji sada sadrži odvojene biofilmove) u svježu sterilnu ploču za daljnju analizu.

(A) Ploča koja sadrži TSB s 2% glukoze koja se koristi za stvaranje biofilma, oporavak stanica i
određivanje MIC i MBCB; (B) Poklopac s iglama za stvaranje stafilokoknih biofilmova. određivanje MIC i MBCB; (B) Poklopac s iglama za stvaranje stafilokoknih biofilmova.
Stanice biofilma formirane na klinovima uklonjene su sonikacijom (Hielscher Ultrasound Technology) tijekom 5 minuta u pločama s 96 jažica koje sadrže svježi medij kulture za obnavljanje stanica.
(Slika i studija: ©de Oliveira et al., 2016.)

Korak 4: Procjena održivosti

Ploče i biofilmovi odvojeni od kulture:

1. Izvršite serijska razrjeđenja medija za obnavljanje i ploču na agaru kako biste izbrojali jedinice koje tvore kolonije (CFU).
   Alternativno, koristite kolorimetrijski ili fluorescentni test održivosti.
2. Rekordni rezultati:
   Odredite MBEC kao najnižu koncentraciju antimikrobika koja je iskorijenila detektabilnu održivost biofilma.

Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – Kvaliteta Proizvedeno u Njemačkoj

Hielscher ultrasonicators su poznati po svojim najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavan rad omogućuju glatku integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijske objekte. Teški uvjeti i zahtjevna okruženja lako se nose sa Hielscher sonikatorima.

Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana tvrtka i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne uređaje visokih performansi koji sadrže najsuvremeniju tehnologiju i jednostavnu su za korištenje. Naravno, Hielscher ultrasonicators sukladni su CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Ovdje pročitajte kako se UIP400MTP koristi za odvajanje biofilma kao korak pripreme uzorka tijekom ASTM E2799 protokola za ispitivanje učinkovitosti dezinficijensa protiv biofilma Pseudomonas aeruginosa pomoću MBEC testa.