Protokol MBEC testa s pomoću sonikatora za ploče s 96 jažica UIP400MTP

MBEC test služi za određivanje koncentracije antimikrobnih sredstava potrebne za uklanjanje biofilmova nastalih na poklopcima s klinovima. Za procjenu vijabilnosti biofilma biofilmove je najprije potrebno odvojiti od poklopaca s klinovima ploče s 96 jažica. Sonikacija je najpouzdanija i najučinkovitija metoda za to odvajanje. Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP posebno je osmišljen za obradu ploča za testiranje uz maksimalnu učinkovitost i praktičnost te pojednostavnjuje i ubrzava MBEC testove s velikim kapacitetom obrade.

Sonikacija za odvajanje biofilma

Sonikacija je ključan korak u testovima minimalne koncentracije za eradikaciju biofilma (MBEC) jer omogućuje učinkovito odvajanje stanica biofilma od površine na koju su pričvršćene. Biofilmovi su po svojoj prirodi strukturirane zajednice mikroorganizama obavijene izvanstaničnim matriksom, zbog čega su znatno otporniji na antimikrobna sredstva od planktonskih stanica. Tijekom MBEC testova sonikacijom se primjenjuju ultrazvučni valovi za stvaranje kontrolirane kavitacije, čime se razara matriks biofilma i oslobađaju stanice uklopljene u njemu u suspenziju. Taj korak osigurava ravnomjernu raspodjelu stanica biofilma u mediju za oporavak te olakšava točnu procjenu vijabilnosti metodama nasađivanja, razrjeđivanja ili spektrofotometrije. Bez pravilnog odvajanja biofilma preostale komponente matriksa mogle bi štititi stanice, što bi dovelo do podcjenjivanja učinkovitosti antimikrobnih sredstava. Stoga je sonikacija neophodna za dobivanje pouzdanih i ponovljivih vrijednosti MBEC-a koje odražavaju stvarni eradikacijski potencijal ispitivanih sredstava. Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP omogućuje jednostavnu pripremu uzoraka u pločama za testiranje uz velik kapacitet obrade.

Protokol testa minimalne koncentracije za eradikaciju biofilma (MBEC)

Korak 1: Stvaranje biofilma

1. Pripremite bakterijsku suspenziju:
   Uzgojite bakterije u odgovarajućim medijima do logaritamske faze rasta.
   Razrijedite bakterijsku kulturu do definirane optičke gustoće (npr. OD600 ~0,1).
2. Inokulirajte ploču s 96 jažica:
   Dodajte bakterijsku suspenziju (npr. 150–200 µL) u svaku jažicu standardne mikrotitarske ploče s 96 jažica.
3. Postavite poklopac s klinovima:
   Postavite poklopac s klinovima na inokuliranu ploču kako biste omogućili stvaranje biofilma na površinama klinova.
4. Inkubirajte ploču:
   Inkubirajte sustav na odgovarajućoj temperaturi (npr. 37°C) tijekom 24–48 sati bez protresanja kako biste potaknuli rast biofilma.

Korak 2: Obrada antimikrobnim sredstvima

• Pripremite antimikrobne otopine:
  Pripremite niz koncentracija antimikrobnih sredstava u svježim medijima.
  Izložite biofilmove antimikrobnim sredstvima:
  Uklonite poklopac s klinovima s bakterijske kulture i isperite ga sterilnom fiziološkom otopinom ili PBS-om kako biste uklonili planktonske stanice.
  Postavite poklopac s klinovima u novu ploču s 96 jažica koja sadržava antimikrobne otopine.
• Inkubirajte ploču:
  Inkubirajte tijekom definiranog razdoblja (npr. 24 sata) kako biste omogućili izlaganje antimikrobnim sredstvima.

Korak 3: Sonikacija sonikatorom za ploče s 96 jažica UIP400MTP

Korak sonikacije presudan je za odvajanje biofilmova od poklopaca s klinovima radi procjene vijabilnosti. Slijedite ove korake za sonikator UIP400MTP:

1. Pripremite sustav:
   Napunite svaku jažicu nove ploče s 96 jažica medijem za oporavak (npr. neutralizirajućim bujonom ili svježim medijem za rast).
2. Prenesite poklopac s klinovima:
   Uklonite poklopac s klinovima s ploče za obradu antimikrobnim sredstvima.
   Isperite poklopac s klinovima sterilnom fiziološkom otopinom ili PBS-om kako biste uklonili preostala antimikrobna sredstva.
3. Postavite ploču i sonikator:
   Postavite poklopac s klinovima na ploču s medijem za oporavak.
   Postavite ploču s medijem za oporavak na platformu sonikatora UIP400MTP te provjerite je li ploča centrirana i stabilna.
4. Prilagodite parametre sonikacije:
   Postavite parametre sonikacije na uređaju UIP400MTP (postavke se mogu prilagoditi biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Vrijeme sonikacije: 1–3 minute (prilagodite ovisno o otpornosti biofilma) u cikličkom načinu rada.
5. Sonicirajte:
   Pokrenite postupak sonikacije. Ultrazvučne vibracije odvojit će biofilmove od površina klinova i prenijeti ih u medij za oporavak.
6. Pratite postupak:
   Upotrijebite priključivi temperaturni senzor za praćenje temperature uzorka u jažicama. UIP400MTP može se priključiti na laboratorijski rashladni uređaj radi hlađenja.
7. Postupanje nakon sonikacije:
   Odmah prenesite medij za oporavak (koji sada sadržava odvojene biofilmove) u novu sterilnu ploču za daljnju analizu.

(A) Ploča koja sadržava TSB s 2% glukoze, upotrijebljena za stvaranje biofilma, oporavak stanica i
određivanje MIC-a i MBCB-a; (B) Poklopac s klinovima za stvaranje stafilokoknih biofilmova. određivanje MIC-a i MBCB-a; (B) Poklopac s klinovima za stvaranje stafilokoknih biofilmova.
Stanice biofilma nastale na klinovima odvojene su sonikacijom (Hielscher Ultrasound Technology) tijekom 5 min u pločama s 96 jažica koje su sadržavale svježi medij za uzgoj radi oporavka stanica.
(Slika i istraživanje: ©de Oliveira et al., 2016)

Korak 4: Procjena vijabilnosti

Nasadite i uzgojite odvojene biofilmove:

1. Provedite serijska razrjeđenja medija za oporavak i nasadite ih na agar radi određivanja broja jedinica koje tvore kolonije (CFU).
   Alternativno, upotrijebite kolorimetrijski test vijabilnosti ili test temeljen na fluorescenciji.
2. Zabilježite rezultate:
   Odredite MBEC kao najnižu koncentraciju antimikrobnog sredstva koja je uklonila svu mjerljivu vijabilnost biofilma.

Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj

Ultrazvučni uređaji Hielscher poznati su po najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju neometanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Sonikatori Hielscher lako podnose teške uvjete i zahtjevna okruženja.

Hielscher Ultrasonics tvrtka je s ISO certifikatom i poseban naglasak stavlja na ultrazvučne uređaje visokih performansi koji se odlikuju najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnošću uporabe. Naravno, ultrazvučni uređaji Hielscher sukladni su zahtjevima CE te ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Ovdje pročitajte kako se UIP400MTP upotrebljava za odvajanje biofilma kao korak pripreme uzoraka u protokolu ASTM E2799 za ispitivanje učinkovitosti dezinficijensa protiv biofilma bakterije Pseudomonas aeruginosa primjenom MBEC testa.