Protokol ispitivanja minimalne inhibitorne koncentracije (MIC).

Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) temeljene na biofilmu ključna je metoda za procjenu učinkovitosti antimikrobnih sredstava protiv mikroorganizama povezanih s biofilmom, koji pokazuju povećanu otpornost zbog svog zaštitnog izvanstaničnog matriksa. Ključni korak u ovom testu je prekid strukture biofilma kako bi se oslobodile ugrađene stanice radi točne procjene održivosti. UIP400MTP sonikator ploča s više jažica olakšava ovaj proces korištenjem fokusiranog ultrazvuka za stvaranje kontrolirane kavitacije, učinkovito odvajanje stanica biofilma i njihovo raspršivanje u jednoliku suspenziju. Ovaj precizan i ponovljiv poremećaj biofilma povećava pouzdanost i propusnost MIC testova, čineći UIP400MTP bitnim alatom u unaprjeđenju istraživanja biofilma.

Sonikacija za odvajanje biofilma

MIC test temeljen na biofilmu obično mjeri bakterijsku održivost ili inhibiciju rasta korištenjem metoda kao što su postavljanje na ploču, brojanje kolonija ili mjerenje optičke gustoće. Sonikacija je kritičan korak u MIC testovima koji se temelje na biofilmu kada se procjenjuje antimikrobna osjetljivost mikroorganizama povezanih s biofilmom. Njegova je primarna funkcija odvojiti i raspršiti stanice ugrađene u matricu biofilma u jednoličnu suspenziju za točnu analizu.
Biofilmovi su znatno otporniji na antimikrobna sredstva u usporedbi s planktonskim stanicama, zbog čega je pravilno odvajanje ključno za točnu analizu. Tijekom ovog procesa, ultrazvučni valovi stvaraju kontroliranu kavitaciju, razbijaju matricu biofilma i oslobađaju ugrađene stanice u jednoliku suspenziju unutar medija za oporavak. Ovaj korak omogućuje preciznu procjenu održivosti stanica raspršenih biofilmom putem metoda kao što su postavljanje na ploče, razrjeđivanje i brojanje kolonija. Pravilno razbijanje biofilma sonikacijom sprječava zaostale komponente matriksa da štite stanice, što bi inače moglo dovesti do podcjenjivanja antimikrobne aktivnosti. Sonikator ploča s više jažica UIP400MTP posebno je prikladan za ovu svrhu, nudeći precizne i ponovljive uvjete sonikacije kako bi se osigurala pouzdana i visokoučinkovita priprema ploča za ispitivanje.

Zašto je sonikacija neophodna u ispitivanjima minimalne inhibitorne koncentracije na bazi biofilma

Za mjerenja viabilnosti i brojanje stanica potrebno je potpuno i pouzdano odvajanje i disperzija pojedinačnih stanica. UIP400MTP potiče ravnomjerno, neoštećujuće odvajanje biofilma i disperziju stanica za robusne rezultate testa.

• Složenost biofilma: Biofilmovi su strukturirane mikrobne zajednice umotane u matricu izvanstanične polimerne tvari (EPS), koja štiti mikroorganizme i čini ih otpornijima na antimikrobna sredstva.
• Ujednačena disperzija: Kako bi se točno izmjerila održivost stanica ugrađenih u biofilm ili njihova osjetljivost na antimikrobna sredstva, biofilm se prvo mora ukloniti i razgraditi u homogenu suspenziju.

Protokol ispitivanja minimalne inhibitorne koncentracije temeljen na biofilmu

Određivanje minimalne inhibicijske koncentracije (MIC) određuje najnižu koncentraciju antimikrobnog sredstva koja je potrebna za inhibiciju vidljivog rasta mikroorganizama. Ovaj je protokol osmišljen za mikroorganizme povezane s biofilmom, koristeći sonikator ploče s više jažica UIP400MTP za razbijanje biofilma.

Korak 1: Priprema bakterijskog inokuluma

1. Pripremite bakterijsku suspenziju:
   Uzgoj bakterija u odgovarajućem mediju do srednje logaritamske faze.
   Razrijedite kulturu kako biste postigli standardiziranu gustoću stanica (npr. 0,5 McFarland standarda ili OD600 ~0,1).
2. Pripremite antimikrobne otopine:
   Razrijedite antimikrobno sredstvo u prikladnom mediju kako biste stvorili raspon koncentracija (npr. dvostruka serijska razrjeđenja).
3. Rasporedite u ploču s 96 jažica:
   Dodajte antimikrobne otopine u jažice standardne ploče s 96 jažica, s konačnim volumenom jažice od ~150–200 µL.
   Uključite kontrolu rasta (bez antimikrobnih sredstava) i kontrolu sterilnosti (bez bakterijskog inokuluma).

Korak 2: Stvaranje biofilma na poklopcu klina

• Pričvrstite poklopac klinova:
  Stavite specijalizirani poklopac klina na inokulirane jažice, pazeći da su klinovi potpuno uronjeni u bakterijsku suspenziju.
• Inkubirajte ploču:
  Inkubirajte na odgovarajućoj temperaturi (npr. 37°C) određeno vrijeme (npr. 24 sata) u statičkim uvjetima kako biste omogućili stvaranje biofilma na klinovima.

Korak 3: Antimikrobna izloženost

• Isperite klinove:
  Uklonite poklopac klina s bakterijske suspenzije i nježno isperite sterilnom fiziološkom otopinom ili PBS-om kako biste uklonili labavo pričvršćene planktonske stanice.
• Izlaganje antimikrobnim sredstvima:
  Premjestite poklopac klina u novu ploču s 96 jažica koja sadrži prethodno pripremljena antimikrobna razrjeđenja.
  Inkubirajte određeni period (npr. 24 sata) u statičkim uvjetima kako biste omogućili antimikrobnom sredstvu da djeluje na biofilmove.

Korak 4: Sonikacija s Microplate Sonicator UIP400MTP

Korak sonikacije je kritičan za odvajanje biofilmova od poklopaca klinova za procjenu održivosti. Slijedite ove korake za sonikator UIP400MTP:

1. Pripremite postavku:
   Napunite svježu ploču s 96 jažica s medijem za obnavljanje (npr. neutralizirajućim bujonom ili sterilnim medijem za rast) u svaku jažicu.
2. Prijenos poklopca klinova:
   Uklonite poklopac klina s ploče za antimikrobnu obradu.
   Isperite poklopac klina u sterilnoj fiziološkoj otopini ili PBS-u kako biste uklonili ostatke antimikrobnih sredstava.
3. Postavite ploču u sonikator:
   Pričvrstite poklopac klina na ploču s medijem za oporavak.
   Postavite ploču s medijem za oporavak u sonikator UIP400MTP, pazeći da ploča sjedi u sredini i da je stabilna kao što je opisano u priručniku.
4. Podesite parametre sonikacije:
   Postavite parametre sonikacije na UIP400MTP (postavke se mogu prilagoditi biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Vrijeme sonikacije: 1–3 minute (prilagodite na temelju strukture biofilma) u ciklusu.
5. Sonicate:
   Pokrenite proces sonikacije. Ultrazvučni valovi će poremetiti matricu biofilma i istisnuti stanice u medij za oporavak.
6. Pratite proces:
   Upotrijebite priključni temperaturni senzor za praćenje temperature uzorka u jažicama. UIP400MTP može se spojiti na laboratorijski rashladni uređaj za hlađenje.
7. Rukovanje nakon sonikacije:
   Odmah premjestite medij za oporavak koji sadrži odvojene biofilmove u svježu sterilnu ploču za naknadnu analizu.

(A) Ploča koja sadrži TSB s 2% glukoze koja se koristi za stvaranje biofilma, obnavljanje stanica i određivanje MIC i MBEC; (B) Poklopac s iglama za stvaranje stafilokoknih biofilmova.
Stanice biofilma formirane na klinovima uklonjene su sonikacijom (Hielscher Ultrasound Technology) tijekom 5 minuta u pločama s 96 jažica koje sadrže svježi medij kulture za obnavljanje stanica.
(Slika i studija: ©de Oliveira et al., 2016.)

Korak 4: Procjena održivosti

Ploče i biofilmovi odvojeni od kulture:

1. Izvršite serijska razrjeđenja medija za obnavljanje i ploču na agaru kako biste izbrojali jedinice koje tvore kolonije (CFU).
2. Procijenite MIC:
   Odredite MIC kao najnižu antimikrobnu koncentraciju koja potpuno inhibira vidljivi rast mikroba u mediju za obnavljanje.

MIC Minimalna inhibitorna koncentracija: Primjer mikrotitarske ploče i tumačenje rezultata mikrodilucije.
(Studija i slika: ©Jaskiewicz et al. 2019.)

Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – Kvaliteta Proizvedeno u Njemačkoj

Hielscher ultrasonicators su poznati po svojim najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavan rad omogućuju glatku integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijske objekte. Teški uvjeti i zahtjevna okruženja lako se nose sa Hielscher sonikatorima.

Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana tvrtka i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne uređaje visokih performansi koji sadrže najsuvremeniju tehnologiju i jednostavnu su za korištenje. Naravno, Hielscher ultrasonicators sukladni su CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Ovdje pročitajte kako se UIP400MTP koristi za odvajanje biofilma u ASTM E2799 protokolu – Ispitivanje učinkovitosti dezinficijensa protiv biofilma Pseudomonas aeruginosa pomoću MBEC testa.