Protokol ispitivanja minimalne inhibitorne koncentracije (MIC)

Ispitivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) na biofilmu ključna je metoda za procjenu učinkovitosti antimikrobnih sredstava protiv mikroorganizama povezanih s biofilmom, koji pokazuju povećanu otpornost zbog svojeg zaštitnog izvanstaničnog matriksa. Ključan korak u ovom ispitivanju jest odvajanje struktura biofilma kako bi se oslobodile uklopljene stanice radi točne procjene vijabilnosti. Sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP olakšava taj postupak primjenom fokusiranog ultrazvuka za stvaranje kontrolirane kavitacije, čime učinkovito odvaja stanice biofilma i dispergira ih u jednoliku suspenziju. Ovo precizno i ponovljivo razaranje biofilma povećava pouzdanost i kapacitet obrade uzoraka pri ispitivanjima MIC-a, što UIP400MTP čini ključnim alatom za unapređenje istraživanja biofilmova.

Zašto primjenjivati sonikaciju tijekom ispitivanja MIC-a?

• Točni, ponovljivi podaci: Dobijte jednolike stanične suspenzije koje uklanjaju zaštitni učinak matriksa, osiguravajući da vaši rezultati brojanja kolonija i očitanja optičke gustoće doista odražavaju antimikrobnu učinkovitost.
• Učinkovitost uz velik kapacitet obrade uzoraka: Istodobno obradite cijelu pločicu s 96 jažica u samo 1–3 minute, zamjenjujući sporo, neujednačeno ručno struganje pojednostavljenim radnim postupkom.
• Očuvana vijabilnost stanica: Nježno odvojite uklopljene stanice bez fizičkih oštećenja uzrokovanih struganjem, održavajući veće stope preživljavanja radi pouzdanih izračuna MIC-a/MBEC-a.
• Nulti rizik od unakrsne kontaminacije: Iskoristite prednosti beskontaktne izvedbe s čašastim ultrazvučnim nastavkom koja jednoliko obrađuje sve jažice, bez dodirivanja pojedinačnih uzoraka ili jažica sondama.
• Usklađenost s normama: Uskladite svoju metodologiju s validiranim industrijskim protokolima kao što je ASTM E2799-22, čime vaši podaci dobivaju veću vjerodostojnost za regulatorne potrebe ili objavljivanje.
• Pouzdano probirno ispitivanje lijekova i terapija: Oslonite se na svoje rezultate ispitivanja osjetljivosti kako biste donosili bolje odluke o antimikrobnoj učinkovitosti, profiliranju otpornosti ili razvoju terapija.

Sonikacija za odvajanje biofilma

Ispitivanjem MIC-a na biofilmu obično se mjeri vijabilnost bakterija ili inhibicija rasta metodama kao što su nasađivanje na podlogu, brojanje kolonija ili mjerenje optičke gustoće. Sonikacija je ključan korak u ispitivanjima MIC-a na biofilmu pri procjeni osjetljivosti mikroorganizama povezanih s biofilmom na antimikrobna sredstva. Njezina je primarna funkcija odvajanje i dispergiranje stanica uklopljenih u matriks biofilma u jednoliku suspenziju radi točne analize.
Biofilmovi su znatno otporniji na antimikrobna sredstva od planktonskih stanica, zbog čega je pravilno odvajanje ključno za točnu analizu. Tijekom ovog postupka ultrazvučni valovi stvaraju kontroliranu kavitaciju, razarajući matriks biofilma i oslobađajući uklopljene stanice u jednoliku suspenziju u mediju za oporavak. Ovaj korak omogućuje preciznu procjenu vijabilnosti stanica dispergiranih iz biofilma metodama kao što su nasađivanje na podlogu, razrjeđivanje i brojanje kolonija. Pravilno razaranje biofilma sonikacijom sprječava zaštitno djelovanje preostalih sastavnica matriksa na stanice, koje bi inače moglo dovesti do podcjenjivanja antimikrobne aktivnosti. Sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP osobito je prikladan za ovu namjenu jer pruža precizne i ponovljive uvjete sonikacije koji osiguravaju pouzdanu pripremu pločica za ispitivanje uz velik kapacitet obrade uzoraka.

Zašto je sonikacija nužna u ispitivanjima minimalne inhibitorne koncentracije na biofilmu

Za mjerenje vijabilnosti i brojanje stanica potrebno je potpuno i pouzdano odvajanje i dispergiranje pojedinačnih stanica. UIP400MTP pospješuje jednoliko odvajanje biofilma i dispergiranje stanica bez oštećenja radi dobivanja pouzdanih rezultata ispitivanja.

• Složenost biofilma: Biofilmovi su strukturirane mikrobne zajednice unutar matrice izvanstaničnih polimernih tvari (EPS), koja štiti mikroorganizme i čini ih otpornijima na antimikrobna sredstva.
• Ujednačena disperzija: Kako bi se točno izmjerila održivost stanica ugrađenih u biofilm ili njihova osjetljivost na antimikrobe, biofilm se najprije mora odvojiti i razbiti u homogenu suspenziju.

Protokol ispitivanja minimalne inhibitorne koncentracije na biofilmu

Ispitivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) određuje najnižu koncentraciju antimikrobnog sredstva potrebnu za sprječavanje vidljivog rasta mikroorganizama. Ovaj je protokol namijenjen mikroorganizmima povezanima s biofilmom, a za razgradnju biofilma koristi sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP.

Korak 1: Priprema bakterijskog inokuluma

1. Pripremite bakterijsku suspenziju:
   Uzgojite bakterije u odgovarajućim podlogama do srednje logaritamske faze.
   Razrijedite kulturu do standardizirane gustoće stanica (npr. 0,5 McFarlandov standard ili OD600 oko 0,1).
2. Pripremite antimikrobne otopine:
   Razrijedite antimikrobno sredstvo u odgovarajućoj podlozi kako biste dobili raspon koncentracija (npr. dvostruka serijska razrjeđenja).
3. Raspodijelite u pločicu s 96 jažica:
   Ulijte antimikrobne otopine u jažice standardne pločice s 96 jažica, s krajnjim volumenom po jažici od ~150–200 µL.
   Uključite kontrole rasta (bez antimikrobnog sredstva) i kontrole sterilnosti (bez bakterijskog inokuluma).

Korak 2: Stvaranje biofilma na poklopcu s kolčićima

• Postavite poklopac s kolčićima:
  Postavite posebni poklopac s kolčićima na inokulirane jažice, pazeći da kolčići budu potpuno uronjeni u bakterijsku suspenziju.
• Inkubirajte pločicu:
  Inkubirajte na odgovarajućoj temperaturi (npr. 37°C) tijekom određenog vremena (npr. 24 sata) u mirnim uvjetima kako bi se na kolčićima stvorio biofilm.

Korak 3: Izlaganje antimikrobnom sredstvu

• Isperite kolčiće:
  Uklonite poklopac s kolčićima iz bakterijske suspenzije i nježno isperite u sterilnoj fiziološkoj otopini ili PBS-u kako biste uklonili labavo pričvršćene planktonske stanice.
• Izložite antimikrobnom sredstvu:
  Prenesite poklopac s kolčićima u novu pločicu s 96 jažica koja sadrži ranije pripremljena antimikrobna razrjeđenja.
  Inkubirajte određeno vrijeme (npr. 24 sata) u mirnim uvjetima kako bi antimikrobno sredstvo djelovalo na biofilmove.

Korak 4: Sonikacija sonikatorom za mikropločice UIP400MTP

Korak sonikacije ključan je za odvajanje biofilma s poklopaca s kolčićima radi procjene održivosti. Pratite ove korake za sonikator UIP400MTP:

1. Pripremite postavu:
   Napunite novu pločicu s 96 jažica podlogom za oporavak (npr. neutralizacijskim bujonom ili sterilnom podlogom za uzgoj) u svakoj jažici.
2. Prenesite poklopac s kolčićima:
   Uklonite poklopac s kolčićima iz pločice s antimikrobnim tretmanom.
   Isperite poklopac u sterilnoj fiziološkoj otopini ili PBS-u kako biste uklonili ostatke antimikrobnih sredstava.
3. Postavite pločicu u sonikator:
   Pričvrstite poklopac s kolčićima na pločicu s podlogom za oporavak.
   Stavite pločicu s podlogom za oporavak u sonikator UIP400MTP, pazeći da pločica stoji centrirano i stabilno, kako je opisano u priručniku.
4. Podesite parametre sonikacije:
   Postavite parametre sonikacije na UIP400MTP (postavke se mogu prilagoditi biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Vrijeme sonikacije: 1–3 minute (prilagodite prema strukturi biofilma) u cikličkom načinu rada.
5. Sonicirajte:
   Pokrenite postupak sonikacije. Ultrazvučni valovi će razgraditi matricu biofilma i otisnuti stanice u podlogu za oporavak.
6. Pratite postupak:
   Upotrijebite priključivi senzor temperature za praćenje temperature uzoraka u jažicama. UIP400MTP se, radi hlađenja, može povezati s laboratorijskim rashladnim uređajem.
7. Rukovanje nakon sonikacije:
   Odmah prenesite podlogu za oporavak s odvojenim biofilmom u novu sterilnu pločicu za naknadnu analizu.

(A) Ploča koja sadržava TSB s 2% glukoze, upotrijebljena za stvaranje biofilma, oporavak stanica te određivanje MIC-a i MBEC-a; (B) Poklopac s klinovima za stvaranje stafilokoknih biofilmova.
Stanice biofilma nastalog na klinovima odvojene su sonikacijom (Hielscher Ultrasound Technology) tijekom 5 min u pločama s 96 jažica koje su sadržavale svježi hranjivi medij za oporavak stanica.
(Slika i istraživanje: ©de Oliveira et al., 2016)

Korak 4: Procjena vijabilnosti

Nasijte i uzgojite odvojene biofilmove:

1. Pripremite serijska razrjeđenja medija za oporavak i nasijte ih na agar radi određivanja broja jedinica koje tvore kolonije (CFU).
2. Procijenite MIC:
   Odredite MIC kao najnižu koncentraciju antimikrobnog sredstva koja potpuno inhibira vidljiv rast mikroorganizama u mediju za oporavak.

MIC – minimalna inhibitorna koncentracija: primjer mikrotitarske ploče i tumačenje rezultata mikrodilucije.
(Istraživanje i slika: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Tko ima koristi od sonikacije tijekom testova MIC-a?

• Proizvođači medicinskih proizvoda: Za ispitivanje učinkovitosti površinskih premaza i validaciju protokola čišćenja proizvoda sklonih stvaranju biofilma.
• Klinički mikrobiolozi: Za preciznu dijagnostiku infekcija povezanih s implantatima (poput PJI-ja) izdvajanjem bakterija s medicinskih uređaja i dijelova.
• Stručnjaci za razvoj lijekova: Za procjenu učinkovitosti novih antimikrobnih sredstava protiv otpornih patogena uklopljenih u biofilm.
• Akademski istraživači: Za provedbu reproducibilnih istraživanja biologije biofilma i mehanizama antimikrobne rezistencije uz velik kapacitet obrade uzoraka.
• Timovi za kontrolu kvalitete u industriji: Za procjenu biološkog obraštanja i učinkovitosti dezinficijensa u industrijskim uvjetima (npr. primjenom normi ASTM E2799-22).

Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj

Ultrazvučni uređaji Hielscher poznati su po najvišim standardima kvalitete i projektiranja. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Sonikatori Hielscher lako se nose s teškim uvjetima i zahtjevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics tvrtka je certificirana prema ISO normama koja poseban naglasak stavlja na ultrazvučne uređaje visokih performansi s najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnim rukovanjem. Naravno, ultrazvučni uređaji Hielscher sukladni su zahtjevima za oznaku CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Ovdje pročitajte kako se UIP400MTP upotrebljava za odvajanje biofilma u protokolu ASTM E2799 – ispitivanje učinkovitosti dezinficijensa protiv biofilma bakterije Pseudomonas aeruginosa primjenom testa MBEC.