Protokol za uzgoj i odvajanje biofilma bakterija roda Staphylococcus

Standardizirane metode ključne su za pouzdane rezultate istraživanja. Ovdje možete pronaći protokol za uzgoj i odvajanje stafilokoknih biofilmova. Ovaj je protokol usmjeren na pojednostavljenu pripremu velikog broja uzoraka pomoću sonikatora za ploče s više jažica UIP400MTP za učinkovito odvajanje biofilma velikog broja uzoraka u pločama s 96 jažica. Protokol također sadržava ključne korake za uzgoj, ispiranje i vizualizaciju biofilma, s naglaskom na smanjenje varijabilnosti i osiguravanje ponovljivosti.

Istraživanje stafilokoknih biofilmova i antibiotika

Stafilokokni biofilmovi imaju ključnu ulogu u trajnim infekcijama zbog svoje otpornosti na antibiotike i imunološke odgovore. Nastanak biofilma bakterijama pruža zaštitno okruženje, zbog čega se infekcije teško liječe. Istraživanja biofilmova često su usmjerena na razumijevanje njihova nastanka, ponašanja i osjetljivosti na antimikrobna sredstva, s naglaskom na metode za obradu velikog broja uzoraka radi pojednostavljenja eksperimentalnih radnih postupaka.
Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP pruža znatnu prednost u istraživanju biofilmova jer omogućuje brzo i učinkovito odvajanje biofilmova s ploča s 96 jažica. Ovaj uređaj dovodi ujednačenu ultrazvučnu energiju u sve jažice, čime osigurava dosljedne rezultate uz smanjenje varijabilnosti.

Protokol za uzgoj i odvajanje biofilma bakterija roda Staphylococcus

U nastavku vas vodimo korak po korak kroz postupak uzgoja i odvajanja stafilokoknog biofilma. Kao primjer analitičkog koraka pokazujemo kako spektrofotometrijski kvantificirati uzgojenu biomasu bojenjem kristal-violetom.

Uzgoj stafilokoknog biofilma

Potreban materijal:

• Sterilne polistirenske mikrotitarske ploče s 96 jažica ravnog dna, površinski obrađene za kulturu tkiva, s poklopcima
• Tripton-sojin bujon (TSB) s 0,25% glukoze
• Biološki sigurnosni kabinet

Koraci:

1. Pripremite sterilno radno okruženje u biološkom sigurnosnom kabinetu kako biste smanjili kontaminaciju.
2. U jažice mikrotitarske ploče dodajte TSB koji sadržava 0,25% glukoze. TSB bez glukoze općenito ne podržava nastanak biofilma i treba ga upotrebljavati samo kao kontrolu ako je potrebna.
3. Inokulirajte jažice bakterijskim sojevima pripremljenima kako je opisano u nastavku:
4. Pripremite bakterijske suspenzije tako da uklonite postojeće nakupine stanica homogenizacijom suspenzija sonikacijom ili razbijanjem nakupina iglom debljine 23 G i kratkim miješanjem na vorteks-miješalici.
5. Zatvorite ploču njezinim poklopcem i inkubirajte u uvjetima optimalnima za nastanak biofilma (npr. na 37°C tijekom 24 sata).
6. Provedite pokus u triplikatu za svaki bakterijski soj (tri jažice po soju) kako biste osigurali pouzdanost.
7. Odvojite šest jažica po ploči za negativne kontrole. Na jednoj ploči s 96 jažica može se ispitati do 30 sojeva.

Vizualizacija i ispiranje biofilma

1. Nakon inkubacije pažljivo odbacite medij kako ne biste narušili biofilm.
2. Svaku jažicu isperite četiri puta fiziološkom otopinom kako biste uklonili planktonske bakterije.
3. Pregledajte dno jažica i provjerite ima li bijelih mrlja koje upućuju na prisutnost biofilma.

Odvajanje biofilma pomoću sonikatora za ploče s više jažica UIP400MTP

Postavljanje uređaja i parametri:

• Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP
• Radne postavke: amplituda 60%, ciklički način rada s 60 sekundi UKLJUČENO / 30 sekundi ISKLJUČENO

Koraci:

1. Postavite ispranu mikrotitarsku ploču na platformu uređaja UIP400MTP.
2. Sonicirajte uzorke pri preporučenim postavkama (amplituda 60%, 60 sekundi UKLJUČENO, 30 sekundi ISKLJUČENO). Prilagodite postavke bakterijskom soju.
3. Pokrenite postupak sonikacije kako biste odvojili biofilm. Ultrazvučni valovi razaraju matriks biofilma i oslobađaju prianjajuće bakterije.
4. UIP400MTP osigurava ujednačenu izloženost u svim jažicama radi dosljednih rezultata odvajanja.

Analitički korak: kvantifikacija biomase odvojenog stafilokoknog biofilma pomoću kristal-violeta (CV)

Potreban materijal:

• 0,1% otopina kristal-violeta (CV)
• 95% etanol ili 30% octena kiselina (za solubilizaciju)
• Čitač mikropločica koji omogućuje mjerenje pri 570 nm
• Sterilne mikrotitarske pločice za bojenje

Koraci:

1. Priprema pločice za bojenje: Prenesite 100 µL suspenzije odvojenog biofilma iz svake jažice sonicirane pločice u odgovarajuće jažice čiste, sterilne mikrotitarske pločice s 96 jažica. Time se osigurava čisto i ujednačeno okruženje za bojenje.
2. Bojenje odvojenog biofilma: Dodajte 150 µL 0,1% otopine kristal violeta u svaku jažicu koja sadržava suspenziju odvojenog biofilma. Nježno pipetirajte kako biste osigurali ravnomjerno miješanje suspenzije biofilma i kristal violeta.
3. Inkubacija: Ostavite pločicu da se inkubira na sobnoj temperaturi 15 minuta kako bi kristal violet učinkovito obojio biomasu.
4. Pranje: Nakon inkubacije pažljivo uklonite otopinu kristal violeta iz jažica bez narušavanja biomase. Operite svaku jažicu tri puta sterilnom fiziološkom otopinom kako biste uklonili nevezano bojilo.
5. Sušenje: Ostavite pločicu da se osuši na zraku pri sobnoj temperaturi ili u kabinetu sa sterilnim strujanjem zraka. Izbjegavajte zagrijavanje jer ono može promijeniti rezultate.
6. Solubilizacija: Dodajte 200 µL 95% etanola (ili 30% octene kiseline, ovisno o uobičajenim laboratorijskim postupcima) u svaku jažicu kako biste otopili vezani kristal violet. Nježno miješajte pipetiranjem ili protresanjem pločice 10 minuta na sobnoj temperaturi.
7. Mjerenje: Izmjerite optičku gustoću (OD) otopine solubiliziranog kristal violeta pri 570 nm pomoću čitača mikropločica.
8. Analiza podataka: Oduzmite srednju vrijednost OD570 negativnih kontrola (jažice s TSB-om, ali bez bakterijskog inokuluma) od vrijednosti eksperimentalnih jažica kako biste uzeli u obzir pozadinsko bojenje. Zabilježite i analizirajte podatke.

Napomena: Provedite eksperiment u triplikatu za svaki uvjet kako biste osigurali ponovljivost. Osigurajte pravilno rukovanje kristal violetom i etanolom, uz pridržavanje protokola sigurnosti i zbrinjavanja.
 

Glavne prednosti uređaja UIP400MTP na prvi pogled:

• Obrada velikog broja uzoraka: Dizajniran posebno za pločice s više jažica, omogućuje istodobnu obradu više uzoraka.
• Ujednačena raspodjela ultrazvuka: Osigurava jednak intenzitet ultrazvuka u svim jažicama, čime se postižu dosljedni rezultati za sve uzorke.
• Upotrijebite bilo koju standardnu pločicu: UIP400MTP može obrađivati sve standardne pločice s više jažica, Petrijeve zdjelice i stalke za epruvete. Nisu potrebne skupe posebne pločice proizvođača!
• Korisničko sučelje jednostavno za upotrebu: Jednostavno postavljanje i upravljanje čine ga izvrsnim alatom za povećanje produktivnosti laboratorija. Programibilne postavke i automatizacija olakšavaju standardizaciju procesa!