Protokol uzgoja i odvajanja biofilma Staphylococcus

Standardizirane metode neophodne su za pouzdane rezultate istraživanja. Ovdje možete pronaći protokol za uzgoj i odvajanje stafilokoknih biofilmova. Ovaj se protokol usredotočuje na pojednostavljenu pripremu uzorka visoke propusnosti pomoću sonikatora ploča s više jažica UIP400MTP za učinkovito odvajanje biofilma visoke propusnosti u pločama s 96 jažica. Protokol također sadrži ključne korake za uzgoj biofilma, pranje i vizualizaciju, s fokusom na smanjenje varijabilnosti i osiguravanje ponovljivosti.

Biofilm stafilokoka i istraživanje antibiotika

Biofilmovi stafilokoka igraju ključnu ulogu u perzistentnim infekcijama zbog svoje otpornosti na antibiotike i imunološkog odgovora. Stvaranje biofilma osigurava zaštitno okruženje za bakterije, što otežava liječenje infekcija. Istraživanje biofilmova često se usredotočuje na razumijevanje njihove formacije, ponašanja i osjetljivosti na antimikrobna sredstva, s naglaskom na visokoučinkovite metode za usmjeravanje eksperimentalnih radnih procesa.
UIP400MTP sonikator ploča s više jažica nudi značajnu prednost u istraživanju biofilma omogućavajući brzo i učinkovito odvajanje biofilmova s ploča s 96 jažica. Ovaj uređaj daje ujednačenu ultrazvučnu energiju u sve jažice, osiguravajući konzistentne rezultate uz smanjenje varijabilnosti.

Protokol za uzgoj i odvajanje biofilma Staphylococcus

U nastavku vas vodimo s uputama korak po korak kroz proces uzgoja i odvajanja biofilma stafilokoka. Kao primjer analitičkog koraka, pokazujemo vam kako spektrofotometrijski kvantificirati uzgojenu biomasu bojenjem kristalno ljubičastom bojom.

Uzgoj biofilma stafilokoka

Potrebni materijali:

• Sterilne mikrotitarske ploče s 96 jažica i polistirenskim tkivom s ravnim dnom i poklopcima
• Triptična sojina juha (TSB) s 0,25% glukoze
• Biološki sigurnosni kabinet

koraci:

1. Pripremite sterilno radno okruženje u biološko sigurnom kabinetu kako biste smanjili kontaminaciju.
2. Dodajte TSB koji sadrži 0,25% glukoze u jažice mikrotitarske ploče. TSB bez glukoze općenito ne podržava stvaranje biofilma i treba ga koristiti samo kao kontrolu ako je potrebno.
3. Inokulirajte jažice sojevima bakterija pripremljenim kako je opisano u nastavku:
4. Pripremite bakterijske suspenzije, osiguravajući da nema već postojećih klastera stanica homogeniziranjem suspenzija sonikacijom ili razbijanjem klastera iglom veličine 23 i kratkim vrtloženjem.
5. Zatvorite ploču poklopcem i inkubirajte u uvjetima optimalnim za stvaranje biofilma (npr. 37°C 24 sata).
6. Izvedite pokus u tri primjerka za svaki bakterijski soj (tri jažice po soju) kako biste osigurali pouzdanost.
7. Dodijelite šest jažica po ploči za negativne kontrole. Može se testirati do 30 sojeva po ploči s 96 jažica.

Vizualizacija i pranje biofilma

1. Nakon inkubacije pažljivo bacite medij kako biste izbjegli remećenje biofilma.
2. Isperite svaku jažicu četiri puta fiziološkom otopinom kako biste uklonili planktonske bakterije.
3. Pregledajte ima li na dnu jažica bijelih mrlja koje ukazuju na prisutnost biofilma.

Odvajanje biofilma pomoću sonikatora ploča s više jažica UIP400MTP

Postavljanje uređaja i parametri:

• UIP400MTP sonikator ploče s više jažica
• Radne postavke: 60% amplitude, ciklični način rada sa 60 sekundi UKLJUČENO / 30 sekundi ISKLJUČENO

koraci:

1. Stavite opranu mikrotitarsku ploču na UIP400MTP platformu.
2. Sonicirajte uzorke na preporučenim postavkama (60% amplitude, 60 sekundi UKLJUČENO, 30 sekundi ISKLJUČENO). Prilagodite postavke soju bakterija.
3. Pokrenite postupak ultrazvuka kako biste odvojili biofilm. Ultrazvučni valovi ometaju matricu biofilma, oslobađajući prianjajuće bakterije.
4. UIP400MTP osigurava jednoliku izloženost u svim jažicama za dosljedne rezultate odvajanja.

Analitički korak: Kvantifikacija biomase odvojenog Staphylococcus biofilma korištenjem Crystal Violeta (CV)

Potrebni materijali:

• 0.1% otopina kristalno ljubičaste (CV).
• 95% etanol ili 30% octena kiselina (za solubilizaciju)
• Čitač mikropločica s mogućnošću očitavanja na 570 nm
• Sterilne mikrotitarske ploče za bojenje

koraci:

1. Priprema ploče za bojenje: Prenesite 100 µL odvojene suspenzije biofilma iz svake jažice sonikirane ploče u odgovarajuće jažice čiste, sterilne mikrotitarske ploče s 96 jažica. To osigurava čistu i ujednačenu okolinu za bojenje.
2. Bojanje odvojenog biofilma: dodajte 150 µL 0,1% otopine kristalno ljubičaste u svaku jažicu koja sadrži odvojenu suspenziju biofilma. Nježno pipetirajte kako biste osigurali ravnomjerno miješanje suspenzije biofilma i kristalno ljubičaste.
3. Inkubacija: Ostavite ploču da se inkubira na sobnoj temperaturi 15 minuta kako bi kristalno ljubičica učinkovito obojila biomasu.
4. Ispiranje: Nakon inkubacije, pažljivo bacite kristalno ljubičastu otopinu iz jažica bez ometanja biomase. Isperite svaku jažicu tri puta sterilnom fiziološkom otopinom kako biste uklonili nevezanu mrlju.
5. Sušenje: Pustite ploču da se osuši na sobnoj temperaturi ili pod sterilnom komorom za protok zraka. Izbjegavajte zagrijavanje jer to može promijeniti rezultate.
6. Solubilizacija: Dodajte 200 µL 95% etanola (ili 30% octene kiseline, ovisno o standardnoj laboratorijskoj praksi) u svaku jažicu kako biste otopili vezani kristal violet. Lagano promiješajte pipetiranjem ili tresenjem ploče 10 minuta na sobnoj temperaturi.
7. Mjerenje: Izmjerite optičku gustoću (OD) solubilizirane kristalno ljubičaste otopine na 570 nm pomoću čitača mikropločica.
8. Analiza podataka: Oduzmite srednju vrijednost OD570 negativnih kontrola (jažice s TSB-om, ali bez bakterijskog inokuluma) od eksperimentalnih jažica kako biste uzeli u obzir pozadinsko bojenje. Snimite i analizirajte podatke.

Napomena: Izvedite pokus u tri primjerka za svaki uvjet kako biste osigurali ponovljivost. Osigurajte pravilno rukovanje kristalno violetom i etanolom, pridržavajući se sigurnosnih protokola i protokola za odlaganje.
 

Glavne prednosti UIP400MTP na prvi pogled:

• Obrada visoke propusnosti: Osmišljen posebno za pločice s više jažica, omogućujući vam obradu više uzoraka istovremeno.
• Jednolika ultrazvučna distribucija: Osigurava jednak ultrazvučni intenzitet u svim jažicama, pružajući dosljedne rezultate u svim uzorcima.
• Koristite bilo koju standardnu ploču: UIP400MTP može rukovati svim standardnim pločama s više jažica, Petrijevim zdjelicama i nosačima za epruvete. Nisu potrebne skupe vlasničke tablice!
• Sučelje prilagođeno korisniku: Jednostavan za postavljanje i kontrolu, što ga čini izvrsnim alatom za povećanje produktivnosti laboratorija. Programabilne postavke i automatizacija olakšavaju standardizaciju procesa!