Protokol ASTM E2799-22 za procjenu antimikrobnog djelovanja

Hielscher UIP400MTP snažan je i učinkovit sonikator za ploče s više jažica, osmišljen za pojednostavnjenje koraka sonikacije u protokolu ASTM E2799-22. Ravnomjernom isporukom ultrazvučne energije po cijeloj mikrotitarskoj ploči UIP400MTP osigurava dosljedno i pouzdano odvajanje biofilmova s poklopaca s klinovima bez oštećivanja stanica ili narušavanja cjelovitosti uzorka. Njegov visok kapacitet obrade uzoraka i jednostavno rukovanje znatno skraćuju vrijeme obrade uz istodobno poboljšanje ponovljivosti, što ga čini idealnim rješenjem za laboratorije koji provode testove vijabilnosti biofilmova i ispitivanja antimikrobne učinkovitosti.

ASTM E2799

ASTM E2799 standardizirana je ispitna metoda namijenjena procjeni učinkovitosti antimikrobnih sredstava protiv biofilmova, s posebnim naglaskom na bakteriju Pseudomonas aeruginosa. Biofilmovi su složene mikrobne zajednice koje prianjaju uz površine i pokazuju povećanu otpornost na antimikrobne tretmane, zbog čega predstavljaju znatan izazov u zdravstvu, industriji i zaštiti okoliša. Ova metoda upotrebljava test minimalne koncentracije za eradikaciju biofilma (MBEC) kako bi pružila pouzdan i ponovljiv okvir za ispitivanje dezinficijensa u realističnim uvjetima biofilma.

Kako sonikacija doprinosi metodi ASTM E2799?

Sonikacija ima ključnu ulogu u protokolu ASTM E2799 jer olakšava odvajanje biofilmova s ispitnih površina, čime se osigurava točna procjena vijabilnosti mikroorganizama nakon tretmana. Upotrebom kontrolirane ultrazvučne energije protokol omogućuje učinkovito i dosljedno razaranje biofilma bez oštećivanja stanica, čime se postižu precizni i ponovljivi rezultati. Zbog toga je ASTM E2799 nezaobilazan alat za unaprjeđenje istraživanja biofilmova i razvoj učinkovitih antimikrobnih strategija.

Kako provesti test MBEC u skladu s normom ASTM E2799-22

Protokol ASTM E2799-22 opisuje korake za procjenu učinkovitosti antimikrobnih sredstava protiv biofilmova. Pri upotrebi sonikatora za mikrotitarske ploče Hielscher UIP400MTP protokol se može prilagoditi kako bi uključivao ovu naprednu metodu sonikacije za odvajanje biofilmova. U nastavku je opis koraka prilagođenih upotrebi sonikatora za mikroploče UIP400MTP:

1. Priprema biofilmova
   Pripremite sterilnu mikrotitarsku ploču s 96 jažica i odvojivim poklopcima s klinovima.
   Inokulirajte jažice standardiziranom bakterijskom suspenzijom u prikladnoj hranjivoj podlozi.
   Postavite poklopac s klinovima na ploču, pazeći da klinovi budu potpuno uronjeni u bakterijsku suspenziju.
   Inkubirajte ploču u kontroliranim uvjetima (npr. temperature i vremena) kako bi se omogućilo stvaranje biofilma na klinovima.
2. Tretman antimikrobnim sredstvima
   Nakon stvaranja biofilma zamijenite podlogu svježom podlogom koja sadržava ispitivana antimikrobna sredstva u različitim koncentracijama.
   Ponovno postavite poklopac s klinovima i inkubirajte u uvjetima navedenima u planu ispitivanja.
3. Priprema za odvajanje biofilma
   Nakon tretmana isperite poklopac s klinovima uranjanjem u sterilnu otopinu za ispiranje kako biste uklonili ostatke antimikrobnih sredstava i slabo prianjajuće planktonske stanice.
4. Odvajanje biofilma sonikatorom UIP400MTP
   Pripremite novu mikrotitarsku ploču s 96 jažica koja sadržava podlogu za oporavak (npr. neutralizacijski bujon).
   Odvojite biofilmove postavljanjem poklopca s klinovima u jažice ploče s podlogom za oporavak.
   Umetnite ploču u sonikator UIP400MTP, pazeći da poklopac i ploča budu pravilno poravnati.
   Postavite sonikator na amplitudu od 70%–80% i sonicirajte 3–4 minute u cikličkom načinu rada kako biste osigurali dosljedno odvajanje biofilma bez lize stanica.
5. Procjena vijabilnosti biofilma
   Nakon sonikacije obradite podlogu za oporavak koja sadržava odvojene stanice biofilma standardnim mikrobiološkim ili analitičkim tehnikama, kao što su:
   • Brojenje jedinica koje tvore kolonije (CFU): provedite serijska razrjeđenja i nasijte na agar radi određivanja broja vijabilnih stanica.
   • Mjerenja optičke gustoće (OD): upotrijebite spektrofotometrijsku analizu za procjenu gustoće stanica.
   • Testovi vijabilnosti temeljeni na fluorescenciji: kvantificirajte žive i mrtve stanice s pomoću fluorescentnih boja.
6. Analiza podataka
   Usporedite podatke o vijabilnosti tretiranih i netretiranih biofilmova kako biste utvrdili učinkovitost antimikrobnih sredstava.
   Izračunajte minimalnu koncentraciju za eradikaciju biofilma (MBEC) na temelju koncentracije potrebne za uklanjanje vijabilnih stanica biofilma.
7. Kontrola kvalitete
   Osigurajte dosljedne uvjete sonikacije redovitom kalibracijom uređaja UIP400MTP i provjerom da postupak odvajanja biofilma ne uzrokuje znatnu lizu ili uništenje stanica.
   Uključite odgovarajuće kontrole, poput netretiranih biofilmova i slijepih uzoraka koji sadržavaju samo podlogu, kako biste potvrdili valjanost rezultata.

Stanice biofilma nastale na klinovima odvojene su sonikacijom (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Njemačka, UIP250MTP) tijekom 5 min u pločama s 96 jažica koje su sadržavale svježu podlogu za uzgoj radi oporavka stanica.
(Slika i istraživanje: ©de Oliveira et al., 2016)

Uključivanjem uređaja UIP400MTP u radni postupak prema normi ASTM E2799-22 postupak odvajanja biofilma optimizira se u pogledu dosljednosti, učinkovitosti i primjena koje zahtijevaju obradu velikog broja uzoraka.