ASTM E2799-22 Protokol za antimikrobnu procjenu

Hielscher UIP400MTP snažan je i učinkovit sonikator ploče s više jažica dizajniran za pojednostavljenje koraka sonikacije u protokolu ASTM E2799-22. Isporukom ujednačene ultrazvučne energije kroz cijelu mikrotitarsku ploču, UIP400MTP osigurava dosljedno i pouzdano odvajanje biofilmova od poklopaca klinova bez oštećenja stanica ili ugrožavanja integriteta uzorka. Njegova sposobnost velike propusnosti i jednostavno rukovanje značajno skraćuju vrijeme obrade dok povećavaju ponovljivost, što ga čini idealnim rješenjem za laboratorije koji provode testove održivosti biofilma i testiranje antimikrobne učinkovitosti.

ASTM E2799

ASTM E2799 standardizirana je ispitna metoda osmišljena za procjenu učinkovitosti antimikrobnih sredstava protiv biofilmova, s posebnim naglaskom na Pseudomonas aeruginosa. Biofilmovi su složene mikrobne zajednice koje prianjaju na površine i pokazuju povećanu otpornost na antimikrobne tretmane, što ih čini značajnim izazovom u zdravstvenom, industrijskom i ekološkom kontekstu. Ova metoda koristi analizu minimalne koncentracije eradikacije biofilma (MBEC) kako bi pružila pouzdan i ponovljiv okvir za testiranje dezinficijensa u realnim uvjetima biofilma.

Kako ultrazvuk doprinosi ASTM E2799?

Sonikacija ima ključnu ulogu u protokolu ASTM E2799 olakšavajući odvajanje biofilmova s ispitnih površina, osiguravajući točnu procjenu održivosti mikroba nakon tretmana. Korištenjem kontrolirane ultrazvučne energije, protokol postiže učinkovito i dosljedno ometanje biofilma bez oštećenja stanica, omogućujući precizne i ponovljive rezultate. To čini ASTM E2799 bitnim alatom za unaprjeđenje istraživanja biofilma i razvoj učinkovitih antimikrobnih strategija.

Kako provesti MBEC test u skladu s ASTM E2799-22

Protokol ASTM E2799-22 opisuje korake za procjenu učinkovitosti antimikrobnih sredstava protiv biofilma. Kada koristite sonikator Hielscher UIP400MTP mikrotitarske ploče, protokol se može prilagoditi za uključivanje ove napredne metode ultrazvuka za odvajanje biofilma. U nastavku je opis koraka prilagođenih korištenju sonikatora za mikroploče UIP400MTP:

1. Priprema biofilmova
   Pripremite sterilnu mikrotitarsku ploču s 96 jažica s poklopcima koji se mogu odvojiti.
   Inokulirajte jažice standardiziranom bakterijskom suspenzijom u prikladnom mediju za rast.
   Postavite poklopac klinova na ploču, pazeći da su klinovi potpuno uronjeni u bakterijsku suspenziju.
   Inkubirajte ploču pod kontroliranim uvjetima (npr. temperatura i vrijeme) kako biste omogućili stvaranje biofilma na klinovima.
2. Liječenje antimikrobnim sredstvima
   Nakon stvaranja biofilma, zamijenite medij svježim medijem koji sadrži ispitivana antimikrobna sredstva u različitim koncentracijama.
   Ponovno pričvrstite poklopac klina i inkubirajte pod uvjetima navedenim u dizajnu testa.
3. Priprema za odvajanje biofilma
   Nakon tretmana, isperite poklopac klina uranjanjem u sterilnu otopinu za ispiranje kako biste uklonili ostatke antimikrobnih sredstava i labavo zalijepljene planktonske stanice.
4. Odvajanje biofilma pomoću sonikatora UIP400MTP
   Pripremite svježu mikrotitarsku ploču s 96 jažica koja sadrži medij za oporavak (npr. neutralizirajuću juhu).
   Odvojite biofilmove postavljanjem poklopca klina u udubljenja ploče s medijem za oporavak.
   Umetnite ploču u sonikator UIP400MTP, pazeći da su poklopac i ploča ispravno poravnati.
   Postavite sonikator na 70%-80% amplitude i sonicirate 3-4 minute u ciklusu kako biste osigurali dosljedno odvajanje biofilma bez lize stanica.
5. Procjena održivosti biofilma
   Nakon sonikacije, obradite medij za oporavak koji sadrži odvojene stanice biofilma korištenjem standardnih mikrobioloških ili analitičkih tehnika, kao što su:
   • Brojanje jedinica koje stvaraju kolonije (CFU): Izvedite serijska razrjeđenja i stavite ploču na agar za brojanje živih stanica.
   • Mjerenja optičke gustoće (OD): Koristite spektrofotometrijsku analizu za procjenu gustoće stanica.
   • Fluorescencijski testovi održivosti: Kvantificirajte žive i mrtve stanice pomoću fluorescentnih boja.
6. Analiza podataka
   Usporedite podatke o održivosti tretiranih i netretiranih biofilmova kako biste odredili učinkovitost antimikrobnih sredstava.
   Izračunajte minimalnu koncentraciju eradikacije biofilma (MBEC) na temelju koncentracije potrebne za eliminaciju živih stanica biofilma.
7. kontrola kvalitete
   Osigurajte dosljedne uvjete sonikacije redovitim kalibriranjem UIP400MTP i provjerom da proces odvajanja biofilma ne dovodi do značajne lize ili uništenja stanica.
   Uključite odgovarajuće kontrole, kao što su netretirani biofilmovi i slijepe probe samo za medij, za potvrdu rezultata.

Stanice biofilma formirane na klinovima uklonjene su sonikacijom (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Njemačka, UIP250MTP) tijekom 5 minuta u pločama s 96 jažica koje sadrže svježi medij kulture za obnavljanje stanica.
(Slika i studija: ©de Oliveira et al., 2016.)

Integracijom UIP400MTP u tijek rada ASTM E2799-22, proces odvajanja biofilma je optimiziran za dosljednost, učinkovitost i aplikacije visoke propusnosti.