Priprema velikog broja FFPE uzoraka: ekstrakcija proteina i fragmentacija nukleinskih kiselina smicanjem
Ultrazvučnim uređajem visokog kapaciteta UIP400MTP Hielscher Ultrasonics rješava izazove pripreme tkiva fiksiranog formalinom i uklopljenog u parafin (FFPE). Saznajte kako se ultrazvukom obrađuje velik broj FFPE uzoraka radi deparafinizacije, lize tkiva, homogenizacije, ekstrakcije proteina i fragmentacije DNA/RNA smicanjem! Iskoristite prednosti ultrazvučne pripreme FFPE tkiva – obrade velikog broja uzoraka u pločicama s više jažica! Dobijte visokokvalitetne uzorke i velik broj uzoraka za pouzdane rezultate istraživanja! I na kraju, ali ne manje važno, uštedite vrijeme i novac!
Priprema FFPE uzoraka olakšana sonikacijom velikog broja uzoraka
Fiksacija formalinom i uklapanje u parafin (FFPE) najčešća je metoda očuvanja i arhiviranja čvrstih tkiva. Ekstrakcija biomolekula iz uzoraka FFPE tkiva često predstavlja znatne izazove zbog kvalitete pohranjenih uzoraka. Ti uzorci, koji su neprocjenjivi u molekularnoj biologiji i kliničkim istraživanjima, pružaju bogat izvor bioloških informacija za retrospektivna istraživanja i validaciju dijagnostičkih biomarkera. Međutim, postupak fiksacije formalinom i uklapanja u parafin, iako čuva arhitekturu i morfologiju tkiva, otežava ekstrakciju visokokvalitetnih nukleinskih kiselina i proteina. Formalin izaziva umrežavanje nukleinskih kiselina i proteina, što dovodi do fragmentacije molekula i kemijskih modifikacija. Saznajte kako ultrazvučni uređaj visokog kapaciteta UIP400MTP prevladava izazove pripreme FFPE uzoraka!
Ultrazvučni uređaj za učinkovitu pripremu FFPE uzoraka
- Jednostavan radni postupak: pojednostavljeni procesi prilagođeni korisniku.
- Deparafinizacija, ekstrakcija proteina, fragmentacija DNA / RNA smicanjem
- Brza obrada velikog broja uzoraka: učinkovit rad s pločicama s više jažica.
- Učinkovita deparafinizacija: poboljšana solubilizacija proteina.
- Netoksična otapala: izbjegava se uporaba štetnih organskih otapala poput ksilena.
Sonikator visokog kapaciteta UIP400MTP za obradu velikog broja FFPE uzoraka u pločicama s više jažica
Napredak u tehnikama ekstrakcije proteina iz FFPE tkiva
Hielscher Ultrasonics rješava izazove pripreme velikog broja FFPE uzoraka. Sonikacija primjenjuje ultrazvučne valove za stvaranje mehaničkih vibracija i usmjerene kavitacije, čime učinkovito razara stanične strukture i poboljšava solubilizaciju biomolekula. Ova je tehnika postala popularna zbog svoje sposobnosti povećanja učinkovitosti i prinosa ekstrakcije nukleinskih kiselina i proteina iz FFPE tkiva te fragmentacije DNA i RNA smicanjem za pripremu knjižnica. Vrlo je važno istaknuti da ultrazvučna obrada sonikatorom UIP400MTP za pločice s više jažica održava cjelovitost tih biomolekula za daljnje primjene.
Fragmentacija nukleinskih kiselina smicanjem primjenom ultrazvučne obrade velikog broja uzoraka
Ultrazvučni uređaj UIP400MTP za ploče s više jažica, namijenjen obradi velikog broja uzoraka, podiže pripremu FFPE uzoraka na novu razinu. Ova metoda sonikacije u pločama s više jažica pruža učinkovito i pouzdano rješenje za istodobnu obradu više uzoraka. Omogućuje brzu i ponovljivu ekstrakciju DNA, RNA i proteina, koji su ključni za različite analitičke tehnike, uključujući sekvenciranje nove generacije (NGS), kvantitativni PCR i proteomske analize. Optimizacija parametara sonikacije, kao što su amplituda, trajanje i temperatura, dodatno poboljšava kvalitetu i povećava količinu ekstrahiranih biomolekula.
Sonikator UIP400MTP za ploče s više jažica nudi značajne prednosti za fragmentaciju i smično usitnjavanje DNA i RNA iz FFPE tkiva. Jedna od istaknutih značajki ovog sustava jest njegova sposobnost postizanja uskog raspona veličina fragmenata DNA i RNA, uz mogućnost preciznog podešavanja intenziteta sonikacije radi dobivanja kratkih fragmenata od 150–200 parova baza (bp) ili duljih fragmenata od 15–20 kiloparova baza (kbp). Ta svestranost čini UIP400MTP nezamjenjivim i za sekvenciranje kratkih očitanja i za sekvenciranje dugih očitanja, osiguravajući visokokvalitetne rezultate za sekvenciranje nove generacije (NGS) i sekvenciranje cijelog genoma (WGS). Precizna kontrola veličine fragmenata ključna je za istraživače u svim područjima genomike jer omogućuje pripremu uzoraka prema specifikacijama.
Obratite nam se za napredna rješenja za FFPE tkivo
Otkrijte sonikator UIP400MTP za ploče s više jažica, koji omogućuje učinkovito izdvajanje biomolekula iz FFPE uzoraka uz očuvanje cjelovitosti ekstrahiranih nukleinskih kiselina i proteina te osiguravanje ponovljivosti rezultata. Ova se tehnologija besprijekorno uklapa u druge pripremne i analitičke radne postupke, pojednostavljujući i unapređujući molekularna istraživanja koja se koriste arhivskim FFPE tkivima.
Fiksativi i njihovi učinci
Fiksacija je ključan korak u pripremi uzoraka kojim se čuvaju stanične strukture, zaustavljaju biokemijske reakcije i sprječava razgradnja. Ovisno o specifičnim zahtjevima eksperimenta, primjenjuju se različiti fiksativi. Dva najčešća fiksativa su formaldehid i paraformaldehid, koji umrežavaju proteine i nukleinske kiseline, čuvajući morfologiju i antigenost stanica i tkiva. Drugi fiksativi, kao što su etanol, metanol i glutaraldehid, upotrebljavaju se za specifične primjene.
Formaldehidni i paraformaldehidni fiksativi stvaraju metilenske mostove između amino skupina, što dovodi do umrežavanja proteina. Ovaj postupak učinkovito imobilizira stanične komponente, čuvajući njihovu cjelovitost tijekom naknadnih koraka analize. Na učinke ovih fiksativa mogu utjecati čimbenici kao što su koncentracija, pH i temperatura, a optimizacija tih parametara ključna je za osiguravanje optimalnog očuvanja staničnih struktura.
Prednosti ultrazvučne pripreme FFPE uzoraka
Ultrazvučna obrada moćna je tehnika za razaranje fiksiranih stanica i tkiva koja nadmašuje konvencionalne tehnike. Nudi nekoliko značajnih prednosti u odnosu na tradicionalne metode lize:
- Brzina i učinkovitost: Ultrazvučna liza omogućuje brzo razaranje stanica i tkiva, čime se znatno skraćuje vrijeme obrade u usporedbi s mehaničkim ili kemijskim metodama lize. Visokofrekventni zvučni valovi koje stvara ultrazvučna sonda stvaraju mehaničke smične sile koje uzrokuju razaranje fiksiranih staničnih struktura. Ovo brzo i učinkovito razaranje omogućuje istraživačima obradu velikih volumena uzoraka u kratkom vremenu.
- Blagost i podesivost: Ultrazvučna liza pruža blag mehanizam razaranja koji oštećenja osjetljivih biomolekula, kao što su proteini, nukleinske kiseline i enzimi, svodi na najmanju moguću mjeru. Za razliku od mehaničkih metoda koje stvaraju prekomjernu toplinu ili smične sile, ultrazvučna liza koristi kontroliranu kavitaciju za razaranje stanica uz očuvanje cjelovitosti i funkcionalnosti unutarstaničnih komponenti.
- Svestranost: Ultrazvučna liza može se primijeniti na uzorke tretirane različitim fiksativima, što istraživačima omogućuje rad sa širokim rasponom fiksiranih uzoraka. Neovisno o tome upotrebljavaju li formaldehid, paraformaldehid ili alternativne fiksative, ultrazvučna liza dosljedno osigurava učinkovito razaranje i optimalno izdvajanje staničnih sastavnica.
- Visok prinos i kvaliteta: Ultrazvučna liza omogućuje visoke prinose očuvanih staničnih sastavnica zahvaljujući sposobnosti ravnomjernog razaranja fiksiranih stanica i tkiva. Time se omogućuje dobivanje pouzdanih i ponovljivih rezultata u daljnjim primjenama kao što su analiza proteina, ekstrakcija nukleinskih kiselina i enzimski testovi.
- Kompatibilnost s automatizacijom: Ultrazvučna liza može se jednostavno integrirati u automatizirane sustave, što omogućuje obradu velikog broja uzoraka. Ta kompatibilnost omogućuje istraživačima pojednostavnjenje tijeka rada i povećanje produktivnosti, osobito u opsežnim istraživanjima.
Sonikator UIP400MTP za pločice s 96 jažica za sonikaciju mikrotitarskih pločica i pločica s više jažica
Ultrazvučna liza revolucionirala je razaranje fiksiranih stanica i tkiva, nudeći brojne prednosti u odnosu na tradicionalne metode lize. Njezina brzina, učinkovitost, selektivnost, svestranost, visok prinos i kompatibilnost s automatizacijom čine je nezamjenjivim alatom u istraživanjima molekularne biologije i biotehnologije. Nudeći beskontaktne sonikatore i sonikatore sa sondom, Hielscher Ultrasonics nudi najprikladniji ultrazvučni homogenizator za vašu primjenu u znanostima o životu. Bilo da želite obrađivati pojedinačne uzorke, više uzoraka ili vrlo velik broj uzoraka istodobno, ponudit ćemo vam najbolji sonikator koji odgovara vašim istraživačkim i dijagnostičkim zahtjevima.
Pročitajte više o beskontaktnim sonikatorima Hielscher za pripremu više uzoraka i pripremu velikog broja uzoraka!
- jednokratno ulaganje
- upotrebljavajte vlastiti potrošni materijal
- bez ponavljajućih troškova za pribor i potrošni materijal specifičan za proizvođača
- obrada velikog broja uzoraka
- precizna kontrola
- najsuvremenija tehnologija
- pouzdanost i robusnost
- podesiva, precizna kontrola procesa
- industrijska izvedba: može neprekidno raditi 24/7
- jednostavno i sigurno rukovanje
- minimalno održavanje
Pročitajte više o primjenama sonikatora u znanostima o životu!
Sonikator UIP400MTP za sve pločice s 96 jažica, mikrotitarske pločice i pločice s više jažica.
Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj
Ultrazvučni uređaji Hielscher poznati su po najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Ultrazvučni uređaji Hielscher lako podnose teške uvjete i zahtjevna okruženja.
Hielscher Ultrasonics tvrtka je s ISO certifikatom koja poseban naglasak stavlja na ultrazvučne uređaje visokih performansi s najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnim rukovanjem. Naravno, ultrazvučni uređaji Hielscher sukladni su zahtjevima za oznaku CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Ultrazvučni uređaj UIP400MTP: Priprema velikog broja FFPE uzoraka u pločici s više jažica
Često postavljana pitanja
U nastavku odgovaramo na često postavljana pitanja o pripremi FFPE tkiva i ultrazvučnoj obradi FFPE uzoraka.
Kako se priprema FFPE tkivo?
Koraci pripreme FFPE tkiva: Pažljivo rukovanje svježim tkivom i njegova obrada ključni su za dobivanje visokokvalitetnih FFPE uzoraka. Očuvanje stanične arhitekture, nukleinskih kiselina i proteina nužno je za točnu naknadnu analizu. Svaki korak – od prikupljanja do uklapanja – zahtijeva preciznost kako bi se očuvao integritet uzorka za različite analize, uključujući histološki pregled, imunohistokemiju i molekularna istraživanja. Pravilno proveden postupak fiksacije i uklapanja osigurava da očuvano tkivo točno odražava stanje in vivo, omogućujući pouzdane dijagnostičke i istraživačke rezultate.
Vodimo vas kroz 6 glavnih koraka postupka uklapanja FFPE uzoraka tkiva.
- Prikupljanje tkiva
Biopsije živih sisavaca i kulture tkiva prikladni su izvori svježeg tkiva za pripremu FFPE uzoraka.
Važno je primjenjivati aseptičnu tehniku: Koristite sterilne instrumente i rukavice kako biste izbjegli kontaminaciju. Idealno je tkivo prikupljati u sterilnom okruženju, poput operacijske dvorane ili kabineta s laminarnim strujanjem zraka.
Budući da je uzorak vrlo osjetljiv, nužno je njime pažljivo rukovati: Svedite odgode obrade na najmanju moguću mjeru i odmah nakon ekscizije započnite daljnju obradu tkiva. To je ključno za sprječavanje autolize i razgradnje. Držite tkivo na sobnoj temperaturi; izbjegavajte zamrzavanje jer može uzrokovati stvaranje kristala leda i oštećenje tkiva. - Fiksacija tkiva
Prvo se tkivo obrađuje otopinom fiksativa: Koristite 10% neutralno puferirani formalin (NBF), koji odgovara 4% formaldehidu u vodi, puferiranom na neutralni pH.
Potpuno uronite tkivo u formalin. Osigurajte volumni omjer fiksativa i tkiva od najmanje 10:1. Vrijeme fiksacije obično iznosi od 6 do 24 sata, ovisno o vrsti i veličini tkiva. Važno je da fiksativ može temeljito prodrijeti u tkivo. Međutim, prekomjerna fiksacija može dovesti do umrežavanja koje otežava razotkrivanje antigena, dok nedovoljna fiksacija može rezultirati lošim očuvanjem tkiva. - Obrezivanje tkiva
Drugo, obrežite tkivo na debljinu od oko 3–5 mm kako biste omogućili odgovarajuće prodiranje fiksativa. Osigurajte pravilnu orijentaciju tkiva kako biste obuhvatili relevantne histološke strukture. To olakšava postupak ekstrakcije kada se tkivo poslije koristi za analizu. - Obrada fiksiranog uzorka
Sada se fiksirano tkivo mora dehidrirati: Nakon fiksacije tkivo je potrebno dehidrirati kako bi se osiguralo temeljito prodiranje parafinskog voska. Provedite tkivo kroz niz otopina etanola rastućih koncentracija (70%, 80%, 90% i 100%) kako biste uklonili vodu.
Bistrenje ksilenom: Parafinski vosak netopljiv je u vodi, ali je topljiv u ksilenu. Stoga se voda u tkivu mora zamijeniti ksilenom. Međutim, sam ksilen netopljiv je u vodi, ali je topljiv u alkoholu, pa je potreban međukorak u kojem se voda najprije zamjenjuje alkoholom. Uronite tkivo u ksilen ili zamjenu za ksilen kako biste uklonili etanol i pripremili tkivo za infiltraciju parafinom.
Infiltracija parafinom: Uklopite tkivo u rastaljeni parafinski vosak, osiguravajući potpunu infiltraciju. Ovaj korak obično uključuje nekoliko izmjena parafina kako bi se osigurala temeljita impregnacija. - Uklapanje tkiva
U ovom se koraku tkivo oblikuje u tkivni blok: Postavite tkivo u kalup u željenoj orijentaciji i prelijte ga rastaljenim parafinom. Pustite da se parafin skrutne hlađenjem na sobnoj temperaturi ili na hladnoj ploči. - Rezanje i postavljanje na predmetna stakalca
Mikrotomija: Za rezanje uklopljenog tkiva upotrijebite mikrotom kako biste iz parafinskog bloka izrezali tanke rezove (obično 4–5 mikrometara). Zatim se uzorak postavlja na predmetna stakalca, pri čemu se rezovi polažu na stakalca za naknadno bojenje i mikroskopsku analizu.
Na kraju provjerite kvalitetu histološkog preparata: Pregledajte prve rezove pod mikroskopom kako biste osigurali pravilnu fiksaciju i obradu. Prema potrebi prilagodite protokole na temelju vrste tkiva i uočene kvalitete.
Iz FFPE tkiva mogu se izdvojiti RNA, DNA i proteini te otkriti znakovi raka ili drugih bolesti. Mogu se čuvati godinama i ključan su dio načina na koji istraživači i liječnici upotrebljavaju uzorke tkiva za dijagnostiku i istraživanja.
Koji su uobičajeni problemi i izazovi povezani s FFPE tkivom?
Uzorci tkiva fiksiranih formalinom i uklopljenih u parafin (FFPE) široko se upotrebljavaju u istraživanjima i dijagnostici, ali povezani su s nekoliko izazova i uobičajenih problema:
- Razgradnja biomolekula: Produljena fiksacija može dovesti do razgradnje DNA, RNA i proteina, što otežava ekstrakciju visokokvalitetnih nukleinskih kiselina ili proteina za daljnje primjene. Pravilna fiksacija (uz izbjegavanje nedovoljne i prekomjerne fiksacije) ključna je za očuvanje tkiva.
- Maskiranje antigena: Proces fiksacije može maskirati antigenska mjesta, smanjujući učinkovitost vezanja protutijela u imunohistokemijskim i drugim imunološkim ispitivanjima. To često zahtijeva razotkrivanje antigena, postupak kojim se uklanja maskiranje epitopa i ponovno omogućuje vezanje epitopa i protutijela. Međutim, puna antigeničnost možda se neće uvijek moći obnoviti.
- Promjenjiva kvaliteta fiksacije: Razlike u trajanju i uvjetima fiksacije mogu dovesti do neujednačene kvalitete uzoraka, što utječe na ponovljivost i usporedivost rezultata. Primjenjujte pouzdane protokole fiksacije i izbjegavajte nedovoljnu i prekomjernu fiksaciju.
- Oštećenje i fragmentacija DNA: Fiksacija FFPE uzoraka formalinom može uzrokovati različite vrste oštećenja DNA, uključujući deaminaciju citozina (mutacije C u T), oksidacijska oštećenja (npr. 8-okso-guanin koji dovodi do mutacija G u T), kao i fizička oštećenja poput jednolančanih prekida, praznina i abazičnih mjesta koja ometaju aktivnost DNA polimeraze. Proces fiksacije formalinom može uzrokovati fragmentaciju DNA, što otežava genetičke i genomske analize poput PCR-a i sekvenciranja.
- Kvaliteta RNA: RNA ekstrahirana iz FFPE tkiva često je fragmentirana i kemijski modificirana, što otežava provedbu visokokvalitetnih transkriptomskih analiza.
- Modifikacije proteina: Formalin može izazvati kemijske modifikacije proteina, utječući na njihovu strukturu i funkciju, što može ometati proteomske analize.
- Artefakti pri obradi uzoraka: Tijekom uklapanja i rezanja na presjeke mehaničko naprezanje i toplina mogu uzrokovati nastanak artefakata i dodatno oštetiti tkivo.
- Varijabilnost između serija: Razlike u protokolima fiksacije i uklapanja između različitih serija mogu dovesti do značajne varijabilnosti rezultata, što otežava usporedbe između studija.
- Problemi pri pohrani: Dugotrajna pohrana FFPE blokova može s vremenom dovesti do dodatne razgradnje i gubitka integriteta nukleinskih kiselina, što utječe na prikladnost arhivskih uzoraka za retrospektivne studije.
Umrežavanje: Fiksacija formalinom uzrokuje umrežavanje proteina i nukleinskih kiselina, što može otežati molekularnu analizu i utjecati na točnost imunohistokemijskih i drugih ispitivanja.
Primjena optimiziranih protokola, pažljivo rukovanje uzorcima i primjena naprednih tehnika pomažu poboljšati kvalitetu i pouzdanost podataka dobivenih iz FFPE tkiva.
Koja je razlika između FFPE i zamrznutog tkiva?
FFPE tkivo (fiksirano formalinom i uklopljeno u parafin) konzervira se fiksacijom formalinom, a zatim se uklapa u parafinski vosak, što omogućuje dugotrajnu pohranu na sobnoj temperaturi uz očuvanje morfologije tkiva. Nasuprot tome, zamrznuto tkivo brzo se konzervira zamrzavanjem, čime se bolje očuva integritet nukleinskih kiselina i proteina, ali zahtijeva pohranu na vrlo niskim temperaturama.
Koje se kemikalije upotrebljavaju za uklapanje FFPE tkiva?
Kemikalije koje se upotrebljavaju za uklapanje u parafin pri pripremi FFPE uzoraka obično uključuju formalin za fiksaciju i parafinski vosak za uklapanje. Pri pripremi FFPE uzoraka tkiva se obično fiksiraju ili 10% (v/v) neutralnim puferiranim formalinom (FA) ili svježe pripremljenom 4% (w/v) otopinom formaldehida (PFA) dobivenom iz paraformaldehida u prahu. Formalin, otopina formaldehida u vodi, puferira se na neutralni pH kako bi se očuvala morfologija tkiva i spriječilo prekomjerno umrežavanje. Otopina na bazi paraformaldehida također omogućuje učinkovitu fiksaciju umrežavanjem proteina, čime stabilizira strukturu tkiva za naknadno uklapanje u parafinski vosak. Te su kemikalije ključne za očuvanje cjelovitosti i morfologije tkiva tijekom postupka fiksacije i uklapanja.
Kako se parafin uklanja iz FFPE uzoraka?
Kako bi se parafin uklonio iz FFPE uzoraka, rezovi tkiva obično se podvrgavaju nizu ispiranja ksilenom, nakon čega slijedi rehidracija kroz niz otopina alkohola postupno promjenjivih koncentracija i naposljetku vodu. Budući da je ksilen vrlo toksičan i predstavlja zdravstvene rizike poput respiratornih tegoba, nadraženosti kože i mogućih dugoročnih učinaka pri ponavljanom izlaganju, ultrazvučno uklanjanje parafina postaje obećavajuća alternativa u mnogim laboratorijima. Ova metoda primjenjuje intenzivne ultrazvučne valove za učinkovito i sigurno uklanjanje parafina bez potrebe za toksičnim otapalima poput ksilena, čime se smanjuje rizik za laboratorijsko osoblje i stvara sigurnije radno okruženje.
Koliko dugo trebam fiksirati tkiva kako bih dobio kvalitetne FFPE uzorke?
Opće preporuke za trajanje fiksacije obično predlažu fiksiranje uzoraka tkiva u formalinu tijekom 24 do 48 sati. To je trajanje uglavnom dovoljno za očuvanje morfologije tkiva i staničnih struktura uz svođenje prekomjerne fiksacije na najmanju moguću mjeru, jer ona može dovesti do prekomjernog umrežavanja i razgradnje nukleinskih kiselina i proteina. Međutim, optimalno vrijeme fiksacije može varirati ovisno o veličini i vrsti tkiva, pri čemu manji ili osjetljiviji uzorci zahtijevaju kraće vrijeme fiksacije. Ključno je postići ravnotežu između odgovarajuće fiksacije kojom se sprječavaju autoliza i razgradnja tkiva te izbjegavanja dugotrajne fiksacije koja bi mogla otežati naknadne molekularne analize.