Ultrazvučna fragmentacija DNA za sekvenciranje sljedećeg gena
Sekvenciranje sljedeće generacije (NGS) zahtijeva pouzdano striženje i fragmentaciju genomske DNA kako bi se sekvencionirali genomski DNK niti i stvorile knjižnice genoma. Kontrolirana fragmentacija DNA u fragmente DNA bitan je korak pripreme uzorka potreban prije sekvenciranja DNA. Ultrasonication je dokazano kao učinkovita i pouzdana tehnika za fragmentaciju DNA određene duljine. Ultrazvučni protokoli fragmentacije DNA postižu ponovljive rezultate fragmentacije. Hielscher ultrasonicators su sposobni proizvesti širok raspon genomskih DNA fragmenta veličine raspodjele, precizno kontrolirati putem operativnih parametara. Budući da su Hielscher ultrazvučni sustavi za siječenje DNA dostupni za pojedinačne i višestruke bočice, kao i za mikroploče, priprema uzorka postaje vrlo učinkovita.
Elektroforetski analiza genomske DNA iz E.coli EDL933 podvrgnuti na 0 - 15 min ultrazvukom. L označava DNA ljestve. (Basselet et al. 2008)
- ponovljivi / ponovljivi rezultati
- precizno podesivo kako bi se dobila određena duljina fragmenta
- brza obrada
- dosljedni rezultati fragmentacije DNA
- za sve količine uzoraka (npr. više bočica ili mikroploča)
- visoka propusnost
- precizna kontrola temperature
- jednostavan, jednostavan rad
Sekvenciranje sljedeće generacije: Ultrazvučna fragmentacija DNA za pripremu knjižnice
Da bi se provelo sekvenciranje sljedeće generacije, moraju se provesti tri osnovna koraka (1) pripreme knjižnice, (2) sekvenciranja i (3) analize podataka. Tijekom pripreme knjižnice, DNA je fragmentirana, zatim se fragmenti popravljaju (poliraju) dodavanjem jedne adeninske baze, a ciljni fragmenti se pretvaraju u dvolančanu DNK. Konačno, takozvani adapteri su pričvršćeni podvezivanjem, PCR-om ili tagmentacijom tako da se konačni DNA proizvod knjižnice može kvantificirati za sekvenciranje.
Fragmentacija DNA pomoću Sonication: Pogotovo kada kratko čitanje sekvenciranje tehnologije kao što su Illumina, koji ne mogu čitati duže DNK fragmente lako, DNA stoji mora biti fragmentiran na određenu veličinu koja se može postići pouzdano ultrazvukom.
Ultrazvuka može se pouzdano koristiti za DNK, RNA i kromatina fragmentacije.
Kako djeluje ultrazvučna fragmentacija DNA?
Sonication, također poznat kao akustična obrada uzoraka, je široko korištena metoda za fragmentiranje DNA. Za ultrazvučno siječenje DNA, uzorci su izloženi ultrazvučnim valovima pod kontroliranim stanjem. Princip rada ultrazvučne fragmentacije DNA temelji se na vibracijama i kavitaciji koju stvaraju ultrazvučni valovi. Sile smicanja koje proizlaze iz ultrazvučne (akustične) kavitacije razbijaju molekule DNA visoke molekularne težine. Postavka ultrazvukom kao što su intenzitet (amplituda, trajanje), pulsirajući način rada i temperatura omogućuju preciznu fragmentaciju DNA na određenu željenu duljinu DNK fragmenata. Dok JE DNA često smanjena na 100 do 600 bp pomoću ultrazvuka, duže FRAGMENTI DNA do 1300 bp mogu se dobiti kada se primjenjuju blaži ultrazvučni uvjeti.
Ultrazvučni DNK striženje tijekom ChIP – kromatina imunoprecipitaciju
Prilagođeno iz Jkwchuija pod CC-BY-SA.03
Kontrola temperature kako bi se spriječila degradacija DNA
Dvolančani molekularni oblik DNA vrlo je osjetljiv na povišene temperature tako da je točna kontrola temperature tijekom koraka pripreme uzorka ključan čimbenik za pouzdane rezultate analize.
Bilo da koristite Hielscher sonde ultrasonicators, VialTweeter ili UIP400MTP – kontinuirano praćenje i kontrola temperature osigurani su zahvaljujući senzoru temperature koji se može priključiti i softveru pametnog uređaja. Da biste održali temperaturu unutar određenog raspona, možete postaviti gornju i donju temperaturnu granicu. Prema tome, ultrasonicator će pauzirati čim se prekorači ova granica temperature i automatski će nastaviti sonikirati kada se temperatura spusti za postavljeni ∆T.
Sofisticirani softver Hielscher ultrasonicators osigurava pouzdano održavanje idealnih uvjeta liječenja uzorka.
Fragmentacija DNA uzorka mase s UIP400MTP multi-well ploča ultrasonicator
Broj uzoraka u znanosti o životu značajno se povećao u posljednjem desetljeću. To znači da se vrlo velik broj uzoraka (npr. 384, 1536 ili 3456 bušotina po mikroplati) mora obraditi tijekom pripreme i analize uzorka pod dosljedno jednakim uvjetima kako bi se dobili usporedivi i valjani rezultati. S UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics slijedi trend masovne obrade uzoraka. UIP400MTP je ultrasonicator za pripremu uzoraka pomoću mikroploča. UIP400MTP može obraditi ploče sa 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ili 3456 bušotina. Ovisno o vrsti mikroploče, svaka bušotina obično može držati volumene uzoraka između desetaka nanolitara do nekoliko mililitara. Široko korišten u istraživanjima znanosti o životu, UIP400MTP se vrlo često koristi za pripremu uzoraka prije analiza kao što su ELISA (enzimski imunosorbentni test) ili PCR, prije analitike proteina, kao i za pripremu kromatina prije CHiP i CHiP-seq, identifikaciju modifikacije histona i druge analitičke tretmane (npr. gel elektroforeza, masena spektrometrija).
VialTweeter za uzorak praparacije do 10 bočica
VialTweeter je široko korišteni laboratorijski ultrasonicator VialTweeter koji omogućuje učinkovitu i udobnu ultrazvukom do 10 bočica istovremeno. Budući da se bočice i epruvete (npr. Eppendorf bočice, krio bočice, centrifuge) indirektno ultrazvukom izbjegavaju unakrsnu kontaminaciju. Kako se isti ultrazvučni intenzitet isporučuje svakom uzorku, svi rezultati ultrazvukom su homogeni i ponovljivi. VialTweeter nudi sve pametne značajke kao što su naši drugi digitalni uređaji (npr. pametni izbornik, programabilne postavke, kontrola temperature, daljinski upravljač itd.) kako bi se osigurala najveća udobnost korisnika.
Sonde s više prstiju za Microwell ploče
Dostupan za ultrazvučne sonde homogenizatori UP200Ht i UP200St, multi-prst sonde s 4 ili 8 prstiju su udobna opcija za sonikiranje više uzoraka u isto vrijeme pod istim uvjetima. Na primjer, sonotrode MTP-24-8-96 je sonda s osam prstiju, koja je idealna za integraciju u automatizirane sustave ili učinkovitu ručnu pripremu uzoraka bušotina ploča s više bušotina. Sonotrode s više prstiju idealan je za automatiziranje za laboratorije, gdje se obrađuju uglavnom čaše i epruvete pomoću standardne ultrazvučne sonotrode. Multi-prst i standardne sonde mogu se brzo međusobno promijeniti u roku od nekoliko minuta pretvarajući jednostruki sonda ultrasonicator u multi-sonda ultrazvučni disruptor.
Hielscher Ultrasonicators za fragmentaciju DNA
Hielscher Ultrasonics nudi razne ultrazvučne platforme za DNK, RNA, i kromatina fragmentacije. Ove različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrodes), neizravne sonication rješenja za istovremenu pripremu uzoraka više cijevi ili više-bušotinskih ploča (npr. Ploče od 96 bušotina, mikrotiter ploče), sonoreactors, i ultrazvučni cuphorns. Sve platforme za sijeknje DNA pokreću se frekvencijski podešenim ultrazvučnim procesorima visokih performansi, koji se precizno mogu kontrolirati i pružiti ponovljive rezultate.
Ultrazvučni procesori za bilo koji broj i veličinu uzorka
S Hielscherovim multi-uzorak ultrasonicators VialTweeter (za do 10 epruvete) i UIP400MTP (za mikroplate / multiwell ploče) postaje lako moguće smanjiti vrijeme obrade uzorka zbog intenzivne i precizno kontrolirane ultrazvuke, a dobivanje željene raspodjele i prinosa veličine fragmenta DNA. Ultrazvučna fragmentacija DNA čini pripremu uzorka učinkovitom, pouzdanom i skalabilnom. Protokoli se mogu linearno skalirati od jednog do brojnih uzoraka primjenom stalno kontroliranog ultrazvuka.
Sonda ultrasonicators s jednim do pet prstiju idealni su za pripremu manjih brojeva uzoraka. Hielscher laboratorij ultrasonicators su dostupni u različitim veličinama, tako da vam možemo preporučiti idealan uređaj za vašu primjenu i zahtjeve.
Točna kontrola procesa
Precizno kontrolirane postavke ultrazvukom su presudne jer iscrpno sonifikacija može uništiti DNA, RNA i kromatin, ali neadekvatno ultrazvučno šišanje rezultira predugim fragmentima DNA i kromatina. Hielscher digitalni ultrasonicators može se lako postaviti na precizan sonication parametar. Specifične postavke ultrazvukom također se mogu spremiti kao programirana postavka za brzo ponavljanje istog postupka.
Sva sonicacija automatski se protokolira i pohranjuje kao CSV datoteka na ugrađenoj SD kartici. To omogućuje točnu dokumentaciju izvedenih ispitivanja i omogućuje jednostavnu reviziju ultrazvukom.
Putem daljinskog upravljača preglednika, svi digitalni ultrasonicators mogu raditi i pratiti putem bilo kojeg standardnog preglednika. Instalacija dodatnog softvera nije potrebna, jer LAN veza omogućuje vrlo jednostavno postavljanje plug-n-playa.
Najveća jednostavnost korištenja u ultrazvučnoj pripremi uzoraka
Svi Hielscher ultrasonicators su dizajnirani za pružanje ultrazvuka visokih performansi, dok je u isto vrijeme uvijek vrlo jednostavan za korištenje i jednostavan za rukovanje. Sve su postavke dobro strukturirane u jasnom izborniku, kojem se lako može pristupiti putem zaslona osjetljivog na dodir u boji ili daljinskog upravljača preglednika. Pametni softver s programabilnim postavkama i automatskim snimanjem podataka osigurava optimalne postavke ultrazvukom za pouzdane i ponovljive rezultate. Čisto i jednostavno sučelje izbornika pretvara Hielscher ultrasonicators u jednostavne i učinkovite uređaje.
Tablica u nastavku daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših laboratorijskih ultrasonicatora, koji su idealni za zadatke pripreme uzoraka kao što su fragmentacija DNA i RNA, liza stanica, kao i ekstrakcija proteina:
| Uređaj | Snaga [W] | Tip | Volumen [ml] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | za mikroploča | 6 – 3456 bunara | VialTweeter | 200 | do 10 bočica plus mogućnost stezanja | 00,5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | Sonda tipa | 00,01 – 250 |
| UP100H | 100 | Sonda tipa | 00,01 – 500 |
| Uf200 ः t | 200 | Sonda tipa | 00,1 – 1000 |
| UP200St | 200 | Sonda tipa | 00,1 – 1000 |
| UP400St | 400 | Sonda tipa | 5,0 – 2000 |
| Cuphorn | 200 | CupHorn, sonoglumac | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | stanice protoka bez onečišćenja |
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Ultrazvučna jedinica za pripremu s više uzoraka VialTweeter omogućuje istovremenu sonikaciju do 10 bočica. S uređajem za stezanje VialPress, do 4 dodatne cijevi mogu se pritisnuti na prednju stranu radi intenzivne sonikacije.
Sonotrode MTP-24-8-96 ima osam ultrazvučnih sondi za sonikaciju bunara mikrotitarskih ploča.
Književnost / Reference
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Činjenice koje vrijedi znati
Što je sekvenciranje sljedeće generacije?
Sekvenciranje sljedeće generacije, također Sekvenciranje next gena (NGS), sekvenciranje visoke propusnosti ili sekvenciranje druge generacije, odnosi se na pristup masivnog paralelnog sekvenciranja, gdje se vrlo velike (masivne) količine DNK milijuna fragmenata sekvenciraju istodobno po vožnji.
Da bi se provelo sekvenciranje sljedeće generacije, moraju se provesti tri osnovna koraka (1) pripreme knjižnice, (2) sekvenciranja i (3) analize podataka. Tijekom pripreme knjižnice, DNK niti moraju biti fragmentirane u fragmente DNA određene duljine. Sonication je jedna od preferiranih tehnika za fragmentiranje DNA.
Tijekom procesa sekvenciranja DNA, redoslijed nukleotida u DNK – nukleinska kiselina – određuje se. Slijed nukleinskih kiselina sastoji se od četiri baze nukleotida – adenina, citozina, guanina, tilina – koji kod za informacije.
Sekvenciranje sljedeće generacije potiče istraživanja u znanosti o životu i personaliziranoj medicini budući da se sekvenciranje DNA i RNA uvelike koristi u genomskim istraživanjima, istraživanju raka, istraživanju rijetkih i složenih bolesti, mikrobnim istraživanjima, agrogenomiji i mnogim drugim područjima istraživanja.
Sekvenciranje sljedeće generacije vs Sanger sekvenciranje
Dok je kod sekvenciranja sljedeće generacije (NGS) moguće sekvencirati ogroman broj genomskih uzoraka, Sekvenciranje Sangera (također poznato kao metoda prekida lanca ili sekvenciranje prve generacije) ima samo sposobnost sekvenciranja malih brojeva uzoraka. Sanger sekvenciranje sekvencira samo jedan DNK fragment u isto vrijeme i može se postići u jednom danu. Zbog svoje akuracije, sekvenciranje Sangera također se smatra tehnologijom zlatnog standarda, koja se koristi za provjeru rezultata dobivenih sekvenciranjem sljedeće generacije.
Sekvenciranje Sangera postiže duljinu čitanja od oko 800bp (obično 500-600bp s neobogaćenom DNA). Duže duljine čitanja u Sekvenciratu Sangera pokazuju značajne prednosti u odnosu na druge metode sekvenciranja, posebno u smislu sekvenciranja ponavljajućih područja genoma. Izazov kratko čitanih podataka o sekvenci posebno je problem u sekvencitiranim novim genomima (de novo) i sekvenciranim visoko preuređenim segmentima genoma, obično onima koji se vide u genomima raka ili u regijama kromosoma koji pokazuju strukturne varijacije. [Cp. Morozova i Marra, 2008.]
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi Laboratorija do industrijske veličine.