Ultrazvučna fragmentacija DNK za sekvenciranje sljedeće generacije
Sekvenciranje sljedeće generacije (NGS) zahtijeva pouzdano šišanje i fragmentaciju genomske DNK kako bi se sekvencirali lanci genomske DNK i stvorile biblioteke genoma. Kontrolirana fragmentacija DNA u fragmente DNA bitan je korak pripreme uzorka prije sekvencioniranja DNA. Ultrasonication je dokazano kao učinkovita i pouzdana tehnika za fragmentaciju DNA određene duljine. Ultrazvučni protokoli fragmentacije DNA postižu ponovljive rezultate fragmentacije. Hielscher ultrasonicators su sposobni za proizvodnju širokog raspona distribucije veličine fragmenata genomske DNA, precizno kontrolirati preko radnih parametara. Budući da su Hielscher ultrazvučni sustavi za smicanje DNK dostupni za jednu i više bočica, kao i za mikropločice, priprema uzorka postaje vrlo učinkovita.
Sonikator ploča UIP400MTP za visokoučinkovitu pripremu uzoraka, ravnomjerno sonicira uzorke u pločama s više jažica, mikrotitarskim pločama i pločama s 96 jažica
- ponovljivi/reproducibilni rezultati
- precizno podesiv za postizanje određene duljine fragmenata
- Brza obrada
- dosljedni rezultati fragmentacije DNA
- uređaji za bilo koji volumen uzorka (npr. više bočica ili mikropločica)
- Visoka propusnost
- precizna kontrola temperature
- jednostavan rad lak za korištenje
Sekvenciranje sljedeće generacije: Ultrazvučna fragmentacija DNK za pripremu knjižnice
Kako bi se provelo sekvenciranje sljedeće generacije, moraju se provesti tri osnovna koraka (1) priprema knjižnice, (2) sekvenciranje i (3) analiza podataka. Tijekom pripreme biblioteke, DNK se fragmentira, zatim se krajevi fragmenata popravljaju (poliraju) dodavanjem jedne baze adenina i ciljni fragmenti se pretvaraju u dvolančanu DNK. Na kraju se takozvani adapteri pričvršćuju ligacijom, PCR-om ili označavanjem tako da se konačni DNK produkt knjižnice može kvantificirati za sekvencioniranje.
Fragmentacija DNK pomoću sonikacije: Osobito kod tehnologija sekvenciranja kratkog čitanja kao što je Illumina, koja ne može lako čitati duže fragmente DNK, stalci DNK moraju biti fragmentirani do određene veličine koja se može pouzdano postići ultrazvučnom obradom.
Ultrasonication se pouzdano može koristiti za fragmentaciju DNA, RNA i kromatina.
Sekvenciranje sljedeće generacije – priprema knjižnice
Ultrazvučna fragmentacija DNK obično se koristi u pripremi biblioteka za sekvenciranje DNK za platforme za sekvenciranje sljedeće generacije (NGS). Ova se tehnika koristi za razbijanje molekula DNA u manje fragmente željenog raspona veličina, što olakšava sljedeće korake u pripremi knjižnice. Ultrazvučna fragmentacija DNK obično je potrebna tijekom koraka pripreme biblioteke u radnim procesima NGS-a za fragmentaciju genomske DNK u manje dijelove prikladne za daljnju obradu i sekvenciranje. Igra ključnu ulogu u osiguravanju uspjeha eksperimenta sekvenciranja generiranjem fragmenata DNK odgovarajućeg raspona veličina za specifičnu platformu sekvenciranja koja se koristi.
Elektroforetske analize genomske DNA E. coli EDL933 podvrgnute ultrazvučnoj obradi 0 – 15 minuta. L označava DNK ljestvicu. (Basselet et al. 2008.)
Sekvenciranje sljedeće generacije – Koraci procesa:
- Ultrazvučna fragmentacija DNK: Prije izgradnje biblioteke, genomska DNK se fragmentira u manje dijelove kojima se lakše upravlja. Ultrazvučna fragmentacija uključuje korištenje visokofrekventnih zvučnih valova za smicanje molekula DNK u fragmente željenog raspona veličina. Ovaj je korak ključan jer pomaže osigurati da će kasnije generirana očitanja sekvenciranja biti odgovarajuće duljine za platformu sekvenciranja koja se koristi. Raspon veličine fragmenata može se prilagoditi na temelju specifičnih zahtjeva eksperimenta sekvenciranja.
- Klonalna amplifikacija pomoću PCR-a: Nakon ultrazvučne fragmentacije, fragmenti DNK podvrgavaju se popravku kraja, povezivanju adaptera i PCR amplifikaciji kako bi se stvorile konačne biblioteke sekvenciranja DNK. Ovi koraci pripremaju fragmentirane molekule DNA za proces sekvenciranja dodavanjem adapterskih sekvenci potrebnih za vezanje na platformu za sekvenciranje i osiguravanje početnih mjesta za PCR pojačanje.
- Sekvenciranje DNK sintezom: Nakon što se pripreme biblioteke za sekvenciranje, započinje proces sekvenciranja DNK sintezom (SBS). Tijekom SBS-a, sekvenca DNA određena je sekvencijalnim dodavanjem nukleotida komplementarnom lancu. Ovaj korak uključuje cikličke reakcije ugradnje nukleotida, snimanja i cijepanja, što omogućuje određivanje sekvence DNA na temelju fluorescentnih signala koje emitiraju ugrađeni nukleotidi.
- Masivno paralelno sekvenciranje: U završnom koraku, prostorno odvojeni, amplificirani predlošci DNK sekvenciraju se simultano na masovno paralelan način. Ovaj pristup sekvenciranja visoke propusnosti omogućuje generiranje milijuna do milijardi čitanja sekvenciranja u jednom sekvencioniranju, što omogućuje učinkovito i brzo određivanje sekvenci DNK.
Kako radi ultrazvučna fragmentacija DNK?
Sonikacija, također poznata kao akustična obrada uzoraka, široko je korištena metoda za fragmentiranje DNK. Za ultrazvučno rezanje DNK, uzorci se izlažu ultrazvučnim valovima u kontroliranim uvjetima. Princip rada ultrazvučne fragmentacije DNK temelji se na vibracijama i kavitaciji koju stvaraju ultrazvučni valovi. Smične sile koje proizlaze iz ultrazvučne (akustične) kavitacije lome molekule DNA velike molekularne težine. Postavke ultrazvuka kao što su intenzitet (amplituda, trajanje), način pulsiranja i temperatura omogućuju preciznu fragmentaciju DNA do određene željene duljine fragmenata DNA. Dok se DNK često smanjuje na 100 do 600 bp korištenjem ultrazvučne obrade, dulji fragmenti DNK do 1300 bp mogu se dobiti kada se primjenjuju blaži ultrazvučni uvjeti.
Ultrazvučno rezanje DNK tijekom ChIP-a – imunoprecipitacija kromatina
Prilagođeno iz Jkwchui pod CC-BY-SA.03
Kontrola temperature za sprječavanje degradacije DNK
Dvolančani molekularni oblik DNA vrlo je osjetljiv na povišene temperature tako da je točna kontrola temperature tijekom koraka pripreme uzorka ključni faktor za pouzdane rezultate analize.
Bez obzira koristite li Hielscherove ultrazvučne sonde, VialTweeter ili UIP400MTP – Stalno praćenje i kontrola temperature osigurani su senzorom temperature koji se može priključiti i softverom pametnog uređaja. Kako biste održali temperaturu unutar određenog raspona, možete postaviti gornju i donju granicu temperature. Posljedično, ultrazvučni uređaj će se zaustaviti čim se prekorači ovo temperaturno ograničenje i automatski će nastaviti sonikirati kada se temperatura spusti za postavljeni ∆T.
Sofisticirani softver Hielscher ultrasonicators osigurava pouzdano održavanje idealnih uvjeta obrade uzoraka.
Fragmentacija DNK masovnog uzorka s UIP400MTP ultrasonicatorom ploče s više jažica
Broj uzoraka u znanosti o životu značajno se povećao u posljednjem desetljeću. To znači da se vrlo velik broj uzoraka (npr. 384, 1536 ili 3456 jažica po mikropločici) mora obraditi tijekom pripreme uzorka i analize pod dosljedno jednakim uvjetima kako bi se dobili usporedivi i valjani rezultati. S UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics slijedi trend masovne obrade uzoraka. UIP400MTP je ultrazvučni uređaj za pripremu uzorka pomoću mikropločica. UIP400MTP može obrađivati ploče sa 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ili 3456 jažica. Ovisno o vrsti mikropločice, svaka jažica obično može sadržavati volumen uzorka između desetaka nanolitara do nekoliko mililitara. Široko korišten u istraživanju znanosti o životu, UIP400MTP se vrlo često koristi za pripremu uzoraka prije analiza kao što je ELISA (enzimski imunoanaliza) ili PCR, prije analize proteina, kao i za pripremu kromatina prije CHiP i CHiP-seq, modifikacije histona identifikacija i drugi analitički tretmani (npr. gel elektroforeza, masena spektrometrija).
VialTweeter za pripremu uzoraka do 10 bočica
VialTweeter široko je korišten laboratorijski ultrazvučni uređaj VialTweeter koji omogućuje učinkovitu i udobnu sonikaciju do 10 bočica istovremeno. Budući da se bočice i epruvete (npr. Eppendorfove bočice, krio bočice, epruvete za centrifuge) neizravno soniciraju, izbjegava se svaka unakrsna kontaminacija. Kako se isti intenzitet ultrazvuka isporučuje svakom uzorku, svi rezultati sonikacije su homogeni i ponovljivi. VialTweeter nudi sve pametne značajke kao i naši drugi digitalni uređaji (npr. pametni izbornik, programabilne postavke, kontrola temperature, daljinski upravljač itd.) tako da je zajamčena najveća udobnost za korisnika.
Sonde s više prstiju za mikrojažične ploče
Dostupne za homogenizatore ultrazvučne sonde UP200Ht i UP200St, sonde s više prstiju s 4 ili 8 prstiju udobna su opcija za sonikaciju više uzoraka u isto vrijeme pod istim uvjetima. Na primjer, sonotroda MTP-24-8-96 je sonda s osam prstiju, koja je idealna za integraciju u automatizirane sustave ili učinkovitu ručnu pripremu uzorka jažica ploča s više jažica. Sonotroda s više prstiju idealna je za automatizirane laboratorije, gdje se uglavnom obrađuju čaše i epruvete pomoću standardne ultrazvučne sonotrode. Višeprstne i standardne sonde mogu se brzo zamijeniti unutar nekoliko minuta transformirajući ultrazvučni uređaj s jednom sondom u ultrazvučni disruptor s više sondi.
Hielscher ultrazvučni uređaji za fragmentaciju DNA
Hielscher Ultrasonics nudi različite platforme temeljene na ultrazvuku za fragmentaciju DNK, RNK i kromatina. Ove različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrode), rješenja za neizravnu sonikaciju za simultanu pripremu uzorka više epruveta ili ploča s više jažica (npr. ploče s 96 jažica, mikrotitarske ploče), sonoreaktore i ultrazvučne kuporne. Sve platforme za rezanje DNK pokreću frekvencijski podešeni ultrazvučni procesori visokih performansi, kojima se može precizno upravljati i daju ponovljive rezultate.
Ultrazvučni procesori za bilo koji broj i veličinu uzorka
S Hielscherovim ultrazvučnim uređajima za više uzoraka VialTweeter (za do 10 epruveta) i UIP400MTP (za mikroploče/pločice s više jažica) postaje lako moguće smanjiti vrijeme obrade uzorka zahvaljujući intenzivnoj i precizno kontroliranoj ultrazvučnoj obradi uz dobivanje željene distribucije veličine fragmenta DNA i prinosa . Ultrazvučna fragmentacija DNK čini pripremu uzorka učinkovitom, pouzdanom i skalabilnom. Protokoli se mogu linearno skalirati od jednog do više uzoraka primjenom stalno kontroliranog ultrazvuka.
Sonda ultrasonicators s jednim do pet prstiju idealna je za pripremu manjeg broja uzoraka. Hielscherovi laboratorijski ultrazvučni uređaji dostupni su u različitim veličinama kako bismo vam mogli preporučiti idealan uređaj za vašu primjenu i zahtjeve.
precizna kontrola procesa
Precizno kontrolirane postavke sonikacije su ključne jer iscrpna sonifikacija može uništiti DNK, RNK i kromatin, ali neadekvatno ultrazvučno smicanje rezultira predugačkim fragmentima DNK i kromatina. Hielscherovi digitalni ultrazvučni uređaji mogu se jednostavno postaviti na precizne parametre sonikacije. Specifične postavke ultrazvuka također se mogu spremiti kao programirane postavke za brzo ponavljanje istog postupka.
Sva sonikacija se automatski protokolira i pohranjuje kao CSV datoteka na ugrađenu SD karticu. To omogućuje točnu dokumentaciju izvedenih ispitivanja i omogućuje jednostavnu reviziju sonikacijskih radova.
Preko daljinskog upravljača preglednika, svim digitalnim ultrazvučnim uređajima može se upravljati i nadzirati putem bilo kojeg standardnog preglednika. Instalacija dodatnog softvera nije potrebna, jer LAN veza omogućuje vrlo jednostavno plug-n-play postavljanje.
Najveća jednostavnost upotrebe u ultrazvučnoj pripremi uzorka
Svi Hielscher ultrasonicators dizajnirani su za pružanje ultrazvuka visokih performansi, dok su u isto vrijeme uvijek vrlo jednostavni za korištenje i jednostavni za rukovanje. Sve postavke su dobro strukturirane u preglednom izborniku, kojem se lako može pristupiti putem dodirnog zaslona u boji ili daljinskog upravljača preglednika. Pametan softver s programabilnim postavkama i automatskim snimanjem podataka osigurava optimalne postavke sonikacije za pouzdane i ponovljive rezultate. Čisto i jednostavno sučelje izbornika pretvara Hielscher ultrasonicators u user-friendly i učinkovite uređaje.
Donja tablica daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših laboratorijskih ultrazvučnih uređaja, koji su idealni za zadatke pripreme uzoraka kao što su fragmentacija DNA i RNA, liza stanica kao i ekstrakcija proteina:
| Uređaj | Snaga [W] | Tip | Volumen [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | za mikroploče | 6 – 3456 bunara | VialTweeter | 200 | za do 10 bočica plus mogućnost pričvršćivanja | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | tip sonde | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | tip sonde | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | tip sonde | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | tip sonde | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | tip sonde | 5.0 – 2000. godine |
| kuphorn | 200 | CupHorn, sonoreaktor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | protočna ćelija bez kontaminacije |
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Ultrazvučna jedinica za pripremu više uzoraka VialTweeter omogućuje istovremenu sonikaciju do 10 bočica. S uređajem za stezanje VialPress, do 4 dodatne cijevi mogu se pritisnuti naprijed za intenzivnu sonikaciju.
Sonotroda MTP-24-8-96 ima osam ultrazvučnih sondi za sonikaciju jažica mikrotitarskih ploča.
Literatura / Reference
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Činjenice koje vrijedi znati
Što je sekvenciranje sljedeće generacije?
Sekvenciranje sljedeće generacije, također i sekvenciranje sljedeće generacije (NGS), visokopropusno sekvenciranje ili sekvenciranje druge generacije, odnosi se na pristup masivnog paralelnog sekvenciranja, gdje se vrlo velike (masivne) količine DNK od milijuna fragmenata sekvenciraju istovremeno paralelno po vožnji.
Kako bi se provelo sekvenciranje sljedeće generacije, potrebna su tri osnovna koraka
- priprema knjižnice,
- sekvenciranje, i
- Analiza podataka
su potrebni.
Tijekom pripreme biblioteke, DNK lanci moraju biti fragmentirani u DNK fragmente određene duljine. Sonikacija je jedna od preferiranih tehnika za fragmentiranje DNK.
Tijekom procesa sekvenciranja DNK, redoslijed nukleotida u DNK – poznat kao sekvenca nukleinske kiseline – određuje se. Sekvenca nukleinske kiseline sastoji se od četiri nukleotidne baze – adenin, citozin, guanin, timin – koji kod za informacije.
Sekvenciranje sljedeće generacije pokreće istraživanja u znanosti o životu i personaliziranoj medicini budući da se sekvenciranje DNA i RNA uvelike koristi u genomskim istraživanjima, istraživanju raka, istraživanju rijetkih i složenih bolesti, istraživanju mikroba, agrigenomici i mnogim drugim istraživačkim poljima.
Sekvenciranje sljedeće generacije u odnosu na Sangerovo sekvenciranje
Dok je sekvenciranjem sljedeće generacije (NGS) moguće sekvencirati ogroman broj genomskih uzoraka, Sangerovo sekvenciranje (poznato i kao metoda prekidanja lanca ili sekvenciranje prve generacije) ima samo mogućnost sekvenciranja malog broja uzoraka. Sangerovo sekvenciranje samo sekvencira jedan po jedan fragment DNK u isto vrijeme i može se izvršiti u jednom danu. Zbog svoje točnosti, Sangerovo sekvenciranje također se smatra zlatnim standardom tehnologije, koja se koristi za provjeru rezultata dobivenih sekvenciranjem sljedeće generacije.
Sangerovo sekvenciranje postiže duljine čitanja od približno 800 bp (obično 500-600 bp s neobogaćenom DNK). Dulje duljine čitanja u Sangerovom sekvenciranju pokazuju značajne prednosti u odnosu na druge metode sekvenciranja, posebno u smislu sekvenciranja ponavljajućih regija genoma. Izazov podataka kratkog očitavanja sekvenci posebno je problem u sekvenciranju novih genoma (de novo) i u sekvenciranju visoko preuređenih segmenata genoma, obično onih koji se vide u genomima raka ili u regijama kromosoma koji pokazuju strukturnu varijaciju. [cp. Morozova i Marra, 2008.]
DNK – Deoksiribonukleinska kiselina – Njegovi oblici i funkcije
Svaki oblik DNK ima jedinstvene karakteristike i primjene, pridonoseći širokom spektru istraživačkih polja, uključujući onkologiju, genetiku, forenzičku znanost i evolucijsku biologiju. Hielscher sonikatori su vrlo učinkovito i pouzdano rješenje za izolaciju i fragmentiranje DNK i RNK za potrebe vaše analize. Na donjem popisu objašnjavamo vam specifične oblike DNK i kategoriziramo ih na temelju njihovog biološkog konteksta i funkcija:
- Genomska DNA (gDNA)
Genomska DNK (gDNK): Kompletan skup DNK u organizmu, uključujući i kodirajuće (gene) i nekodirajuće regije. - Izvanstanična DNA
Cirkulirajuća tumorska DNA (ctDNA): Fragmenti DNK koje tumorske stanice otpuštaju u krvotok.
DNA bez stanica (cfDNA): Fragmenti DNK slobodno cirkuliraju u krvotoku, a potječu iz različitih tkiva. - Ekstrakromosomska kružna DNK (eccDNA): Kružne molekule DNA koje se nalaze izvan kromosoma u eukariotskim stanicama.
Virusna DNK: DNK koja potječe iz virusa, integrirana u genom domaćina ili kao episomalna DNK. - mitohondrijska DNA
Mitohondrijska DNA (mtDNA): DNK koja se nalazi u mitohondrijima, nasljeđuje se s majke i uključena je u proizvodnju energije. - plazmid DNA
Plazmid DNA: Male, kružne molekule DNK koje se repliciraju neovisno o kromosomskoj DNK, obično se nalaze u bakterijama i koriste se u genetičkom inženjeringu. - nuklearna DNK
Nuklearna DNK (nDNK): DNK sadržana u jezgri eukariotskih stanica, koja čini većinu genetskog materijala u organizmu. - Jednostanična DNA
Jednostanična DNA (scDNA): DNK ekstrahirana iz jedne stanice, koja se koristi za detaljnu genomsku analizu na razini pojedinačne stanice. - Rekombinantna DNA
Rekombinantna DNA (rDNA): Molekule DNA formirane laboratorijskim metodama genetske rekombinacije kako bi se spojio genetski materijal iz više izvora. - Specijalizirani obrasci
DNK okoliša (eDNA): DNK prikupljena iz uzoraka okoliša (tlo, voda) bez izolacije izvornih organizama
Drevni DNK (aDNK): DNK izvađen iz drevnih uzoraka, pružajući uvid u evolucijsku biologiju i drevne populacije. - Kromosomska DNA
Kromosomska DNK: DNA koja čini kromosome unutar stanične jezgre, obuhvaćajući i kodirajuća i nekodirajuća područja. - Virusni i sintetski oblici
Virusna DNK: DNK izvedena iz virusa, koji se mogu integrirati u genome domaćina ili postojati kao neovisni entiteti.
Sintetička DNK: Umjetno sintetizirane sekvence DNK stvorene kemijskim procesima, često korištene u istraživanju i biotehnologiji.
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorija do industrijska veličina.