Ultrazvučni uzorak prep za ELISA Assays

Testovi kao što je ELISA naširoko se koriste za in vitro dijagnostiku, otkrivanje proteina povezanih s bolešću i kontrolu kvalitete (npr. praćenje alergena hrane). Ultrazvučna priprema uzoraka je brza, pouzdana i ponovljiva tehnika za lizijsku stanicu i izoliranje unutarstaničnih proteina, DNK, RNK i organela. Hielscher Ultrasonics nudi razna ultrazvučna rješenja za praktičnu pripremu pojedinačnih uzoraka, više bočica kao i za mikrotiter ploče i 96-well ploče.

Elisa – Enzimski povezani imunosorbeni assay

ELISA je kratica za imunosorbentni napad povezan s enzimom i široko je korištena tehnika biokemijske analize kategorije napada koji vežu ligand. U ELISA-i se tekući uzorak dodaje u stacionarnu čvrstu fazu s posebnim svojstvima vezanja. Obično se stacionarna čvrsta faza nanosi kao premaz na ploču bunara ili ELISA ploču. Zatim se sekvencijalno dodaju, inkubiraju i isperu razni tekući reagensi, tako da se konačno u završnoj tekućini u bunaru događa optička promjena (npr. razvoj boje proizvodom enzimske reakcije). Optička promjena omogućuje mjerenje količine analita takozvanim kvantitativnim “čitanje". Za kvantitativno očitanje koristi se spektrofotometar, fluometar ili luminometar za otkrivanje i mjerenje intenziteta prenesenog svjetla. Na osjetljivost detekcije utječe pojačavanje signala tijekom analitičkih reakcija. Budući da su reakcije enzima dobro istražene i pouzdani procesi pojačavanja, enzimi se koriste za stvaranje signala. Enzimi su povezani s reagensima za otkrivanje u fiksnim omjerima kako bi se omogućila točna kvantifikacija, što objašnjava i naziv "enzimom povezan" imunosorbeni napad.
Kako se ELISA testovi izvode u mikrotitra pločama / 96-bunarskim pločama, poznat je kao tehnika testa na bazi ploča i koristi se npr.
ELISA tehnika često se koristi kao dijagnostički alat u medicini, biotehnologiji, biljnoj patologiji, a također je važno mjerenje kontrole kvalitete u više industrija.

Ultrazvučni uzorak prep prije ELISA

Prije nego što se elisa test može izvesti, uzorci zahtijevaju korake pripreme takve stanične lize i ekstrakcije unutarstaničnih proteina, DNK, RNK itd. Prednost ultrazvučne stanične lize i izolacije proteina je njegova visoka učinkovitost, pouzdanost i ponovljivost. Svi ovi čimbenici važni su kako bi se dobila visokokvalitetna dijagnostika i rezultati istraživanja

Protokol za pre-ELISA ultrazvučnu staničnu lizu

• Za stanične kulture: Prije lize ultrazvučnih stanica, centrifuge stanice za 5 minuta na 270 x g u mikrocentrifuge. Uklonite supernatant aspiracijom i ponovnom potrošnjom stanica u 30 – 100 μL RIPA pufera. Zatim inkubijte staničnu kuglicu na ledu 30 minuta.
• Sada, uzorak stanica je spreman za ultrazvučnu lizu:
  Koristite ultrazvuk tipa sonde (npr. Uf200 ः t sa sondom S26d2) ili ultrazvučnim uređajem s više uzoraka (npr. VialTweeter za istovremenu sonikaciju do 10 bočica ili UIP400MPT za mikrotiterske ploče / 96-bunarske ploče) ovisno o količini uzoraka koje trebate pripremiti.
  Za sonikaciju sonikacije tipa sonikiranja jednog uzorka, stavite stanice u mikrocentrirajuće cijevi od 1,5 mL.
• Unaprijed postavite svoje ultrazvučno trajanje, ukupni unos energije, način ciklusa i/ili ograničenja temperature u digitalnom izborniku ultrazvuka. To osigurava vrlo pouzdanu sonikaciju i ponovljivost.
• Uključite sonotrode i uključite ultrazvučni uređaj. Nježno pomičite mikro-vrh ultrazvučne sonde kroz uzorak kako biste ravnomjerno sonicirali uzorak.
  Za većinu stanica, ultrazvučna liza će biti završena nakon 2 -4 ciklusa 10 sec sonikacije.
• Nakon sonikacije izvadite sonotrode iz uzorka. Uzorke treba inkubirati na ledu 5 min. Zatim, centrifuga na 10.000 x g za 20 min pellet krhotine. Prebacite supernatenata u novu mikrocentruge cijev. Označite analite i pohranite na -20°C.
• Ultrazvučni sonotrode može se očistiti pravilnim brisanjem alkohola ili sonicati u dabru napunjenom alkoholom, npr. Sve ultrazvučne sonde napravljene od titana su autoklave.

Za tkiva homogenates:

• Isperite tkivo ledeno hladnim PBS-om (0,01M, pH=7,4) kako biste temeljito uklonili višak krvi hemolize.
• Izvagajte tkivo (bubreg, srce, pluća, slezenu itd.) i macerirajte ga na male komadiće, koji su homogenizirani u PBS-u. Potreban volumen PBS-a povezan je s težinom tkiva. U pravilu, 1g tkiva zahtijeva cca. Preporuča se dodati neki inhibitor proteaze u PBS. (RIPA ili hipotonični međuspremnik lize koji sadrži koktel inhibitora proteaze i fosfataze može se koristiti alternativno.)
• Ovisno o veličini tkiva, kratki tretman vrtloga (cca 1-2 min. u 15 sek. impulsa) može biti od pomoći za prethodno liječenje tkiva.
• Montirajte mikro-vrh, npr. Stavite cijev uzorka s tkivom u ledenu kupku.
• Sonicirati uzorak sa svojim ultrazvukom, npr UP200St (80% amplitude) za 1 min. u pulsnom načinu rada (15sec na, 15sec pauza). Držite uzorak u ledenoj kupki.
• Homogenati se zatim centrifugiraju kako bi se dobili određeni bazeni (citosolični, nuklearni, mitohondrijski ili lisosomalni) kako bi se protein obogatio za analizu. Centrifugiranjem uzorka na 5 minuta na 5000×, supernatant se dohvaća.

Pouzdana kontrola temperature tijekom sonikacije

Temperatura je ključan čimbenik koji utječe na procese i koji je posebno važan za liječenje bioloških uzoraka, npr. Kao i sve mehaničke tehnike pripreme uzoraka, sonikacija stvara toplinu. Međutim, temperatura uzoraka može se dobro kontrolirati pri korištenju Hielscher Ultrasonics uređaja. Predstavljamo vam različite mogućnosti praćenja i kontrole temperature vaših uzoraka dok ih pripremate s ultrazvukom tipa sonde ili VialTweeterom unaprijed analitikom.

1. Praćenje temperature uzorka: Svi Hielscherovi digitalni ultrazvučni procesori opremljeni su inteligentnim softverom i senzorom temperature koji se može priključiti. Priključite senzor temperature u ultrazvučni uređaj (npr. Uf200 ः t, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) i umetnite vrh temperaturnog senzora u jednu od oglednih cijevi. Putem digitalnog zaslona osjetljivog na dodir u boji možete postaviti u izbornik ultrazvučnog procesora određeni temperaturni raspon za sonikaciju uzorka. Ultrasonikator će se automatski zaustaviti kada se dosegne maksimalna temperatura i pauzirati dok se temperatura uzorka ne spusti na nižu vrijednost postavljene temperature ∆. Tada sonikacija počinje automatski opet. Ova pametna značajka sprječava degradaciju izazvanu toplinom.
2. Što se tiče ultrazvučne jedinice s više uzoraka VialTweeter, titanski blok, koji drži cijevi uzorka, može se prethodno ohladiti. Stavite blok VialTweeter (samo sonotrode bez soducera!) u hladnjak ili zamrzivač kako biste prethodno ohladili titanski blok pomaže odgoditi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, i sam uzorak se može prethodno ohladiti.
3. Koristite ledenu kupku ili suhi led da se ohladi tijekom sonikacije. Stavite svoje ogledne cijevi tijekom sonikacije u ledenu kupku. Za VialTweeter koristite plitki pladanj ispunjen suhim ledom i stavite VialTweeter na suhi led tako da se toplina može brzo raspršiti.

Kupci diljem svijeta koriste Hielscher sondu-ultrasonikatore, kao i jedinice za sonikaciju s više uzoraka VialTweeter i UIP400MTP za svakodnevni rad na pripremi uzoraka u biološkim, biokemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijima. Inteligentni softver i kontrola temperature Hielscher procesora, temperatura se pouzdano kontrolira i izbjegava se degradacija uzorka izazvana toplinom. Ultrazvučna priprema uzoraka s Hielscherovim ultrazvučnim rješenjima daje vrlo pouzdane i ponovljive rezultate!