Ultrazvučna priprema uzoraka za testove ELISA

Testovi poput testa ELISA široko se primjenjuju u in vitro dijagnostici, otkrivanju proteina povezanih s bolestima i kontroli kvalitete (npr. praćenju alergena u hrani). Ultrazvučna priprema uzoraka brza je, pouzdana i reproducibilna tehnika za lizu stanica i izolaciju unutarstaničnih proteina, DNA, RNA i organela. Hielscher Ultrasonics nudi različita ultrazvučna rješenja za praktičnu pripremu pojedinačnih uzoraka, više bočica te mikrotitarskih pločica i pločica s 96 jažica.

ELISA – enzimski vezani imunosorbentni test

ELISA je kratica za enzimski vezani imunosorbentni test i široko je primjenjivana tehnika biokemijske analize iz kategorije testova vezanja liganda. U testu ELISA tekući se uzorak dodaje na nepokretnu čvrstu fazu s posebnim svojstvima vezanja. Nepokretna čvrsta faza obično se nanosi kao prevlaka na pločicu s jažicama ili pločicu za test ELISA. Zatim se redom dodaju različiti tekući reagensi, provode se inkubacija i ispiranje, tako da na kraju u preostaloj tekućini u jažici dolazi do optičke promjene (npr. razvoja boje zbog produkta enzimske reakcije). Optička promjena omogućuje mjerenje količine analita takozvanim kvantitativnim „očitanjem”. Za kvantitativno očitanje upotrebljava se spektrofotometar, fluorometar ili luminometar za otkrivanje i mjerenje intenziteta propuštene svjetlosti. Na osjetljivost detekcije utječe pojačavanje signala tijekom analitičkih reakcija. Budući da su enzimske reakcije dobro istraženi i pouzdani procesi pojačavanja, enzimi se upotrebljavaju za stvaranje signala. Enzimi su povezani s detekcijskim reagensima u stalnim omjerima kako bi se omogućila precizna kvantifikacija, što objašnjava i naziv „enzimski vezani” imunosorbentni test.
Budući da se testovi ELISA provode u mikrotitarskim pločicama / pločicama s 96 jažica, ELISA je poznata kao tehnika testiranja na pločicama i primjenjuje se, primjerice, u kliničkoj in vitro dijagnostici, istraživanju, razvoju lijekova itd. za otkrivanje i kvantifikaciju protutijela, peptida, proteina i hormona.
Tehnika ELISA često se upotrebljava kao dijagnostički alat u medicini, biotehnologiji i biljnoj patologiji, a ujedno je i važna metoda kontrole kvalitete u brojnim industrijama.

Ultrazvučna priprema uzoraka prije testa ELISA

Prije provođenja testa ELISA uzorci zahtijevaju pripremne korake poput lize stanica i ekstrakcije unutarstaničnih proteina, DNA, RNA itd. Prednost ultrazvučne lize stanica i izolacije proteina jest njihova visoka učinkovitost, pouzdanost i reproducibilnost. Svi su ti čimbenici važni za dobivanje visokokvalitetnih dijagnostičkih i istraživačkih rezultata

Protokol za ultrazvučnu lizu stanica prije testa ELISA

• Za stanične kulture: Prije ultrazvučne lize stanica centrifugirajte stanice u mikrocentrifugi tijekom 5 mins pri 270 x g. Uklonite supernatant aspiracijom i resuspendirajte stanice u 30 – 100 μL pufera RIPA. Zatim inkubirajte stanični talog na ledu tijekom 30 min.
• Stanični je uzorak sada spreman za ultrazvučnu lizu:
  Upotrijebite ultrazvučni uređaj sa sondom (npr. UP200Ht sa sondom S26d2) ili ultrazvučni uređaj za više uzoraka (npr. VialTweeter za istodobnu sonikaciju do 10 bočica ili UIP400MPT za mikrotitarske pločice / pločice s 96 jažica), ovisno o broju uzoraka koje trebate pripremiti.
  Za sonikaciju pojedinačnog uzorka sondom stavite stanice u mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 mL.
• U digitalnom izborniku ultrazvučnog uređaja unaprijed postavite trajanje ultrazvučne obrade, ukupni unos energije, način rada u ciklusima i/ili temperaturne granice. Time se osiguravaju vrlo pouzdana sonikacija i ponovljivost.
• Umetnite sonotrodu i uključite ultrazvučni uređaj. Nježno pomičite mikrovrh ultrazvučne sonde kroz uzorak kako biste uzorak ravnomjerno sonicirali.
  Za većinu stanica ultrazvučna liza bit će dovršena nakon 2–4 ciklusa sonikacije u trajanju od 10 sec.
• Nakon sonikacije izvadite sonotrodu iz uzorka. Uzorke treba inkubirati na ledu 5 min. Zatim centrifugirajte pri 10.000 x g tijekom 20 min kako bi se ostaci istaložili. Prenesite supernatante u novu mikrocentrifugalnu epruvetu. Označite analite i pohranite ih na -20°C.
• Ultrazvučna sonotroda može se očistiti temeljitim brisanjem alkoholom ili sonikacijom u laboratorijskoj čaši napunjenoj alkoholom, npr. 70% etanolom. Sve ultrazvučne sonde izrađene od titana mogu se sterilizirati u autoklavu.

• Isperite tkivo ledeno hladnim PBS-om (0,01M, pH=7,4) kako biste temeljito uklonili višak hemolizirane krvi.
• Izvažite tkivo (bubreg, srce, pluća, slezena itd.) i maceracijom ga usitnite na male komade, koji se homogeniziraju u PBS-u. Potreban volumen PBS-a ovisi o masi tkiva. U pravilu je za 1g tkiva potrebno približno 9mL PBS-a. Preporučuje se dodati inhibitor proteaza u PBS. (Alternativno se može upotrijebiti RIPA ili hipotonični pufer za lizu koji sadržava koktel inhibitora proteaza i fosfataza.)
• Ovisno o veličini tkiva, kratka obrada na vorteks-miješalici (približno 1–2 min. u impulsima od 15 sec.) može biti korisna za prethodnu obradu tkiva.
• Pričvrstite mikrovrh, npr. S26d2, na svoj ultrazvučni uređaj. Stavite epruvetu s uzorkom tkiva u ledenu kupelj.
• Sonicirajte uzorak svojim ultrazvučnim uređajem, npr. UP200St (80% amplitude), tijekom 1 min. u impulsnom načinu rada (15sec uključeno, 15sec stanka). Držite uzorak u ledenoj kupelji.
• Homogenati se zatim centrifugiraju kako bi se dobile specifične frakcije (citosolne, jezgrine, mitohondrijske ili lizosomske) radi obogaćivanja proteina za analizu. Centrifugiranjem uzorka tijekom 5 minuta pri 5000×g dobiva se supernatant.

Pouzdana kontrola temperature tijekom sonikacije

Temperatura je ključan čimbenik koji utječe na proces, a osobito je važna pri obradi bioloških uzoraka, npr. radi sprječavanja toplinske razgradnje proteina. Kao i sve mehaničke tehnike pripreme uzoraka, sonikacija stvara toplinu. Međutim, temperatura uzoraka može se dobro kontrolirati pri uporabi uređaja Hielscher Ultrasonics. Predstavljamo vam različite mogućnosti praćenja i kontrole temperature vaših uzoraka tijekom njihove predanalitičke pripreme ultrazvučnim uređajem sa sondom ili uređajem VialTweeter.

1. Praćenje temperature uzorka: Svi Hielscher digitalni ultrazvučni procesori opremljeni su inteligentnim softverom i priključivim temperaturnim senzorom. Priključite temperaturni senzor na ultrazvučni uređaj (npr., UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP) i umetnite vrh temperaturnog senzora u jednu od epruveta s uzorcima. Putem digitalnog zaslona u boji osjetljivog na dodir možete u izborniku ultrazvučnog procesora postaviti određeni temperaturni raspon za sonikaciju uzoraka. Ultrazvučni uređaj automatski će se zaustaviti kada se dosegne maksimalna temperatura i pauzirati dok temperatura uzorka ne padne na donju vrijednost postavljene temperature ∆. Zatim se sonikacija automatski ponovno pokreće. Ova pametna funkcija sprječava razgradnju uzrokovanu toplinom.
2. Kod ultrazvučnog uređaja VialTweeter za više uzoraka titanijski blok, koji drži epruvete s uzorcima, može se prethodno ohladiti. Stavite blok VialTweeter (samo sonotrodu bez pretvornika!) u hladnjak ili zamrzivač kako biste prethodno ohladili titanijski blok, što pomaže odgoditi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, i sam uzorak može se prethodno ohladiti.
3. Za hlađenje tijekom sonikacije upotrijebite ledenu kupelj ili suhi led. Tijekom sonikacije stavite epruvete s uzorcima u ledenu kupelj. Za VialTweeter upotrijebite plitku posudu napunjenu suhim ledom i postavite VialTweeter na suhi led kako bi se toplina mogla brzo odvoditi.

Korisnici diljem svijeta upotrebljavaju Hielscher ultrazvučne uređaje sa sondom te uređaje za sonikaciju više uzoraka VialTweeter i UIP400MTP za svakodnevnu pripremu uzoraka u biološkim, biokemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijima. Inteligentni softver i regulacija temperature Hielscher procesora omogućuju pouzdanu kontrolu temperature i sprječavaju razgradnju uzoraka uzrokovanu toplinom. Ultrazvučna priprema uzoraka s pomoću Hielscher ultrazvučnih rješenja daje vrlo pouzdane i ponovljive rezultate!
Pročitajte više o sonikaciji s velikim kapacitetom obrade uzoraka s pomoću uređaja UIP400MTP za sonikaciju pločica s više jažica za analitičke testove!