Ultrazvučna priprema uzorka za ELISA testove

Testovi poput ELISA naširoko se koriste za in vitro dijagnostiku, otkrivanje proteina povezanih s bolešću i kontrolu kvalitete (npr. praćenje alergena u hrani). Ultrazvučna priprema uzorka je brza, pouzdana i ponovljiva tehnika za lizu stanica i izolaciju unutarstaničnih proteina, DNA, RNA i organela. Hielscher Ultrasonics nudi različita ultrazvučna rješenja za praktičnu pripremu pojedinačnih uzoraka, više bočica kao i za mikrotitarske ploče i ploče s 96 jažica.

ELISA – Imunoenzimski test

ELISA je kratica za enzyme-linked immunosorbent assay i široko je korištena tehnika biokemijske analize iz kategorije testova vezanja liganda. U ELISA testu, tekući uzorak se dodaje na stacionarnu čvrstu fazu s posebnim svojstvima vezivanja. Obično se stacionarna čvrsta faza nanosi kao premaz na ploču s jažicom ili ELISA ploču. Zatim se uzastopno dodaju različiti tekući reagensi, inkubiraju i isperu, tako da konačno dođe do optičke promjene (npr. razvoj boje produkta enzimske reakcije) u konačnoj tekućini u jažici. Optička promjena omogućuje mjerenje količine analita takozvanim kvantitativnim “čitanje". Za kvantitativno očitavanje koristi se spektrofotometar, fluorometar ili luminometar za otkrivanje i mjerenje intenziteta propuštene svjetlosti. Na osjetljivost detekcije utječe pojačanje signala tijekom analitičkih reakcija. Budući da su enzimske reakcije dobro istražene i pouzdani procesi pojačanja, enzimi se koriste za stvaranje signala. Enzimi su povezani s reagensima za detekciju u fiksnim omjerima kako bi se omogućila točna kvantifikacija, što također objašnjava naziv "enzimski vezana" imunoanaliza.
Budući da se ELISA testovi izvode u mikrotitarskim pločama / pločama s 96 jažica, poznati su kao tehnika ispitivanja temeljena na pločama i upotrebljavaju se npr. u kliničkoj in vitro dijagnostici, istraživanju, razvoju lijekova itd. za otkrivanje i kvantificiranje protutijela, peptida, proteina, i hormoni.
ELISA tehnika se često koristi kao dijagnostički alat u medicini, biotehnologiji, biljnoj patologiji, a također je važno mjerenje kontrole kvalitete u više industrija.

Ultrazvučna priprema uzorka prije ELISA

Prije nego što se može izvesti ELISA test, uzorci zahtijevaju korake pripreme kao što su stanična liza i ekstrakcija intracelularnih proteina, DNA, RNA itd. Prednost ultrazvučne stanične lize i izolacije proteina je njena visoka učinkovitost, pouzdanost i ponovljivost. Svi ovi čimbenici važni su za dobivanje kvalitetne dijagnostike i rezultata istraživanja

Protokol za pre-ELISA ultrazvučnu lizu stanica

• Za kulture stanica: Prije ultrazvučne stanične lize, centrifugirajte stanice 5 minuta na 270 xg u mikrocentrifugi. Uklonite supernatant aspiracijom i resuspendirajte stanice u 30 – 100 μL RIPA pufera. Zatim inkubirajte talog stanica na ledu 30 minuta.
• Sada je uzorak stanice spreman za ultrazvučnu lizu:
  Koristite ultrazvučni uređaj tipa sonde (npr UP200Ht sa sondom S26d2) ili ultrazvučni uređaj za više uzoraka (npr. VialTweeter za istovremenu sonikaciju do 10 bočica ili UIP400MPT za mikrotitarske ploče / ploče s 96 jažica) ovisno o količini uzoraka koje trebate pripremiti.
  Za sonikaciju jednog uzorka pomoću sonde, stavite stanice u mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 mL.
• Unaprijed postavite trajanje ultrazvuka, ukupni unos energije, način ciklusa i/ili ograničenja temperature u digitalnom izborniku ultrazvučnog uređaja. To osigurava vrlo pouzdanu sonikaciju i ponovljivost.
• Umetnite sonotrodu i uključite ultrazvučni uređaj. Nježno pomičite mikrovrh ultrazvučne sonde kroz uzorak kako biste uzorak sonikirali jednolično.
  Za većinu stanica, ultrazvučna liza bit će dovršena nakon 2-4 ciklusa sonikacije od 10 sekundi.
• Nakon sonikacije, uklonite sonotrodu iz uzorka. Uzorke treba inkubirati na ledu 5 minuta. Zatim centrifugirajte na 10 000 xg tijekom 20 minuta kako biste istaložili ostatke. Prenesite supernatante u novu epruvetu mikrocentrifuge. Označite analite i pohranite na -20°C.
• Ultrazvučna sonotroda može se očistiti pravilnim brisanjem alkoholom ili ultrazvukom u čaši napunjenoj alkoholom, npr. 70% etanolom. Sve ultrazvučne sonde izrađene od titana mogu se autoklavirati.

• Isperite tkivo ledeno hladnim PBS-om (0,01 M, pH=7,4) kako biste temeljito uklonili višak krvi hemolize.
• Izvažite tkivo (bubreg, srce, pluća, slezena itd.) i macerirajte ga u male komadiće koji se homogeniziraju u PBS-u. Potreban volumen PBS-a povezan je s težinom tkiva. U pravilu, 1 g tkiva zahtijeva cca. 9 mL PBS. Preporuča se dodati neki inhibitor proteaze u PBS. (alternativno se može koristiti RIPA ili hipotonični pufer za lizu koji sadrži koktel inhibitora proteaze i fosfataze.)
• Ovisno o veličini tkiva, kratki vortex tretman (otprilike 1-2 min. u 15 s. impulsima) može biti od pomoći za prethodnu obradu tkiva.
• Postavite mikrovrh, npr. S26d2, na svoj ultrazvučni aparat. Stavite epruvetu s uzorkom s tkivom u ledenu kupelj.
• Sonicirajte uzorak svojim ultrazvučnim uređajem, npr. UP200St (80% amplitude) 1 minutu. u pulsnom načinu rada (15 sekundi uključeno, 15 sekundi pauza). Držite uzorak u ledenoj kupelji.
• Homogenati se zatim centrifugiraju kako bi se dobili specifični pulovi (citosolni, nuklearni, mitohondrijski ili lizosomski) kako bi se obogatio protein za analizu. Centrifugiranjem uzorka 5 minuta na 5000×g, supernatant se izvlači.

Pouzdana kontrola temperature tijekom sonikacije

Temperatura je ključni čimbenik koji utječe na proces koji je posebno važan za obradu bioloških uzoraka, npr. za sprječavanje toplinske razgradnje proteina. Kao i sve mehaničke tehnike pripreme uzoraka, sonikacija stvara toplinu. Međutim, temperatura uzoraka može se dobro kontrolirati korištenjem uređaja Hielscher Ultrasonics. Predstavljamo vam različite opcije za praćenje i kontrolu temperature vaših uzoraka dok ih pripremate ultrazvučnim uređajem tipa sonde ili VialTweeter-om predanalitički.

1. Praćenje temperature uzorka: Svi Hielscher digitalni ultrazvučni procesori opremljeni su inteligentnim softverom i senzorom temperature koji se može priključiti. Uključite senzor temperature u ultrazvučni uređaj (npr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Sonikator ploče s više jažica UIP400MTP) i umetnite vrh senzora temperature u jednu od epruveta za uzorke. Putem digitalnog zaslona u boji osjetljivog na dodir, u izborniku ultrazvučnog procesora možete postaviti određeni temperaturni raspon za sonikaciju uzorka. Ultrasonicator će se automatski zaustaviti kada se postigne maksimalna temperatura i pauzirati dok se temperatura uzorka ne spusti na nižu vrijednost postavljene temperature ∆. Zatim sonikacija ponovno automatski počinje. Ova pametna značajka sprječava degradaciju izazvanu toplinom.
2. Što se tiče ultrazvučne jedinice za više uzoraka VialTweeter, titanski blok koji drži epruvete s uzorcima može se prethodno ohladiti. Stavite VialTweeter blok (samo sonotrodu bez sonde!) u hladnjak ili zamrzivač kako biste prethodno ohladili titanski blok koji pomaže odgoditi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, sam se uzorak također može prethodno ohladiti.
3. Koristite ledenu kupku ili suhi led za hlađenje tijekom sonikacije. Stavite svoju epruvetu(e) za uzorke tijekom sonikacije u ledenu kupelj. Za VialTweeter koristite plitku ladicu napunjenu suhim ledom i stavite VialTweeter na suhi led tako da se toplina može brzo raspršiti.

Kupci diljem svijeta koriste ultrazvučne uređaje Hielscher tipa sonde, kao i jedinice za sonikaciju s više uzoraka VialTweeter i UIP400MTP za svoj dnevni rad na pripremi uzoraka u biološkim, biokemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijima. Inteligentni softver i kontrola temperature Hielscher procesora, temperatura je pouzdano kontrolirana i izbjegnuta je degradacija uzorka izazvana toplinom. Ultrazvučna priprema uzorka s Hielscher ultrazvučnim rješenjima daje vrlo pouzdane i ponovljive rezultate!
Pročitajte više o visokoučinkovitoj sonikaciji pomoću sonikatora ploča s više jažica UIP400MTP za analize!