Ultrazvučna priprema uzorka za ELISA testove
Testovi poput ELISA naširoko se koriste za in vitro dijagnostiku, otkrivanje proteina povezanih s bolešću i kontrolu kvalitete (npr. praćenje alergena u hrani). Ultrazvučna priprema uzorka je brza, pouzdana i ponovljiva tehnika za lizu stanica i izolaciju unutarstaničnih proteina, DNA, RNA i organela. Hielscher Ultrasonics nudi različita ultrazvučna rješenja za praktičnu pripremu pojedinačnih uzoraka, više bočica kao i za mikrotitarske ploče i ploče s 96 jažica.
ELISA – Imunoenzimski test
ELISA je kratica za enzyme-linked immunosorbent assay i široko je korištena tehnika biokemijske analize iz kategorije testova vezanja liganda. U ELISA testu, tekući uzorak se dodaje na stacionarnu čvrstu fazu s posebnim svojstvima vezivanja. Obično se stacionarna čvrsta faza nanosi kao premaz na ploču s jažicom ili ELISA ploču. Zatim se uzastopno dodaju različiti tekući reagensi, inkubiraju i isperu, tako da konačno dođe do optičke promjene (npr. razvoj boje produkta enzimske reakcije) u konačnoj tekućini u jažici. Optička promjena omogućuje mjerenje količine analita takozvanim kvantitativnim “čitanje". Za kvantitativno očitavanje koristi se spektrofotometar, fluorometar ili luminometar za otkrivanje i mjerenje intenziteta propuštene svjetlosti. Na osjetljivost detekcije utječe pojačanje signala tijekom analitičkih reakcija. Budući da su enzimske reakcije dobro istražene i pouzdani procesi pojačanja, enzimi se koriste za stvaranje signala. Enzimi su povezani s reagensima za detekciju u fiksnim omjerima kako bi se omogućila točna kvantifikacija, što također objašnjava naziv "enzimski vezana" imunoanaliza.
Budući da se ELISA testovi izvode u mikrotitarskim pločama / pločama s 96 jažica, poznati su kao tehnika ispitivanja temeljena na pločama i upotrebljavaju se npr. u kliničkoj in vitro dijagnostici, istraživanju, razvoju lijekova itd. za otkrivanje i kvantificiranje protutijela, peptida, proteina, i hormoni.
ELISA tehnika se često koristi kao dijagnostički alat u medicini, biotehnologiji, biljnoj patologiji, a također je važno mjerenje kontrole kvalitete u više industrija.

Ultrazvučna jedinica za pripremu uzoraka VialTweeter koristi se za lizu stanica i ekstrakciju proteina prije ELISA testova
Ultrazvučna priprema uzorka prije ELISA
Prije nego što se može izvesti ELISA test, uzorci zahtijevaju korake pripreme kao što su stanična liza i ekstrakcija intracelularnih proteina, DNA, RNA itd. Prednost ultrazvučne stanične lize i izolacije proteina je njena visoka učinkovitost, pouzdanost i ponovljivost. Svi ovi čimbenici važni su za dobivanje kvalitetne dijagnostike i rezultata istraživanja
- Homogena obrada uzorka
- Potpuna liza
- Kompletna ekstrakcija proteina (npr. antitijela, DNK)
- Optimalna prilagodba tipu stanice
- Za bilo koju veličinu uzorka
- ponovljiv
- kontrolirana temperatura
- Automatsko protokoliranje podataka na SD kartici
Protokol za pre-ELISA ultrazvučnu lizu stanica
- Za kulture stanica: Prije ultrazvučne stanične lize, centrifugirajte stanice 5 minuta na 270 xg u mikrocentrifugi. Uklonite supernatant aspiracijom i resuspendirajte stanice u 30 – 100 μL RIPA pufera. Zatim inkubirajte talog stanica na ledu 30 minuta.
- Sada je uzorak stanice spreman za ultrazvučnu lizu:
Koristite ultrazvučni uređaj tipa sonde (npr UP200Ht sa sondom S26d2) ili ultrazvučni uređaj za više uzoraka (npr. VialTweeter za istovremenu sonikaciju do 10 bočica ili UIP400MPT za mikrotitarske ploče / ploče s 96 jažica) ovisno o količini uzoraka koje trebate pripremiti.
Za sonikaciju jednog uzorka pomoću sonde, stavite stanice u mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 mL. - Unaprijed postavite trajanje ultrazvuka, ukupni unos energije, način ciklusa i/ili ograničenja temperature u digitalnom izborniku ultrazvučnog uređaja. To osigurava vrlo pouzdanu sonikaciju i ponovljivost.
- Umetnite sonotrodu i uključite ultrazvučni uređaj. Nježno pomičite mikrovrh ultrazvučne sonde kroz uzorak kako biste uzorak sonikirali jednolično.
Za većinu stanica, ultrazvučna liza bit će dovršena nakon 2-4 ciklusa sonikacije od 10 sekundi. - Nakon sonikacije, uklonite sonotrodu iz uzorka. Uzorke treba inkubirati na ledu 5 minuta. Zatim centrifugirajte na 10 000 xg tijekom 20 minuta kako biste istaložili ostatke. Prenesite supernatante u novu epruvetu mikrocentrifuge. Označite analite i pohranite na -20°C.
- Ultrazvučna sonotroda može se očistiti pravilnim brisanjem alkoholom ili ultrazvukom u čaši napunjenoj alkoholom, npr. 70% etanolom. Sve ultrazvučne sonde izrađene od titana mogu se autoklavirati.

Ekstrakcija proteina iz stanica E.coli s ultrazvučna sonda UP200St
- Isperite tkivo ledeno hladnim PBS-om (0,01 M, pH=7,4) kako biste temeljito uklonili višak krvi hemolize.
- Izvažite tkivo (bubreg, srce, pluća, slezena itd.) i macerirajte ga u male komadiće koji se homogeniziraju u PBS-u. Potreban volumen PBS-a povezan je s težinom tkiva. U pravilu, 1 g tkiva zahtijeva cca. 9 mL PBS. Preporuča se dodati neki inhibitor proteaze u PBS. (alternativno se može koristiti RIPA ili hipotonični pufer za lizu koji sadrži koktel inhibitora proteaze i fosfataze.)
- Ovisno o veličini tkiva, kratki vortex tretman (otprilike 1-2 min. u 15 s. impulsima) može biti od pomoći za prethodnu obradu tkiva.
- Postavite mikrovrh, npr. S26d2, na svoj ultrazvučni aparat. Stavite epruvetu s uzorkom s tkivom u ledenu kupelj.
- Sonicirajte uzorak svojim ultrazvučnim uređajem, npr. UP200St (80% amplitude) 1 minutu. u pulsnom načinu rada (15 sekundi uključeno, 15 sekundi pauza). Držite uzorak u ledenoj kupelji.
- Homogenati se zatim centrifugiraju kako bi se dobili specifični pulovi (citosolni, nuklearni, mitohondrijski ili lizosomski) kako bi se obogatio protein za analizu. Centrifugiranjem uzorka 5 minuta na 5000×g, supernatant se izvlači.
Pouzdana kontrola temperature tijekom sonikacije
Temperatura je ključni čimbenik koji utječe na proces koji je posebno važan za obradu bioloških uzoraka, npr. za sprječavanje toplinske razgradnje proteina. Kao i sve mehaničke tehnike pripreme uzoraka, sonikacija stvara toplinu. Međutim, temperatura uzoraka može se dobro kontrolirati korištenjem uređaja Hielscher Ultrasonics. Predstavljamo vam različite opcije za praćenje i kontrolu temperature vaših uzoraka dok ih pripremate ultrazvučnim uređajem tipa sonde ili VialTweeter-om predanalitički.
- Praćenje temperature uzorka: Svi Hielscher digitalni ultrazvučni procesori opremljeni su inteligentnim softverom i senzorom temperature koji se može priključiti. Uključite senzor temperature u ultrazvučni uređaj (npr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Sonikator ploče s više jažica UIP400MTP) i umetnite vrh senzora temperature u jednu od epruveta za uzorke. Putem digitalnog zaslona u boji osjetljivog na dodir, u izborniku ultrazvučnog procesora možete postaviti određeni temperaturni raspon za sonikaciju uzorka. Ultrasonicator će se automatski zaustaviti kada se postigne maksimalna temperatura i pauzirati dok se temperatura uzorka ne spusti na nižu vrijednost postavljene temperature ∆. Zatim sonikacija ponovno automatski počinje. Ova pametna značajka sprječava degradaciju izazvanu toplinom.
- Što se tiče ultrazvučne jedinice za više uzoraka VialTweeter, titanski blok koji drži epruvete s uzorcima može se prethodno ohladiti. Stavite VialTweeter blok (samo sonotrodu bez sonde!) u hladnjak ili zamrzivač kako biste prethodno ohladili titanski blok koji pomaže odgoditi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, sam se uzorak također može prethodno ohladiti.
- Koristite ledenu kupku ili suhi led za hlađenje tijekom sonikacije. Stavite svoju epruvetu(e) za uzorke tijekom sonikacije u ledenu kupelj. Za VialTweeter koristite plitku ladicu napunjenu suhim ledom i stavite VialTweeter na suhi led tako da se toplina može brzo raspršiti.
Kupci diljem svijeta koriste ultrazvučne uređaje Hielscher tipa sonde, kao i jedinice za sonikaciju s više uzoraka VialTweeter i UIP400MTP za svoj dnevni rad na pripremi uzoraka u biološkim, biokemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijima. Inteligentni softver i kontrola temperature Hielscher procesora, temperatura je pouzdano kontrolirana i izbjegnuta je degradacija uzorka izazvana toplinom. Ultrazvučna priprema uzorka s Hielscher ultrazvučnim rješenjima daje vrlo pouzdane i ponovljive rezultate!
Pročitajte više o visokoučinkovitoj sonikaciji pomoću sonikatora ploča s više jažica UIP400MTP za analize!
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Literatura / Reference
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Činjenice koje vrijedi znati
Koje vrste ELISA testa postoje?
Postoji nekoliko vrsta ELISA, koje se razlikuju po principu rada. Poznate su kao izravna ELISA, neizravna ELISA, sendvič ELISA, kompetitivna ELISA i obrnuta ELISA. U nastavku vam predstavljamo pregled različitih vrsta ELISA testa i njihovih glavnih karakteristika i razlika.
ELISA se može provesti u kvalitativnom ili kvantitativnom formatu. Kvalitativni rezultati daju jednostavan pozitivan ili negativan rezultat, dok se u kvantitativnoj ELISA-i optička gustoća (OD) uzorka uspoređuje sa standardnom krivuljom, koja je obično serijsko razrjeđenje otopine poznate koncentracije ciljne molekule.
Izravna ELISA
Izravna ELISA je najjednostavniji oblik testa ELISA, gdje se koristi samo enzimom obilježeno primarno protutijelo, a sekundarna protutijela nisu potrebna. Primarno antitijelo obilježeno enzimima veže se direktno na metu, odnosno antigen. Puferirana otopina antigena dodaje se u svaku jažicu mikrotitarske ploče (obično ploče s 96 jažica, ELISA-ploče), gdje prianja na plastičnu površinu kroz interakcije naboja. Kada enzim povezan s primarnim protutijelom reagira sa svojim supstratom, proizvodi vidljivi signal koji se može mjeriti spektrofotometrom, fluorometrom ili luminometrom.
Indirektna ELISA
Za neizravni ELISA test potrebno je i primarno i sekundarno protutijelo. Međutim, za razliku od izravne ELISA-e, ne primarno antitijelo, već sekundarno antitijelo obilježeno je enzimom. Antigen je imobiliziran na ploču s jažicom i vezan primarnim antitijelom. Potom se sekundarno antitijelo obilježeno enzimom veže na primarno antitijelo. Konačno, enzim povezan sa sekundarnim antitijelom reagira sa svojim supstratom i proizvodi vidljiv signal koji se može detektirati.
Sendvič ELISA
Dok je u izravnim i neizravnim ELISA testovima antigen imobiliziran i obložen na površinu ploče s jažicom, u sendvič ELISA-i antitijelo je imobilizirano na plastičnu površinu ELISA-pločice. Imobilizirana antitijela u sendvič ELISA testu poznata su kao antitijela za hvatanje. Osim capture antitijela, u sendvič ELISA-i potrebna su i takozvana detekcijska antitijela. Protutijela za detekciju uključuju neobilježeno primarno detekcijsko antitijelo i enzimom obilježeno sekundarno detekcijsko antitijelo.
Postupno, antigen od interesa veže se za antitijelo za hvatanje imobilizirano na ploču. Zatim se primarno antitijelo za otkrivanje veže za antigen. Nakon toga, sekundarno detekcijsko protutijelo veže se na primarno detekcijsko protutijelo. U završnom koraku reakcije, enzim reagira sa svojim supstratom kako bi proizveo vidljivi signal koji se može detektirati optički.
Kompetitivni ELISA
Kompetitivni ELISA, također poznat kao inhibicijski ELISA, najsloženiji je tip ELISA jer uključuje upotrebu inhibitornog antigena. Svaki od tri formata, izravni, neizravni i sendvič ELISA, može se prilagoditi konkurentskom ELISA formatu. U kompetitivnoj ELISA testu, inhibitorni antigen i antigen od interesa natječu se za vezanje na primarno antitijelo.
Za kompetitivnu ELISA-u neobilježeno antitijelo se inkubira u prisutnosti njegovog antigena, odnosno uzorka. Ovi vezani kompleksi antitijelo/antigen se zatim dodaju u jažicu obloženu antigenom.
Ploča se opere kako bi se uklonila nevezana antitijela. Kompetitivni ELISA je dobio naziv zbog činjenice da što je više antigena u uzorku, to se stvara više kompleksa antigen-antitijelo. To znači da postoji manje nevezanih antitijela koja se mogu vezati za antigen u jažici i antigeni se moraju natjecati za dostupno antitijelo. Dodano je sekundarno antitijelo koje odgovara primarnom antitijelu. Ovo drugo antitijelo povezano je s enzimom. Kada se doda supstrat, preostali enzimi proizvode kromogeni ili fluorescentni signal.
U ovom trenutku reakcija se zaustavlja kako bi se izbjeglo eventualno zasićenje signala.
Neki kompetitivni ELISA kompleti uključuju antigen vezan za enzim umjesto antitijela vezanog za enzim. Označeni antigen natječe se za primarna mjesta vezanja antitijela s antigenom uzorka (neobilježenim). Što je manje antigena u uzorku, to se više obilježenog antigena zadržava u jažici i signal je jači.
Obrnuta ELISA
Obrnuta ELISA ne koristi ploče s jažicama, već ostavlja antigene suspendirane u testnoj tekućini. Reverzni ELISA test mjeri količinu vezanih antitijela putem antigena. Razvijen je posebno za otkrivanje i istraživanje proteina ovojnice virusa zapadnog Nila i kako može pronaći antitijela specifična za virus.
Koji se enzimski markeri koriste za ELISA?
Donji popis daje najčešće enzimske markere koji se koriste u ELISA testovima, koji omogućuju mjerenje rezultata testa nakon završetka.
- OPD (o-fenilendiamin dihidroklorid) postaje jantarno obojen kako bi se otkrio HRP (peroksidaza hrena), koji se često koristi kao konjugirani protein.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin) postaje plav pri detekciji HRP i postaje žut nakon dodatka sumporne ili fosforne kiseline.
- ABTS (2,2′-Azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina]-diamonijeva sol) postaje zelena kada se detektira HRP.
- PNPP (p-nitrofenil fosfat, dinatrijeva sol) postaje žut pri otkrivanju alkalne fosfataze.