Stanična liza BL21 stanica ultrazvukom
Stanice BL21 soj su E. coli koji se naširoko koristi u istraživačkim laboratorijima, biotehnologiji i industrijskoj proizvodnji zbog svoje sposobnosti vrlo učinkovite ekspresije proteina. Ultrazvučno razbijanje stanica, liza i ekstrakcija proteina uobičajena je metoda za izolaciju i prikupljanje ciljanih proteina iz stanične unutrašnjosti BL21 stanica. Ultrazvučna obrada potpuno ometa stanicu i oslobađa sve zarobljene proteine, čineći 100% proteina dostupnim.
BL21 stanice za ekspresiju proteina
BL21 stanica je kemijski kompetentan bakterijski soj E. coli pogodan za transformaciju i visoku razinu ekspresije proteina korištenjem indukcijskog sustava T7 RNA polimeraze-IPTG. BL21 stanice omogućuju visokoučinkovitu ekspresiju proteina bilo kojeg gena koji je pod kontrolom T7 promotora. Soj E. coli BL21(DE3) je soj za proizvodnju proteina baziran na T7 RNA polimerazi u kombinaciji s ekspresijskim vektorima temeljenim na promotoru T7 i naširoko se primjenjuje u laboratorijima i industriji za proizvodnju rekombinantnih proteina. U BL21(DE3), ekspresija gena koji kodira rekombinantni protein transkribira se pomoću kromosomski kodirane T7 RNA polimeraze (T7 RNAP), koja transkribira osam puta brže od konvencionalnog E. coli RNAP. To čini soj BL21(DE3) visoko učinkovitim i pretvara ga u jedan od najpoželjnijih staničnih sustava ekspresije proteina.
Protokol za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina iz BL21 stanica
Stanična liza BL21 stanica uglavnom se izvodi pomoću ultrazvuka u kombinaciji s natrijevim lauroil sarkozinatom (također poznatim kao sarkozil) kao puferom za lizu. Prednosti ultrazvučnog razbijanja stanica i ekstrakcije proteina leže u pouzdanosti, ponovljivosti kao i jednostavnom, sigurnom i brzom radu ultrazvučnih uređaja. Protokol u nastavku daje upute korak po korak za ultrazvučnu lizu stanica BL21:
- Kako bi se uklonili proteini šaperona, bakterijske pelete BL21 resuspendirane su u 50 ml ledeno hladnog natrijeva tris-EDTA (STE) pufera (koji se sastoji od 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl s dodatkom 100 mM PMSF).
- Doda se 500 ul lizozima (10 mg/ml) i stanice se inkubiraju na ledu 15 minuta.
- Nakon toga se doda 500 ul DTT i 7 ml sarkosila (10% (w/v) pripremljenog u STE puferu).
- Neophodno je držati sve pufere za pročišćavanje ledeno hladnima i cijelo vrijeme držati uzorke na ledu. Sve korake pročišćavanja treba provesti u hladnoj sobi ako je moguće.
- Za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina, uzorci se soniciraju u VialTweeter MultiSample Ultrasonicator 4 x 30 sekundi pri 100% amplitudi s intervalom od 2 minute između svake sonikacije. Alternativno, ultrazvučni homogenizator tipa sonde s mikrovrhom, npr. UP200Ht sa S26d2 (3 x 30 sekundi, 2 min. pauze između ultrazvučnih ciklusa, 80% amplitude) može se koristiti.
- Za daljnje korake pročišćavanja uzorke je potrebno držati na ledu ili alternativno pohraniti na -80°C do daljnje obrade.
Ultrazvučni disruptor stanica UP200St s mikro vrhom S26d2 za lizu i ekstrakciju proteina
Ultrazvučna liza pod preciznom kontrolom temperature
Precizna i pouzdana kontrola temperature ključna je pri rukovanju biološkim uzorcima. Visoke temperature pokreću toplinski induciranu razgradnju proteina u uzorcima.
Kao i sve mehaničke tehnike pripreme uzoraka, sonikacija stvara toplinu. Međutim, temperatura uzoraka može se dobro kontrolirati korištenjem VialTweetera. Predstavljamo vam različite opcije za praćenje i kontrolu temperature vaših uzoraka dok ih pripremate za analizu pomoću uređaja VialTweeter i VialPress.
- Praćenje temperature uzorka: Ultrazvučni procesor UP200St, koji pokreće VialTweeter, opremljen je inteligentnim softverom i senzorom temperature koji se može priključiti. Priključite senzor temperature u UP200St i umetnite vrh senzora temperature u jednu od epruveta za uzorke. Putem digitalnog zaslona u boji osjetljivog na dodir, u izborniku uređaja UP200St možete postaviti određeni temperaturni raspon za sonikaciju uzorka. Ultrasonicator će se automatski zaustaviti kada se postigne maksimalna temperatura i pauzirati dok se temperatura uzorka ne spusti na nižu vrijednost postavljene temperature ∆. Zatim sonikacija ponovno automatski počinje. Ova pametna značajka sprječava degradaciju izazvanu toplinom.
- VialTweeter blok se može prethodno ohladiti. Stavite VialTweeter blok (samo sonotrodu bez sonde!) u hladnjak ili zamrzivač kako biste prethodno ohladili titanski blok koji pomaže odgoditi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, sam se uzorak također može prethodno ohladiti.
- Koristite suhi led za hlađenje tijekom sonikacije. Upotrijebite plitku ladicu napunjenu suhim ledom i stavite VialTweeter na led tako da se toplina može brzo raspršiti.
Kupci diljem svijeta koriste VialTweeter i VialPress za svoj dnevni rad na pripremi uzoraka u biološkim, biokemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijima. Inteligentni softver i kontrola temperature procesora UP200St, temperatura se pouzdano kontrolira i izbjegnuta je degradacija uzorka izazvana toplinom. Ultrazvučna priprema uzorka s VialTweeter i VialPress daje vrlo pouzdane i ponovljive rezultate!
Pronađite optimalni ultrazvučni disruptor za svoju aplikaciju za lizu
Hielscher Ultrasonics je dugogodišnji iskusni proizvođač visokoučinkovitih ultrazvučnih razarača stanica i homogenizatora za laboratorije, stolne i industrijske sustave. Veličina vaše bakterijske stanične kulture, vaš istraživački ili proizvodni cilj i volumen stanica za obradu po satu ili danu ključni su čimbenici za pronalaženje pravog ultrazvučnog disruptora stanica za vašu primjenu.
Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za istovremenu sonikaciju više uzoraka (do 10 bočica s VialTweeterom) i masovnih uzoraka (tj. mikrotitarske ploče / ELISA ploče s UIP400MTP), kao i klasični laboratorijski ultrazvučni uređaj tipa sonde s različitim razine snage od 50 do 400 vata do potpuno industrijskih ultrazvučnih procesora s do 16 000 vata po jedinici za komercijalno ometanje stanica i ekstrakciju proteina u velikoj proizvodnji. Svi Hielscher ultrasonicators su izgrađeni za rad 24/7/365 pod punim opterećenjem. Robusnost i pouzdanost temeljne su značajke naših ultrazvučnih uređaja.
Svi digitalni ultrazvučni homogenizatori opremljeni su pametnim softverom, zaslonom osjetljivim na dodir u boji i automatskim protokoliranjem podataka, što ultrazvučni uređaj čini praktičnim radnim alatom u laboratoriju i proizvodnim pogonima.
Javite nam koje vrste stanica, koji volumen, s kojom učestalošću i s kojim ciljem morate obraditi svoje biološke uzorke. Preporučit ćemo vam najprikladniji ultrazvučni disruptor stanica za vaše zahtjeve procesa.
Donja tablica daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih sustava od kompaktnih ručnih homogenizatora i MultiSample Ultrasonicators do industrijskih ultrazvučnih procesora za komercijalne primjene:
| Volumen serije | Protok | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| 96-jažica / mikrotitarske ploče | na | UIP400MTP |
| 10 bočica od 0,5 do 1,5 ml | na | VialTweeter na UP200St |
| 0.01 do 250 ml | 5 do 100 ml/min | UP50H |
| 0.01 do 500 ml | 10 do 200 ml/min | UP100H |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 do 20L | 0.2 do 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 do 100l | 2 do 10L/min | UIP4000hdT |
| na | 10 do 100L/min | UIP16000 |
| na | veći | klaster od UIP16000 |
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Sonikator ploča UIP400MTP za visokoučinkovito razbijanje stanica u pločama s 96 jažica
ultrazvučni uređaj UP200Ht s mikrovrhom od 2 mm S26d2 za sonikaciju malih uzoraka
Pročitajte više o tome kako možete koristiti svoj ultrazvučni homogenizator tkiva za učinkovitu i pouzdanu pripremu puferskih otopina!
Činjenice koje vrijedi znati
Escherichia coli bakterija
Escherichia coli je vrsta bakterije koja ne stvara spore, Gram negativna i karakterizirana je oblikom ravnog štapića. Bakterije E.coli prisutne su u okolišu, hrani i crijevima ljudi i životinja. E. coli je obično pokretna pomoću peritrihalnih flagela, ali postoje i nepomične vrste. E.coli su takozvani fakultativno anaerobni kemoorganotrofni organizmi, što znači da su sposobni i za respiratorni i za fermentativni metabolizam. Većina vrsta E.coli je benigna i ispunjava korisne funkcije u tijelu, npr. potiskuje rast štetnih bakterijskih vrsta, sintetizira vitamine itd.
Stanice bakterije Escherichia coli tzv. tipa B posebna su kategorija sojeva E.coli, koji se naširoko koriste u istraživanjima za istraživanje mehanizama poput osjetljivosti bakteriofaga ili sustava restrikcije-modifikacije. Nadalje, bakterije E.coli cijenjene su kao pouzdana radna snaga za ekspresiju proteina u biotehnološkim i laboratorijima za znanost o životu. Na primjer, E.coli se koristi za sintetiziranje spojeva kao što su proteini i oligosaharidi u industrijskim razmjerima. Zbog specifičnosti kao što su nedostatak proteaze, niska proizvodnja acetata pri visokoj razini glukoze i povećana propusnost, B stanice E. coli su najčešće korištene stanice domaćini za proizvodnju genetski modificiranih proteina.
Rekombinantni protein
Rekombinantni proteini (rProt) dobivaju značajnu važnost u raznim granama, uključujući kemijsku proizvodnju, farmaceutsku, kozmetičku, medicinu za ljude i životinje, poljoprivredu, hranu kao i industriju obrade otpada.
Proizvodnja rekombinantnog proteina zahtijeva korištenje ekspresijskog sustava. Kao sustavi stanica za ekspresiju za proizvodnju rekombinantne DNA, mogu se koristiti i prokariotske i eukariotske stanice. Dok se bakterijske stanice najčešće koriste za ekspresiju proteina zbog čimbenika kao što su niska cijena, laka skalabilnost i jednostavni uvjeti medija, sustavi sisavaca, kvasaca, algi, insekata i sustavi bez stanica uspostavljene su alternative. Vrsta proteina, funkcionalna aktivnost, kao i potreban prinos eksprimiranih proteina utječu na odabir staničnog sustava koji se koristi za ekspresiju proteina.
Kako bi se eksprimirao rekombinantni protein, određena stanica mora biti transficirana s DNA vektorom koji sadrži predložak rekombinantne DNA. Stanice transficirane s predloškom se zatim uzgajaju. Kao posljedica staničnog mehanizma, stanice prepisuju i prevode protein od interesa, proizvodeći ciljani protein.
Budući da su eksprimirani proteini zarobljeni u staničnom matriksu, stanica se mora lizirati (prekinuti i slomiti) kako bi oslobodila proteine. U sljedećem koraku pročišćavanja, protein se odvaja i pročišćava.
Prvi rekombinantni protein korišten u liječenju bio je rekombinantni humani inzulin 1982. Danas se u svijetu proizvodi više od 170 vrsta rekombinantnih proteina za medicinske tretmane. Obično korišteni rekombinantni proteini koji se koriste u medicini su na primjer rekombinantni hormoni, interferoni, interleukini, faktori rasta, faktori nekroze tumora, faktori zgrušavanja krvi, trombolitički lijekovi i enzimi za liječenje ozbiljnih bolesti kao što su dijabetes, patuljasti rast, infarkt miokarda, kongestivno zatajenje srca, cerebralna apopleksija, multipla skleroza, neutropenija, trombocitopenija, anemija, hepatitis, reumatoidni artritis, astma, Crohnova bolest i terapije raka. (usp. Phuc V. Pham, u Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018.)
Literatura / Reference
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonikator za istovremenu sonikaciju 10 uzoraka, npr. za razbijanje BL21 stanica
Ultrazvuk visokih performansi! Hielscherov asortiman proizvoda pokriva cijeli spektar od kompaktnog laboratorijskog ultrazvučnog uređaja preko stolnih jedinica do potpuno industrijskih ultrazvučnih sustava.