Liza stanica BL21 ultrazvukom

Stanice BL21 pripadaju soju E. coli koji se široko primjenjuje u istraživačkim laboratorijima, biotehnologiji i industrijskoj proizvodnji zbog svoje sposobnosti vrlo učinkovite ekspresije proteina. Ultrazvučno razaranje stanica, liza i ekstrakcija proteina uobičajena su metoda za izolaciju i prikupljanje ciljanih proteina iz unutrašnjosti stanica BL21. Ultrazvučna obrada potpuno razara stanicu i oslobađa sve zarobljene proteine, čime 100% proteina postaje dostupno.

Stanice BL21 za ekspresiju proteina

Stanice BL21 pripadaju kemijski kompetentnom bakterijskom soju E. coli prikladnom za transformaciju i visoku razinu ekspresije proteina primjenom indukcijskog sustava T7 RNA polimeraza–IPTG. Stanice BL21 omogućuju vrlo učinkovitu ekspresiju proteina iz bilo kojeg gena pod kontrolom promotora T7. Soj E. coli BL21(DE3) jest soj za proizvodnju proteina koji se temelji na T7 RNA polimerazi, kombinira se s ekspresijskim vektorima koji se temelje na promotoru T7 te se široko primjenjuje u laboratorijima i industriji za proizvodnju rekombinantnih proteina. U soju BL21(DE3) ekspresiju gena koji kodira rekombinantni protein transkribira kromosomski kodirana T7 RNA polimeraza (T7 RNAP), koja transkribira osam puta brže od uobičajene RNAP bakterije E. coli. Zbog toga je soj BL21(DE3) vrlo učinkovit i jedan od najpoželjnijih staničnih sustava za ekspresiju proteina.

Protokol za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina iz stanica BL21

Liza stanica BL21 najčešće se provodi ultrazvučnom obradom u kombinaciji s natrijevim lauroil-sarkozinatom (poznatim i kao sarkozil) kao puferom za lizu. Prednosti ultrazvučnog razaranja stanica i ekstrakcije proteina jesu pouzdanost, ponovljivost te jednostavno, sigurno i brzo rukovanje ultrazvučnim uređajima. Protokol u nastavku daje upute korak po korak za ultrazvučnu lizu stanica BL21:

• Kako bi se uklonili proteini šaperoni, bakterijski talozi BL21 resuspendirani su u 50 ml ledeno hladnog pufera natrij-Tris-EDTA (STE) (koji se sastoji od 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl uz dodatak 100 mM PMSF).
• Zatim se dodaje 500 ul lizozima (10 mg/ ml), a stanice se inkubiraju na ledu 15 min.
• Nakon toga dodaje se 500 ul DTT-a i 7 ml sarkozila (10% (w/v), pripremljenog u puferu STE).
• Ključno je održavati sve pufere za pročišćavanje ledeno hladnima, a uzorke cijelo vrijeme držati na ledu. Sve korake pročišćavanja treba, ako je moguće, provoditi u hladnoj komori.



• Za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina uzorci se soniciraju u uređaju VialTweeter MultiSample Ultrasonicator tijekom 4 x 30 sec pri amplitudi od 100%, s razmakom od 2 min između pojedinih sonikacija. Alternativno se može upotrijebiti ultrazvučni homogenizator sa sondom i mikrovrhom, npr. UP200Ht sa S26d2 (3 x 30 sec, stanka od 2 min. između ultrazvučnih ciklusa, amplituda od 80%).
• Za daljnje korake pročišćavanja uzorci se moraju držati na ledu ili alternativno pohraniti na -80°C do daljnje obrade.

Ultrazvučna liza uz preciznu kontrolu temperature

Precizna i pouzdana kontrola temperature ključna je pri rukovanju biološkim uzorcima. Visoke temperature pokreću toplinski uzrokovanu razgradnju proteina u uzorcima.
Kao i sve tehnike mehaničke pripreme uzoraka, sonikacija stvara toplinu. Međutim, primjenom uređaja VialTweeter temperatura uzoraka može se dobro kontrolirati. Predstavljamo vam različite mogućnosti praćenja i kontrole temperature uzoraka tijekom njihove pripreme za analizu uređajima VialTweeter i VialPress.

1. Praćenje temperature uzorka: ultrazvučni procesor UP200St, koji pokreće VialTweeter, opremljen je inteligentnim softverom i priključivim temperaturnim senzorom. Priključite temperaturni senzor na UP200St i umetnite vrh temperaturnog senzora u jednu od epruveta s uzorcima. Putem digitalnog zaslona u boji osjetljivog na dodir u izborniku uređaja UP200St možete postaviti određeni temperaturni raspon za sonikaciju uzorka. Ultrazvučni uređaj automatski će se zaustaviti kada se dosegne maksimalna temperatura i pauzirati dok temperatura uzorka ne padne na donju vrijednost zadane temperature ∆. Tada sonikacija automatski ponovno započinje. Ova pametna funkcija sprječava razgradnju uzrokovanu toplinom.
2. Blok VialTweeter može se prethodno ohladiti. Stavite blok VialTweeter (samo sonotrodu bez pretvornika!) u hladnjak ili zamrzivač kako biste prethodno ohladili titanijski blok, što pomaže odgoditi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, i sam uzorak može se prethodno ohladiti.
3. Za hlađenje tijekom sonikacije upotrijebite suhi led. Upotrijebite plitku posudu napunjenu suhim ledom i postavite VialTweeter na led kako bi se toplina mogla brzo odvoditi.

Korisnici diljem svijeta upotrebljavaju VialTweeter i VialPress za svakodnevnu pripremu uzoraka u biološkim, biokemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijima. Zahvaljujući inteligentnom softveru i regulaciji temperature procesora UP200St, temperatura se pouzdano regulira i izbjegava se razgradnja uzoraka uzrokovana toplinom. Ultrazvučna priprema uzoraka uređajima VialTweeter i VialPress daje vrlo pouzdane i ponovljive rezultate!
 

Pronađite optimalan ultrazvučni uređaj za razaranje stanica za svoju primjenu lize

Hielscher Ultrasonics proizvođač je s dugogodišnjim iskustvom u proizvodnji visokoučinkovitih ultrazvučnih uređaja za razaranje stanica i homogenizatora za laboratorije, stolne sustave i sustave industrijskog mjerila. Veličina vaše kulture bakterijskih stanica, cilj istraživanja ili proizvodnje te volumen stanica koji treba obraditi po satu ili danu ključni su čimbenici pri odabiru odgovarajućeg ultrazvučnog uređaja za razaranje stanica za vašu primjenu.
Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za istodobnu sonikaciju više uzoraka (do 10 bočica uređajem VialTweeter) i velikog broja uzoraka (tj. mikrotitarskih ploča / ELISA ploča uređajem UIP400MTP), kao i klasične laboratorijske ultrazvučne uređaje sa sondom različitih snaga od 50 do 400 vata pa sve do potpuno industrijskih ultrazvučnih procesora snage do 16.000 vata po jedinici za komercijalno razaranje stanica i ekstrakciju proteina u proizvodnji velikog opsega. Svi ultrazvučni uređaji Hielscher izrađeni su za rad 24/7/365 pod punim opterećenjem. Robusnost i pouzdanost temeljne su značajke naših ultrazvučnih uređaja.
Svi digitalni ultrazvučni homogenizatori opremljeni su pametnim softverom, zaslonom u boji osjetljivim na dodir i automatskim bilježenjem podataka, što ultrazvučni uređaj čini praktičnim radnim alatom u laboratorijima i proizvodnim pogonima.
Javite nam koju vrstu stanica, koji volumen, koliko često i s kojim ciljem trebate obrađivati svoje biološke uzorke. Preporučit ćemo vam najprikladniji ultrazvučni uređaj za razaranje stanica prema zahtjevima vašeg procesa.

Tablica u nastavku daje pregled približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih sustava, od kompaktnih ručnih homogenizatora i ultrazvučnih uređaja za više uzoraka do industrijskih ultrazvučnih procesora za komercijalne primjene:

Literatura / Reference

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.