Ultrasonic shearing DNA

• Tijekom DNK i RNA striženja, molekule DNA se razlaže na manje komade. Fragmentacija DNA / RNA jedan je od važnih koraka pripreme uzorka potrebnih za stvaranje knjižnica za sekvenciranje sljedeće generacije (NGS).
• Ultrazvučno DNK šišanje koristi sile akustične kavitacije razbiti DNA ili RNA u komadima 100 – 5 KB bp.
• Ultrazvučni rezanje omogućava precizno fragmentacije DNA i prilagodbe na željenu duljinu DNA.

DNK šišanje pomoću ultrazvuka

Hielscher Ultrasonics nudi različite ultrazvučne-based rješenja za DNA, RNA i kromatina šišanje. Birati između sonde tipa ultrasonicators (npr UP100H) za izravno korištenje sonifikacije mikrotipom, ili koristiti VialTweeeter ili ultrazvučni cuphorn za pripravu neizravnog DNA različitih uzoraka istovremeno. Hielscher nudi idealnu uređaja s obzirom na vaše potrebe: vremenske imate 1 ili do 10 uzoraka, količine od mikrolitru do volumena litre – Hielscher ultrazvučni procesori su dostupni u susret vašim zahtjevima za pripremu DNA, RNA i kromatina fragmente na pravom duljine. Obnovljivost, jednostavno rukovanje i preciznu kontrolu omogućiti pouzdanu knjižnica za sljedeću generaciju sekvencioniranje.
Za razliku od enzimskog DNA fragmentacije, ultrazvučni šišanje primjenjuje čiste mehaničke sile smicanja bez dodavanja kemikalija. Preciznom podešavanju procesnih parametara, ultrazvučni rezanje proizvodi fragmente visoke molekulske težine DNK (DNA plazmida i genomska).
Pročišćena nukleinske kiseline mogu biti umnožene prije ili nakon koraka fragmentacije.
Zvučne obrade parametri (snaga, puls ciklus / prodori, vrijeme i temperatura) može se kontrolirati sigurno preko softverskih postavki.

Protokoli za ultrazvučni DNA Shearingom

Za pokus kromatina imunoprecipitacije

Ukratko, stanice su stavljene u posude s promjerom od 60 mm (400.000 po posudi) i transfektirane s RhoA siRNA (kao što je opisano); nakon 72 h, inkubirani su s formaldehidom (konačna koncentracija, 1%) tijekom 10 minuta na 37 ° C da se križne veze proteina na DNA. Reakcija umrežavanja je zaustavljena dodavanjem jedne desetine volumena od 1,25 mol / l glicina, dajući 125 mmol / L konačne koncentracije. Stanice su dvaput isprane s ledeno hladnim PBS-om, resuspendirane u puferu za radioimunoprecipitaciju (150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksiholata, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl )] koji je sadržavao 1 mmol / 1 fenilmetilsulfonil fluorida, 1 Ag / mL aprotinina i 1 Ag / mL pepstatin A i držao na ledu tijekom 30 minuta. Zatim su stanični lizati sonicirani na ledu s a Hielscher da ultrazvuk sonikatora (3 x 40 s, amplituda 40%, ciklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) do umreženi chromatins je presječena kako bi se dobilo DNA fragmenata između 200 i 1000 bp. Jedna desetina cijelog lizat je korišten za kvantificiranje količinu DNA prisutan u različitim uzorcima i smatrati “ukupan unos DNA”, Supernatanti se inkubiraju s DNA sperme lososa / proteina agarozni 50% mulj kako bi se smanjila nespecifične pozadine. Imunoprecipitacija je zatim obavlja preko noći na 4 ° C s 5 Ag anti-NF-NB P65 (Upstate) ili bez protutijela (negativna kontrola). Te supernatanti nadopunjen s 5 mol / L NaCl i zagrijavana preko noći na 65 ° C da se vrati protein-DNA cross-veze. A imunokompleksa se dalje tretira sa vodi bez DNaze i RNaza bez proteinazom K, i DNA je pročišćena pomoću fenol / ekstrakcijom kloroformom te taloženjem etanola. PCR je učinjeno sa specifičnim primerima odgovarajućeg slijeda unutar promotorske regije ljudskog gena iNOS (p1 temeljnog: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶, p2 klica: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studije ekspresije EGFP-

Za ekspresiju studije, rekombinantnog soja L. tarentolae P10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena biomedicine, Njemačka) s genom za EGFP (Enhanced zeleni fluorescentni protein), kromosomske SSU integrirana, uzgaja se u različitim medijima kao što je prethodno opisano i dodatno, uz dodatak 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena biomedicine, Njemačka). Tijekom kultivacije, 1 ml uzeti su uzorci, centrifugira (2000 × g, 20 ° C, 10 min) i ispere s 0,9% -tnom otopinom NaCl. Pelet je ponovno suspendiran u puferu (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) i dezintegrirane ultrazvuka sa ultrazvučnom procesor UP400S (Primjena energije-400 Ws). Stanični ostaci su uklonjeni centrifugiranjem (6000 x g, 4 ° C, 5 min) i analiziran natrijevog dodecil sulfata - poliakrilamid gel elektroforeze (SDS-PAGE) u redukcijskim uvjetima u skladu s postupkom iz Laemmli (1970), s 12,5% polyacralamide gelovima , EGFP-ekspresija je ispitan u agitiranih kulturi. (Fritsche et al. 2007)

kromatina imunoprecipitaciju

Ispitivanje kromatina imunoprecipitaciju izvedena je pomoću čip IT^Tm Izrazite (Active Motiv, Carlsbad, CA, USA) prema uputama proizvođača s nekim izmjenama. Ukratko, ljudski diferencirane podocytes su umreženi s 1% formaldehida 10 minuta na sobnoj temperaturi. Stanice su isprane s ledeno hladnim PBS-om, a reakcijska fiksacija je zaustavljena dodatkom 0,125 M glicina za 5 minuta na sobnoj temperaturi. Stanice su ponovo isprane s ledeno hladnim PBS-om i struganje iz posude. Stanice su istaložene centrifugiranjem i ponovno suspendirane u puferu za lizu. Nakon centrifugiranja, nakupina jezgre su ponovno suspendirane u puferu smicanja, inkubira na ledu 30 minuta, a kromatin je presječena sonikacijom, npr UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Njemačka) s 25% snage 5 impulsa od po 20 sekundi na ledu u ulomke od približno 200-600 bp. Shearni kromatin je zatim centrifugiran i supernatant je sakupljen. Za imunoprecipitations, 60 ul kromatina inkubirano je s 1 ug Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-kB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ili NF-κB p50 (Abcam) antitijela ili s kunićem IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), kao negativnu kontrolu, preko noći na 4 ° C s blagom rotacijom. Imunokompleksi vezani za magnetske kuglice su sakupljeni pomoću magnetskog stalka, opsežno su oprani, a proteinski / DNA prekriženi su obrnuti i DNA eluirana za realnom vremenu PCR analize. (Ristola i sur., 2009)

EHEC priprema za DNA chip array analizu

Raspored staničnih lizata i ekstrahira DNA
Bakterijski peleti suspendirani u PBS do konačne koncentracije od željene pomiješa se s ultrazvuk disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Njemačka) opremljen je mikrotipom MS1 (promjera 1 mm). Radna frekvencija bila je 30 kHz, a efektivna izlazna snaga bila je 100 W. Tijekom operacije, uzorci su ohladeni u ledenoj kupelji, miješani i centrifugirani. Uzorci su korišteni za studije protočne citometrije, dok su za kasnije rukovanje uzorci bili podvrgnuti toplinskoj obradi (95 ° C, 5 min). Sirovi stanični lizati obrađeni su sa smjesom fenola: kloroform: izoamil alkohol (25: 24: 1). Jednodrni volumen ove smjese je dodan uzorku lizata, otopina se snažno miješala tijekom 15 s i centrifugirana na 15,000 xg 2 minute na sobnoj temperaturi (RT) oko 22 ° C. Gornja vodena faza koja sadrži genomsku DNK pažljivo je odijeljena i sakupljena u novoj sterilnoj Eppendorf cijevi.
Zatim su uzorci sonicirani da bi fragmentirali DNA. Step sonication je realiziran u istim uvjetima kao što je gore opisano. Da bi se procijenili učinci fragmentacije na genomsku DNK, uzorci su analizirani korištenjem agaroza gel elektroforeze.
(…) Uzorci prethodno soniciranog 2,5 min podvrgnuti su ekstrakcijskoj fazi nakon toplinske obrade i centrifugiranja. Otpuštena DNA ekstrahirana je dva puta s mješavinom fenola: kloroform: izoamil alkohol, a zatim je podvrgnuta drugoj sonicaciji tijekom 0 do 15 minuta. Agaroza gel elektroforeza korištena je za određivanje raspodjele veličine DNA podvrgnute post-ekstrakcijskoj ultrazvučnoj fragmentaciji (Slika na gornjoj desnoj strani). Vrlo fragmentirana DNA vidljiva je iz prisutnosti DNA testiranja umjesto skupina visokih molekularnih težina koje su uklonjene iz uzoraka ultrazvukom 2.5 ili duže. Dulja sonikacija postupno smanjuje duljinu fragmenta na približno 150 - 600 bp, a ultrazvučna ekspresija tijekom 15 min dalje degradira te fragmente, što se može vidjeti uglavnom gornjim dijelom razmazivanja. Tako je prosječna veličina fragmenata DNA postupno smanjena s vremenom ultrasonizacije i tretiranjem od 5 minuta omogućeno je da se dobiju veličine DNA fragmenata koji su najprikladniji za pokuse na čipu. Napokon, uspostavljena je procedura pripreme analita DNA koja obuhvaća prve 2 minute ultrazvučne obrade, ekstrakciju DNA (2 ×) i naknadno 5 min sonikacije. (Basselet i sur., 2008)

Imunoprecipitacija kromatina (Chip)

HEK293 stanice su kultivirane kao što je gore opisano i fiksirano s 2 mM disukcinimidilglutarata 45 min na sobnoj temperaturi. Zatim su stanice dvaput isprane PBS-om. Kromatin se umrežava 10 minuta na sobnoj temperaturi upotrebom 1% (v / v) formaldehida i dva puta ispere ledeno hladnim PBS-om. Umrežavanje reakcije je zaustavljeno inkubacijom s glicinom pri konačnoj koncentraciji od 0.125 M tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije s tripsinom, stanice su odrezane iz antene za staničnu kulturu i dvaput isprane PBS-om. Stanični talog je resuspendiran u puferu za lizu (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% (v / v) Nonidet P-40), inkubiran 10 minuta na ledu i homogeniziran s Dounce homogenizatorom. Zatim se jezgre granulira centrifugiranjem (3500 xg, 5 min, 4 ° C) i resuspendira u puferu jezgre (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA i 1% (m / V) SDS). Jezgre su prekinute ultrazvukom s tri 20-bitna impulsa u a UP50H Ultrazvuk (Hielscher Ultraschall Technologie) pri postavljanju ciklusa 0,5 i amplitude 30%, čime se dobije genomskih DNA fragmenti veličine masom od 200 - 1000 bp. Za čip, 50g DNA razrijeđeno je 4 puta na imunoprecipitacije pufera (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% (v / v) Triton X-100, 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histona modifikacija analiza kromatina imunoprecipitacijom (Chip)

Ukratko, 6 x 10⁶ stanice su dvaput isprane s PBS i unakrsno vezane na ploči za kulturu 15 minuta na sobnoj temperaturi u prisutnosti 0.5% formaldehida. Reakcija povezivanja prekida se zaustavljanjem dodavanjem 0.125 M glicina. Svi sljedeći koraci su provedeni na 48 ° C. Svi puferi su prethodno ohlađeni i sadržavali inhibitore proteaze (Complete Mini, Roche). Stanice su dvaput isprane s PBS-om i potom strugile. Sakupljeni kuglice su otopljeni u 1 ml pufera za liziranje (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) i sonicirani u hladnoj etanoli kupki za 10 ciklusa s 100% amplitudom upotrebom UP50H Ultrazvuk (Hielscher, Teltow, Njemačka). Fragmentacija kromatina vizualizirati u 1% agaroznom gelu. Dobiveni fragmenti bili su u rasponu 200-500pb. Topljivi kromatina se dobije centrifugiranjem na 14,000 tretira ultrazvukom uzorke 10 minuta na 48 ° C. Topljivi frakcija se razrijedi 1/10 u puferu za razrjeđivanje (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), a zatim u alikvotima pohrani pri 80 ° C do upotrebe. (Rodriguez et al. 2008)