Ultrazvučno smično fragmentiranje DNA

Tijekom smičnog fragmentiranja DNA i RNA duge molekule DNA razbijaju se na manje dijelove, što je ključan korak u pripremi uzoraka za izradu knjižnica za sekvenciranje sljedeće generacije (NGS). Ultrazvučno smično fragmentiranje DNA koristi sile akustične kavitacije za razbijanje DNA ili RNA na fragmente veličine od 100 bp do 5 kb. Ova metoda omogućuje preciznu kontrolu veličine fragmenata, čime olakšava prilagodbu željenoj duljini DNA za optimalne rezultate sekvenciranja.

Smično fragmentiranje DNA ultrazvukom

Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja koja se temelje na ultrazvuku za smično fragmentiranje DNA, RNA i kromatina. Odaberite ultrazvučni uređaj sa sondom (npr. UP100H) za izravnu sonikaciju pomoću mikrovrha ili upotrijebite VialTweeeter ili ultrazvučni cuphorn za neizravnu pripremu DNA iz više uzoraka istodobno. Hielscher nudi idealan uređaj za vaše potrebe: bilo da imate 1 ili do 10 uzoraka, volumena od mikrolitara do litara – Hielscher sonikatori ispunit će vaše zahtjeve za pripremu fragmenata DNA, RNA i kromatina odgovarajuće duljine. Ponovljivost, jednostavno rukovanje i precizna kontrola omogućuju pouzdanu knjižnicu za sekvenciranje sljedeće generacije.
Za razliku od enzimske fragmentacije DNA, ultrazvučno smično fragmentiranje primjenjuje isključivo mehaničke smične sile bez dodavanja ikakvih kemikalija. Preciznim postavljanjem procesnih parametara ultrazvučnim smičnim fragmentiranjem nastaju fragmenti DNA visoke molekulske mase (plazmidna i genomska DNA).
Pročišćene nukleinske kiseline mogu se umnožavati prije ili nakon koraka fragmentacije.
Parametri sonikacije (snaga, pulsni ciklus / nizovi impulsa, vrijeme i temperatura) mogu se sigurno kontrolirati putem softverskih postavki.

Protokoli za ultrazvučno smično fragmentiranje DNA

Za analizu imunoprecipitacijom kromatina

Ukratko, stanice su nasađene u posude promjera 60mm (400.000 po posudi) i transfecirane RhoA siRNA (kako je opisano); nakon 72 h inkubirane su s formaldehidom (konačna koncentracija, 1%) tijekom 10 min na 37°C radi umrežavanja proteina s DNA. Reakcija umrežavanja zaustavljena je dodavanjem jedne desetine volumena glicina koncentracije 1,25 mol/L, čime je postignuta konačna koncentracija od 125 mmol/L. Stanice su dvaput isprane ledeno hladnim PBS-om, resuspendirane u puferu za radioimunoprecipitacijsku analizu [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksikolata, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] koji je sadržavao 1 mmol/L fenilmetilsulfonil-fluorida, 1 Ag/mL aprotinina i 1 Ag/mL pepstatina A te držane na ledu 30 min. Zatim su stanični lizati sonicirani na ledu uređajem Hielscher UP200S za ultrazvučnu sonikaciju (3 x 40 s, amplituda 40%, ciklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) dok umreženi kromatin nije smično fragmentiran tako da nastanu fragmenti DNA veličine između 200 i 1.000 bp. Jedna desetina ukupnog lizata upotrijebljena je za kvantifikaciju količine DNA prisutne u različitim uzorcima i smatrana je „ukupnom ulaznom DNA”. Supernatanti su inkubirani s 50%-tnom suspenzijom DNA iz sperme lososa/proteina na agarozi radi smanjenja nespecifičnog pozadinskog signala. Imunoprecipitacija je zatim provedena preko noći na 4°C s 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) ili bez protutijela (negativna kontrola). Tim je supernatantima dodan NaCl koncentracije 5 mol/L te su zagrijavani preko noći na 65°C radi poništavanja umrežavanja proteina i DNA. Imunokompleksi su dodatno obrađeni proteinazom K bez DNaze i RNaze, a DNA je pročišćena ekstrakcijom fenolom/kloroformom i taloženjem etanolom. PCR je proveden sa specifičnim početnicama koje odgovaraju sekvenci unutar promotorske regije ljudskog gena iNOS (početnica p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; početnica p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Istraživanja ekspresije EGFP-a

Za istraživanja ekspresije rekombinantni soj L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Njemačka), s genom za EGFP (pojačani zeleni fluorescentni protein) integriranim u kromosomski lokus ssu, uzgajan je u različitim medijima kako je prethodno opisano, uz dodatak 100 mg l^-1 Nourseothricina (Jena Bioscience, Njemačka). Tijekom uzgoja uzimani su uzorci od 1 ml, centrifugirani (2000 × g, 20°C, 10 min) i isprani otopinom 0,9% NaCl. Talog je resuspendiran u puferu (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) i razoren sonikacijom ultrazvučnim procesorom UP400S (primijenjena energija ∼ 400 Ws). Stanični ostaci uklonjeni su centrifugiranjem (6000 × g, 4°C, 5 min) i analizirani elektroforezom u poliakrilamidnom gelu uz natrijev dodecil-sulfat (SDS-PAGE) u reducirajućim uvjetima prema metodi Laemmlija (1970), uz 12,5% poliakrilamidne gelove. Ekspresija EGFP-a ispitivana je u kulturi uz miješanje. (Fritsche et al. 2007)

Imunoprecipitacija kromatina

Test imunoprecipitacije kromatina proveden je s pomoću kompleta ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, SAD) prema uputama proizvođača uz neke izmjene. Ukratko, u diferenciranim ljudskim podocitima provedeno je umrežavanje s 1% formaldehida tijekom 10 min na sobnoj temperaturi. Stanice su isprane ledeno hladnim PBS-om, a reakcija fiksacije zaustavljena je dodavanjem 0,125 M glicina tijekom 5 min na sobnoj temperaturi. Stanice su ponovno isprane ledeno hladnim PBS-om i sastrugane s posude. Stanice su istaložene centrifugiranjem i resuspendirane u puferu za lizu. Nakon centrifugiranja istaložene jezgre resuspendirane su u puferu za fragmentaciju smičnim silama, inkubirane na ledu tijekom 30 min, a kromatin je fragmentiran sonikacijom, npr. uređajem UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Njemačka) pri 25% snage, s 5 impulsa od po 20 sec na ledu, u fragmente veličine približno 200–600 bp. Fragmentirani kromatin zatim je centrifugiran i prikupljen je supernatant. Za imunoprecipitaciju je 60 μl kromatina inkubirano s 1 μg protutijela na Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SAD), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ili NF-κB p50 (Abcam), odnosno sa zečjim IgG-om (Zymed Laboratories) kao negativnom kontrolom, preko noći na 4°C uz lagano rotiranje. Imunokompleksi vezani na magnetske kuglice prikupljeni su s pomoću magnetskog stalka i temeljito isprani, a zatim su raskinute poprečne veze između proteina i DNA te je DNA eluirana za analizu PCR-om u stvarnom vremenu. (Ristola et al. 2009)

Priprema DNA EHEC-a za analizu mikročipom

Priprema staničnih lizata i ekstrahiranih DNA
Bakterijski talozi suspendirani u PBS-u do željene konačne koncentracije obrađeni su ultrazvučnim uređajem za razaranje stanica UP100H (Hielscher GmbH, Njemačka) opremljenim mikrovrhom MS1 (promjera 1mm). Radna frekvencija iznosila je 30 kHz, a efektivna izlazna snaga 100 W. Tijekom rada uzorci su hlađeni u kupelji s ledom i vodom, miješani i centrifugirani. Uzorci su upotrijebljeni za ispitivanja protočnom citometrijom, dok su za daljnju obradu podvrgnuti toplinskoj obradi (95°C, 5 min). Sirovi stanični lizati obrađeni su smjesom fenol:kloroform:izoamilni alkohol (25:24:1). Jednak volumen te smjese dodan je uzorku lizata, otopina je snažno miješana na vorteksnoj miješalici tijekom 15 s i centrifugirana pri 15.000 x g tijekom 2 min na sobnoj temperaturi (RT) od približno 22°C. Gornja vodena faza koja je sadržavala genomsku DNA pažljivo je odvojena i prikupljena u novu sterilnu epruvetu Eppendorf.
Nakon toga uzorci su sonicirani radi fragmentacije DNA. Korak sonikacije proveden je u istim uvjetima kao što je prethodno opisano. Kako bi se procijenili učinci fragmentacije na genomsku DNA, uzorci su analizirani elektroforezom u agaroznom gelu.
(…) Uzorci prethodno sonicirani tijekom 2,5 min podvrgnuti su koraku ekstrakcije nakon toplinske obrade i centrifugiranja. Oslobođena DNA dvaput je ekstrahirana smjesom fenol:kloroform:izoamilni alkohol, a zatim podvrgnuta drugoj sonikaciji u trajanju od 0 – 15 min. Elektroforeza u agaroznom gelu upotrijebljena je za određivanje raspodjele veličina DNA podvrgnute ultrazvučnoj fragmentaciji nakon ekstrakcije (slika gore desno). Visok stupanj fragmentacije DNA bio je vidljiv iz prisutnosti razmaza DNA umjesto vrpci visoke molekulske mase, koje su nestale iz uzoraka soniciranih tijekom 2,5 min ili dulje. Dulja sonikacija postupno je smanjivala duljinu fragmenata na približno 150 – 600 bp, a sonikacija tijekom 15 min dodatno je razgradila te fragmente, što se ponajviše može vidjeti u gornjem dijelu razmaza. Tako se prosječna veličina fragmenata DNA postupno smanjivala s vremenom ultrazvučne obrade, a obrada u trajanju od 5 min omogućila je dobivanje fragmenata DNA čije su veličine najprikladnije za analize na mikročipovima. Naposljetku je uspostavljen postupak pripreme analita DNA koji obuhvaća najprije 2 min ultrazvučne obrade, ekstrakciju DNA (2×) i naknadnu sonikaciju tijekom 5 min. (Basselet et al. 2008)

Imunoprecipitacija kromatina (ChIP)

Stanice HEK293 uzgajane su kako je prethodno opisano i fiksirane s 2 mM disukcinimidil-glutarata tijekom 45 min na sobnoj temperaturi. Zatim su stanice dvaput isprane PBS-om. Kromatin je umrežen tijekom 10 min na sobnoj temperaturi primjenom 1% (v/v) formaldehida i dvaput ispran ledeno hladnim PBS-om. Reakcija umrežavanja zaustavljena je inkubacijom s glicinom pri konačnoj koncentraciji od 0,125 M tijekom 5 min na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije s tripsinom stanice su sastrugane s posude za staničnu kulturu i dvaput isprane PBS-om. Stanični talog resuspendiran je u puferu za lizu (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubiran na ledu tijekom 10 min i homogeniziran Dounceovim homogenizatorom. Zatim su jezgre istaložene centrifugiranjem (3500 x g, 5 min, 4 °C) i resuspendirane u puferu za jezgre (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA i 1% (w/v) SDS). Jezgre su razorene sonikacijom trima impulsima u trajanju od po 20 s pomoću sonikatora UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) pri postavci ciklusa 0,5 i amplitude 30%, čime su dobiveni fragmenti genomske DNA pretežito veličine 200 – 1000 bp. Za ChIP je 50g DNA razrijeđeno 4 puta u puferu za imunoprecipitaciju (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 i 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza modifikacija histona imunoprecipitacijom kromatina (ChIP)

Ukratko, 6 x 10⁶ stanica dvaput je isprano PBS-om i umreženo na ploči za uzgoj tijekom 15 min na sobnoj temperaturi u prisutnosti 0,5% formaldehida. Reakcija umrežavanja zaustavljena je dodavanjem 0,125 M glicina. Svi sljedeći koraci provedeni su pri 48°C. Svi puferi bili su prethodno ohlađeni i sadržavali su inhibitore proteaza (Complete Mini, Roche). Stanice su dvaput isprane PBS-om, a zatim sastrugane. Prikupljeni talozi otopljeni su u 1 ml pufera za lizu (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) i sonikirani u hladnoj etanolnoj kupelji tijekom 10 ciklusa pri amplitudi od 100% pomoću sonikatora UP50H (Hielscher, Teltow, Njemačka). Fragmentacija kromatina vizualizirana je u 1% agaroznom gelu. Dobiveni fragmenti bili su u rasponu od 200–500pb. Topljivi kromatin dobiven je centrifugiranjem sonikiranih uzoraka pri 14.000g tijekom 10 min pri 48°C. Topljiva frakcija razrijeđena je u omjeru 1/10 u puferu za razrjeđivanje (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), zatim podijeljena u alikvote i pohranjena pri 80°C do uporabe. (Rodriguez et al. 2008)