Ultrazvučno rezanje DNK

Tijekom razdvajanja DNA i RNA, dugačke molekule DNA fragmentiraju se u manje dijelove, što je ključni korak u pripremi uzoraka za konstrukciju biblioteke sljedeće generacije sekvenciranja (NGS). Ultrazvučno smicanje DNK koristi sile akustične kavitacije za razbijanje DNK ili RNK na fragmente u rasponu od 100 bp do 5 kb. Ova metoda omogućuje preciznu kontrolu nad veličinom fragmenata, olakšavajući prilagodbu željenoj duljini DNK za optimalne rezultate sekvenciranja.

Smicanje DNK pomoću ultrazvuka

Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja temeljena na ultrazvuku za smicanje DNA, RNA i kromatina. Odaberite između ultrazvučnih uređaja tipa sonde (npr. UP100H) za izravnu sonikaciju pomoću mikrovrha ili koristite VialTweeeter ili ultrazvučni cuphorn za neizravnu pripremu DNK različitih uzoraka istovremeno. Hielscher nudi idealan uređaj s obzirom na vaše potrebe: bilo da imate 1 ili do 10 uzoraka, volumene od mikrolitara do litara – Hielscher sonikatori zadovoljit će vaše zahtjeve za pripremu fragmenata DNK, RNK i kromatina odgovarajuće duljine. Ponovljivost, jednostavno rukovanje i precizna kontrola omogućuju pouzdanu biblioteku za sekvenciranje sljedeće generacije.
Za razliku od enzimatske fragmentacije DNA, ultrazvučno smicanje primjenjuje čiste mehaničke sile smicanja bez dodavanja kemikalija. Preciznim podešavanjem procesnih parametara ultrazvučnim smicanjem nastaju fragmenti DNA visoke molekularne težine (plazmidna i genomska DNA).
Pročišćene nukleinske kiseline mogu se umnožiti prije ili nakon koraka fragmentacije.
Parametri sonikacije (snaga, pulsni ciklus / burstovi, vrijeme i temperatura) mogu se sigurno kontrolirati putem softverskih postavki.

Protokoli za ultrazvučno smicanje DNA

Za imunoprecipitacijski test kromatina

Ukratko, stanice su stavljene u posude promjera 60 mm (400 000 po posudi) i transficirane s RhoA siRNA (kako je opisano); nakon 72 h, inkubirane su s formaldehidom (konačna koncentracija, 1%) 10 minuta na 37°C da se umreže proteini s DNA. Reakcija unakrsnog povezivanja ugašena je dodatkom jedne desetine volumena 1,25 mol/L glicina, dajući konačnu koncentraciju od 125 mmol/L. Stanice su isprane dva puta s ledeno hladnim PBS-om, resuspendirane u puferu za ispitivanje radioimunoprecipitacije [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksiholata, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0). )] koji sadrži 1 mmol/L fenilmetilsulfonil fluorida, 1 Ag/mL aprotinina i 1 Ag/mL pepstatina A, i drži na ledu 30 minuta. Zatim su stanični lizati sonikirani na ledu s a Hielscher UP200S ultrazvučni sonikator (3 x 40 s, amplituda 40%, ciklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) dok se umreženi kromatini nisu odrezali da bi se dobili fragmenti DNA između 200 i 1000 bp. Jedna desetina cijelog lizata korištena je za kvantificiranje količine DNK prisutne u različitim uzorcima i smatrana je “ukupni unos DNK”. Supernatanti su inkubirani s DNA sperme lososa/protein agaroza-50% kaša da se smanji nespecifična pozadina. Imunoprecipitacija je zatim učinjena preko noći na 4°C s 5 g anti-NF-nB p65 (Upstate) ili bez antitijela (negativna kontrola). Ovi supernatanti su dopunjeni sa 5 mol/L NaCl i zagrijavani preko noći na 65°C da se ponište poprečne veze protein-DNA. Imunokompleksi su dalje tretirani proteinazom K bez DNaze i RNaze, a DNK je pročišćena ekstrakcijom fenol/kloroformom i taloženjem etanolom. PCR je učinjen sa specifičnim početnicama koje odgovaraju sekvenciji unutar promotorske regije ljudskog iNOS gena (p1 početnica: 5¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3¶; p2 početnica: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶). (Doublier i sur., 2008.)

Studije ekspresije EGFP

Za studije ekspresije, rekombinantni soj L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Njemačka) s genom za EGFP (poboljšani zeleni fluorescentni protein), integriranim kromosomskim ssu, kultiviran je u različitim medijima kako je prethodno opisano i dodatno nadopunjen sa 100 mg l^-1 Nourseotricin (Jena Bioscience, Njemačka). Tijekom uzgoja uzeti su uzorci od 1 ml, centrifugirani (2000 × g, 20°C, 10 min) i isprani 0,9% otopinom NaCl. Pelet je resuspendiran u puferu (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) i dezintegriran ultrazvučnom obradom UP400S (primjena energije ~ 400 Ws). Stanični ostaci uklonjeni su centrifugiranjem (6000 × g, 4°C, 5 min) i analizirani elektroforezom na natrijevom dodecil sulfatu – poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) u redukcijskim uvjetima prema metodi Laemmlija (1970.) s 12,5% poliakralamidnim gelovima . Ekspresija EGFP ispitana je u agitiranoj kulturi. (Fritsche i dr. 2007.)

imunoprecipitacija kromatina

Imunoprecipitacijski test kromatina proveden je pomoću ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) prema uputama proizvođača uz neke izmjene. Ukratko, diferencirani ljudski podociti su umreženi s 1% formaldehidom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Stanice su isprane s ledeno hladnim PBS-om i reakcija fiksacije je zaustavljena dodavanjem 0,125 M glicina tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Stanice su ponovno isprane s ledeno hladnim PBS-om i sastrugane s posude. Stanice su peletirane centrifugiranjem i resuspendirane u puferu za lizu. Nakon centrifugiranja, peletirane jezgre resuspendirane su u puferu za smicanje, inkubirane na ledu 30 minuta i kromatin je razrezan sonikacijom, npr. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Njemačka) pri 25% snage 5 impulsa od po 20 sekundi na ledu u fragmente veličine približno 200–600 bp. Odrezani kromatin je zatim centrifugiran i supernatant je sakupljen. Za imunoprecipitacije, 60 μl kromatina inkubirano je s 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SAD), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ili NF-κB p50 (Abcam) protutijela ili sa zečjim protutijelima IgG (Zymed Laboratories), kao negativna kontrola, preko noći na 4°C uz laganu rotaciju. Imunokompleksi vezani na magnetske kuglice sakupljeni su pomoću magnetskog stalka, opsežno isprani, a poprečne veze proteina/DNK su obrnute i DNK eluirana za PCR analizu u stvarnom vremenu. (Ristola i dr. 2009.)

EHEC DNA priprema za analizu niza čipova

Raspored staničnih lizata i ekstrahiranih DNA
Bakterijske pelete suspendirane u PBS-u do željene konačne koncentracije tretirane su s ometač ultrazvuka UP100H (Hielscher GmbH, Njemačka) opremljen mikrovrhom MS1 (promjera 1 mm). Radna frekvencija bila je 30 kHz, a efektivna izlazna snaga bila je 100 W. Tijekom rada uzorci su hlađeni u kupki s ledenom vodom, miješani i centrifugirani. Uzorci su korišteni za protočnu citometriju, dok su za kasnije rukovanje uzorci podvrgnuti toplinskoj obradi (95°C, 5 min). Sirovi lizati stanica obrađeni su smjesom fenol:kloroform:izoamil alkohol (25:24:1). Jednak volumen ove mješavine dodan je uzorku lizata, otopina je snažno vrtložena 15 sekundi i centrifugirana na 15 000 xg 2 minute na sobnoj temperaturi (RT) oko 22°C. Gornja vodena faza koja je sadržavala genomsku DNA pažljivo je odvojena i sakupljena u novu sterilnu Eppendorf epruvetu.
Nakon toga, uzorci su obrađeni ultrazvukom kako bi se fragmentirala DNK. Korak sonikacije je realiziran u istim uvjetima kao što je gore opisano. Kako bi se procijenili učinci fragmentacije na genomsku DNA, uzorci su analizirani elektroforezom u agaroznom gelu.
(…) Uzorci prethodno sonicirani 2,5 min podvrgnuti su koraku ekstrakcije nakon toplinske obrade i centrifugiranja. Oslobođena DNA ekstrahirana je dva puta mješavinom fenola:kloroforma:izoamilnog alkohola, a nakon toga podvrgnuta drugoj sonikaciji 0 – 15 minuta. Elektroforeza u agaroznom gelu korištena je za određivanje raspodjele veličine DNA podvrgnute ultrazvučnoj fragmentaciji nakon ekstrakcije (slika gore desno). Visoko fragmentirana DNK bila je vidljiva iz prisutnosti razmaza DNK, a ne iz traka visoke molekularne težine koje su eliminirane iz uzoraka soniciranih 2,5 min ili dulje. Dulja sonikacija postupno je smanjila duljinu fragmenata na otprilike 150 – 600 bp, a sonikacija od 15 minuta dodatno je degradirala te fragmente, što se uglavnom može vidjeti po gornjem dijelu razmaza. Stoga je prosječna veličina fragmenata DNA postupno opadala s vremenom ultrazvučne obrade, a tretman od 5 minuta omogućio je dobivanje veličina fragmenata DNA koje su najprikladnije za testove s nizom čipova. Napokon je uspostavljen postupak pripreme DNA analita koji se sastoji od prve 2 minute ultrazvučnog tretmana, ekstrakcije DNA (2x) i naknadnih 5 minuta sonikacije. (Basselet et al. 2008.)

Imunoprecipitacija kromatina (ChIP)

Stanice HEK293 uzgajane su kako je gore opisano i fiksirane s 2 mM disukcinimidil-glutaratom 45 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, stanice su isprane dva puta s PBS. Kromatin je umrežen 10 minuta na sobnoj temperaturi upotrebom 1% (v/v) formaldehida i dva puta ispran s ledeno hladnim PBS-om. Reakcija unakrsnog povezivanja je zaustavljena inkubacijom s glicinom u konačnoj koncentraciji od 0,125 M tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije s tripsinom, stanice su sastrugane iz posude za kulturu stanica i dva puta isprane s PBS-om. Stanični talog je resuspendiran u puferu za lizu (5 mM cijevi, pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubiran na ledu 10 minuta i homogeniziran s Dounce homogenizatorom. Nakon toga, jezgre su peletirane centrifugiranjem (3500 xg, 5 min, 4 °C) i resuspendirane u puferu za jezgre (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA i 1% (w/v) SDS). Jezgre su poremećene sonikacijom s tri pulsa od 20 s u a UP50H sonikator (Hielscher Ultraschall Technologie) pri postavci ciklusa 0,5 i amplitudi 30%, dajući fragmente genomske DNA ukupne veličine od 200 – 1000 bp. Za ChIP, 50 g DNA razrijeđeno je 4 puta u puferu za imunoprecipitaciju (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 i 0,01% (w/ v) SDS). (Weiske i dr. 2006.)

Analiza histonske modifikacije imunoprecipitacijom kromatina (ChIP)

Ukratko, 6 x 10⁶ stanice su isprane dva puta s PBS-om i umrežene na ploči kulture 15 minuta na sobnoj temperaturi u prisutnosti 0,5% formaldehida. Reakcija unakrsnog povezivanja je zaustavljena dodatkom 0,125 M glicina. Svi sljedeći koraci su provedeni na 48°C. Svi su puferi bili prethodno ohlađeni i sadržavali su inhibitore proteaze (Complete Mini, Roche). Stanice su isprane dva puta s PBS-om i zatim ostrugane. Sakupljene pelete su otopljene u 1 ml pufera za lizu (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) i sonikirane u hladnoj etanolskoj kupelji 10 ciklusa pri 100% amplitudi korištenjem UP50H sonikator (Hielscher, Teltow, Njemačka). Fragmentacija kromatina vizualizirana je u 1% agaroznom gelu. Dobiveni fragmenti bili su u rasponu od 200-500 pb. Topljivi kromatin dobiven je centrifugiranjem soniciranih uzoraka na 14 000 g tijekom 10 minuta na 48 °C. Topljiva frakcija je razrijeđena 1/10 u puferu za razrjeđivanje (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) zatim alikvotirana i pohranjena na 80°C do upotrebe. (Rodriguez i dr. 2008.)