Priprema plazmida ultrazvukom

Ultrazvučna obrada pouzdana je tehnika fragmentacije plazmidne DNA. Precizno podesiva amplituda, pulsni način rada i kontrola temperature najvažnije su značajke ultrazvučnog uređaja za fragmentaciju plazmida bez oštećivanja. Osim toga, primjena određenih sredstava pomaže u zaštiti plazmida od razgradnje. Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za kontroliranu fragmentaciju plazmida u pojedinačnim bočicama, istodobnu sonikaciju brojnih uzoraka te obradu ploča s više jažica. Saznajte više o uspješnoj ultrazvučnoj fragmentaciji plazmida!

Smicanje plazmida ultrazvukom

Kada su uzorci DNA izloženi ultrazvučnim valovima, vibracije nastale djelovanjem ultrazvuka stvaraju akustičnu kavitaciju u tekućini koja mehaničkim silama smiče ili lomi molekule DNA velike molekulske mase. Sonikacija je najčešće korištena metoda za eksperimente smicanja DNA na razini cijelog uzorka, uključujući primjene poput imunoprecipitacije kromatina (ChIP), za koje su male veličine fragmenata apsolutno ključne za postizanje visoke razlučivosti. (usp. Tseng et al., 2012)
Plazmidna DNA (pDNA) specifičan je oblik DNA koji se odlikuje prstenastim oblikom, a nalazi se u bakterijama i nekim eukariotima.
Superspiralizirana pDNA poželjan je oblik plazmidne DNA jer daje najbolje rezultate u daljnjim procesima kao što su automatizirano sekvenciranje i transfekcija. Ultrazvučna obrada prikladna je za uspješnu fragmentaciju pDNA, uključujući superspiraliziranu pDNA.
Thompson et al. (2008) pokazali su da je sonikacija plazmida, za koju je poznato da fragmentira superspiraliziranu DNA, učinkovit način povećanja duljine očitanja sekvence s kvalitetom phred20 do razine na kojoj se ona ne razlikuje značajno od duljina dobivenih s kontrolnim predloškom tvrtke Beckman Coulter ili enzimatski lineariziranim plazmidima.

Primjena plazmidnih vektora

Plazmidi se često koriste kao alati za kloniranje, prijenos i manipulaciju genima. Kada se plazmidi eksperimentalno koriste u te svrhe, nazivaju se vektorima. Fragmenti DNA ili geni mogu se umetnuti u plazmidni vektor, čime nastaje takozvani rekombinantni plazmid. Plazmidni vektori služe kao prijenosnici za unošenje rekombinantne DNA u stanicu domaćina i ključna su komponenta molekularnog kloniranja.
“Nevirusni vektori intenzivno se istražuju zbog njihove potencijalne primjene u genskoj terapiji za liječenje različitih složenih bolesti. Nevirusni vektori štite plazmidnu DNA od fizičke, kemijske i enzimske razgradnje te prenose molekulu DNA na ciljno mjesto. Primjerice, kationski liposomi, hitozan i druge pozitivno nabijene nanočestice stvaraju komplekse s plazmidnom DNA putem elektrostatskih interakcija. Međutim, kompleksi kationskih liposoma i plazmidne DNA, koji se lako stvaraju, relativno su veliki (tj. 300–400 nm) i heterogeni po svojoj prirodi, što otežava njihovu primjenu u farmaciji. Veliki i heterogeni kompleksi plazmidne DNA/liposoma, plazmidne DNA/aerosola i plazmidne DNA/peptida mogu se ultrazvučnom obradom smanjiti na manje i homogene čestice.” (Sarker et al., 2019)
Istaknut primjer primjene plazmidnih vektora jest CRISPR–Cas9. Sustav CRISPR–Cas9 obično se unosi u stanice kao jedan veliki plazmid ili više manjih plazmida koji kodiraju ciljnu sekvencu, vodič CRISPR i Cas9.

Ultrazvučna priprema nanočestica PLGA s uklopljenom DNA nanoprecipitacijom

Jo et al. (2020) upotrijebili su poli(mliječnu-ko-glikolnu kiselinu) (PLGA) za izradu nanočestičnog nosača za dostavu modelnog plazmida CRISPR–Cas9 u primarne makrofage dobivene iz koštane srži. Za nanoprecipitaciju nanočestica PLGA upotrijebljen je PLGA s dvije različite krajnje skupine (esterskim i aminskim skupinama) s ciljem da pozitivno nabijene aminske krajnje skupine povećaju učinkovitost inkapsulacije i količinu uklopljenog plazmida zahvaljujući elektrostatskim interakcijama između tih skupina i negativno nabijene okosnice DNA. U polipropilenskoj konusnoj epruveti za centrifugiranje od 50 mL otopljeno je 100 mg Pluronic F127 u 20 mL autoklavirane deionizirane vode vrtložnim miješanjem, nakon čega je provedena blaga sonikacija tijekom 30 min u ultrazvučnoj kupelji (vidi CupHorn). Dodan je autoklavirani magnetni štapić za miješanje te je otopina miješana pri 600 RPM tijekom 30 min dok su pripremane ostale otopine. Tijekom cijelog postupka upotrebljavan je plastični laboratorijski pribor umjesto staklenoga kako bi se nespecifična adsorpcija DNA svela na najmanju moguću mjeru. Zasebno su pripremljene otopine PLGA otopljenog u DMF-u (44,48 mg/ ml) i TIPS pentacena otopljenog u THF-u (0,667 mg/ml). PLGA je ostavljen da se bez miješanja kvasi u DMF-u tijekom 30 min prije sonikacije tijekom 30 min. (za cjelovit protokol vidi Jo et al., 2020)

Zaštita plazmidne DNA tijekom sonikacije

DNA, uključujući plazmide i superzavijene plazmide, vrlo je osjetljiva na razgradnju. Sve dostupne metode fragmentacije poznate su po određenim nedostacima. Ultrazvučna fragmentacija DNA jedna je od preferiranih metoda jer kontrolirana sonikacija u kombinaciji sa zaštitnim mjerama omogućuje smanjenje oštećenja lanaca DNA uzrokovanih smičnim silama i toplinom.
Osim postavki niske amplitude, pulsnog načina rada i kontrole temperature tijekom ultrazvučnog smicanja DNA, primjena određenih sredstava pokazala je značajan zaštitni učinak protiv razgradnje DNA. Primjerice, različiti polimeri, peptidi i lipidi štite plazmidnu DNA tijekom ultrazvučne obrade.

Stabilnost plazmidne DNA i nanokompleksa plazmidne DNA/IL pri ultrazvučnom smičnom naprezanju ispitana je elektroforezom u agaroznom gelu. I plazmidna DNA i nanokompleksi plazmidne DNA/IL podvrgnuti su ultrazvučnom smičnom naprezanju u različitim vremenskim intervalima. Plazmidna DNA bila je izložena ultrazvučnom smičnom naprezanju tijekom 0, 10, 20, 30 i 40 minuta. Međutim, nanokompleksi plazmidne DNA/IL bili su izloženi ultrazvučnom smičnom naprezanju tijekom 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minuta.
(istraživanje i slika: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) pokazali su da je, kada su nanostrukture plazmidne DNA / ionske tekućine (pDNA/IL) podvrgnute ultrazvučnom smičnom naprezanju tijekom 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 min te kompleksirane s komercijalno dostupnim kationskim sredstvom za dostavu gena lipofektaminom, postotak fluorescentno pozitivnih stanica iznosio redom 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% i 50% (vidi grafikon u nastavku). Postotak fluorescentno pozitivnih stanica povećao se kada su nanostrukture podvrgnute ultrazvučnom smičnom naprezanju tijekom 10 i 20 min, a zatim se polako smanjivao.

Utjecaj ionske tekućine [Bmim][PF6] na dostavu plazmidne DNA u stanice COS7. Nanokompleksi plazmidne DNA/IL (ionske tekućine) podvrgnuti su ultrazvučnom smičnom naprezanju u trajanju do 120 minuta te kompleksirani s LA prije dostave u stanice COS7. Podaci prikazuju prosječan broj (%) stanica HeLa pozitivnih na GFP izbrojenih u 10 različitih mikroskopskih vidnih polja, a pokus je proveden više puta tijekom triju različitih dana. (Istraživanje i grafikon: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvučna priprema lizata

Protokol ultrazvučne lize stanica
Započnite s obogaćenim uzorkom stanica pripremljenim metodom odvajanja stanica (npr. imunomagnetskim odvajanjem stanica, sortiranjem stanica aktiviranim fluorescencijom (FACS), centrifugiranjem u gradijentu gustoće, izolacijom stanica na temelju imunogustoće).
Uzorci stanica moraju sadržavati volumen pufera za lizu koji odgovara cilju pokusa i ultrazvučnom uređaju sa sondom.
Prednost se daje hipotoničnim puferima jer pojačavaju ultrazvučnu lizu stanica. Važno je da se aditivi i koncentracija soli primjenjuju na odgovarajući način.
Odaberite uređaj za ultrazvučnu lizu: za neizravnu sonikaciju bočica preporučuju se VialTweeter ili CupHorn. Za ploče s više jažica UIP400MTP je idealan ultrazvučni uređaj. Za klasičnu sonikaciju sondom najprikladniji je ultrazvučni homogenizator poput UP100H ili UP200Ht s mikrovrhom.
Protokol sonikacije sondom: Uronite sondu ultrazvučnog uređaja u volumen uzorka u mikrocentrifugalnoj epruveti i sonicirajte približno 10 sekundi. Ovisno o uzorku DNA, sonikacija se može ponoviti još jednom ili dvaput. Potreban unos ultrazvučne energije (Ws/mL) ovisi o viskoznosti uzorka i vrsti DNA. Hlađenje ledenom kupelji i pulsni način rada ultrazvučnog uređaja pomažu u sprječavanju toplinske razgradnje uzorka.
Nakon ultrazvučne lize uzorak se centrifugira kako bi se izdvojili ostaci u talogu (koji sadržava nelizirane stanice, jezgre i nelizirane organele).
Ako se uzorak odmah dalje ne obrađuje, može se pohraniti na odgovarajućoj temperaturi kako bi se očuvala njegova vijabilnost.

Ultrazvučni uređaji za fragmentaciju DNA

Hielscher Ultrasonics nudi različite platforme temeljene na ultrazvuku za fragmentaciju DNA, RNA i kromatina. Te različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrode), rješenja za neizravnu sonikaciju radi istodobne pripreme uzoraka u više epruveta ili pločama s više jažica (npr. pločama s 96 jažica, mikrotitarskim pločama), sonoreaktore i ultrazvučne uređaje tipa CupHorn. Sve platforme za smicanje DNA pokreću visokoučinkoviti ultrazvučni procesori s podešenom frekvencijom, koji omogućuju preciznu kontrolu i daju ponovljive rezultate.

Ultrazvučni procesori za bilo koji broj i veličinu uzoraka

Uz ultrazvučne uređaje za više uzoraka tvrtke Hielscher VialTweeter (za do 10 epruveta) i UIP400MTP (za mikroploče / ploče s više jažica) lako je skratiti vrijeme obrade uzoraka zahvaljujući intenzivnoj sonikaciji kojom se može precizno upravljati, uz istodobno postizanje željene raspodjele veličina fragmenata DNA i prinosa. Ultrazvučna fragmentacija DNA čini korake pripreme plazmida učinkovitima, pouzdanima i skalabilnima. Protokoli se mogu linearno skalirati s jednog na velik broj uzoraka primjenom stalnih ultrazvučnih parametara.
Ultrazvučni uređaji sa sondom s jednim do pet prstiju idealni su za pripremu manjeg broja uzoraka. Laboratorijski ultrazvučni uređaji tvrtke Hielscher dostupni su s različitim razinama snage kako biste mogli odabrati idealan ultrazvučni uređaj za razaranje za svoju primjenu povezanu s DNA.