Priprema plazmida pomoću ultrazvuka
Ultrazvuk je pouzdana tehnika za fragmentiranje plazmidne DNA. Precizno kontrolirana amplituda, način pulsiranja i kontrola temperature najvažnije su značajke ultrazvučnog uređaja za neoštećujuću fragmentaciju plazmida. Osim toga, upotreba određenih sredstava pomaže u zaštiti od razgradnje plazmida. Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za kontroliranu fragmentaciju plazmida iz pojedinačnih bočica, istovremenu sonikaciju brojnih uzoraka kao i ploče s više jažica. Saznajte više o uspješnoj ultrazvučnoj fragmentaciji plazmida!

UIP400MTP omogućuje precizno kontroliranu ultrazvučnu obradu ploča s više jažica. Jedna od primjena UIP400MTP je fragmentacija plazmidne DNA kako bi se dobili fragmenti specifično ciljane duljine.
Smicanje plazmida pomoću ultrazvuka
Kada se uzorci DNK podvrgnu ultrazvučnim valovima, ultrazvučno generirane vibracije stvaraju akustičnu kavitaciju u tekućini koja mehaničkim silama reže ili lomi molekule DNK velike molekularne težine. Sonikacija je najčešće korištena metoda za eksperimente skupnog smicanja DNK, uključujući primjene, kao što je imunoprecipitacija kromatina (ChIP), za koju su male veličine fragmenata apsolutno ključne za postizanje visoke rezolucije. (usp. Tseng i sur., 2012.)
Plazmidna DNA (pDNA) je specifičan oblik DNA, karakteriziran prstenastim oblikom i nalazi se u bakterijama i nekim eukariotima.
Superzamotana pDNA željeni je oblik plazmidne DNA jer pokazuje najbolje rezultate u nizvodnim procesima kao što su automatizirano sekvenciranje i transfekcija. Ultrasonication je pogodan za fragmentiranje pDNA, uključujući supercoiled pDNA, uspješno.
Thompson et al. (2008) demonstrated that plasmid sonication, which is known to fragment supercoiled DNA, is an effective way to improve sequence phred20 read lengths to the point that they are not significantly different from Beckman Coulter’s control template or enzymatically linearized plasmids.
- precizno kontrolirati
- Ponovljivi rezultati
- Podesiv za ciljane duljine fragmenata DNA
- kontrola temperature
- Skalabilan na bilo koju veličinu uzorka
Upotreba plazmidskih vektora
Plazmidi se često koriste kao alati za kloniranje, prijenos i manipuliranje genima. Kada se plazmidi koriste eksperimentalno u te svrhe, nazivaju se vektori. Fragmenti DNA ili geni mogu se umetnuti u plazmidni vektor, stvarajući takozvani rekombinantni plazmid. Plazmidni vektori koriste se kao prijenosnici za pokretanje rekombinantne DNA u stanicu domaćina i ključna su komponenta molekularnog kloniranja.
“Nevirusni vektori opsežno se proučavaju radi njihove potencijalne upotrebe u genskoj terapiji za liječenje raznih kompliciranih bolesti. Nevirusni vektori štite plazmidnu DNK od fizičke, kemijske i enzimske degradacije i dostavljaju DNK molekulu na ciljno mjesto. Na primjer, kationski liposomi, kitozan i druge pozitivno nabijene nanočestice tvore komplekse s plazmidnom DNA putem elektrostatskih interakcija. Međutim, kompleksi kationski liposomi/plazmid DNA koji se lako formiraju relativno su veliki (tj. 300-400 nm) i heterogene prirode što ih čini teškim za upotrebu u farmaceutskim primjenama. Veliki i heterogeni plazmidni DNA/liposomi, plazmidni DNA/aerosoli i plazmidni DNA/peptidni kompleksi mogu se reducirati na manje i homogene čestice pomoću ultrazvuka.” (Sarker i sur., 2019.)
Istaknuti primjer za korištenje plazmidnih vektora je CRISPR-Cas9. Sustav CRISPR-Cas9 obično se dostavlja stanicama kao jedan veliki plazmid ili više manjih plazmida koji kodiraju ciljnu sekvencu, CRISPR vodič i Cas9.
Ultrazvučna priprema PLGA nanočestica napunjenih DNA nanoprecipitacijom
Jo i sur. (2020.) koristili su poli(mliječnu-ko-glikolnu kiselinu) (PLGA) kako bi formirali nosač nanočestica za isporuku modela plazmida CRISPR–Cas9 u primarne makrofage izvedene iz koštane srži. Za nanoprecipitaciju PLGA nanočestica korišten je PLGA s dvije različite krajnje skupine (esterske i aminske skupine) s ciljem da pozitivno nabijene završne kape amina povećaju učinkovitost inkapsulacije i opterećenje zbog interakcija naboja između njih i negativno nabijene okosnice DNK. U konusnoj polipropilenskoj epruveti za centrifugiranje od 50 mL, 100 mg Pluronica F127 otopljeno je u 20 mL autoklavirane DI vode vrtložnim miješanjem nakon čega je uslijedilo 30 minuta nježne sonikacije u ultrazvučnoj kupki (vidi CupHorn). Dodana je autoklavirana magnetska miješalica i otopina je miješana na 600 okretaja u minuti 30 minuta dok su ostale otopine napravljene. Plastično laboratorijsko posuđe korišteno je umjesto staklenog posuđa kako bi se smanjila nespecifična adsorpcija DNK. Otopine PLGA otopljenog u DMF (44,48 mg/ml) i TIPS pentacena otopljenog u THF (0,667 mg/ml) napravljene su odvojeno. PLGA je ostavljen da se mirno vlaži u DMF-u 30 minuta prije nego što je 30 minuta sonikiran. (za cijeli protokol vidi Jo et al., 2020.)
- Ekstrakcija DNK
- Enkapsulacija DNA
- Disperzija DNA obložene nanočesticama
- Dostava plazmidne DNA u stanice
Zaštita plazmidne DNA tijekom sonikacije
DNK, uključujući plazmide i supersmotane plazmide, vrlo je osjetljiva na razgradnju. Sve dostupne metode fragmentacije poznate su po određenim nedostacima. Ultrazvučna fragmentacija DNK jedna je od poželjnih metoda budući da kontrolirana sonikacija u kombinaciji sa zaštitnim mjerama omogućuje smanjenje oštećenja lanaca DNK izazvana smicanjem i toplinom.
Osim postavki niske amplitude, načina pulsiranja i kontrole temperature tijekom ultrazvučnog rezanja DNA, korištenje određenih sredstava pokazalo je značajan zaštitni učinak protiv degradacije DNA. Na primjer, razni polimeri, peptidi i lipidi štite plazmidnu DNA tijekom ultrazvučne obrade.

Stabilnost plazmidne DNA i nanokompleksa plazmidne DNA/IL u odnosu na ultrazvučni smični stres ispitana je pomoću testa elektroforeze u agaroznom gelu. I plazmidna DNA i plazmidna DNA/IL nanokompleksi bili su podvrgnuti ultrazvučnom smičnom naprezanju u različitim vremenskim točkama. Plazmidna DNA je bila izložena ultrazvučnom smičnom stresu 0, 10, 20, 30 i 40 minuta. Međutim, nanokompleksi plazmida DNA/IL bili su izloženi ultrazvučnom smičnom naprezanju 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minuta.
(studija i slika: ©Sarker et al., 2019)
Sarker i sur. (2019) pokazali su da kada su nanostrukture plazmidne DNA? ionske tekućine (pDNA/IL) podvrgnute ultrazvučnom smičnom naprezanju 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minuta i kompleksirane s komercijalno dostupnim kationskim genom lijeka za isporuku lipofektamina, postotak fluorescentno pozitivnih stanica bio je 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, odnosno 50% (vidi donju tablicu). Postotak fluorescentno pozitivnih stanica povećao se kada su nanostrukture bile podvrgnute ultrazvučnom smičnom naprezanju tijekom 10 i 20 minuta, a nakon toga se polako smanjivao.

Utjecaj ionske tekućine [Bmim][PF6] na dostavu plazmidne DNA u COS7 stanice. Nanokompleksi plazmidne DNA/IL (ionske tekućine) bili su podvrgnuti ultrazvučnom smičnom stresu do 120 minuta i kompleksirani s LA prije isporuke u stanice COS7. Podaci pokazuju prosječan broj (%) GFP pozitivnih HeLa stanica izbrojanih u 10 različitih mikroskopskih polja, a eksperiment je izveden više puta u tri različita dana. (Studija i grafikon: ©Sarker et al., 2019.)

Plazmidna DNA može se zaštititi dodavanjem agensa prije ultrazvučne fragmentacije: sonikacijom inducirana degradacija gole pDNA (A) i pDNA formulirane s 1,5 mM CaCl2 i 20 % (v/v) t-butanol (B)
Uzorci su sonikirani sondom od 20 W do 120 s, kao što je naznačeno na vrhu svake trake. Traka H odgovara markeru Hyperladder I™️. Označene su OC i SC plazmidne trake.
(studija i slike: ©Wu et al., 2009.)
Ultrazvučna priprema lizata
Protokol ultrazvučne lize stanica
Započnite s obogaćenim uzorkom stanica koji je pripremljen metodom odvajanja stanica (npr. imunomagnetsko odvajanje stanica, razvrstavanje stanica aktivirano fluorescencijom (FACS), centrifugiranje u gradijentu gustoće, izolacija stanica pomoću imunodenziteta).
Uzorci stanica moraju pokazati volumen pufera za lizu koji je prikladan za eksperimentalni cilj i ultrazvučni uređaj tipa sonde.
Hipotonični puferi su poželjni jer pospješuju ultrazvučnu lizu stanica. Važno je da se aditivi i koncentracija soli koriste na odgovarajući način.
Odaberite svoj ultrazvučni uređaj za lizu: Za neizravnu sonikaciju bočica preporučuje se VialTweeter ili CupHorn. Za ploče s više jažica, UIP400MTP je idealan ultrazvučni uređaj. Najprikladniji su klasična ultrazvučna obrada tipa sonde, ultrazvučni homogenizator kao UP100H ili UP200Ht s mikrovrhom.
Protokol za ultrazvuk tipa sonde: Stavite ultrazvučnu sondu u volumen uzorka u epruveti za mikrocentrifugu i sonicirate cca. 10 sekundi. Ovisno o DNK uzorku, sonikacija se može ponoviti još jedan ili dva puta. Potrebni unos ultrazvučne energije (Ws/mL) ovisi o viskoznosti uzorka i vrsti DNA. Hlađenje putem ledene kupelji i način rada pulsiranja ultrazvučnog uređaja pomaže u sprječavanju termičke degradacije uzorka.
Nakon ultrazvučne lize, uzorak se centrifugira kako bi se odvojili ostaci peleta (koji sadrže nelizirane stanice, jezgre i nelizirane organele)
Ako se uzorak odmah ne obradi dalje, može se pohraniti na odgovarajućoj temperaturi kako bi se očuvala njegova održivost.
Ultrazvučni uređaji za fragmentaciju DNA
Hielscher Ultrasonics nudi različite platforme temeljene na ultrazvuku za fragmentaciju DNK, RNK i kromatina. Ove različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrode), rješenja za neizravnu sonikaciju za simultanu pripremu uzorka više epruveta ili ploča s više jažica (npr. ploče s 96 jažica, mikrotitarske ploče), sonoreaktore i ultrazvučne kuporne. Sve platforme za rezanje DNK pokreću frekvencijski podešeni ultrazvučni procesori visokih performansi, kojima se može precizno upravljati i daju ponovljive rezultate.
Ultrazvučni procesori za bilo koji broj i veličinu uzorka
With Hielscher’s multi-sample ultrasonicators VialTweeter (for up to 10 test tubes) and UIP400MTP (for microplates/ multiwell plates) it becomes easily possible to reduce sample processing time due to intense and precisely controllable ultrasonication whilst obtaining the desired DNA fragment size distribution and yield. Ultrasonic DNA fragmentation makes plasmid preparation steps efficient, reliable and scalable. Protocols can be linearly scaled from one to numerous samples by applying constant ultrasound parameters.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

Ultrazvučna jedinica za pripremu više uzoraka VialTweeter omogućuje istovremenu sonikaciju do 10 bočica. S uređajem za stezanje VialPress, do 4 dodatne cijevi mogu se pritisnuti naprijed za intenzivnu sonikaciju.
precizna kontrola procesa
Precisely controllable sonication settings are crucial since exhaustive sonification can destroy DNA, RNA and chromatin, but inadequate ultrasonic shearing results in too long DNA and chromatin fragments. Hielscher’s digital ultrasonicators can be easily set to precise sonication parameter. Specific sonication settings can be also saved as programmed setting for fast repetition of the same procedure.
Sva sonikacija se automatski protokolira i pohranjuje kao CSV datoteka na ugrađenu SD karticu. To omogućuje točnu dokumentaciju izvedenih ispitivanja i omogućuje jednostavnu reviziju sonikacijskih radova.
Preko daljinskog upravljača preglednika, svim digitalnim ultrazvučnim uređajima može se upravljati i nadzirati putem bilo kojeg standardnog preglednika. Instalacija dodatnog softvera nije potrebna, jer je LAN veza vrlo jednostavna plug-n-play instalacija.
Najveća jednostavnost korištenja tijekom ultrazvučne pripreme DNK
Svi Hielscher ultrasonicators dizajnirani su za pružanje ultrazvuka visokih performansi, dok su u isto vrijeme uvijek vrlo jednostavni za korištenje i jednostavni za rukovanje. Sve postavke su dobro strukturirane u preglednom izborniku, kojem se lako može pristupiti putem dodirnog zaslona u boji ili daljinskog upravljača preglednika. Pametan softver s programabilnim postavkama i automatskim snimanjem podataka osigurava optimalne postavke sonikacije za pouzdane i ponovljive rezultate. Čisto i jednostavno sučelje izbornika pretvara Hielscher ultrasonicators u user-friendly i učinkovite uređaje.
Donja tablica daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših laboratorijskih ultrazvučnih uređaja za lizu stanica i fragmentaciju DNA:
Volumen serije | Protok | Preporučeni uređaji |
---|---|---|
ploče s više jažica | n/a | UIP400MTP |
bočice, mala čaša | n/a | Ultrazvučni CupHorn |
do 10 bočica | n/a | VialTweeter |
1 do 500 ml | 10 do 200 ml/min | UP100H |
10 do 2000 ml | 20 do 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
Kontaktirajte nas!? Pitajte nas!
Literatura? Reference
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Činjenice koje vrijedi znati
Što su plazmidi?
Plazmid je mala kružna molekula DNA koja je fizički odvojena od kromosomske DNA i neovisno se replicira. Plazmidi su često povezani s genima koji pridonose preživljavanju organizma i daju specifične prednosti, npr. otpornost na antibiotike. Plazmidi se najčešće nalaze kao male kružne, dvolančane molekule DNA u bakterijama; međutim, plazmidi su ponekad prisutni u arhejama i eukariotskim organizmima. Plazmidi su važni alati u molekularnoj biologiji, genetici, biokemiji i znanosti o životu. Poznati kao vektori u genetičkom inženjeringu, plazmidi se koriste za replikaciju ili ekspresiju određenih gena. Ciljana izmjena vektora naziva se dizajn vektora.
GFP analiza u istraživanju stanica
Zeleni fluorescentni protein (GFP) svestrani je biološki marker za praćenje fizioloških procesa, vizualizaciju lokalizacije proteina i otkrivanje transgene ekspresije in vivo. GFP se može pobuditi laserskom linijom od 488 nm i optimalno se detektira na 510 nm.

Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorija do industrijska veličina.