Ultrasonication je pouzdana tehnika za fragmentiranje plazmid DNA. Precizno kontrolirana amplituda, pulsirajući način i kontrola temperature najvažnije su značajke ultrasonicatora za fragmentaciju plazmida koja se ne oštećuje. Osim toga, uporaba određenih sredstava pomaže u zaštiti od razgradnje plazmida. Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za kontroliranu fragmentaciju plazmida iz pojedinačnih bočica, istovremeno ultrazvukom brojnih uzoraka, kao i multi-well ploča. Saznajte više o uspješnoj ultrazvučnoj fragmentaciji plazmida!

Plasmid šišanje pomoću ultrazvuka

Kada su uzorci DNK podvrgnuti ultrazvučnim valovima, ultrazvučno generirane vibracije stvaraju akustičnu kavitaciju u tekućini koja mehaničkim silama striže ili razbija molekule DNA visoke molekularne težine. Ultrazvukom je najčešće korištena metoda za eksperimente masovnog smicanja DNA, uključujući primjene, kao što je Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), za koje su male veličine fragmenata apsolutno ključne za postizanje visoke rezolucije. (usp. Tseng i dr., 2012)
PlazmidSKA DNA (pDNA) je specifičan oblik DNA, karakteriziran oblikom prstena i nalazi se u bakterijama i nekim eukariotima.
Supercoiled pDNA je željeni oblik plazmidne DNA jer pokazuje najbolje rezultate u procesima down-streama kao što su automatizirano sekvenciranje i transfekcija. Ultrasonication je pogodan za fragment pDNA, uključujući supercoiled pDNA, uspješno.
(2008) je pokazala da je ultrazvukom plazmida, za koju se zna da fragmentira supercoiled DNA, učinkovit način za poboljšanje sekvence phred20 duljina čitanja do te mjere da se ne razlikuju značajno od kontrolnog predloška Beckmana Coultera ili enzimski lineariziranih plazmida.

Upotreba Plasmid vektora

Plazmidi se često koriste kao alati za kloniranje, prijenos i manipuliranje genima. Kada se plazmidi koriste eksperimentalno u te svrhe, nazivaju se vektori. Fragmenti DNA ili geni mogu se umetnuti u vektor plazmida, stvarajući takozvani rekombinantni plazmid. Vektori plazmida koriste se kao vozila za tjeranje rekombinantne DNK u ćeliju domaćina i ključna su komponenta molekularnog kloniranja.
“Ne-virusni vektori opsežno se proučavaju zbog njihove potencijalne uporabe u genskoj terapiji za liječenje raznih kompliciranih bolesti. Ne-virusni vektori štite plazmidnu DNK od fizičke, kemijske i enzimske razgradnje i isporučuju molekulu DNA na ciljno mjesto. Na primjer, kationski liposomi, kitozan i druge pozitivno nabijene nanočestice tvore komplekse s plazmidnom DNA kroz elektrostatičke interakcije. Međutim, lako oblikovani kationski liposomi/plazmidni DNA kompleksi relativno su veliki (tj. 300–400 nm) i heterogeni u prirodi što ih čini teškim za uporabu u farmaceutskim primjenama. Veliki i heterogeni plazmid DNA / liposomi, plazmid DNA / aerosoli i kompleksi plazmida DNA / peptida mogu se svesti na manje i homogene čestice pomoću ultrazvuka.” (Sarker i dr., 2019)
Istaknuti primjer za uporabu vektora plazmida je CRISPR–Cas9. CRISPR-Cas9 sustav obično se isporučuje stanicama kao jedan veliki plazmid ili više manjih plazmida koji kodiraju ciljni slijed, CRISPR vodič i Cas9.

Ultrazvučna priprema PLGA nanočestica napunjenih DNA nanočesticama nanoprecipitacijom

(2020) koristila je poli(mliječno-ko-glikolnu kiselinu) (PLGA) kako bi se stvorio nosač nanočestica za isporuku modela CRISPR-Cas9 plazmida u primarne makrofage izvedene iz koštane srži. Za nanoprecipitaciju PLGA nanočestica korištena je PLGA s dvije različite krajnje skupine (esterske i aminske skupine) s ciljem da pozitivno nabijene aminske krajnje kape povećaju učinkovitost enkapsulacije i opterećenje zbog interakcije naboja između nje i negativno nabijene okosnice DNA. U 50 mL polipropilenske konusne centrifuge cijevi, 100 mg Pluronic F127 otopljeno je u 20 mL autoklaviranoj DI vodi miješanjem vrtloga nakon čega je uslijedilo 30 min nježne ultrazvukom pomoću ultrazvučne kupke (pogledajte CupHorn). Dodana je autoklavirana magnetska šipka za miješanje i otopina je miješana pri 600 o / min tijekom 30 minuta dok su ostala rješenja napravljena. Plastični laboratorijski softver korišten je umjesto staklenog posuđa kako bi se smanjila nespecifična adsorpcija DNA. Otopine PLGA otopljene u DMF (44,48 mg/ ml) i TIPS pentacen otopljen u THF (0,667 mg/ml) izrađene su odvojeno. PLGA je ostavljena da se quiescently mokri u DMF-u 30 minuta prije nego što je sonificirana 30 minuta.

Zaštita DNA plazmida tijekom ultrazvukom

DNK, uključujući plazmide i supercoiled plazmide, vrlo su osjetljiva degradacija. Sve dostupne metode fragmentacije poznate su po određenim nedostacima. Ultrazvučna fragmentacija DNA jedna je od preferiranih metoda jer kontrolirana ultrazvukom u kombinaciji sa zaštitnim mjerama omogućuje smanjenje oštećenja DNA niti izazvanih smicama i toplinom.
Osim postavki niske amplitude, načina pulsiranja i kontrole temperature tijekom ultrazvučnog smicanja DNA, upotreba određenih sredstava pokazala je značajan zaštitni učinak protiv razgradnje DNA. Na primjer, razni polimeri, peptidi i lipidi štite plazmid DNK tijekom ultrazvuka.

Stabilnost DNA plazmida i nanokompleksa plazmida DNA / IL protiv ultrazvučnog stresa smicanja istražena je pomoću testa elektroforeze agaroznog gela. I plazmid DNA i plazmid DNA / IL nanokompleksi bili su podvrgnuti ultrazvučnom stresu smicanja za različite vremenske točke. PlazmidSKA DNK bila je izložena ultrazvučnom stresu smicanja 0, 10, 20, 30 i 40 minuta. Međutim, nanokompleksi plazmid DNA / IL bili su izloženi ultrazvučnom stresu smicanja 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minuta.
(studija i slika: ©Sarker i sur., 2019.)

(2019) pokazala je da kada su nanostrukture plazmida DNA / ionske tekućine (pDNA / IL) bile podvrgnute ultrazvučnom stresu smicanja za 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 min i složene s komercijalno dostupnim kationskim sredstvom za isporuku gena lipofektaminom, postotak fluorescentnih pozitivnih stanica bio je 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, odnosno 50% (vidi grafikon u nastavku). Postotak fluorescentnih pozitivnih stanica povećao se kada su nanostrukture bile izložene ultrazvučnom stresu smicanja 10 i 20 minuta, a nakon toga su se polako smanjivale.

Utjecaj ionske tekućine [Bmim][PF6] na isporuku plazmidne DNA COS7 stanicama. Nanokompleksi plazmid DNA / IL (ionska tekućina) bili su podvrgnuti ultrazvučnom stresu smicanja do 120 minuta i složeni s LA-om prije isporuke u COS7 stanice. Podaci pokazuju prosječan broj (%) GFP pozitivnih HeLa stanica izbrojanih u 10 različitih mikroskopskih polja, a eksperiment je proveden više puta u tri različita dana. (Studija i grafikon: ©Sarker i dr., 2019))

Ultrazvučni lizatni pripravak

Ultrazvučni stanična liza protokol
Započnite s obogaćenim uzorkom stanica koji je pripremljen metodom odvajanja stanica (npr. Odvajanje imunomagnetskih stanica, sortiranje stanica aktiviranih fluorescencijom (FACS), centrifugacija gradijenta gustoće, izolacija stanica imunodenznosti).
Uzorci stanica moraju pokazati volumen pufera lize koji je prikladan za eksperimentalni cilj i sonda tipa ultrasonicator.
Preferiraju se hipotonski puferi jer poboljšavaju ultrazvučnu staničnu lizu. Važno je da se aditivi i koncentracija soli koriste na odgovarajući način.
Odaberite svoj ultrazvučni uređaj za lizu: Za neizravnu ultrazvukom bočica preporučuju se VialTweeter ili CupHorn. Za multiwell-ploče, UIP400MTP je idealan ultrasonicator. I klasična sonda tipa ultrazvukom, ultrazvučni homogenizator kao UP100H ili UP200Ht s mikro-vrhom su najprikladniji.
Protokol za ultrazvukom tipa sonde: Stavite sondu ultrasonicator u volumen uzorka u mikrocentrifuge cijevi i sonificirajte oko 10 sekundi. Ovisno o uzorku DNK, ultrazvukom se može ponoviti još jedan ili dva puta. Potreban ultrazvučni unos energije (Ws/mL) ovisi o viskoznosti uzorka i tipu DNA. Hlađenje putem ledene kupke i pulsiranja načina ultrazvuka pomaže u sprječavanju toplinskog razgradnje uzorka.
Nakon ultrazvučne lize, uzorak se centrifugira kako bi se odvojili ostaci peleta (koji sadrže nelizirane stanice, jezgre i nelizirane organele)
Ako se uzorak ne obradi odmah dalje, može se pohraniti na odgovarajućoj temperaturi kako bi se očuvala njegova održivost.

Ultrasonicators za fragmentaciju DNA

Hielscher Ultrasonics nudi razne ultrazvučne platforme za DNK, RNA, i kromatina fragmentacije. Ove različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrodes), neizravne sonication rješenja za istovremenu pripremu uzoraka više cijevi ili više-bušotinskih ploča (npr. Ploče od 96 bušotina, mikrotiter ploče), sonoreactors, i ultrazvučni cuphorns. Sve platforme za sijeknje DNA pokreću se frekvencijski podešenim ultrazvučnim procesorima visokih performansi, koji se precizno mogu kontrolirati i pružiti ponovljive rezultate.

Ultrazvučni procesori za bilo koji broj i veličinu uzorka

S Hielscherovim višeuzornim ultrasonicators VialTweeter (za do 10 epruveta) i UIP400MTP (za mikroploče / multiwell ploče) postaje lako moguće smanjiti vrijeme obrade uzorka zbog intenzivne i precizno upravljive ultrazvuka uz dobivanje željene raspodjele i prinosa veličine fragmenta DNA. Ultrazvučna fragmentacija DNA čini korake pripreme plazmida učinkovitim, pouzdanim i skalabilnim. Protokoli se mogu linearno skalirati s jednog na brojne uzorke primjenom stalnih ultrazvučnih parametara.
Sonde ultrasonicators s jednim do pet prstiju idealni su za pripremu manjih brojeva uzoraka. Hielscherovi laboratorijski ultrasonicators su dostupni s različitim razinama snage tako da možete odabrati idealan ultrazvučni disruptor za svoju DNK povezanu primjenu.