Priprema plazmida pomoću ultrazvuka

Ultrazvuk je pouzdana tehnika za fragmentiranje plazmidne DNA. Precizno kontrolirana amplituda, način pulsiranja i kontrola temperature najvažnije su značajke ultrazvučnog uređaja za neoštećujuću fragmentaciju plazmida. Osim toga, upotreba određenih sredstava pomaže u zaštiti od razgradnje plazmida. Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za kontroliranu fragmentaciju plazmida iz pojedinačnih bočica, istovremenu sonikaciju brojnih uzoraka kao i ploče s više jažica. Saznajte više o uspješnoj ultrazvučnoj fragmentaciji plazmida!

Smicanje plazmida pomoću ultrazvuka

Kada se uzorci DNK podvrgnu ultrazvučnim valovima, ultrazvučno generirane vibracije stvaraju akustičnu kavitaciju u tekućini koja mehaničkim silama reže ili lomi molekule DNK velike molekularne težine. Sonikacija je najčešće korištena metoda za eksperimente skupnog smicanja DNK, uključujući primjene, kao što je imunoprecipitacija kromatina (ChIP), za koju su male veličine fragmenata apsolutno ključne za postizanje visoke rezolucije. (usp. Tseng i sur., 2012.)
Plazmidna DNA (pDNA) je specifičan oblik DNA, karakteriziran prstenastim oblikom i nalazi se u bakterijama i nekim eukariotima.
Superzamotana pDNA željeni je oblik plazmidne DNA jer pokazuje najbolje rezultate u nizvodnim procesima kao što su automatizirano sekvenciranje i transfekcija. Ultrasonication je pogodan za fragmentiranje pDNA, uključujući supercoiled pDNA, uspješno.
Thompson et al. (2008) demonstrated that plasmid sonication, which is known to fragment supercoiled DNA, is an effective way to improve sequence phred20 read lengths to the point that they are not significantly different from Beckman Coulter’s control template or enzymatically linearized plasmids.

Upotreba plazmidskih vektora

Plazmidi se često koriste kao alati za kloniranje, prijenos i manipuliranje genima. Kada se plazmidi koriste eksperimentalno u te svrhe, nazivaju se vektori. Fragmenti DNA ili geni mogu se umetnuti u plazmidni vektor, stvarajući takozvani rekombinantni plazmid. Plazmidni vektori koriste se kao prijenosnici za pokretanje rekombinantne DNA u stanicu domaćina i ključna su komponenta molekularnog kloniranja.
“Nevirusni vektori opsežno se proučavaju radi njihove potencijalne upotrebe u genskoj terapiji za liječenje raznih kompliciranih bolesti. Nevirusni vektori štite plazmidnu DNK od fizičke, kemijske i enzimske degradacije i dostavljaju DNK molekulu na ciljno mjesto. Na primjer, kationski liposomi, kitozan i druge pozitivno nabijene nanočestice tvore komplekse s plazmidnom DNA putem elektrostatskih interakcija. Međutim, kompleksi kationski liposomi/plazmid DNA koji se lako formiraju relativno su veliki (tj. 300-400 nm) i heterogene prirode što ih čini teškim za upotrebu u farmaceutskim primjenama. Veliki i heterogeni plazmidni DNA/liposomi, plazmidni DNA/aerosoli i plazmidni DNA/peptidni kompleksi mogu se reducirati na manje i homogene čestice pomoću ultrazvuka.” (Sarker i sur., 2019.)
Istaknuti primjer za korištenje plazmidnih vektora je CRISPR-Cas9. Sustav CRISPR-Cas9 obično se dostavlja stanicama kao jedan veliki plazmid ili više manjih plazmida koji kodiraju ciljnu sekvencu, CRISPR vodič i Cas9.

Ultrazvučna priprema PLGA nanočestica napunjenih DNA nanoprecipitacijom

Jo i sur. (2020.) koristili su poli(mliječnu-ko-glikolnu kiselinu) (PLGA) kako bi formirali nosač nanočestica za isporuku modela plazmida CRISPR–Cas9 u primarne makrofage izvedene iz koštane srži. Za nanoprecipitaciju PLGA nanočestica korišten je PLGA s dvije različite krajnje skupine (esterske i aminske skupine) s ciljem da pozitivno nabijene završne kape amina povećaju učinkovitost inkapsulacije i opterećenje zbog interakcija naboja između njih i negativno nabijene okosnice DNK. U konusnoj polipropilenskoj epruveti za centrifugiranje od 50 mL, 100 mg Pluronica F127 otopljeno je u 20 mL autoklavirane DI vode vrtložnim miješanjem nakon čega je uslijedilo 30 minuta nježne sonikacije u ultrazvučnoj kupki (vidi CupHorn). Dodana je autoklavirana magnetska miješalica i otopina je miješana na 600 okretaja u minuti 30 minuta dok su ostale otopine napravljene. Plastično laboratorijsko posuđe korišteno je umjesto staklenog posuđa kako bi se smanjila nespecifična adsorpcija DNK. Otopine PLGA otopljenog u DMF (44,48 mg/ml) i TIPS pentacena otopljenog u THF (0,667 mg/ml) napravljene su odvojeno. PLGA je ostavljen da se mirno vlaži u DMF-u 30 minuta prije nego što je 30 minuta sonikiran. (za cijeli protokol vidi Jo et al., 2020.)

Zaštita plazmidne DNA tijekom sonikacije

DNK, uključujući plazmide i supersmotane plazmide, vrlo je osjetljiva na razgradnju. Sve dostupne metode fragmentacije poznate su po određenim nedostacima. Ultrazvučna fragmentacija DNK jedna je od poželjnih metoda budući da kontrolirana sonikacija u kombinaciji sa zaštitnim mjerama omogućuje smanjenje oštećenja lanaca DNK izazvana smicanjem i toplinom.
Osim postavki niske amplitude, načina pulsiranja i kontrole temperature tijekom ultrazvučnog rezanja DNA, korištenje određenih sredstava pokazalo je značajan zaštitni učinak protiv degradacije DNA. Na primjer, razni polimeri, peptidi i lipidi štite plazmidnu DNA tijekom ultrazvučne obrade.

Stabilnost plazmidne DNA i nanokompleksa plazmidne DNA/IL u odnosu na ultrazvučni smični stres ispitana je pomoću testa elektroforeze u agaroznom gelu. I plazmidna DNA i plazmidna DNA/IL nanokompleksi bili su podvrgnuti ultrazvučnom smičnom naprezanju u različitim vremenskim točkama. Plazmidna DNA je bila izložena ultrazvučnom smičnom stresu 0, 10, 20, 30 i 40 minuta. Međutim, nanokompleksi plazmida DNA/IL bili su izloženi ultrazvučnom smičnom naprezanju 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minuta.(studija i slika: ©Sarker et al., 2019)

Sarker i sur. (2019) pokazali su da kada su nanostrukture plazmidne DNA? ionske tekućine (pDNA/IL) podvrgnute ultrazvučnom smičnom naprezanju 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minuta i kompleksirane s komercijalno dostupnim kationskim genom lijeka za isporuku lipofektamina, postotak fluorescentno pozitivnih stanica bio je 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, odnosno 50% (vidi donju tablicu). Postotak fluorescentno pozitivnih stanica povećao se kada su nanostrukture bile podvrgnute ultrazvučnom smičnom naprezanju tijekom 10 i 20 minuta, a nakon toga se polako smanjivao.

Utjecaj ionske tekućine [Bmim][PF6] na dostavu plazmidne DNA u COS7 stanice. Nanokompleksi plazmidne DNA/IL (ionske tekućine) bili su podvrgnuti ultrazvučnom smičnom stresu do 120 minuta i kompleksirani s LA prije isporuke u stanice COS7. Podaci pokazuju prosječan broj (%) GFP pozitivnih HeLa stanica izbrojanih u 10 različitih mikroskopskih polja, a eksperiment je izveden više puta u tri različita dana. (Studija i grafikon: ©Sarker et al., 2019.)

Ultrazvučna priprema lizata

Protokol ultrazvučne lize stanica
Započnite s obogaćenim uzorkom stanica koji je pripremljen metodom odvajanja stanica (npr. imunomagnetsko odvajanje stanica, razvrstavanje stanica aktivirano fluorescencijom (FACS), centrifugiranje u gradijentu gustoće, izolacija stanica pomoću imunodenziteta).
Uzorci stanica moraju pokazati volumen pufera za lizu koji je prikladan za eksperimentalni cilj i ultrazvučni uređaj tipa sonde.
Hipotonični puferi su poželjni jer pospješuju ultrazvučnu lizu stanica. Važno je da se aditivi i koncentracija soli koriste na odgovarajući način.
Odaberite svoj ultrazvučni uređaj za lizu: Za neizravnu sonikaciju bočica preporučuje se VialTweeter ili CupHorn. Za ploče s više jažica, UIP400MTP je idealan ultrazvučni uređaj. Najprikladniji su klasična ultrazvučna obrada tipa sonde, ultrazvučni homogenizator kao UP100H ili UP200Ht s mikrovrhom.
Protokol za ultrazvuk tipa sonde: Stavite ultrazvučnu sondu u volumen uzorka u epruveti za mikrocentrifugu i sonicirate cca. 10 sekundi. Ovisno o DNK uzorku, sonikacija se može ponoviti još jedan ili dva puta. Potrebni unos ultrazvučne energije (Ws/mL) ovisi o viskoznosti uzorka i vrsti DNA. Hlađenje putem ledene kupelji i način rada pulsiranja ultrazvučnog uređaja pomaže u sprječavanju termičke degradacije uzorka.
Nakon ultrazvučne lize, uzorak se centrifugira kako bi se odvojili ostaci peleta (koji sadrže nelizirane stanice, jezgre i nelizirane organele)
Ako se uzorak odmah ne obradi dalje, može se pohraniti na odgovarajućoj temperaturi kako bi se očuvala njegova održivost.

Ultrazvučni uređaji za fragmentaciju DNA

Hielscher Ultrasonics nudi različite platforme temeljene na ultrazvuku za fragmentaciju DNK, RNK i kromatina. Ove različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrode), rješenja za neizravnu sonikaciju za simultanu pripremu uzorka više epruveta ili ploča s više jažica (npr. ploče s 96 jažica, mikrotitarske ploče), sonoreaktore i ultrazvučne kuporne. Sve platforme za rezanje DNK pokreću frekvencijski podešeni ultrazvučni procesori visokih performansi, kojima se može precizno upravljati i daju ponovljive rezultate.

Ultrazvučni procesori za bilo koji broj i veličinu uzorka

With Hielscher’s multi-sample ultrasonicators VialTweeter (for up to 10 test tubes) and UIP400MTP (for microplates/ multiwell plates) it becomes easily possible to reduce sample processing time due to intense and precisely controllable ultrasonication whilst obtaining the desired DNA fragment size distribution and yield. Ultrasonic DNA fragmentation makes plasmid preparation steps efficient, reliable and scalable. Protocols can be linearly scaled from one to numerous samples by applying constant ultrasound parameters.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.