Protokol za inaktivaciju SARS-CoV-2 koronavirusa sonikacijom

Hielscher VialTweeter jedinstvena je ultrazvučna jedinica za pripremu više uzoraka koja se koristi za inaktivaciju koronavirusa SARS-COV-2. VialTweeter omogućuje pripremu do 10 bočica s uzorkom istovremeno i stoga je idealna jedinica za obradu masovnih uzoraka.

Deaktivacija SARS-CoV-2 koronavirusa pomoću VialTweetera

Nakon uklanjanja fiksativa, monoslojevi su isprani tri puta fiziološkom otopinom s fosfatnim puferom (PBS) prije struganja stanica u 1 mL MEM/5% FBS i sonikirani (3 × 10 sekundi uključeno, 10 sekundi isključeno pri 100% snage i amplitude) koristeći Hielscher ultrazvučni procesor UP200St s VialTweeterom privitak. Supernatanti su pročišćeni centrifugiranjem na 3000 x g tijekom 10 minuta. Ovdje pročitajte cijeli protokol za inaktivaciju SARS-CoV-2 koronavirusa Welcha i sur. (2020.) u nastavku:

Stanice i virus

Vero E6 stanice (Vero C1008; ATCC CRL-1586) uzgajane su u modificiranom Eagleovom minimalnom esencijalnom mediju (MEM) dopunjenom s 10% (v/v) fetalnog telećeg seruma (FCS). Virus koji je korišten bio je SARS-CoV-2 soj hCOV-19/England/2/2020, izoliran pomoću PHE iz prve skupine pacijenata u Ujedinjenom Kraljevstvu 29. siječnja 2020. Ovaj virus je dobiven na prolazu 1 i korišten za studije inaktivacije na prolazu 2 ili 3.
Za reagense i kemikalije koje se koriste za inaktivaciju SARS-CoV-2, kao i za uklanjanje citotoksičnosti reagensa, pogledajte znanstveno izvješće Welcha i sur. (2020).

Inaktivacija virusa deterdžentima – Protokol inaktivacije SARS-CoV-2 Coronavirus Welch et al. 2020

Inaktivacija SARS-CoV-2

Za komercijalne proizvode, pripravci virusa (tekućina kulture tkiva, titri u rasponu od 1 × 10⁶ na 1 × 10⁸ PFU/ml) tretirani su u triplikatu s reagensima u koncentracijama i za kontaktna vremena preporučena u uputama proizvođača za uporabu, ako su dostupni, ili za koncentracije i vremena koja su posebno zahtijevali ispitni laboratoriji. Tamo gdje je proizvođač naveo raspon koncentracija, ispitan je najniži omjer proizvoda i uzorka (tj. najniža preporučena koncentracija ispitnog proizvoda). Reagensi u epruvetama za transport uzoraka testirani su korištenjem omjera jednog volumena tekućine kulture tkiva i deset volumena reagensa, osim ako proizvođač nije odredio volumenski omjer tekućine uzorka i reagensa. Deterdženti, fiksativi i otapala ispitani su u navedenim koncentracijama tijekom naznačenih vremena. Svi koraci inaktivacije provedeni su na sobnoj temperaturi (18 – 25°C). Za testiranje alternativnih tipova uzoraka, virus je ubačen u matricu navedenog uzorka u omjeru 1:9, a zatim tretiran testnim reagensima kao što je gore navedeno. Svi pokusi uključivali su trostruke kontrolne lažno tretirane uzorke s ekvivalentnim volumenom PBS-a umjesto ispitnog reagensa. Neposredno nakon potrebnog vremena kontakta, 1 mL tretiranog uzorka obrađeno je pomoću odgovarajuće odabrane filtracijske matrice. Uklanjanje reagensa za ispitivanje inaktivacije provedeno je u većem formatu centrifugalne kolone koristeći Pierce 4 mL centrifugalne kolone za uklanjanje deterdženta (Thermo Fisher) ili punjenjem praznih Pierce centrifugalnih kolona kapaciteta 10 mL (Thermo Fisher) sa SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ili Sephadex LH-20 da se dobije 4 mL pakiranih kuglica/smole. Za pročišćavanje pomoću Amicon filtara, uzorci od 2 × 500 μl pročišćeni su pomoću dva centrifugalna filtra prethodno opisanom metodom, a zatim su skupljeni zajedno. Za formaldehid i formaldehid s uklanjanjem glutaraldehida, korišten je jedan filter s 1× 500 μl volumena uzorka, resuspendiran nakon obrade u 500 μl PBS, i dodan u 400 ul MEM/5% FBS. Za inaktivaciju zaraženih jednoslojevi, 12,5 cm² tikvice stanica Vero E6 (2,5 × 10⁶ stanice/boca u 2,5 mL MEM/5% FBS) su inficirane na MOI 0,001 i inkubirane na 37°C/5% CO₂ za 24 sata. Supernatant je uklonjen, a stanice su fiksirane pomoću 5 mL formaldehida, ili formaldehida i glutaraldehida na sobnoj temperaturi 15 ili 60 minuta. Fiksativ je uklonjen, a monoslojevi su isprani tri puta s PBS prije struganja stanica u 1 mL MEM/5% FBS i sonikirane (3 × 10 sekundi uključeno, 10 sekundi isključeno pri 100% snage i amplitude) korištenjem UP200St s dodatkom VialTweeter (Hielscher Ultrasound Tehnologija). Supernatanti su pročišćeni centrifugiranjem na 3000 x g tijekom 10 minuta.

Pojedinosti o reagensu koji se koristi za inaktivaciju SARS-CoV-2 koronavirusa ultrazvučnim VialTweeterom prema protokolu Welcha i sur. 2020

Cijeli protokol uključujući upotrebu Hielscher VialTweetera može se pronaći ovdje:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofisticirani ultrazvučni dismembratori i razarači stanica

Ultrazvučni uređaj za više uzoraka VialTweeter samo je jedno od mnogih ultrazvučnih rješenja za pripremu uzoraka u biološkim, biokemijskim i kliničkim laboratorijima. Hielscher Ultrasonics nudi idealan ultrazvučni dismembrator za vašu primjenu, npr. liza stanica, ekstrakcija stanica, homogenizacija tkiva, solubilizacija lizata, otapanje, otplinjavanje uzorka itd.
Javite nam koliko uzoraka morate obraditi po satu i danu, preferirate li izravnu ili neizravnu sonikaciju i koji je cilj ultrazvučne obrade uzoraka. Preporučit ćemo vam najprikladniju ultrazvučnu jedinicu za vašu svakodnevnu radnu rutinu!
Hielscher Ultrasonicsovi digitalni ultrazvučni procesori opremljeni su pametnim softverom, automatskim snimanjem podataka, jednostavnim opcijama predpodešavanja za kontrolu temperature, trajanje sonikacije, način rada ciklusa/pulsa kao i osvjetljenje uzorka i daljinsko upravljanje preglednikom. Nastojimo naše ultrazvučne uređaje učiniti što pametnijima kako bi vaše istraživanje i radna rutina postali što praktičniji i uspješniji.
Kliknite ovdje kako biste pronašli više aplikacija uključujući protokole ultrazvučne pripreme uzorka s VialTweeterom!