Protokol inaktivacije koronavirusa SARS-CoV-2 sonikacijom

VialTweeter tvrtke Hielscher jedinstvena je ultrazvučna jedinica za pripremu više uzoraka koja se upotrebljava za inaktivaciju koronavirusa SARS-CoV-2. VialTweeter omogućuje istovremenu pripremu do 10 epruveta s uzorkom te je stoga idealna jedinica za masovnu obradu uzoraka.

Inaktivacija koronavirusa SARS-CoV-2 pomoću jedinice VialTweeter

Nakon uklanjanja fiksativa monoceljski su slojevi oprani tri puta fosfatno puferiranim fiziološkim otopinama (PBS) prije nego što su stanice strugane u 1mL MEM/5% FBS i sonicirane (3 × 10 s aktivno, 10 s pauze pri 100% snage i amplitude) pomoću ultrazvučnog procesora Hielscher UP200St s VialTweeter priključkom. Supernatanti su razbistreni centrifugiranjem pri 3000 × g tijekom 10 min. Potpuni protokol inaktivacije koronavirusa SARS-CoV-2 od Welch et al. (2020) pročitajte u nastavku:

Stanice i virus

Stanice Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) kultivirane su u modificiranom Eagleovom esencijalnom mediju (MEM) dopunjenom s 10% (v/v) fetalnog telećeg seruma (FCS). Upotrijebljeni virus bio je soj SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, koji su iz PHE izolirali iz prvog klastera pacijenata u Ujedinjenom Kraljevstvu 29/01/2020. Taj je virus stečen na prolazu 1 i upotrijebljen za ispitivanja inaktivacije na prolazu 2 ili 3.
Za reaktante i kemikalije upotrijebljene za inaktivaciju SARS-CoV-2, kao i za uklanjanje citotoksičnosti reaktanata, pogledajte znanstveno izvješće Welch et al. (2020).

Inaktivacija virusa detergentima – protokol inaktivacije koronavirusa SARS-CoV-2 od Welch et al. 2020

Inaktivacija SARS-CoV-2


Za komercijalne proizvode virusni pripravci (fluid tkivne kulture, titri u rasponu od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) obrađivani su u trostrukom postupku reaktantima pri koncentracijama i vremenima kontakta preporučenima u uputama proizvođača za uporabu, gdje su dostupne, ili pri koncentracijama i vremenima koja su izričito zatražili ispitivački laboratoriji. Kada je proizvođač naveo raspon koncentracija, ispitivan je najniži omjer proizvoda i uzorka (tj. najniža preporučena koncentracija ispitivanog proizvoda). Reaktanti u epruvetama za transport uzoraka ispitivani su pri omjeru jednog volumena fluida tkivne kulture na deset volumena reaktanta, osim ako je proizvođač naveo volumni omjer uzorčnog fluida i reaktanta. Deterdženti, fiksativi i otapala ispitivani su pri navedenim koncentracijama tijekom navedenih vremena. Svi su koraci inaktivacije izvedeni na sobnoj temperaturi okoline (18 – 25°C). Za ispitivanje alternativnih vrsta uzoraka virus je dodan u navedenu matricu uzorka u omjeru 1:9, a zatim obrađen ispitnim reaktantima kao gore. Svi su eksperimenti uključivali trostruke kontrolne uzorke lažne obrade s odgovarajućim volumenom PBS-a umjesto ispitnog reaktanta. Odmah nakon potrebnog vremena kontakta 1mL obrađenog uzorka obrađen je pomoću prikladno odabrane filtracijske matrice. Uklanjanje reaktanata za ispitivanje inaktivacije izvedeno je u većem formatu centrifugalnih kolona pomoću Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) ili ispunjavanjem praznih Pierce centrifugalnih kolona kapaciteta 10mL (Thermo Fisher) kuglicama SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ili Sephadex LH-20, tako da se dobije 4mL zapakovanog sadržaja kuglica/smole. Za pročišćavanje pomoću Amicon filtera obrađeno je 2 × 500μl uzoraka s dva centrifugalna filtera ranije opisanom metodom, a zatim su sjedinjeni. Za uklanjanje formaldehida, odnosno formaldehida s glutaraldehidom, upotrijebljen je jedan filter s uzoračnim volumenom od 1× 500μl, resuspendiran nakon postupka u 500μl PBS-a i dodan u 400ul MEM/5% FBS. Za inaktivaciju zaraženih monoslojeva korištene su kolbe od 12,5 cm² sa stanicama Vero E6 (2,5 × 10⁶ stanica u 2,5mL MEM/5% FBS) zaražene pri MOI 0,001 i inkubirane na 37°C/5% CO₂ tijekom 24 sata. Supernatant je uklonjen, a stanice fiksirane korištenjem 5mL formaldehida, odnosno formaldehida i glutaraldehida, na sobnoj temperaturi tijekom 15 ili 60 min. Fiksativ je uklonjen, a monoceljski su slojevi oprani tri puta PBS-om prije nego što su stanice strugane u 1mL MEM/5% FBS i sonicirane (3 × 10 s aktivno, 10 s pauze pri 100% snage i amplitude) pomoću UP200St s ugrađenim VialTweeter priključkom (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanti su razbistreni centrifugiranjem pri 3000 × g tijekom 10 min.


Detalji reaktanta upotrijebljenog za inaktivaciju koronavirusa SARS-CoV-2 ultrazvučnom jedinicom VialTweeter prema protokolu Welch et al. 2020

Potpuni protokol, uključujući upotrebu jedinice VialTweeter tvrtke Hielscher, možete pronaći ovdje:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Napredni ultrazvučni dismembratori i razarači stanica

Višeuzoračni ultrazvučni uređaj VialTweeter samo je jedno od mnogih ultrazvučnih rješenja za pripremu uzoraka u biološkim, biokemijskim i kliničkim laboratorijima. Hielscher Ultrasonics nudi idealan ultrazvučni dismembrator za vašu primjenu, npr. lizu stanica, ekstrakciju stanica, homogenizaciju tkiva, solubilizaciju lisata, razrjeđivanje, otapanje, degaziranje uzorka i dr.
Javite nam koliko uzoraka morate obrađivati na sat i na dan, radi li se o direktnoj ili indirektnoj sonikaciji i što je cilj ultrazvučne obrade uzorka. Preporučit ćemo vam najprikladniju ultrazvučnu jedinicu za vašu svakodnevnu radnu rutinu!
Digitalni ultrazvučni procesori Hielscher Ultrasonics opremljeni su pametnim softverom, automatskim snimanjem podataka, jednostavnim unaprijed postavljenim opcijama za kontrolu temperature, trajanje sonikacije, ciklični/pulsni način rada, kao i osvjetljenje uzorka i daljinsko upravljanje preglednikom. Nastojimo učiniti naše ultrazvučne uređaje što pametnijima kako bi vaše istraživanje i radna rutina postali što udobniji i uspješniji.
Kliknite ovdje da biste pronašli više primjena, uključujući protokole ultrazvučne pripreme uzoraka jedinicom VialTweeter!