Ultrazvučna liza uzoraka vrste Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster široko se upotrebljava u laboratorijima kao modelni organizam. Stoga se predanalitički koraci pripreme, poput lize, razaranja stanica, ekstrakcije proteina i smicanja DNA iz uzoraka vrste Drosophila melanogaster, moraju često provoditi. Ultrazvučni dezintegratori pouzdani su i učinkoviti te se mogu upotrebljavati za jednostavno obavljanje različitih zadataka, poput lize, ekstrakcije proteina ili fragmentacije DNA, samo prilagodbom parametara ultrazvučnog procesa. Ultrazvučni homogenizatori stoga su prilagodljivi alati sa širokim rasponom primjena.

Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina

Liza, solubilizacija stanica, homogenizacija tkiva i ekstrakcija proteina tipični su zadaci za ultrazvučne dezintegratore u biološkim laboratorijima. Ultrazvučni dezintegratori i uređaji za razaranje stanica prikladni su za homogenizaciju životinjskih tkiva, kukaca (npr. Drosophila melanogaster, C. elegans) ili biljnih uzoraka. Daljnje primjene ultrazvuka obuhvaćaju lizu staničnih suspenzija i taloga te ekstrakciju unutarstaničnih proteina.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina vrlo su pouzdani i ponovljivi procesi koji se mogu provoditi na temelju utvrđenih protokola. Budući da se intenzitet ultrazvučnog procesa može precizno prilagoditi parametrima sonikacije, poput amplitude, cikličkog / pulsnog načina rada, temperature i volumena uzorka, jednom provjereni protokoli mogu se iznova ponavljati s istim ishodom.

Ultrazvučna fragmentacija DNA i RNA

Nakon lize stanica i ekstrakcije proteina, često potreban korak u pripremi uzoraka jest smicanje i fragmentacija DNA, RNA i kromatina, npr. prije imunoprecipitacije kromatina (ChIP). Fragmentacija DNA i RNA može se pouzdano postići kidanjem kovalentnih veza koje drže DNA na okupu djelovanjem fizičkih sila. Pri fizičkom smicanju, primjerice sonikacijom, najprije se prekidaju lanci DNA, a zatim se DNA fragmentira na manje dijelove.
Ultrazvučna fragmentacija DNA pouzdana je i učinkovita metoda smicanja DNA na ciljanu duljinu, npr. 500bp (parova baza). Glavne prednosti ultrazvučne fragmentacije DNA uključuju preciznu kontrolu parametara i intenziteta ultrazvučnog procesa. Parametri ultrazvučnog procesa mogu se prilagoditi preciznim podešavanjem intenziteta, ciklusa i vremena sonikacije. Time se omogućuje dobivanje željenih veličina DNA, a ciljana duljina DNA može se pouzdano postići i ponovno dobiti. Ultrazvučno smicanje DNA idealno je i za dobivanje fragmenata DNA velike molekulske mase.

Protokoli za ultrazvučnu lizu vrste Drosophila melanogaster

U nastavku možete pronaći različite protokole za ultrazvučno potpomognutu lizu, ekstrakciju proteina te fragmentaciju DNA ili kromatina iz uzoraka vrste Drosophila.

Ultrazvučna liza za analizu imunoprecipitacijom uz umrežavanje (CLIP)

Analiza CLIP provedena je kako je prethodno opisano, uz određene izmjene. Približno 20 mg jajnika ženki divljeg tipa starih 0–1 dan umreženo je UV zračenjem (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizirano na ledu u 1 mL pufera RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharoze, 1 mM DTT, 1× inhibitori proteaza Complete bez EDTA, 1 mM PMSF) uz dodatak 300 U RNAseOUT te stavljeno na led na 30 min. Homogenat je soniciran na ledu pri 80% snage, pet puta u intervalima od 20 s s pauzom od 60 s između njih, s pomoću ultrazvučnog procesora Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) i centrifugiran (16.000 × g tijekom 5 min pri 4°C). Topljivi ekstrakt prethodno je pročišćen s 20 μl kuglica Protein-G dynabeads tijekom 20 min pri 4°C. Nakon izdvajanja uzoraka za imunoblot i kvantifikaciju ulazne RNA (1%), HP1 je imunoprecipitiran protutijelom anti-HP1 9A9 iz 450 μl prethodno pročišćenog ekstrakta inkubacijom tijekom 4 h s 50 μl kuglica Protein-G dynabeads. Imunoprecipitati su isprani 4 puta puferom RCB. Radi eluiranja imunoprecipitiranih RNA, istaložene kuglice kuhane su u 100 μL vode UltraPure DEPC-treated Water tijekom 5 min. Supernatantu prikupljenom za pripremu RNA dodano je 900 μL reagensa Qiazol Reagent. Pročišćena RNA upotrijebljena je kao predložak za sintezu cDNA uz oligo dT, nasumične heksamere i reverznu transkriptazu SuperScript III prema protokolu proizvođača.
(Cassale et al. 2019)

Ultrazvučna liza za test imunoprecipitacije kromatina

Imunoprecipitacija kromatina provedena je prema metodi koju je opisao Menet, uz manje izmjene. Približno 20 mg jajnika ženki divljeg tipa starih od 0 do 1 dana homogenizirano je u 1 mL pufera NEB (10 mM HEPES-Na pri pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pri pH 8, 0,5 mM EDTA-Na pri pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidina, 0,15 mM spermina, 1× inhibitora proteaza Complete bez EDTA) homogenizatorom / uronjivim dispergatorom tijekom 1 min (pri 3000 rpm). Homogenat je prenesen u prethodno ohlađeni stakleni homogenizator Dounce te je izvedeno 15 punih poteza klipom s uskim zazorom. Slobodne jezgre zatim su centrifugirane pri 6000xg tijekom 10 min pri 4°C. Talozi koji su sadržavali jezgre resuspendirani su u 1 mL pufera NEB i centrifugirani pri 20.000 × g tijekom 20 min na gradijentu saharoze (0,65 mL 1,6 M saharoze u puferu NEB, 0,35 mL 0,8 M saharoze u puferu NEB). Talog je resuspendiran u 1 mL pufera NEB uz dodatak formaldehida do konačne koncentracije od 1%. Jezgre su umrežavane tijekom 10 min na sobnoj temperaturi, a reakcija je zaustavljena dodavanjem 1/10 volumena 1,375 M glicina. Jezgre su prikupljene centrifugiranjem pri 6000 × g tijekom 5 min. Jezgre su dvaput isprane u 1 mL pufera NEB i resuspendirane u 1 mL pufera za lizu (15 mM HEPES-Na pri pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pri pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% natrijeva deoksikolata, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkozina i 1× inhibitora proteaza Complete bez EDTA). Jezgre su sonicirane ultrazvučnim procesorom Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) šest puta po 20 s uz uključen ultrazvuk i 1 min na ledu. Sonicirane jezgre centrifugirane su pri 13.000 × g tijekom 4 min pri 4°C. Većina soniciranog kromatina bila je duljine od 500 do 1000 parova baza (bp). Za svaku imunoprecipitaciju inkubirano je 15 μg kromatina u prisutnosti 10 μg monoklonskog protutijela HP1 9A9 (3 h pri 4°C na rotirajućem kotaču). Zatim je dodano 50 μl kuglica dynabeads protein G i inkubacija je nastavljena preko noći pri 4°C. Supernatanti su odbačeni, a uzorci su dvaput isprani u puferu za lizu (svako ispiranje 15 min pri 4 °C) i dvaput u puferu TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pri pH 8). Kromatin je eluiran s kuglica u dva koraka; najprije u 100 μl pufera za eluiranje 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pri pH 8) pri 65°C tijekom 15 min, nakon čega su uslijedili centrifugiranje i prikupljanje supernatanta. Materijal s kuglica ponovno je ekstrahiran u 100 μl TE + 0,67% SDS. Objedinjeni eluat (200 μl) inkubiran je preko noći pri 65°C radi razgradnje poprečnih veza te obrađen s 50 μg/ml RNaseA tijekom 15 min pri 65°C i s 500 μg/ml proteinaze K tijekom 3 h pri 65°C. Uzorci su ekstrahirani fenolom i kloroformom te precipitirani etanolom. DNA je resuspendirana u 25 μl vode. Kako bi se maksimalno iskoristile mogućnosti molekularnih analiza imunoprecipitirane DNA, geni kandidati umnoženi su u parovima optimiziranim protokolom duplex-PCR uz upotrebu dvaju različitih skupova početnica sa sličnim temperaturama taljenja u jednoj reakciji.
(Casale et al. 2019)
 

Ultrazvučni uređaji visokih performansi za razaranje stanica u biološkim uzorcima

Hielscher Ultrasonics vaš je partner s dugogodišnjim iskustvom u području ultrazvučnih uređaja visokih performansi za razaranje stanica, lizu, ekstrakciju proteina, fragmentaciju DNA, RNA i kromatina te druge korake predanalitičke pripreme uzoraka. Uz sveobuhvatnu ponudu laboratorijskih ultrazvučnih homogenizatora i jedinica za pripremu uzoraka, Hielscher ima idealan ultrazvučni uređaj za vašu biološku primjenu i zahtjeve.
Klasični ultrazvučni uređaj sa sondom i mikrovrhom, poput uređaja UP200St (200W; pogledajte sliku lijevo), ili jedna od ultrazvučnih jedinica za pripremu uzoraka VialTweeter ili UP200ST_TD_CupHorn s držačem VialHolder popularni su modeli u istraživačkim i analitičkim laboratorijima. Klasična ultrazvučna sonda idealna je kada je potrebno lizirati, ekstrahirati ili fragmentirati manji broj uzoraka. Jedinice za pripremu uzoraka VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn omogućuju istodobnu sonikaciju do 10 odnosno 5 bočica.
Ako je potrebno obraditi velik broj uzoraka (npr. pločice s 96 jažica, mikrotitarske pločice itd.), uređaj UIP400MTP idealan je sustav za sonikaciju. UIP400MTP funkcionira poput većeg uređaja tipa cuphorn koji je napunjen vodom i ima dovoljno prostora za smještaj pločica s mikrojažicama. Pogonjen snažnim ultrazvučnim procesorom od 400 vata, UIP400MTP omogućuje vrlo ujednačenu i intenzivnu sonikaciju pločica s više jažica radi razaranja stanica, lize uzoraka, solubilizacije taloga, ekstrakcije proteina ili smicanja DNA.

Precizno upravljanje putem pametnog softvera

Sva rješenja za sonikaciju tvrtke Hielscher snage od 200 vata naviše opremljena su digitalnim zaslonom u boji osjetljivim na dodir i inteligentnim softverom. Zahvaljujući pametnom bilježenju podataka, svi parametri ultrazvučnog procesa automatski se spremaju kao CSV datoteka na ugrađenu SD karticu čim se ultrazvučni uređaj pokrene. Time se znatno olakšavaju istraživanje i bilježenje podataka. Nakon pokusa sonikacije ili pripreme uzoraka možete jednostavno pregledati parametre sonikacije svakog postupka i usporediti ih.
Putem intuitivnog izbornika brojni se parametri mogu unaprijed postaviti prije sonikacije: primjerice, za kontrolu temperature u uzorku i sprječavanje njegove toplinske razgradnje može se postaviti gornja granica temperature uzorka. Priključivi temperaturni senzor, koji se isporučuje s ultrazvučnom jedinicom, ultrazvučnom procesoru daje povratne informacije o stvarnoj temperaturi sonikacije. Kada se dosegne gornja temperaturna granica, ultrazvučni uređaj privremeno zaustavlja rad dok se ne dosegne donja granica zadanog ∆T, a zatim automatski ponovno započinje sonikaciju.
Ako je potrebna sonikacija s određenim unosom energije, možete unaprijed postaviti konačnu ultrazvučnu energiju postupka sonikacije. Naravno, ultrazvučno pulsiranje i ciklički način rada također se mogu pojedinačno postaviti.
Kako biste ponovno upotrijebili svoje najuspješnije parametre sonikacije, različite načine sonikacije (npr. vrijeme sonikacije, intenzitet, ciklički način rada itd.) možete spremiti kao unaprijed postavljene načine rada, tako da ih možete lako i brzo ponovno pokrenuti.
Za još praktičniji rad svim se digitalnim ultrazvučnim jedinicama može daljinski upravljati putem bilo kojeg uobičajenog preglednika (npr. InternetExplorer, Safari, Chrome itd.). LAN veza jednostavno se uspostavlja priključivanjem i ne zahtijeva instalaciju dodatnog softvera.
Mi u tvrtki Hielscher znamo da uspješna sonikacija bioloških uzoraka zahtijeva preciznost i ponovljivost. Stoga smo svoje ultrazvučne uređaje osmislili kao pametne uređaje sa svim značajkama koje omogućuju učinkovitu, pouzdanu, ponovljivu i praktičnu pripremu uzoraka.

Tablica u nastavku daje pregled približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih sustava, od ultrazvučnih mikrovrhova i klasičnih ultrazvučnih homogenizatora do ultrazvučnih uređaja MultiSample za praktičnu i pouzdanu pripremu velikog broja uzoraka: