Ultrazvučna lysis drosophila melanogaster uzoraka

Drosophila melanogaster je naširoko koristi u laboratorijima kao model organizma. Stoga se često moraju provoditi koraci predanalitikalnog pripravka kao što su liza, poremećaj stanica, ekstrakcija proteina i smicanje DNK uzoraka drosofila melanogastera. Ultrazvučni dismembratori su pouzdani i učinkoviti i mogu se koristiti za obavljanje različitih zadataka kao što su liza, ekstrakcija proteina ili fragmentacija DNK samo podešavanjem ultrazvučnih parametara procesa. Ultrazvučni homogenizatori su time fleksibilni alati sa širokim rasponom primjena.

Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina

Liza, solubilizacija stanica, homogenizacija tkiva i ekstrakcija proteina tipični su zadaci za ultrazvučne dismembratore u biološkim laboratorijima. Ultrazvučni dismembratori i stanični disruptori pogodni su za homogenizaciju životinjskih tkiva, insekata (npr. drosophila melanogaster, C. elegans) ili biljnih primjeraka. Naknadne primjene ultrazvuka su liza staničnih suspenzija i peleta, kao i ekstrakcija unutarstaničnih proteina.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina vrlo su pouzdani i ponovljivi procesi, koji se mogu izvoditi na temelju uspostavljenih protokola. Budući da se ultrazvučni intenzitet procesa može točno podesiti putem sonikacijskih parametara kao što su amplitude, ciklus / pulsni način rada, temperatura i volumen uzorka, nakon što se dokazani protokoli mogu ponavljati s istim ishodom iznova i iznova.

Ultrazvučna DNK i fragmentacija RNK

Nakon stanične lize i ekstrakcije proteina, uobičajeni potreban korak u pripremi uzorka je smiranje i fragmentacija DNK, RNK i kromatina, npr. Fragmentacija DNK i RNK može se pouzdano postići razbijanjem vanatorskih veza koje drže DNK na okupu fizičkim silama. Koristeći fizičko smicanje kao što je sonikacija, isprva su DNA niti slomljene, a zatim se DNK fragmentira na manje dijelove.
Ultrazvučna fragmentacija DNK pouzdana je i učinkovita u smicanju DNK na ciljanu duljinu, npr. Glavne prednosti ultrazvučne fragmentacije DNK uključuju preciznu kontrolu ultrazvučnih procesa i intenziteta. Parametri ultrazvučnog procesa mogu se podesiti preciznim podešavanjem intenziteta sonikacije, ciklusa i vremena. To omogućuje stvaranje željenih veličina DNK, a ciljana duljina DNK može se pouzdano proizvesti i reproducirati. Ultrazvučna DNK shearing je također idealan za stvaranje visoke molekularne težine DNA fragmenata.

Protokoli za ultrazvučnu lizu Drosophila melanogastera

U nastavku možete pronaći različite protokole za ultrazvuku potpomognutu lizu, ekstrakciju proteina i fragmentaciju DNK ili kromatina uzoraka Drosophile.

Ultrazvučna liza za unakrsno povezivanje imunoprecipitacije (CLIP)

CLIP assay je izveden kao što je prethodno prijavljeno s nekim izmjenama. Otprilike 20 mg jajnika od 0- do 1 dana stare ženke divljeg tipa bile su UV križaljke (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizirane na ledu u 1 20 mL RCB pufera (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharoze, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) dopunjen s 300 U RNAseOUT i stavljen na led za 30 min. Homogenat je sonicated na ledu, na 80% snage, pet puta u 20 s rafala s 60 s odmor između korištenja Hielscher Ultrasonic procesor UP100H (100 W, 30 kHz) i centrifugirano (16000 × g 5 min na 4°C). Topljivi ekstrakt je unaprijed s 20 μl proteina-G disaneads za 20 min na 4 °C. Nakon uklanjanja uzoraka za imunoblotting i količinu unosa RNK (1%), HP1 je imunoprecipitated s anti-HP1 9A9 antitijela iz 450 μl prekleared ekstrakt inkubacijom za 4 h s 50 μl Protein-G disanogeads. Imunoprecipitates su oprani 4 puta s RCB. Kako bi se razjasnile imunoprecipirane RNA-e, 100 μL ultrapure DEPC-tretirane vode tijekom 5 min. 900 μL Qiazol Reagent dodan je supernatantu oporavljenom za pripremu RNK. Pročišćena RNK korištena je kao predložak za sintezu cDNA pomoću oligo dT, slučajnih heksamera i SuperScript obrnutog transkriptaza III prema protokolu proizvođača.
(Cassale i sur. 2019.)

Ultrazvučna liza za kromatin imunoprecipitacija Assay

Imunoprecipitacija kromatina izvedena je prema metodi koju je Menet opisao manjim modifikacijama. Otprilike 20 mg jajnika od 0- do 1 dana starih ženki divljeg tipa homogenizirano je u 1 20 mL NEB pufera (10 mM HEPES-Na na pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na na pH 8, 0,5 mM EDTA-Na na pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermine, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) s homogenizatorom / raspršivačem uranjanja 1 min (pri 3000 okraj). Homogenat je prebačen u prethodno ohlađenu staklenu dounce i 15 punih udaraca primijenjeno je uskim tučkom. Besplatne jezgre zatim su centrifugirani na 6000xg za 10 min na 4 ° C. Peleti koji sadrže jezgre reanimirani su u 1 2 mL NEB-a i centrifugirani na 20000 × g 20 min na saharose gradijentu (0,65 mL od 1,6 M saharoza u NEB-u, 0,35 mL saharoza od 0,8 M u NEB-u). Peleta je resuspended u 1 mL NEB i formaldehid na konačnu koncentraciju od 1%. Jezgre su bile unakrsno povezane 10 min na sobnoj temperaturi i utažene dodavanjem 1/10 vola od 1.375 M glicina. Jezgre su prikupljene centrifugacijom na 6000 × g 5 min. Jezgre su oprane dva puta u 1 mL NEB i resuspended u 1 mL Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na na pH 7.6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA na pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine i 1× EDTA-free Complete Protease inhibitori). Jezgre su sonicated pomoću Hielscher Ultrasonic procesor UP100H (100 W, 30 kHz) šest puta za 20 s na i 1 min na ledu. Sonicated jezgre su centrifugirani na 13000 × g za 4 min na 4 °C. Većina sonicated kromatina bila je duljine od 500 do 1000 baznih parova (bp). Za svaki imunoprecipitacijski zglob inkubirao se 15 μg kromatina u prisutnosti 10 μg jednoklonskog protutijela HP1 9A9 (3 sata na 4°C u rotirajućem kotaču). Zatim je dodano 50 μl dynabeads proteina G i inkubacija je nastavljena preko noći na 4 °C. Supernatanti su odbačeni, a uzorci su dva puta oprani u Lysis Bufferu (svaki se pere 15 min na 4 °C) i dva puta u TE Bufferu (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl na pH 8). Kromatin je izdusen iz beadsa u dva koraka; prvi u 100 μl eluition buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl na pH 8) na 65 ° C za 15 min, nakon čega slijedi centrifugacija i oporavak supernatanta. Materijal od beadsa ponovno je izvađen u 100 μl TE + 0,67% SDS-a. Kombinirani eluat (200 μl) inkubiran je preko noći na 65 °C kako bi se preokrenule križne veze i liječio 50 μg/ml RNaseA 15 minuta pri 65 °C i 500 μg/ml Proteinaze K za 3 h pri 65 °C. Uzorci su izvađeni fenol–kloroform i etanol je taložio. DNK je reaniman u 25 μl vode. Za maksimiziranje molekularnih analiza s imunoprecipitiranim DNK, geni kandidata pojačani su u parovima kroz optimizirani duplex-PCR protokol koristeći dva različita skupa primera koji imaju slične temperature taljenja u jednoj reakciji.
(Casale i sur. 2019.)

Ultrazvučni disruptori stanica visokih performansi za biološke uzorke

Hielscher Ultrasonics je vaš dugogodišnji partner kada je riječ o ultraosjećačima visokih performansi za poremećaj stanica, lizu, ekstrakciju proteina, DNK, RNK i fragmentaciju kromatina, kao i druge korake pripreme uzorka prije analize. Nudeći sveobuhvatan portfelj ultrazvučnih laboratorijskih homogenizatora i jedinica za pripremu uzoraka, Hielscher ima idealan ultrazvučni uređaj za vašu biološku primjenu i zahtjeve.
Klasični ultrazvuk sonde s mikro-vrhom kao što je UP200St (200W; vidi sliku lijevo) ili jednu od ultrazvučnih jedinica za pripremu uzoraka VialTweeter ili UP200St_TD_CupHorn s VialHolderom omiljeni su modeli u istraživačkim i analitičkim laboratorijima. Klasična ultrazvučna sonda je idealna, kada se pripremi manje uzoraka mora biti lisirano, izvađeno ili fragmentirano. Jedinice za pripremu uzoraka VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn omogućuju istovremenu sonikaciju do 10 ili 5 bočica.
Ako se moraju obraditi visoki brojevi uzoraka (npr. ploče od 96 bunara, mikrotiterske ploče itd.), UIP400MTP je idealna postava sonikacije. UIP400MTP funkcionira poput većeg cuphorna, koji je napunjen vodom i ima dovoljno prostora za držanje mikro-bunarskih ploča. Pogonjen 400 W snažnim ultrazvučnim procesorom, UIP400MTP isporučuje vrlo ujednačenu i intenzivnu sonikaciju višeslojnih ploča kako bi poremetio stanice, uzorke liza, pelete od solubilize, ekstrakt proteina ili smicanje DNK.

Precizna kontrola putem pametnog softvera

Sva Hielscher rješenja za sonikaciju od 200 W naviše opremljena su digitalnim zaslonom osjetljivim na dodir u boji i inteligentnim softverom. Putem pametnih podataka koji protokolaju sve ultrazvučne parametre procesa automatski se spremaju kao CSV datoteka na ugrađenoj SD-kartici čim se započne ultrasonikator. To čini istraživanje i protokoliranje mnogo praktičnijim. Nakon ispitivanja sonikacije ili pripreme uzorka, možete jednostavno pregledati parametre sonikacije svakog sonikacije i usporediti ih.
Putem intuitivnog izbornika može se postaviti brojni parametri prije sonikacije: Na primjer, za kontrolu temperature u uzorku i sprečavanje njegove toplinske degradacije može se postaviti gornja granica temperature uzorka. Utični senzor temperature, koji dolazi s ultrazvučnom jedinicom, daje ultrazvučnom procesoru povratne informacije o stvarnoj temperaturi sonikacije. Kada se dosegne gornja granica temperature, ultrazvučni uređaj pauzira dok se ne dosegne donja granica ∆T i počne automatski ponovno sonicirati.
Ako je potrebna sonikacija s određenim unosom energije, možete unaprijed ugraditi konačnu ultrazvučnu energiju sonikacije. Naravno, ultrazvučna pulsacija i način ciklusa također se mogu pojedinačno postaviti.
Da biste ponovno koristili svoje najuspješnije parametre sonikacije, možete spremiti različite načine sonikacije (npr. vrijeme sonikacije, intenzitet, način ciklusa itd.) kao unaprijed postavljene načine rada, tako da se mogu lako i brzo ponovno pokrenuti.
Radi operativnije praktičnosti, svim digitalnim ultrazvučnim jedinicama može se upravljati putem daljinskog upravljača preglednika u bilo kojem uobičajenom pregledniku (npr. internetexplorer, Safari, Chrome itd.). LAN veza je jednostavna postavka plug-n-playa i ne zahtijeva dodatnu instalaciju softvera.
Mi u Hielscheru znamo da uspješna sonikacija bioloških uzoraka zahtijeva preciznost i ponovljivost. Stoga smo naše ultrazvučne uređaje dizajnirali kao pametne uređaje sa svim značajkama koje omogućuju učinkovitu, pouzdanu, ponovljivu i praktičnu pripremu uzoraka.

Tablica u nastavku daje vam naznaku približne procesorske sposobnosti naših ultrazvučnih sustava od ultrazvučnih mikro-vrhova i klasičnih ultrazvučnih homogenizatora do MultiSample ultrasonikatora za praktičnu, pouzdanu pripremu brojnih uzoraka: