Ultrazvučna liza uzoraka Drosophile Melanogaster

Drosophila melanogaster naširoko se koristi u laboratorijima kao modelni organizam. Stoga se predanalitičke pripreme kao što su liza, razbijanje stanica, ekstrakcija proteina i cijepanje DNA uzoraka Drosophile melanogaster moraju često provoditi. Ultrazvučni dismembratori su pouzdani i učinkoviti i mogu se koristiti za obavljanje raznih zadataka kao što su liza, ekstrakcija proteina ili fragmentacija DNK na jednostavan način samo podešavanjem parametara ultrazvučnog procesa. Ultrazvučni homogenizatori su stoga fleksibilni alati sa širokim rasponom primjena.

Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina

Liza, solubilizacija stanica, homogenizacija tkiva i ekstrakcija proteina tipični su zadaci za ultrazvučne dismembatore u biološkim laboratorijima. Ultrazvučni dismembratori i stanični disruptori prikladni su za homogeniziranje životinjskih tkiva, insekata (npr. Drosophila melanogaster, C. elegans) ili biljnih uzoraka. Naknadne primjene ultrazvuka su liza staničnih suspenzija i peleta, kao i ekstrakcija unutarstaničnih proteina.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina vrlo su pouzdani i ponovljivi procesi koji se mogu izvesti na temelju utvrđenih protokola. Budući da se intenzitet ultrazvučnog procesa može točno podesiti pomoću parametara ultrazvuka kao što su amplituda, način ciklusa/pulsa, temperatura i volumen uzorka, jednom dokazani protokoli mogu se ponavljati s istim ishodom uvijek iznova.

Ultrazvučna fragmentacija DNA i RNA

Nakon stanične lize i ekstrakcije proteina, uobičajeni korak u pripremi uzorka je šišanje i fragmentacija DNA, RNA i kromatina, npr. prije imunoprecipitacije kromatina (ChIP). Fragmentacija DNA i RNA može se pouzdano postići kidanjem kovalentnih veza koje drže DNA zajedno pomoću fizičkih sila. Upotrebom fizičkog rezanja, kao što je sonikacija, najprije se DNK lanci lome, a zatim se DNK fragmentira u manje dijelove.
Ultrazvučna fragmentacija DNK pouzdana je i učinkovita u rezanju DNK na ciljanu duljinu, npr. 500 bp (parova baza). Glavne prednosti ultrazvučne fragmentacije DNA uključuju preciznu kontrolu parametara i intenziteta ultrazvučnog procesa. Parametri ultrazvučnog procesa mogu se podesiti preciznim podešavanjem intenziteta sonikacije, ciklusa i vremena. To omogućuje stvaranje željenih veličina DNK, a ciljana duljina DNK može se pouzdano proizvesti kao i reproducirati. Ultrazvučno rezanje DNK također je idealno za stvaranje fragmenata DNK visoke molekularne težine.

Protokoli za ultrazvučnu lizu Drosophile melanogaster

U nastavku možete pronaći različite protokole za ultrazvučno potpomognutu lizu, ekstrakciju proteina i fragmentaciju DNK ili kromatina uzoraka Drosophile.

Analiza ultrazvučne lize za unakrsno povezivanje imunoprecipitacije (CLIP).

CLIP test je izveden kao što je prethodno objavljeno uz neke izmjene. Približno 20 mg jajnika od ženki divljeg tipa starih 0 do 1 dan umreženo je UV (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizirano na ledu u 1 mL RCB pufera (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharoze, 1 mM DTT, 1x kompletni inhibitori proteaze bez EDTA, 1 mM PMSF) dopunjeno s 300 U RNAseOUT i stavljeno na led 30 minuta. Homogenat je sonikiran na ledu, pri 80% snage, pet puta u nizovima od 20 s s pauzom od 60 s između pomoću Hielscher ultrazvučnog procesora UP100H (100 W, 30 kHz) i centrifugirana (16000 x g tijekom 5 minuta na 4°C). Topivi ekstrakt prethodno je pročišćen s 20 μl Protein-G dynabeads 20 minuta na 4°C. Nakon uklanjanja uzoraka za imunobloting i kvantitativnog unosa RNA (1%), HP1 je imunoprecipitiran s anti-HP1 9A9 protutijelom iz 450 μl prethodno očišćenog ekstrakta inkubacijom 4 sata s 50 μl Protein-G dynabeads. Imunoprecipitati su isprani 4 puta s RCB. Da bi se eluirale imunoprecipitirane RNA, peletirane kuglice su kuhane u 100 µL vode tretirane UltraPure DEPC-om 5 minuta. 900 μL reagensa Qiazol dodano je supernatantu prikupljenom za pripremu RNA. Pročišćena RNA korištena je kao predložak za sintezu cDNA korištenjem oligo dT, nasumičnih heksamera i SuperScript reverzne transkriptaze III prema protokolu proizvođača.
(Cassale i dr. 2019.)

Ultrazvučna liza za imunoprecipitacijski test kromatina

Imunoprecipitacija kromatina provedena je prema metodi koju je opisao Menet uz manje modifikacije. Otprilike 20 mg jajnika divljih ženki starih 0 do 1 dan homogenizirano je u 1 mL NEB pufera (10 mM HEPES-Na na pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na na pH 8, 0,5 mM EDTA-Na na pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× kompletni inhibitori proteaze bez EDTA) s homogenizatorom/imerzijskim disperzerom 1 min (pri 3000 okretaja u minuti). Homogenat je prebačen u prethodno ohlađenu staklenu posudu i naneseno je 15 punih poteza čvrstim tučkom. Slobodne jezgre su zatim centrifugirane na 6000xg 10 minuta na 4°C. Pelete koje sadrže jezgre resuspendirane su u 1 mL NEB-a i centrifugirane na 20000 x g tijekom 20 minuta na gradijentu saharoze (0,65 mL 1,6 M saharoze u NEB, 0,35 mL 0,8 M saharoze u NEB). Talog je resuspendiran u 1 mL NEB-a i formaldehida do konačne koncentracije od 1%. Jezgre su umrežene 10 minuta na sobnoj temperaturi i ugašene dodavanjem 1/10 vol 1,375 M glicina. Jezgre su sakupljene centrifugiranjem na 6000 x g tijekom 5 minuta. Jezgre su dvaput isprane u 1 mL NEB-a i resuspendirane u 1 mL pufera za lizu (15 mM HEPES-Na na pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA na pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na deoksiholata, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkozina i 1× kompletni inhibitori proteaze bez EDTA). Jezgre su sonicirane korištenjem Hielscher ultrazvučnog procesora UP100H (100 W, 30 kHz) šest puta po 20 s i 1 min na ledu. Sonicirane jezgre su centrifugirane na 13000 × g 4 minute na 4 °C. Većina ultrazvučno obrađenog kromatina bila je duljine 500 do 1000 parova baza (bp). Za svaku imunoprecipitaciju, 15 μg kromatina je inkubirano u prisutnosti 10 μg monoklonskog antitijela HP1 9A9 (3 h na 4°C u rotirajućem kotaču). Zatim je dodano 50 μl dynabeads proteina G i inkubacija je nastavljena preko noći na 4°C. Supernatanti su odbačeni i uzorci su isprani dva puta u puferu za lizu (svako ispiranje 15 minuta na 4 °C) i dva puta u TE puferu (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl na pH 8). Kromatin je eluiran iz kuglica u dva koraka; prvo u 100 μl pufera za ispiranje 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl na pH 8) na 65°C tijekom 15 minuta, nakon čega slijedi centrifugiranje i obnavljanje supernatanta. Materijal kuglica je ponovno ekstrahiran u 100 μl TE + 0,67% SDS. Kombinirani eluat (200 µl) je inkubiran preko noći na 65°C kako bi se preokrenule poprečne veze i tretiran s 50 µg/ml RNazeA tijekom 15 minuta na 65°C i s 500 µg/ml Proteinaze K tijekom 3 sata na 65°C. Uzorci su ekstrahirani fenol-kloroformom i istaloženi etanolom. DNA je resuspendirana u 25 μl vode. Za maksimiziranje molekularnih analiza s imunoprecipitiranom DNA, geni kandidati umnoženi su u parovima putem optimiziranog duplex-PCR protokola upotrebom dva različita skupa početnica sa sličnim temperaturama taljenja u jednoj reakciji.
(Casale i dr. 2019.)
 

Visokoučinkoviti ultrazvučni disruptori stanica za biološke uzorke

Hielscher Ultrasonics vaš je partner s dugogodišnjim iskustvom kada su u pitanju visokoučinkoviti ultrazvučni uređaji za razbijanje stanica, lizu, ekstrakciju proteina, fragmentaciju DNK, RNK i kromatina, kao i druge predanalitičke korake pripreme uzoraka. Nudeći opsežan portfelj ultrazvučnih laboratorijskih homogenizatora i jedinica za pripremu uzoraka, Hielscher ima idealan ultrazvučni uređaj za vašu biološku primjenu i zahtjeve.
Klasični ultrazvučni uređaj tipa sonde s mikro vrhom kao što je UP200St (200 W; vidi sliku lijevo) ili jednu od ultrazvučnih jedinica za pripremu uzoraka VialTweeter ili UP200St_TD_CupHorn s VialHolderom omiljeni su modeli u istraživačkim i analitičkim laboratorijima. Klasična ultrazvučna sonda je idealna, kada se priprema manje uzoraka mora se lizirati, ekstrahirati ili fragmentirati. Jedinice za pripremu uzoraka VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn omogućuju istovremenu sonikaciju do 10 odnosno 5 bočica.
Ako se moraju obraditi veliki brojevi uzoraka (npr. ploče s 96 jažica, mikrotitarske ploče itd.), UIP400MTP je idealna postavka sonikacije. UIP400MTP funkcionira kao veći kupor, koji je napunjen vodom i ima dovoljno prostora za držanje mikropločica. Pokretan ultrazvučnim procesorom snage 400 watta, UIP400MTP pruža vrlo ujednačenu i intenzivnu sonikaciju ploča s više jažica kako bi se poremetile stanice, lizirali uzorci, otapali peleti, ekstrahirali proteini ili posmicala DNA.

Precizna kontrola putem pametnog softvera

Sva Hielscher rješenja za sonikaciju od 200 vata naviše opremljena su digitalnim zaslonom u boji osjetljivim na dodir i inteligentnim softverom. Preko pametnog protokola podataka svi parametri ultrazvučnog procesa automatski se spremaju kao CSV datoteka na ugrađenu SD-karticu čim se ultrazvučni uređaj pokrene. To čini istraživanje i protokoliranje mnogo praktičnijim. Nakon ispitivanja ultrazvukom ili pripreme uzorka, možete jednostavno pregledati parametre ultrazvuka svakog ciklusa sonikacije i usporediti ih.
Preko intuitivnog izbornika brojni parametri mogu se unaprijed postaviti prije sonikacije: Na primjer, za kontrolu temperature u uzorku i sprječavanje njegove toplinske degradacije, može se postaviti gornja granica temperature uzorka. Priključni senzor temperature, koji dolazi s ultrazvučnom jedinicom, daje ultrazvučnom procesoru povratnu informaciju o stvarnoj temperaturi sonikacije. Kada se dosegne gornja granica temperature, ultrazvučni uređaj pauzira dok se ne postigne donja granica postavljenog ∆T i zatim automatski ponovno počinje sonikirati.
Ako je potrebna sonikacija s određenim unosom energije, možete unaprijed postaviti konačnu ultrazvučnu energiju ciklusa sonikacije. Naravno, ultrazvučno pulsiranje i način ciklusa također se mogu individualno postaviti.
Za ponovnu upotrebu najuspješnijih parametara sonikacije, možete spremiti različite načine sonikacije (npr. vrijeme sonikacije, intenzitet, način ciklusa itd.) kao unaprijed postavljene načine, tako da se mogu lako i brzo ponovo pokrenuti.
Za veću praktičnost rada, svim digitalnim ultrazvučnim jedinicama može se upravljati putem daljinskog upravljača preglednika u bilo kojem uobičajenom pregledniku (npr. InternetExplorer, Safari, Chrome itd.). LAN veza je jednostavna plug-n-play instalacija i ne zahtijeva dodatnu instalaciju softvera.
Mi u Hielscheru znamo da uspješna sonikacija bioloških uzoraka zahtijeva preciznost i ponovljivost. Stoga smo dizajnirali naše ultrazvučne uređaje kao pametne uređaje sa svim značajkama koje omogućuju učinkovitu, pouzdanu, ponovljivu i praktičnu pripremu uzorka.

Tablica u nastavku daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih sustava od ultrazvučnih mikro-vrhova i klasičnih ultrazvučnih homogenizatora do MultiSample ultrasonicators za praktičnu, pouzdanu pripremu brojnih uzoraka: