Ultrazvučna lysis drosophila melanogaster uzoraka

Drosophila melanogaster is widely used in laboratories as model organism. Therefore, pre-analytical preparation steps such as lysis, cell disruption, protein extraction and DNA shearing of Drosophila melanogaster samples must be frequently carried out. Ultrasonic dismembrators are reliable and efficient and can used to perform various tasks such as lysis, protein extraction or DNA fragmentation at ease by only adjusting ultrasonic process parameters. Ultrasonic homogenizers are thereby flexible tools with a broad range of applications.

Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina

Liza, solubilizacija stanica, homogenizacija tkiva i ekstrakcija proteina tipični su zadaci za ultrazvučne dismembratore u biološkim laboratorijima. Ultrazvučni dismembratori i stanični disruptori pogodni su za homogenizaciju životinjskih tkiva, insekata (npr. drosophila melanogaster, C. elegans) ili biljnih primjeraka. Naknadne primjene ultrazvuka su liza staničnih suspenzija i peleta, kao i ekstrakcija unutarstaničnih proteina.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina vrlo su pouzdani i ponovljivi procesi, koji se mogu izvoditi na temelju uspostavljenih protokola. Budući da se ultrazvučni intenzitet procesa može točno podesiti putem sonikacijskih parametara kao što su amplitude, ciklus / pulsni način rada, temperatura i volumen uzorka, nakon što se dokazani protokoli mogu ponavljati s istim ishodom iznova i iznova.

Ultrazvučna DNK i fragmentacija RNK

After cell lysis and protein extraction, a common required step in sample preparation is the shearing and fragmentation of DNA, RNA, and chromatin, e.g. before chromatin immunoprecipitation (ChIP). DNA and RNA fragmentation can be reliably achieved by breaking the covalent bonds that hold the DNA together by physical forces. Using physical shearing such as sonication, at first the DNA strands are broken, then the DNA is fragmented into smaller pieces.
Ultrazvučna fragmentacija DNK pouzdana je i učinkovita u smicanju DNK na ciljanu duljinu, npr. Glavne prednosti ultrazvučne fragmentacije DNK uključuju preciznu kontrolu ultrazvučnih procesa i intenziteta. Parametri ultrazvučnog procesa mogu se podesiti preciznim podešavanjem intenziteta sonikacije, ciklusa i vremena. To omogućuje stvaranje željenih veličina DNK, a ciljana duljina DNK može se pouzdano proizvesti i reproducirati. Ultrazvučna DNK shearing je također idealan za stvaranje visoke molekularne težine DNA fragmenata.

Protokoli za ultrazvučnu lizu Drosophila melanogastera

U nastavku možete pronaći različite protokole za ultrazvuku potpomognutu lizu, ekstrakciju proteina i fragmentaciju DNK ili kromatina uzoraka Drosophile.

Ultrazvučna liza za unakrsno povezivanje imunoprecipitacije (CLIP)

CLIP assay was performed as previously reported with some modifications. Approximately 20 mg ovaries from 0- to 1-day-old wild-type females were UV crosslinked (3 × 2000 μJ/cm2), homogenized on ice in 1 mL RCB buffer (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) supplemented with 300 U RNAseOUT and placed on ice for 30 min. The homogenate was sonicated on ice, at 80% power, five times in 20 s bursts with a 60 s rest in between using the Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) i centrifugirano (16000 × g 5 min na 4°C). Topljivi ekstrakt je unaprijed s 20 μl proteina-G disaneads za 20 min na 4 °C. Nakon uklanjanja uzoraka za imunoblotting i količinu unosa RNK (1%), HP1 je imunoprecipitated s anti-HP1 9A9 antitijela iz 450 μl prekleared ekstrakt inkubacijom za 4 h s 50 μl Protein-G disanogeads. Imunoprecipitates su oprani 4 puta s RCB. Kako bi se razjasnile imunoprecipirane RNA-e, 100 μL ultrapure DEPC-tretirane vode tijekom 5 min. 900 μL Qiazol Reagent dodan je supernatantu oporavljenom za pripremu RNK. Pročišćena RNK korištena je kao predložak za sintezu cDNA pomoću oligo dT, slučajnih heksamera i SuperScript obrnutog transkriptaza III prema protokolu proizvođača.
(Cassale i sur. 2019.)

Ultrazvučna liza za kromatin imunoprecipitacija Assay

Chromatin immunoprecipitation was performed according to the method described by Menet with minor modifications. Approximately 20 mg ovaries from 0- to 1-day-old wild-type females were homogenized in 1 mL of NEB buffer (10 mM HEPES-Na at pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na at pH 8, 0.5 mM EDTA-Na at pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM Spermidine, 0.15 mM Spermine, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) with a homogenizer / immersion disperser 1 min (at 3000 rpm). The homogenate was transferred to a pre-chilled glass dounce and 15 full strokes were applied with a tight pestle. Free nuclei were then centrifuged at 6000xg for 10 min at 4°C. The nuclei-containing pellets were resuspended in 1 mL of NEB and centrifuged at 20000 × g for 20 min on sucrose gradient (0.65 mL of 1.6 M sucrose in NEB, 0.35 mL of 0.8 M sucrose in NEB). The pellet was resuspended in 1 mL of NEB and formaldehyde to a final concentration of 1%. Nuclei were cross-linked for 10 min at room temperature and quenched by adding 1/10 vol of 1.375 M glycine. The nuclei were collected by centrifugation at 6000 × g for 5 min. Nuclei were washed twice in 1 mL of NEB and resuspended in 1 mL of Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na at pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA at pH 8, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% Na Deoxycholate, 0.1% SDS, 0.5% N-lauroylsarcosine and 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors). Nuclei were sonicated using a Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) šest puta za 20 s na i 1 min na ledu. Sonicated jezgre su centrifugirani na 13000 × g za 4 min na 4 °C. Većina sonicated kromatina bila je duljine od 500 do 1000 baznih parova (bp). Za svaki imunoprecipitacijski zglob inkubirao se 15 μg kromatina u prisutnosti 10 μg jednoklonskog protutijela HP1 9A9 (3 sata na 4°C u rotirajućem kotaču). Zatim je dodano 50 μl dynabeads proteina G i inkubacija je nastavljena preko noći na 4 °C. Supernatanti su odbačeni, a uzorci su dva puta oprani u Lysis Bufferu (svaki se pere 15 min na 4 °C) i dva puta u TE Bufferu (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl na pH 8). Kromatin je izdusen iz beadsa u dva koraka; prvi u 100 μl eluition buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl na pH 8) na 65 ° C za 15 min, nakon čega slijedi centrifugacija i oporavak supernatanta. Materijal od beadsa ponovno je izvađen u 100 μl TE + 0,67% SDS-a. Kombinirani eluat (200 μl) inkubiran je preko noći na 65 °C kako bi se preokrenule križne veze i liječio 50 μg/ml RNaseA 15 minuta pri 65 °C i 500 μg/ml Proteinaze K za 3 h pri 65 °C. Uzorci su izvađeni fenol–kloroform i etanol je taložio. DNK je reaniman u 25 μl vode. Za maksimiziranje molekularnih analiza s imunoprecipitiranim DNK, geni kandidata pojačani su u parovima kroz optimizirani duplex-PCR protokol koristeći dva različita skupa primera koji imaju slične temperature taljenja u jednoj reakciji.
(Casale i sur. 2019.)

Ultrazvučni disruptori stanica visokih performansi za biološke uzorke

Hielscher Ultrasonics je vaš dugogodišnji partner kada je riječ o ultraosjećačima visokih performansi za poremećaj stanica, lizu, ekstrakciju proteina, DNK, RNK i fragmentaciju kromatina, kao i druge korake pripreme uzorka prije analize. Nudeći sveobuhvatan portfelj ultrazvučnih laboratorijskih homogenizatora i jedinica za pripremu uzoraka, Hielscher ima idealan ultrazvučni uređaj za vašu biološku primjenu i zahtjeve.
Klasični ultrazvuk sonde s mikro-vrhom kao što je UP200St (200W; vidi sliku lijevo) ili jednu od ultrazvučnih jedinica za pripremu uzoraka VialTweeter ili UP200St_TD_CupHorn s VialHolderom omiljeni su modeli u istraživačkim i analitičkim laboratorijima. Klasična ultrazvučna sonda je idealna, kada se pripremi manje uzoraka mora biti lisirano, izvađeno ili fragmentirano. Jedinice za pripremu uzoraka VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn omogućuju istovremenu sonikaciju do 10 ili 5 bočica.
Ako se moraju obraditi visoki brojevi uzoraka (npr. ploče od 96 bunara, mikrotiterske ploče itd.), UIP400MTP je idealna postava sonikacije. UIP400MTP funkcionira poput većeg cuphorna, koji je napunjen vodom i ima dovoljno prostora za držanje mikro-bunarskih ploča. Pogonjen 400 W snažnim ultrazvučnim procesorom, UIP400MTP isporučuje vrlo ujednačenu i intenzivnu sonikaciju višeslojnih ploča kako bi poremetio stanice, uzorke liza, pelete od solubilize, ekstrakt proteina ili smicanje DNK.

Precizna kontrola putem pametnog softvera

Sva Hielscher rješenja za sonikaciju od 200 W naviše opremljena su digitalnim zaslonom osjetljivim na dodir u boji i inteligentnim softverom. Putem pametnih podataka koji protokolaju sve ultrazvučne parametre procesa automatski se spremaju kao CSV datoteka na ugrađenoj SD-kartici čim se započne ultrasonikator. To čini istraživanje i protokoliranje mnogo praktičnijim. Nakon ispitivanja sonikacije ili pripreme uzorka, možete jednostavno pregledati parametre sonikacije svakog sonikacije i usporediti ih.
Via the intuitive menu, numerous parameter can be preset before sonication: For instance, to control the temperature in the sample and to prevent its thermal degradation, an upper limit of sample temperature can be set. A pluggable temperature sensor, which comes with the ultrasonic unit, gives the ultrasonic processor feedback on the actual sonication temperature. When the upper temperature limit is reached, the ultrasonic device pauses until the lower limit of the set ∆T is reached and starts then automatically sonicating again.
Ako je potrebna sonikacija s određenim unosom energije, možete unaprijed ugraditi konačnu ultrazvučnu energiju sonikacije. Naravno, ultrazvučna pulsacija i način ciklusa također se mogu pojedinačno postaviti.
Da biste ponovno koristili svoje najuspješnije parametre sonikacije, možete spremiti različite načine sonikacije (npr. vrijeme sonikacije, intenzitet, način ciklusa itd.) kao unaprijed postavljene načine rada, tako da se mogu lako i brzo ponovno pokrenuti.
Radi operativnije praktičnosti, svim digitalnim ultrazvučnim jedinicama može se upravljati putem daljinskog upravljača preglednika u bilo kojem uobičajenom pregledniku (npr. internetexplorer, Safari, Chrome itd.). LAN veza je jednostavna postavka plug-n-playa i ne zahtijeva dodatnu instalaciju softvera.
Mi u Hielscheru znamo da uspješna sonikacija bioloških uzoraka zahtijeva preciznost i ponovljivost. Stoga smo naše ultrazvučne uređaje dizajnirali kao pametne uređaje sa svim značajkama koje omogućuju učinkovitu, pouzdanu, ponovljivu i praktičnu pripremu uzoraka.

The table below gives you an indication of the approximate processing capacity of our ultrasonic systems from ultrasonic micro-tips and classic ultrasonic homogenizers to MultiSample ultrasonicators for the convenient, reliable preparation of numerous samples: