Ultrazvučna priprema uzoraka C. Elegans

C. elegans, oblić iz skupine nematoda, široko je korišten modelni organizam u biologiji. Priprema uzoraka prije analize zahtijeva lizu, ekstrakciju proteina i lipida te fragmentaciju RNA, što se može pouzdano provesti sonikacijom. Ultrazvučni uređaji za razaranje stanica pouzdani su, sofisticirani uređaji jednostavni za uporabu koji omogućuju brzu pripremu uzoraka C. elegans.

Ultrazvučna priprema uzoraka C. elegans

Caenorhabditis elegans su oblići koji se široko koriste u istraživačkim laboratorijima za proučavanje genomike, razvojne biologije i bolesti. Mnogi geni u genomu C. elegans imaju funkcionalne ekvivalente u ljudi. Stoga je ovaj oblić iznimno koristan model za ljudske bolesti. Druge prednosti koje pridonose širokoj uporabi C. elegans jesu jednostavan i jeftin uzgoj na pločama koje sadržavaju bakterije (npr. E. coli), prozirnost, jednostavno rukovanje te mogućnost zamrzavanja i duljeg čuvanja oblića.
Analiza proteina i lipida uobičajen je postupak u laboratorijima, a ultrazvučna priprema uzoraka etablirana je metoda za lizu nematoda C. elegans u svakom razvojnom stadiju (tj. embriji, ličinke L1–L4, odrasle jedinke). Budući da se C. elegans koristi i kao sustav za ekspresiju proteina radi prekomjerne ekspresije ciljanih proteina, potrebna je pouzdana i ponovljiva metoda lize i ekstrakcije proteina koja daje visoke prinose proteina. Ultrazvučni sustavi za razaranje stanica i ekstrakciju dostupni su kao homogenizatori sa sondom i ultrazvučni uređaji za više uzoraka. Za praktičnu pripremu uzoraka svih veličina i u bilo kojem broju, Hielscher Ultrasonics ima idealan ultrazvučni uređaj za razaranje stanica za vaš laboratorijski postupak.

Ultrazvučni protokoli za razaranje i lizu C. Elegans

Ultrazvučna homogenizacija i liza C. elegans te naknadna ekstrakcija proteina i lipida mogu se provesti različitim postupcima uz uporabu različitih pufera za homogenizaciju i lizu itd. Svim protokolima lize zajedničko je da se uzorci moraju neprekidno držati na ledu kako bi se spriječila razgradnja proteina. U nastavku predstavljamo nekoliko pouzdanih i brzih protokola ultrazvučne lize i ekstrakcije za pripremu visokokvalitetnih uzoraka C. elegans koji sadržavaju proteine ili lipide.

Prednosti ultrazvučne lize C. elegans

• pouzdana
• ponovljiva
• uz preciznu kontrolu temperature
• pouzdana kontrola procesa
• blaga metoda
• jednostavna za primjenu
• sigurna

Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz uzoraka C. elegans

Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina iz oblića C. elegans mogu se provesti različitim protokolima. U nastavku predstavljamo nekoliko pouzdanih i brzih protokola lize za ponovljive rezultate ekstrakcije proteina.

Brza priprema citosolnog ekstrakta iz oblića C. elegans sonikacijom

Sljedećim protokolom možete pripremiti lizate C. elegans za manje od 30 minuta.
Prikupljanje C. elegans
Odaberite željene obliće C. elegans i prenesite ih u epruvetu od 1,5ml koja sadržava fiziološku otopinu puferiranu fosfatom (PBS) ili ih isperite s ploče s 1,5ml PBS-a. Centrifugirajte 1min pri 2000rpm kako biste dobili talog. Uzorke cijelo vrijeme držite na ledu.
Zatim obliće dvaput isperite PBS-om.
Nakon toga obliće dvaput isperite s ddH₂O.
Resuspendirajte obliće u najmanje 500ul pufera za homogenizaciju (HB). Uzorci oblića sada su spremni za ultrazvučnu lizu.
Za višu kvalitetu proteinskog ekstrakta možete smanjiti bakterijsku kontaminaciju ispiranjem oblića po 5min u PBS-u i sterilnoj, ultračistoj vodi (ddH₂O) ili provesti flotaciju u saharozi. Uzorke oblića neprekidno držite na ledu.

Protokol ultrazvučne lize C. elegans

• Pobrinite se da unaprijed pripremite ultrazvučni uređaj kako bi ultrazvučni homogenizator bio spreman za uporabu (sonda montirana, program sonikacije unaprijed postavljen). 

Ako je vaš ultrazvučni uređaj montiran na stalak, postavite ledenu kupelj s epruvetama s uzorcima ispod ultrazvučne sonde i umetnite ultrazvučnu sondu u epruvetu od 1,5ml.

• Za lizu C. elegans uređajem UP200St ili UP200Ht sonikaciju treba provoditi mikrovrhom (npr. sondom S26d2 od 2mm; pogledajte sliku lijevo) pri amplitudi od 40% tijekom 1sec, uz stanke od 30sec između impulsa. Za lizu C. elegans idealno je 5 ciklusa sonikacije u trajanju od po 1 sekunde sa stankama od 30sec. Ako lizu provodite prvi put, nakon svakog impulsa možete mikroskopom provjeriti napredovanje lize u malim alikvotima uzorka.
• Liza je uspješno dovršena kada su crvi razoreni. Prekomjerna sonikacija uzrokuje razaranje jezgara, što postaje vidljivo kada uzorak postane viskozan ili se pjeni. Kako biste spriječili razgradnju uzorka, prema potrebi primijenite više impulsa. Nemojte produljivati trajanje pojedinačnog ciklusa ultrazvučnih impulsa kako biste dobili visokokvalitetne proteinske ekstrakte.
• Izbistrite stanični lizat centrifugiranjem ultrazvučno liziranih crva pri 14.000rpm tijekom 10min na 4ºC.
• Zatim prenesite supernatant u novu epruvetu i pripremite ga za imunoprecipitaciju ili druge analize.

Napomena o puferu za homogenizaciju: pripremite pufer za homogenizaciju za prethodno navedeni protokol ultrazvučne lize na sljedeći način:

Liza C. elegans s velikim kapacitetom obrade u pločicama s 96 jažica pomoću sonikatora za pločice UIP400MTP

Liza C. elegans (odrasle nematode)
UIP400MTP, amplituda 80%, 20 ciklusa (svaki ciklus sonikacije: 30 sec uključeno, 30 sec isključeno)
Pufer za lizu:

• Opcija 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opcija 2) za koimunoprecipitaciju (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (koktel inhibitora proteinaza Complete)

Fragmentacija DNA s velikim kapacitetom obrade
DNA C. elegans (odrasle nematode) 200–300bp: sonikator za pločice UIP400MTP – postavite amplitudu na 80%, 30 impulsa – svaki 30sec uključeno, 30sec isključeno

Sonikator za pločice UIP400MTP za pripremu uzoraka s velikim kapacitetom obrade ravnomjerno sonicira uzorke u pločicama s više jažica, mikrotitarskim pločicama i pločicama s 96 jažica

Ultrazvučna liza C. elegans za kvantitativne analize afinitetnim pročišćavanjem

Svježi embriji C. elegans (∼2 milijuna po ponavljanju) prikupljeni su u tri biološka ponavljanja tretiranjem mladih hermafrodita s jajima otopinom izbjeljivača i sonicirani na ledu (ciklus: 0,5 s, amplituda: 40–45%, 5 impulsa/seriji, 5 serija, razmak između serija: 30 s; ultrazvučnim procesorom UP200S s mikrovrhom S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) u puferu za lizu (ukupni volumen: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerola, smjesa inhibitora proteaza, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Nakon sonikacije dodan je Nonidet P-40 Substitute do koncentracije od 1%, a lizati su inkubirani uz rotaciju s okretanjem preko krajeva na 4°C tijekom 30 min, nakon čega je uslijedilo centrifugiranje pri 20.000 × g tijekom 20 min na 4°C. Izbistreni lizat zatim je aspiriran bez narušavanja gornjeg lipidnog sloja i podijeljen na dvije polovice, od kojih je jedna dodana agaroznim kuglicama anti-GFP, a druga blokiranim kontrolnim kuglicama (40–50 μl). Nakon rotacije s okretanjem preko krajeva na 4°C tijekom 60–90 min, kuglice su jednom isprane puferom za lizu koji je sadržavao 0,1% Nonidet P-40 Substitute, nakon čega su dvaput isprane puferom I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ili puferom II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ili oboma. Za afinitetna izdvajanja GFP:MBK-2 provedena su dva odvojena pokusa uz različite uvjete ispiranja. Proteini su eluirani orbitalnim protresanjem u 50 μl otopine 6 m ureje/2 M tioureje pri sobnoj temperaturi. Za pokuse afinitetnog izdvajanja MBK-1::GFP proteini su dvaput eluirani protresanjem u 50μl otopine 8 m gvanidinijeva klorida na 90°C, nakon čega je uslijedilo taloženje etanolom. Eluirani proteinski uzorci zatim su podvrgnuti digestiji u otopini.
(cf. Chen et al., 2016)

Ultrazvučna homogenizacija i liza oblića

Za postupak lize i ekstrakcije proteina iz C.elegans prikupljeno je 30.000 nematoda odgovarajućeg razvojnog stadija po uzorku, koje su isprane ledeno hladnim medijem S-basal, koncentrirane centrifugiranjem pri 1500 rpm tijekom 2 min., šest puta isprane ledeno hladnim medijem S-basal radi uklanjanja preostalih bakterija, a zatim držane na ledu do uporabe. Za ekstrakciju proteina gravidne odrasle jedinke ostavljene su da nakon posljednjeg ispiranja medijem S-basal formiraju kompaktan talog. Talozi oblića zatim su resuspendirani u 1 ml ledeno hladnog pufera za ekstrakciju [20 mM kalijeva fosfata, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitori proteaza (Sigma P2714)] i odmah obrađeni.
∼30.000 gravidnih odraslih jedinki (što odgovara ∼100 mg mokre mase) sonicirano je na ledu ultrazvučnim uređajem sa sondom (npr. UP50H s mikrovrhom MS2) pri amplitudi od 40% tijekom 10 ciklusa od 3 sec rada i 30 sec stanke, u 1 ml ledeno hladnog pufera za ekstrakciju. (usp. Baskharan et al. 2012)

Ultrazvučna ekstrakcija lipida iz C. elegans

U lipidomici, grani metabolomike, karakterizira se i analizira ukupni lipidni sastav bioloških sustava. C. elegans široko se upotrebljava u lipidomici za istraživanje međudjelovanja metaboličkih lipida i njihovih učinaka na zdravlje i životni vijek.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija upotrebljavaju se za oslobađanje lipida poput sfingolipida iz embrija, ličinki i odraslih jedinki C. elegans. Ultrazvučna obrada upotrebljava se za pripremu homogenata oblića, a zatim za ekstrakciju lipida iz uzorka.
Protokol za ultrazvučnu ekstrakciju lipida iz C. elegans
Odmrznite talog C. elegans na ledu i resuspendirajte ga u 0,5 ml vode ultrawater. Sonicirajte uzorke C. elegans u epruvetama od 1,5mL, neprekidno držeći uzorke na ledu.
Sonikacija se može provesti ultrazvučnim uređajem sa sondom kao što je UP200Ht, uređajem za ultrazvučnu pripremu uzoraka VialTweeter (istodobna sonikacija 10 uzoraka) ili uređajem UIP400MTP (za sonikaciju ploča s više jažica, primjerice ploča s 96 jažica). Za ultrazvučnu lizu uređajem UP200Ht upotrijebite mikrovrh S26d2. Unaprijed postavite način rada ultrazvučnih ciklusa u digitalnom izborniku. Postavite amplitudu na 10% i ciklički način sonikacije na 20 ciklusa s impulsima od 2 sec i stankom od 30 sec. između svakog ultrazvučnog impulsa.
Prenesite supernatante u staklene epruvete s navojnim čepom. Provedite ekstrakciju po Folchu dodavanjem 1 ml vode ultrawater u svaku staklenu epruvetu, a zatim dodavanjem 6 ml smjese kloroforma/metanola (omjer = 2:1) u svaku staklenu epruvetu.
Svaku staklenu epruvetu promiješajte na vorteks miješalici 4 puta po 30 sec. Centrifugirajte epruvete pri 1.258 x g tijekom 15 min (Eppendorf, 5810 R) kako biste dodatno poboljšali razdvajanje faza. Staklenom Pasteurovom pipetom prenesite donju hidrofobnu frakciju u čistu staklenu epruvetu. Osušite donju hidrofobnu frakciju u struji dušika u dušičnom isparivaču. Osušeni talog čuvajte u zamrzivaču na -80 °C do uporabe. 


Ultrazvučna priprema lizata oblića

Lizat oblića: Oblići u stadiju L4 prikupljeni su i tri puta isprani puferom M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl i 0,87 mM MgSO₄) kako bi se uklonile sve bakterije. Nakon uklanjanja što veće količine pufera M9, oblići su resuspendirani u puferu za lizu: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-glicerol fosfata, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natrijeva fluorida, 1 mM natrijeva ortovanadata, 5 mM natrijeva pirofosfata, 0,2 mM fenilmetansulfonilfluorida i inhibitor proteaza. Oblići su tri puta zamrznuti u tekućem dušiku i odmrznuti pri 37°C, a zatim su sonicirani na suhom ledu ultrazvučnim uređajem VialTweeter za istodobnu pripremu 10 epruveta s uzorcima. Sonikacija je provedena pri amplitudi od 50% u 10 ciklusa od 2 sec. sa stankom od 30 sec između sonikacijskih impulsa. Nakon toga uzorci su centrifugirani pri 12.000 rpm na 4°C tijekom 15 min. Supernatant je prikupljen i pohranjen na -70°C. Alikvot je upotrijebljen za kvantifikaciju proteina Bradfordovom metodom.
Određivanje ukupnog glutationa, GSH i GSSG: Za kvantifikaciju glutationa priprema lizata i određivanje provedeni su istog dana. Ličinke L4 hranjene glukozom i kontrolne ličinke prikupljene su i tri puta isprane puferom M9. Nakon uklanjanja što veće količine pufera M9, oblići su resuspendirani u ledeno hladnoj metafosfornoj kiselini (5% w/v), a zatim su sonicirani u ledu ultrazvučnim uređajem VialTweeter pri amplitudi od 50% u deset sonikacijskih ciklusa od 2 sec. sa stankom od 30 sec. između svakog ciklusa. Nakon toga centrifugirani su pri 12.000 rpm na 4 ̊C tijekom 15 min.
(usp. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Priprema uzoraka C. elegans prije imunoprecipitacije i Western blot analize

Ukratko, za pripremu embrionalnih ekstrakata ličinke C. elegans u stadiju L1 uzgajane su do odraslog stadija u tekućim kulturama velikog obujma u mediju S. Embriji su prikupljeni standardnom metodom s izbjeljivačem i suspendirani u puferu za lizu (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerola, 0,05% NP-40, 1􏰅 smjese inhibitora proteaza i 1􏰅 smjese inhibitora fosfataza I i II), brzo zamrznuti u tekućem dušiku te lizirani ultrazvučnim razaranjem stanica primjenom ultrazvučnog uređaja s mikrovrhom kao što je UP200Ht s vrhom S26d2, uz 10 impulsa tijekom 10 s pri amplitudi od 30%. Ako je potrebno pripremiti veći broj uzoraka, preporučuju se ultrazvučni uređaj VialTweeter ili ultrazvučni uređaj za više uzoraka UIP400MTP za pločice s jažicama. Nakon sonikacije ekstrakti su prethodno pročišćeni centrifugiranjem pri 30.000g tijekom 20 min na 4°C. Prethodno pročišćeni ekstrakt (300µg ukupnih proteina) inkubiran je s 40µ􏰂g afinitetno pročišćenog protutijela anti-CDC-25.1 (ovo istraživanje) umreženog s proteinom A na agarozi, ili je kao kontrola upotrijebljena slična količina zečjeg imunoglobulina (Ig)G umreženog s proteinom A na agarozi, u ukupnom volumenu od 200µl pufera za lizu koji je sadržavao 1% NP-40, čiji je dodatak smanjio nespecifično vezanje proteina na matriks. Uzorci su rotirani tijekom 1 h pri 4°C, kuglice su tri puta isprane puferom za lizu, a elucija je provedena s 30µl glicina/HCl i 200 mM NaCl, pH 2,2. Nakon imunoprecipitacije eluati su razrijeđeni u 30µ􏰂l pufera za uzorke sa SDS-om, zagrijani na 95°C tijekom 4 min, a obično je 3% ukupne količine za ulazni uzorak i 30% za eluate naneseno na SDS-PAGE, nakon čega je provedena Western blot analiza s protutijelima anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) ili anti-􏰁β-actin (1:2000). Kada ekstrakti nisu bili podvrgnuti imunoprecipitaciji, jednaka količina ukupnih proteina iz tih ekstrakata resuspendirana je u puferu za uzorke sa SDS-om, zagrijana na 95°C, a zatim izravno nanesena na SDS-PAGE i analizirana Western blot metodom. (usp. Segref et al. 2020)

Ultrazvučna liza uz preciznu kontrolu temperature

Precizna i pouzdana kontrola temperature ključna je pri rukovanju biološkim uzorcima. Visoke temperature pokreću toplinski uzrokovanu razgradnju proteina u uzorcima.
Kao i sve mehaničke tehnike pripreme uzoraka, sonikacija stvara toplinu. Međutim, pri uporabi uređaja VialTweeter temperatura uzoraka može se dobro kontrolirati. Predstavljamo vam različite mogućnosti praćenja i kontrole temperature uzoraka tijekom njihove pripreme za analizu uređajima VialTweeter i VialPress.

1. Praćenje temperature uzorka: ultrazvučni procesor UP200St, koji pokreće VialTweeter, opremljen je inteligentnim softverom i priključivim temperaturnim senzorom. Priključite temperaturni senzor na UP200St i umetnite vrh temperaturnog senzora u jednu od epruveta s uzorcima. Putem digitalnog zaslona u boji osjetljivog na dodir u izborniku uređaja UP200St možete postaviti određeni temperaturni raspon za sonikaciju uzoraka. Ultrazvučni uređaj automatski će se zaustaviti kada se dosegne maksimalna temperatura i pauzirati dok temperatura uzorka ne padne na donju vrijednost zadanog temperaturnog raspona ∆. Zatim se sonikacija automatski ponovno pokreće. Ova pametna funkcija sprječava razgradnju uzrokovanu toplinom.
2. Blok uređaja VialTweeter može se prethodno ohladiti. Stavite blok uređaja VialTweeter (samo sonotrodu bez pretvornika!) u hladnjak ili zamrzivač kako biste prethodno ohladili titanski blok i tako odgodili porast temperature u uzorku. Ako je moguće, prethodno se može ohladiti i sam uzorak.
3. Za hlađenje tijekom sonikacije upotrijebite suhi led. Upotrijebite plitku posudu napunjenu suhim ledom i postavite VialTweeter na suhi led kako bi se toplina mogla brzo odvoditi.

Pronađite optimalan ultrazvučni uređaj za razaranje stanica za svoju primjenu lize

Hielscher Ultrasonics proizvođač je s dugogodišnjim iskustvom u proizvodnji visokoučinkovitih ultrazvučnih uređaja za razaranje stanica i homogenizatora za laboratorije, stolne sustave i sustave industrijskih razmjera. Veličina vaše kulture bakterijskih stanica, vaš istraživački ili proizvodni cilj te volumen stanica koji treba obraditi po satu ili danu ključni su čimbenici za pronalaženje odgovarajućeg ultrazvučnog uređaja za razaranje stanica za vašu primjenu.
Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za istodobnu sonikaciju više uzoraka (do 10 bočica), kao i velikog broja uzoraka (tj. mikrotitarskih ploča / ploča s 96 jažica), klasične laboratorijske ultrazvučne uređaje sa sondom različitih snaga od 50 do 400 vata pa sve do potpuno industrijskih ultrazvučnih procesora snage do 16.000 vata po jedinici za komercijalno razaranje stanica i ekstrakciju proteina u velikoj proizvodnji. Svi Hielscher ultrazvučni uređaji izrađeni su za rad 24/7/365 pod punim opterećenjem. Robusnost i pouzdanost temeljne su značajke naših ultrazvučnih uređaja.
Svi digitalni ultrazvučni homogenizatori opremljeni su pametnim softverom, zaslonom u boji osjetljivim na dodir i automatskim bilježenjem podataka, što ultrazvučni uređaj čini praktičnim radnim alatom u laboratorijima i proizvodnim pogonima.
Javite nam koje vrste stanica, u kojem volumenu, koliko često i s kojim ciljem trebate obrađivati svoje biološke uzorke. Preporučit ćemo vam najprikladniji ultrazvučni uređaj za razaranje stanica prema zahtjevima vašeg procesa.

Tablica u nastavku daje okviran prikaz približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih sustava, od kompaktnih ručnih homogenizatora i ultrazvučnih uređaja za više uzoraka do industrijskih ultrazvučnih procesora za komercijalne primjene: