Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz tkiva i staničnih kultura
- Ekstrakcija proteina ključan je korak pripreme uzoraka u proteomici.
- Proteini se mogu ekstrahirati iz biljnih i životinjskih tkiva, kvasaca i mikroorganizama.
- Sonikacija je pouzdana i učinkovita metoda ekstrakcije proteina koja omogućuje visoke prinose proteina u kratkom vremenu ekstrakcije.
Ekstrakcija proteina iz tkiva i stanica
Ekstrakcija proteina iz tkiva i uzgojenih stanica ključan je korak pripreme uzoraka koji se provodi u mnogim biokemijskim i analitičkim tehnikama, kao što su ELISA, PAGE, Western blot, masena spektrometrija ili pročišćavanje proteina. Ultrazvučno razaranje stanica, liza i ekstrakcija čine netoplinsku tehniku kojom se može precizno upravljati kako bi se osigurali visoki prinosi proteina.
Ekstrakcija proteina iz stanica s pomoću ultrazvučne sonde UP200St
- Brzina
- Visoki prinosi
- Visoka učinkovitost
- Precizna kontrola parametara
- Ponovljivi rezultati
- Linearna skalabilnost
Opće upute za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina
- Kontrola temperature: Kako bi se osigurao visok prinos proteina bez toplinske denaturacije, temperatura se tijekom ekstrakcije mora kontrolirati. Najsuvremenijim ultrazvučnim homogenizatorima tvrtke Hielscher – koji se nazivaju i ultrazvučnim dezintegratorima ili sonifikatorima – može se precizno upravljati. Isporučuju se s priključnim temperaturnim senzorom. U postavkama ultrazvučnog homogenizatora može se zadati maksimalna temperatura. Kada se ta maksimalna temperatura dosegne, ultrazvučni uređaj automatski se zaustavlja dok se uzorak ne ohladi.
- Pufer: Odabir prikladnog pufera i odgovarajućeg volumena pufera razlikuje se ovisno o tkivu te se mora utvrditi ispitivanjem metodom pokušaja i pogrešaka.
- Izolacija / pročišćavanje: Proteinski lizati mogu sadržavati višak biomolekula poput DNA ili ugljikohidrata, koje se mogu ukloniti precipitacijom proteina (deoksikolat–trikloroctena kiselina) ili zamjenom pufera.
Chittapalo i Noomhorm (2009) u svojem su istraživanju izvijestili da se primjenom sonikacije povećao prinos proteina te da postupak ultrazvučne homogenizacije i lize tkiva može znatno unaprijediti postojeće postupke ekstrakcije – otvarajući nove mogućnosti komercijalne ekstrakcije.
Ultrazvučni CupHorn za istodobnu, vrlo učinkovitu pripremu više uzoraka u istim uvjetima radi izolacije proteina i fragmentacije DNA.
Ekstrakcija proteina iz životinjskog tkiva
Za pripremu cijelog tkiva (npr. bubrega, srca, pluća, mišića itd.) tkivo treba izrezati na vrlo male komadiće čistim alatima, po mogućnosti na ledu, i što je brže moguće kako bi se spriječila razgradnja djelovanjem proteaza (npr. pufer za lizu kao što je RIPA ili hipotonični pufer za lizu koji sadržava koktel inhibitora proteaza i fosfataza). Nakon rezanja uzorak se uranja u tekući dušik radi brzog zamrzavanja. Uzorak se može pohraniti na -80°C za kasniju upotrebu ili držati na ledu radi neposredne homogenizacije. Neposredno prije ultrazvučne ekstrakcije u epruvetu s uzorkom brzo se dodaje ledeno hladan pufer za lizu (s inhibitorima proteaza DTT-om, leupeptinom i aprotininom) (preporučuje se približno ~600 μL pufera na ~10 mg tkiva). Preporučuje se približno 20–60mg tkiva po epruveti s uzorkom.
Ultrazvučna homogenizacija, liza i ekstrakcija provode se ultrazvučnim homogenizatorom kao što je UP100H ili UP200Ht, opremljenim sonotrodom s mikrovrhom. Sonikacija traje 60–90 sec. u cikličkom načinu rada ultrazvučnog uređaja s 15 sec. sonikacije i 10 sec. mirovanja. Uzorak treba cijelo vrijeme držati u ledu.
Nakon ultrazvučne homogenizacije / ekstrakcije lizat se centrifugira pri 27.000g približno 20 min. Zatim se prikuplja supernatant kako bi se koncentracija proteina mogla odrediti testom za određivanje proteina kao što je Pierce BCA test za određivanje proteina.
Ekstrakcija proteina iz krvnog seruma
Kako bi se dobila homogena smjesa seruma i fosfatnog pufera, uzorak se prije ultrazvučne lize stanica najprije miješa na vorteksnoj miješalici. Za ultrazvučnu lizu uzorak se sonicira ultrazvučnim laboratorijskim homogenizatorom kao što je UP100H tijekom 8 ciklusa pri amplitudi od 20%, pri čemu svaki ciklus obuhvaća 5 sekundi rada i 15 sekundi stanke. Ekstrakcija proteina provodi se sonikacijom u ciklusima (pulsni način rada) i postavljanjem uzorka na led kako bi se izbjegli pregrijavanje i toplinska razgradnja uzorka. Budući da serum sadrži veliku količinu proteina velike molekulske mase (kao što su albumin, α1-antitripsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulin G i imunoglobulin A), koji ometaju odvajanje proteina male molekulske mase tijekom IEF-a, preporučuje se njihovo uklanjanje iz seruma pomoću kolone za depleciju.
Ekstrakcija proteina iz biljnog tkiva
Svježe, meko biljno tkivo, npr. mahovina itd., može se lako razoriti jednostavnim stavljanjem usitnjenog materijala uzorka u pufer za lizu radi sonikacije. Žilava, odrvenjela biljna tkiva, poput sjemenki, iglica jele itd., treba samljeti na suho. Neki tvrdi, drvenasti biljni materijali moraju se zamrznuti i samljeti u tekućem dušiku prije ekstrakcije sonikacijom. Za suspenzije biljnih staničnih kultura uglavnom je dovoljna ultrazvučna obrada u puferu za lizu u trajanju od 30 do 150 sekundi. Žilaviji materijal, poput sjemenki bundeve, zahtijeva intenzivniju sonikaciju, kako je opisano u nastavku.
Protokol za ultrazvučnu ekstrakciju albumina iz sjemenki bundeve
Za ultrazvučnu ekstrakciju proteina albumina iz fino mljevenog praha sjemenki bundeve u staklenu čašu od 250mL dodaje se 10 g odmašćenog praha sjemenki bundeve i 100 mL deionizirane vode kao otapala. Ekstrakcija proteina sastoji se od dva koraka: najprije se uzorak sonicira pomoću ultrazvučnog uređaja sa sondom UP400St (400W, 24kHz) opremljenog sonotrodom S24d7. Tijekom ultrazvučne homogenizacije staklena se čaša nalazi u hladnoj vodenoj kupelji. Priključivi temperaturni senzor i postavke kontrole temperature ultrazvučnog uređaja UP400St osiguravaju da temperatura uzorka uvijek ostaje ispod 30°C. Preciznom kontrolom temperature tijekom sonikacije izbjegava se denaturacija albumina. U drugom koraku ekstrakcija je provedena miješalicom pri brzini od 200 rpm i temperaturi od 30°C. Nakon toga čaša se prenosi u termostatiranu tresilicu. Globulin se uklanja dijalizom s destiliranom vodom. Nakon uklanjanja globulina može se uzeti uzorak proteinskog ekstrakta za određivanje profila albumina, a ekstrakt se zatim podešava na pI=3,0 pomoću 0,1 M HCl radi koagulacije albumina. Čvrsta faza odvaja se centrifugiranjem pri 5000g i 20°C te se ponovno otapa u deioniziranoj vodi. Koagulacija albumina provodi se dvaput kako bi se povećao udio proteina u koncentratu albumina.
Ultrazvučna alkalna ekstrakcija proteina za pripremu proteinskog koncentrata iz rižinih mekinja pokazuje da ultrazvučna obrada rezultira većim prinosom proteina uz znatno kraće vrijeme ekstrakcije – u usporedbi s konvencionalnim metodama ekstrakcije.
Protokol pripreme uzorka za funkcionalni enzim iNOS
Za dobivanje potpuno funkcionalnog enzima iNOS (npr. za probir lijekova) preporučuje se sljedeći protokol: staničnu suspenziju treba staviti na led i sonicirati uređajem UP100H pri amplitudi od 10µm u cikličkom načinu rada s 5 sekundi sonikacije i 25 sekundi stanke na ledu. Postupak treba ponoviti približno 3 puta. Stanka između ciklusa sonikacije smanjuje porast temperature te stoga smanjuje rizik od denaturacije.
Ultrazvučna solubilizacija proteina
Sonikacija može ubrzati proces solubilizacije proteina, koji obično zahtijeva nekoliko sati. Kako bi se izbjeglo pregrijavanje uzorka te spriječile razgradnja i modifikacije proteina u otopinama koje sadrže ureu, ultrazvučni impulsi ne bi smjeli trajati dulje od nekoliko sekundi.
Ultrazvučni uređaj UP200Ht s mikrovrhom S26d2 od 2mm za sonikaciju malih uzoraka.
Ultrazvučna oprema za ekstrakciju proteina
Hielscher Ultrasonics nudi širok raspon ultrazvučnih homogenizatora za razaranje stanica, tkiva, bakterija, mikroorganizama, kvasaca i spora.
Laboratorijski ultrazvučni uređaji Hielscher snažni su i jednostavni za rukovanje. Izrađeni za rad 24/7, osmišljeni su kao robusni i učinkoviti laboratorijski i stolni uređaji. Kod svih uređaja izlazna energija i amplituda mogu se precizno regulirati. Širok raspon dodatne opreme omogućuje dodatne mogućnosti konfiguracije. Digitalni ultrazvučni uređaji kao što su VialTweeter, UP200Ht, UP200St i UP400St imaju integriranu regulaciju temperature i ugrađenu SD karticu za automatsko bilježenje podataka.
Za neizravnu i istodobnu sonikaciju više uzoraka bez unakrsne kontaminacije nudimo VialTweeter ili ultrazvučni CupHorn.
Tablica u nastavku pruža pregled naših ultrazvučnih uređaja za pripremu uzoraka, razaranje stanica i ekstrakciju. Kliknite na tip uređaja kako biste dobili više informacija o svakom ultrazvučnom homogenizatoru. Naše dobro obučeno tehničko osoblje s dugogodišnjim iskustvom rado će vam pomoći odabrati najprikladniji ultrazvučni uređaj za pripremu vaših uzoraka!
| Volumen šarže | Protok | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| do 10 bočica ili epruveta | n.a. | VialTweeter |
| ploče s više jažica / mikrotitarske ploče | n.a. | UIP400MTP |
| više epruveta / posuda | n.a. | CupHorn |
| 1 do 500mL | 10 do 200mL/min | UP100H |
| 10 do 1000mL | 20 do 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 do 2000mL | 20 do 400mL/min | UP400St |
Ovisno o vašoj primjeni, materijalu i volumenu uzorka, preporučit ćemo vam najprikladniju konfiguraciju za pripremu vaših uzoraka. Obratite nam se već danas!
Obratite nam se! / Pitajte nas!
Digitalni ultrazvučni uređaji Hielscher omogućuju daljinsko upravljanje putem preglednika i automatsko bilježenje podataka na integriranu SD karticu.
VialTweeter za neizravnu sonikaciju.
Korisne činjenice
Proteomika
Proteomika je znanstveno područje koje istražuje proteine i proteom. Proteini obavljaju velik broj životno važnih funkcija u organizmima. Proteom je cjelokupan skup proteina koje genom, stanica, tkivo ili organizam eksprimira u određenom trenutku. Proteom se mijenja tijekom vremena i ovisno o specifičnim zahtjevima ili stresovima kojima su stanica ili organizam izloženi. Preciznije, to je skup eksprimiranih proteina u određenom tipu stanice ili organizma, u određenom trenutku i pod definiranim uvjetima. Naziv je nastao spajanjem riječi protein i genom. Proteomika je proučavanje proteoma.
Protein
Proteini su velike biomolekule, takozvane makromolekule – koje se sastoje od jednog ili više dugih lanaca aminokiselinskih ostataka. Proteini su prisutni u svim organizmima biljnog i životinjskog podrijetla te su ključni za većinu bioloških funkcija. Budući da proteini sadrže mnogo bioloških informacija, ekstrahiraju se u analitičke svrhe, primjerice za proteomička istraživanja. Najvažnije funkcije koje proteini obavljaju uključuju katalizu metaboličkih reakcija, replikaciju DNA, odgovor na podražaje i prijenos molekula s jednog mjesta na drugo. Proteini se međusobno razlikuju prvenstveno po slijedu aminokiselina, koji je određen nukleotidnim slijedom njihovih gena i koji obično dovodi do savijanja proteina u specifičnu trodimenzionalnu strukturu koja određuje njegovu aktivnost. Proteini su – uz peptide – jedna od ključnih sastavnica hrane. Stoga je proteomika moćan alat u znanosti o hrani za optimizaciju procesa, sigurnosti hrane i nutritivne procjene.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je predanalitički postupak za odvajanje i predkoncentriranje analita. U kombinaciji s ultrazvučnom obradom, ekstrakcija pri točki zamućenja može se intenzivirati, čime postupak postaje učinkovitiji, brži i prihvatljiviji za okoliš. Uz ultrazvučnu obradu, ekstrakcija pri točki zamućenja znatno je učinkovitija metoda pripreme analita. Pročitajte više o ultrazvučno potpomognutoj ekstrakciji pri točki zamućenja!
Elektroforeza u gelu
Elektroforeza u gelu glavna je metoda razdvajanja i analize makromolekula kao što su DNA, RNA i proteini te njihovih fragmenata na temelju njihove veličine i naboja. Primjenjuje se u kliničkoj kemiji za razdvajanje proteina prema naboju i/ili veličini (IEF u agarozi, u osnovi neovisno o veličini), a u biokemiji, molekularnoj biologiji i proteomici za razdvajanje mješovite populacije fragmenata DNA i RNA prema duljini, procjenu veličine fragmenata DNA i RNA ili razdvajanje proteina prema naboju.
Stanične kulture
Uzgoj staničnih kultura kontrolirani je proces rasta u kojem se stanice uzgajaju u kontroliranim uvjetima. Uvjeti uzgoja staničnih kultura razlikuju se za svaku vrstu stanica. Općenito, okruženje stanične kulture sastoji se od prikladne posude (npr. Petrijeve zdjelice) sa supstratom ili medijem koji osigurava esencijalne hranjive tvari (aminokiseline, ugljikohidrate, vitamine, minerale), čimbenike rasta, hormone i plinove (CO2, O2) te regulira fizikalno-kemijsko okruženje (pH pufer, osmotski tlak, temperaturu). Većini stanica potrebna je površina ili umjetni supstrat, dok se druge stanične kulture mogu uzgajati slobodno suspendirane u mediju za uzgoj (suspenzijska kultura, stanična suspenzija).
Masovne kulture životinjskih staničnih linija upotrebljavaju se u industrijskoj proizvodnji virusnih cjepiva i drugih biotehnološki dobivenih proizvoda. Ljudske matične stanice uzgajaju se kako bi se povećao broj stanica i kako bi se stanice diferencirale u različite vrste somatskih stanica za potrebe transplantacije.
Uzorci tkiva
Pojam tkivo opisuje staničnu međurazinu na kojoj se stanični materijal organizacijski nalazi između stanica i cjelovitog organa. U tkivu su okupljene slične stanice istog podrijetla koje zajedno obavljaju određenu funkciju. Funkcionalnim povezivanjem više tkiva nastaju složene strukture organa.
Tkivo se uzorkuje za istraživanja u biologiji, histologiji/histopatologiji, parazitologiji, biokemiji i imunohistokemiji te za uzgoj tkiva i ekstrakciju DNA. Razlikuju se životinjsko tkivo (podskupina: tkivo sisavaca) i biljno tkivo. Životinjska tkiva dijele se na četiri osnovne vrste: vezivno, mišićno, živčano i epitelno tkivo. Biljno tkivo dijeli se na sljedeća tri tkivna sustava: epidermu, osnovno tkivo i provodno tkivo.
Uzorci tkiva mogu se pripremiti iz dijelova životinja ili biljaka, npr. kostiju, mišića, listova itd.
Tjelesne tekućine
Krv, serum, plazma, cerebrospinalna tekućina, slina i sinovijalna tekućina tjelesne su tekućine koje predstavljaju izvrstan izvor dijagnostički relevantnih informacija. Stoga je važna sofisticirana priprema uzoraka tjelesnih tekućina za analizu. Prva poteškoća povezana je sa širokim dinamičkim rasponom sastavnica prisutnih u tjelesnim tekućinama.
Određivanje koncentracije proteina
Bradfordova metoda, Lowryjeva metoda i metoda s bicinkoninskom kiselinom (BCA) uobičajene su metode za određivanje koncentracije proteina. Goveđi serumski albumin (BSA) jedan je od najčešće upotrebljavanih proteinskih standarda.
Pufer za lizu
Pufer za lizu mora se odabrati u skladu sa staničnim materijalom ili tkivom (kultura tkiva, biljka, bakterije, gljive itd.), ovisno o tome jesu li stanice dio neke strukture i o vrsti te strukture. Brojni puferi za lizu namijenjeni ekstrakciji proteina, membrana i organela formulirani su s jednim ili više deterdženata. Deterdžent se obično odabire ispitivanjima metodom pokušaja i pogrešaka ili – ako je dostupan – prema postojećem protokolu za ekstrakciju proteina. Deterdžent mora biti kompatibilan s izvornim tkivom i proteinima. Općenito se odabire najblaži deterdžent koji djeluje na određeno tkivo / protein kako bi se očuvala maksimalna funkcionalnost ekstrakta. Nadalje, pri ekstrakciji membrana i organela blagi deterdžent održava membranu cjelovitom. Deterdženti koji se često upotrebljavaju u puferima za lizu uglavnom su neionski ili zwitterionski, npr. CHAPS, deoksikolat, Triton™ X-100, NP40 i Tween 20.
Primjerice, tkiva poput mozga, jetre, crijeva, bubrega, slezene itd. mogu se jednostavno puferirati puferom RIPA – međutim, treba uključiti inhibitore proteaza i DTT (npr. za elektroforezu u gelu).
Pufer za lizu tkiva skeletnih mišića (ledenohladan): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerola, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitola, uz dodatak koktela inhibitora proteaza i fosfataza
Tablica uobičajenih pufera i njihovih raspona pH. Općenito se ti puferi obično upotrebljavaju u koncentracijama od 20–50 mM.
| Pufer | Raspon pH |
|---|---|
| Limunska kiselina – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Natrijev citrat – limunska kiselina | 3,0 – 6,2 |
| Natrijev acetat – octena kiselina | 3,6 – 5,6 |
| Natrijeva sol kakodilne kiseline – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Natrijev dihidrogenfosfat – dinatrijev hidrogenfosfat | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Trietanolamin hidroklorid – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricin – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Natrijev tetraborat – borna kiselina | 7,6 – 9,2 |
| Bicin – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glicin – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Kod većine pufera pH ovisi o temperaturi. To osobito vrijedi za pufere Tris. pKa se mijenja s 8,06 pri 25°C na 8,85 pri 0°C.
(pH i pKa pufera: pH mjeri koncentraciju vodikovih iona u vodenoj otopini. pKa (= konstanta disocijacije kiseline) povezana je, ali specifičnija mjera jer pomaže predvidjeti kako će se molekula ponašati pri određenoj vrijednosti pH.)
TRIzol
TRIzol je kemijska otopina koja se upotrebljava za ekstrakciju RNA/DNA/proteina tijekom ekstrakcije gvanidinijevim tiocijanatom, fenolom i kloroformom. Primjena ekstrakcije TRIzol-om potpomognute ultrazvukom rezultira visokim prinosima DNA, RNA i proteina iz istog uzorka te time nadmašuje druge metode ekstrakcije.
Literatura/Reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.