Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz tkiva i kultura stanica
- ekstrakcija proteina je bitan korak u priprema uzorka proteomike.
- Proteini mogu se ekstrahirati iz biljnog i životinjskog tkiva, kvasaca i mikroorganizama.
- Sonication je pouzdan, učinkovit način za ekstrakciju proteina daje visoko proteinske prinose u kratkom vremenu ekstrakcije.
Ekstrakcija proteina iz tkiva i stanica
Ekstrakcija proteina iz tkiva i kultiviranih stanica bitan je korak pripreme uzorka koji se provodi tijekom mnogih biokemijskih i analitičkih tehnika kao što su ELISA, PAGE, zapadnjačko nadutost, masena spektrometrija ili pročišćavanje proteina. Ultrazvučni poremećaj stanica, liza i ekstrakcija je precizno upravljiva, netoplinska tehnika kako bi se osigurali visoki prinosi proteina.
Ekstrakcija proteina iz stanica s ultrazvučna sonda UP200St
- brz
- visoki prinosi
- vrlo učinkovit
- Precizna kontrola nad parametrima
- ponovljivih rezultata
- linearni skalabilnost
Opće upute za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina
- Kontrola temperature: Kako bi se osiguralo visok prinos proteina bez toplinske denaturacije, temperatura tijekom ekstrakcije mora biti pod kontrolom. Hielscher je stanje-of-art ultrazvučni homogeniziranje – također se naziva ultrazvučni dezintegrator ili ultrasonifikator – su upravo kontrolirati. Oni dolaze s plugable senzor temperature. U mogućnosti podešavanja na ultrazvučni homogenizator, maksimalna temperatura može se namjestiti. Kada se dostigne ta temperatura max je ultrasonicator automatski zaustavlja dok uzorak ne ohladi.
- Pufer: Choise od odgovarajućeg pufera i pravo volumenu pufera varira od tkiva do tkiva i mora biti shvaćen-out testiranjem pokušaja i pogreške.
- Izolacija / pročišćavanje: Protein lizati mogu sadržavati suvišak biomolekule kao što je DNA ili ugljikohidrata, koji se može ukloniti za taloženje proteina (deoksikolat-trikloroctena kiselina) ili puferskom izmjenom.
Chittapalo i Noomhorm (2009) izvijestili su u svojoj studiji da se prinos proteina povećao pomoću ultrazvukom i da ultrazvučni proces homogenizacije i lize tkiva može značajno poboljšati postojeće procese ekstrakcije – omogućavanje novih poslovnih mogućnosti za ekstrakciju.
Ultrazvučno cuphorn za istodobnu, vrlo učinkovitu pripremu uzorka više uzoraka pod istim uvjetima za izolaciju proteina i fragmentaciju DNA.
Ekstrakcija proteina iz životinjskog tkiva
Za pripremu tkiva pune veličine (npr. Bubrega, srca, pluća, mišića i sl.), Tkivo se treba odvojiti u vrlo male komade čistim alatima, na ledu poželjno i što je brže moguće kako bi se spriječilo degradiranje proteazom (npr. pufer za lizu kao što je RIPA ili hipotonični pufer za lizu koji sadrži koktel inhibitora proteaze i fosfataze). Nakon disekcije, uzorak se uranja u tekući dušik za zamrzavanje. Uzorak se može pohraniti na -80 ° C za kasniju uporabu ili se držati na ledu za neposrednu homogenizaciju. Neposredno prije ultrazvučne ekstrakcije, u cijev za uzorku se brzo dodaje pufer za led lizu (s proteaznim inhibitorima DTT, leupeptin i aprotinin) (oko 10 mg tkiva preporučuje se oko 600 ul pufera). Cca. Preporuča se 20-60 mg tkiva po uzorku cijevi.
Ultrazvučna homogenizacija, liza i ekstrakcija izvodi se ultrazvučnim homogenizatorom kao što je UP100H ili UP200Ht, opremljen mikro-vrh sonotrode. Trajanje ultrazvukom je 60-90 sek. u ultrazvučnom ciklusu način od 15 sek. ultrazvukom i 10 sek. vrijeme odmora. Uzorak treba stalno držati u ledu.
Nakon homogenizacije ultrazvučnog / ekstrakcije lizat se centrifugira na 27,000g cca. 20 min. Zatim je supernatant se sakupi, tako da je koncentracija proteina može se odrediti analizom proteina kao što je protein Pierce BCA ispitivanje.
Ekstrakcija proteina iz serumu
Za homogenu mješavinu seruma i fosfatnog pufera, uzorak se prvo vrti prije ultrazvučne stanične lize. Za ultrazvučnu lizu, uzorak je ultrazvukom s ultrazvučnim laboratorijskim homogenizatorom kao što je UP100H za 8 ciklusa na 20% amplitude, za cikluse od svakih 5 sekundi na i 15 sekundi off. Ekstrakcija proteina provodi se ultrazvukom u ciklusima (način pulsiranja) i stavljanjem uzorka na led tako da se izbjegne pregrijavanje i toplinska razgradnja uzorka. Budući da serum sadrži veliku količinu proteina visoke molekularne težine (kao što su albumin, α1-antitripsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulin G i imunoglobulin A), koji ometaju odvajanje proteina niske molekularne težine tijekom IEF-a, preporuča se iscrpiti ih iz seruma pomoću stupca iscrpljivanja.
Ekstrakcija proteina iz biljnog tkiva
Svježe, meko tkivo biljke, npr mahovina itd može lako poremećen jednostavno stavljanjem uzorka sjeckani materijal u lizirajućem puferu sonikaciju. Otporne, ligenous biljnih tkiva, kao što su sjemenke, jele igle itd, trebaju biti temelj suha. Neki tvrde, drvenaste biljke materijali moraju biti zamrznuta i zemlju u tekućem dušiku prije ekstrahiran pomoću zvučnih valova. Za suspenzije biljke kulture stanica, ultrazvučni tretman između 30 i 150 sekundi, u puferu za lizu je uglavnom dovoljna. Čvršći materijala kao što su sjemenke bundeve zahtijevaju intenzivniji obrada ultrazvukom, kako je opisano u nastavku.
Protokol za ultrazvučno vađenje albumin iz sjemena bundeve
Za ultrazvučnu ekstrakciju proteina albumina iz fino mljevenog praha sjemenki bundeve, 10 g odmašćenog praha sjemenki bundeve i 100 mL deionizirane vode kao otapala dodaju se u staklenu čašu od 250 ml. Ekstrakcija proteina sastoji se u dva koraka: Prvo, uzorak se ultrazvukom sonda tipa ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) opremljen sonotrode S24d7. Staklena čaša se stavlja u kupku s hladnom vodom tijekom ultrazvučne homogenizacije. Pluggable senzor temperature i postavke kontrole temperature ultrasonicator UP400St osiguravaju da se temperatura uzorka uvijek drži ispod 30 ° C. Preciznom kontrolom temperature tijekom ultrazvukom izbjegava se denaturacija albumina. Drugo, ekstrakcija je provedena mikserom pri brzini od 200 o / min i na 30 °C. Nakon toga čaša se prenosi u termostatski šejker. Globulin se uklanja dijalizom destiliranom vodom. Nakon uklanjanja globulina, ekstrakt proteina može se uzorkovati za određivanje profila albumina i naknadno se podešava na pI = 3,0 pomoću 0,1 M HCl za zgrušavanje albumina. Čvrsta faza odvojena je centrifugiranjem na 5000g, 20°C i reraspodijeljena u deioniziranoj vodi. Koagulacija albumina izvodi se dva puta kako bi se povećao omjer proteina u koncentratu albumina.
Ultrazvučni ekstrakcije alkalnom proteina za dobivanje koncentrata proteina iz rižine mekinje pokazuje da ultrazvučni tretman rezultira visokom iskorištenju proteina u znatno kraće vrijeme ekstrakcije – u usporedbi s uobičajenim postupcima ekstrakcije.
Uzorak protokol priprema za funkcionalnu iNOS enzima
Da bi se dobio potpuno funkcionalan iNOS enzim (npr. za probir lijekova), preporučuje se sljedeći protokol: Suspenziju stanica treba staviti na led i ultrazvukom s UP100H pri 10μm amplitudi pri ciklusu od 5 sek. ultrazvukom i 25 sek. Postupak treba ponoviti otprilike 3 puta. Vrijeme odmora između ciklusa ultrazvukom smanjuje porast temperature i stoga će smanjiti rizik od denaturacije.
Ultrazvučno proteina Otapanje
Sonication može ubrzati proces otapanja proteina, što obično zahtijeva nekoliko sati. Kako se ne bi pregrijati uzorak i spriječili razgradnju proteina i izmjene u otopinama koje sadrže ureu, ultrazvučni izboji ne smije trajati duže od nekoliko sekundi.
Ultrasonicator UP200Ht s mikrotipom od 2 mm S26d2 za ultrazvukom malih uzoraka.
Ultrazvučna oprema za protein ekstrakcija
Hielscher Ultrasonics nudi široki spektar ultrazvučnih homogenizator za dezintegraciju stanica, tkiva, bakterija, mikroorganizama, kvasce i spore.
Hielscher lab ultrasonicators su snažni i jednostavan za rukovanje. Izrađeni za 24/7 rad, dizajnirani su kao robusni i učinkoviti laboratorijski i stolni uređaji. Za sve uređaje može se precizno kontrolirati izlazna energija i amplituda. Širok raspon dodatne opreme otvara daljnje mogućnosti postavljanja. Digitalni ultrasonicators kao što su VialTweeter, UP200Ht, UP200St, i UP400St imaju integriranu kontrolu temperature i ugrađenu SD karticu za automatsko snimanje podataka.
Za neizravnu, unakrsnu kontaminaciju i istodobnu ultrazvukom više uzoraka nudimo VialTweeter ili ultrazvučni CupHorn.
Tablica u nastavku daje vam pregled naših ultrasonicators za pripremu uzoraka, poremećaj stanica i ekstrakciju. Kliknite na vrstu uređaja da biste dobili više informacija o svakom ultrazvučnom homogenizatoru. Naše dobro obučeno i dugogodišnje iskustvo tehničko osoblje rado će vam pomoći u odabiru najprikladnijeg ultrasonicatora za pripremu uzorka!
| Batch Volumen | Protok | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| do 10 bočica ili cijevi | N.a. | VialTweeter |
| multiwell / mikrotiter ploče | N.a. | UIP400MTP |
| više cijevi / plovila | N.a. | Cuphorn |
| 1 do 500 mL | 10 do 200 mL / min | UP100H |
| 10 do 1000mL | 20 do 200mL/min | Uf200 ः t, UP200St |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400 mL / min | UP400St |
Ovisno o vašoj prijavi, materijala i volumena uzorka, mi ćemo vam preporučiti najprikladnije postavke za svoj uzorak prep. Kontaktirajte nas već danas!
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Hielscher digitalni ultrasonicators imaju preglednik daljinski upravljač i automatsko podatkovno protokoliranje na integriranoj SD-kartici.
VialTweeter za neizravno ultrazvučnoj kupelji.
Činjenice koje vrijedi znati
proteomika
Proteomika je istraživanje polje koje istražuje proteine i Proteom. Proteini ispunjavaju širok niz vitalnih funkcija unutar organizama. Proteom je cijeli niz proteina eksprimiranih genom, stanice, tkiva, ili organizma u određeno vrijeme. Proteom varira s vremenom i različite zahtjeve, ili stresom, da stanica ili organizam prolazi. Točnije, to je set eksprimiranih proteina u određenom tipu stanice ili organizma, u određenom trenutku, pod određenim uvjetima. Termin je mješavina proteina i genomu. Proteomika je proučavanje proteoma.
Proteina
Proteini su velike biomolekule, tzv makromolekule – koji se sastoje od jednog ili više dugih lanaca aminokiselinskih ostataka. Proteini su prisutni u svim organizmima biljnog i životinjskog podrijetla te su ključni za većinu bioloških funkcija. Budući da proteini sadrže puno bioloških informacija, oni se ekstrahiraju za analitičku svrhu, npr. Za proteomsko istraživanje. Najvažnija funkcija koju provode proteini uključuju katalizu metaboličkih reakcija, replikaciju DNA, odgovor na podražaje i transport molekula s jednog mjesta na drugo. Proteini se međusobno razlikuju prvenstveno u njihovom slijedu aminokiselina, što je diktirano nukleotidnim slijedom njihovih gena i koji obično rezultira skupljanjem proteina u specifičnu trodimenzionalnu strukturu koja određuje njegovu aktivnost. Proteini su – osim peptida – jedan od ključnih komponenti hrane. Dakle, proteomika je moćan alat u prehrambenoj znanosti za optimizaciju procesa, sigurnosti hrane i prehrambene procjene.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je predanalitička procedura za odvajanje i prethodno konkretacijskih analita. U kombinaciji s ultrazvukom, ekstrakcija točke oblaka može se pojačati čineći proces učinkovitijim, bržim i ekološki prihvatljivijim. Uz ultrazvukom, ekstrakcija točke oblaka je znatno učinkovitija metoda pripreme analita. Pročitajte više o ultrazvučno potpomognutoj ekstrakciji točke oblaka!elektroforeza u gelu
Gel elektroforeza je glavni način za odvajanje i analizu makromolekula kao što je DNA, RNA i proteina, kao i njihove fragmente, na temelju svoje veličine i naboja. Se koristi u kliničkoj kemiji za odvajanje proteina od punjenja i / ili veličine (IEF agaroze, uglavnom veličina nezavisni) i biokemije, molekularne biologije i proteomike odvojiti mješanu populaciju DNA i RNA fragmenata duljine, za procjenu veličine DNA i RNA fragmenti ili odvajanje proteina od naboja.
stanične kulture
Kultura stanica je kontrolirani uzgoj proces kojim se stanice uzgajane u kontroliranim uvjetima. Uvjeti stanične kulture varirati za svaki stanični tip. Općenito, okolina za kulturu stanica sadrži prikladne posude (npr Petrijevoj zdjelici) sa supstratom ili medij koji opskrbljuje esencijalne hranjive tvari (amino kiseline, ugljikohidrati, vitamini, minerali), faktore rasta, hormone, i plinova (CO2The2), Te regulira fizikalno-kemijsko okruženje (pH pufera, osmotski tlak, temperaturu). Većina stanica treba površinu ili umjetni supstrat, dok druge stanične kulture može uzgajati bez pluta u mediju za kulture (kultura suspenzije, suspenzije stanica).
Masovna kultura staničnih linija životinjskog se koriste u industrijskoj proizvodnji virusnih cjepiva i drugih biotehnološki dobivenih proizvoda. Ljudske matične stanice su kultivirane proširiti broj stanica i razlikovati stanice u različitim tjelesnim tipovima stanica za potrebe transplantacije.
uzorci tkiva
Izraz opisuje tkivo stanični intermedijer, pri čemu je stanica materijal na razini organizacije između stanica i potpuni organa. U tkivu, slične stanice, iz istog podrijetla koji zajedno obavljaju određenu funkciju, su skupi. Do funkcionalnog grupiranja više tkiva, kompleksne strukture organa nastaju.
Tkivo je uzorkovano za istraživanja u biologiji, histologiju / histopatoloških, parazitologija, biokemije, imunohemije kao i njegovati i ekstrakt DNA. Može se razlikovati između životinja (podjele: sisavcu tkiva) i biljnog tkiva. Životinjska tkiva su grupirani u četiri osnovne vrste vezivnog, mišića, živčanog i epitelnog tkiva. Biljno tkivo je podijeljen u sljedeće tri sustava tkiva: epidermu, u prizemlju tkiva i krvnih žila tkiva.
Uzorci tkiva mogu se dobiti iz animalnih ili biljnih dijelova, npr kostiju, mišića, lišće, itd
Tjelesne tekućine
Krv, serum, plazma, cerebrospinalna tekućina, slina i sinovijalnoj tekućini su tjelesne tekućine, koji nude veliki izvor dijagnostički relevantnih informacija. Dakle, sofisticirani priprema uzoraka tjelesnih tekućina za analizu je važno. Prvi je problem povezan sa širokim dinamički raspon komponenata prisutnih u tjelesnim tekućinama.
Određivanje koncentracije proteina
Bradford test, test Lowry i bicinhoninička kiselina (BCA) Test Testovi su uobičajene za određivanje koncentracije proteina. Albumin iz goveđeg seruma (BSA) je jedan od najčešće korištenih standarda proteina.
liza pufera
Pufera mora biti izabran u skladu sa staničnog materijala ili tkiva (biljaka kulture tkiva,, bakterija, gljivica itd), te da li su stanice u strukturi i tipu konstrukcije. Širok raspon lize puferi za ekstrakciju proteina, membrane i organela se formuliraju s jednim ili više sredstava za pranje. Deterdžent obično se odabire putem testova suđenje i pogreške ili – ako je dostupno – skladu s postojećim protokolima za ekstrakciju proteina. Deterdžent mora biti kompatibilan s izvorom tkiva i bjelančevina. Općenito, najblaže deterdžent koji radi za određenu tkiva / proteina, je izabran kako bi se održala maksimalnu funkcionalnost ekstrakta. Nadalje, u slučaju ekstrakcije membrane i organela, blagi deterdžent zadržava membrana netaknut. Obično koriste sredstva za čišćenje u puferi lize uglavnom neionske ili zwitter-iona, npr CHAPS, deoksikolata, Triton ™ X-100, NP40 i Tween 20.
Na primjer, kao što su tkiva mozga, jetre, crijeva, bubrega, slezene, itd može jednostavno puferirana s RIPA – Međutim, inhibitori proteaze i DTT (na primjer za gel elektroforeze) treba uključiti.
Pufera za tkiva kosturnih mišića (ledeno hladan): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) glicerola, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitola i pomiješa s proteazom inhibitora fosfataze koktela
Tablica zajedničkih odbojnika i njihov raspon pH. Općenito, ovi odbojnici normalno koriste pri koncentracijama od 20-50 mM.
| Pufer | raspon pH |
|---|---|
| Limunska kiselina – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| Natrijev citrat – Limunska kiselina | 3,0 – 6,2 |
| Natrijev acetat – octena kiselina | 3,6 – 5,6 |
| kiselina natrijeva sol Cacodylic – Hcl | 5,0 – 7,4 |
| MOJ – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| Natrijev dihidrogen fosfat – dinatrijev hidrogen fosfat | 5,8 – 8,0 |
| imidazola – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| Krpe – Koh | 6,6 – 7,8 |
| trietanolamin hidroklorid – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| tris – Hcl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| Tricina – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| natrij tetraborat – Borna kiselina | 7,6 – 9,2 |
| Bićinama – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| glicin – Naoh | 8,6 – 10,6 |
Većina odbojnika pokazuju pH ovisnost o temperaturi. To posebno vrijedi za Tris pufer. PKa mijenja od 8.06 na 25 ° C do 8,85 na 0 ° C.
(PH i pKa pufera: pH mjeri koncentraciju vodikovih iona u vodenoj otopini pKa (= konstantnu disocijacije kiseline) je povezana, a određenije mjera, da pomaže predvidjeti kako molekule će djelovati na specifičan. pH vrijednost).
Trizola
Trizol je kemijska otopina se koristi za ekstrakciju RNA / DNA / proteina za vrijeme ekstrakcije gvanidinijevog tiocijanat-fenol-kloroformom. Upotreba ultrazvučno potpomognutih TRIZOL ekstrakcijske rezultira visokom DNA, RNA i proteina prinosa od istog uzorka, a odlikuje time druge metode ekstrakcije.
Literatura / Reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.