Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz tkiva i kultura stanica
- ekstrakcija proteina je bitan korak u priprema uzorka proteomike.
- Proteini mogu se ekstrahirati iz biljnog i životinjskog tkiva, kvasaca i mikroorganizama.
- Sonication je pouzdan, učinkovit način za ekstrakciju proteina daje visoko proteinske prinose u kratkom vremenu ekstrakcije.
Ekstrakcija proteina iz tkiva i stanica
Ekstrakcija proteina iz tkiva i stanica u kulturi je bitna priprema uzorka korak koji se provodi tijekom mnogih biokemijskih i analitičkim tehnikama kao što ELISA, PAGE Western blot, Masena spektrometrija, ili pročišćavanje proteina. Ultrazvučni poremećaj stanica, liza i ekstrakcija je upravo kontrolirati tehnika kako bi se osiguralo visoke prinose proteina.
Ekstrakcija proteina iz životinjskog tkiva
Za pripremu tkiva pune veličine (npr. Bubrega, srca, pluća, mišića i sl.), Tkivo se treba odvojiti u vrlo male komade čistim alatima, na ledu poželjno i što je brže moguće kako bi se spriječilo degradiranje proteazom (npr. pufer za lizu kao što je RIPA ili hipotonični pufer za lizu koji sadrži koktel inhibitora proteaze i fosfataze). Nakon disekcije, uzorak se uranja u tekući dušik za zamrzavanje. Uzorak se može pohraniti na -80 ° C za kasniju uporabu ili se držati na ledu za neposrednu homogenizaciju. Neposredno prije ultrazvučne ekstrakcije, u cijev za uzorku se brzo dodaje pufer za led lizu (s proteaznim inhibitorima DTT, leupeptin i aprotinin) (oko 10 mg tkiva preporučuje se oko 600 ul pufera). Cca. Preporuča se 20-60 mg tkiva po uzorku cijevi.
Ultrazvučni homogenizacija, lizu i ekstrakcija se provodi s ultrazvučni homogenizator poput Uf200 ः t ili UP200StOpremljena s mikro-vrha sonotrode. trajanje sonication je 60-90 sek. na način ultrazvučnog ciklusa od 15 sekundi. ultrazvukom i 10 sekundi. odmara vrijeme. Uzorak treba držati na ledu cijelo vrijeme.
Nakon homogenizacije ultrazvučnog / ekstrakcije lizat se centrifugira na 27,000g cca. 20 min. Zatim je supernatant se sakupi, tako da je koncentracija proteina može se odrediti analizom proteina kao što je protein Pierce BCA ispitivanje.
Ultrazvučno ekstrakcija proteina iz stanica s UP200St
Ekstrakcija proteina iz serumu
Za homogenu smjesu seruma i fosfatnog pufera, uzorak se vrtložio prvi prije ultrazvučne lijeve stanice. Za ultrazvučnu lizu, uzorak se ultrazvukom ultrazvučnim laboratorijskim homogenizatorom kao što je UP100H 8 ciklusa na 20%, amplitude za cikluse svakih 5 sekundi i 15 sekundi na obali. Sonocation provodi sonicationg u ciklusima i stavljanjem uzorka na ledu, tako da se izbjegne pregrijavanje i toplinske razgradnje uzorka. Budući da serum sadrži veliku količinu proteina visoke molekulske mase (kao što su albumin, α1-antitripsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulina G i imunoglobulina A), koji interferiraju s odvajanje proteina niske molekularne težine tijekom IEF, preporučljivo je da ih iscrpiti od seruma pomoću iscrpljivanja kolone.
Ekstrakcija proteina iz biljnog tkiva
Svježe, meko tkivo biljke, npr mahovina itd može lako poremećen jednostavno stavljanjem uzorka sjeckani materijal u lizirajućem puferu sonikaciju. Otporne, ligenous biljnih tkiva, kao što su sjemenke, jele igle itd, trebaju biti temelj suha. Neki tvrde, drvenaste biljke materijali moraju biti zamrznuta i zemlju u tekućem dušiku prije ekstrahiran pomoću zvučnih valova. Za suspenzije biljke kulture stanica, ultrazvučni tretman između 30 i 150 sekundi, u puferu za lizu je uglavnom dovoljna. Čvršći materijala kao što su sjemenke bundeve zahtijevaju intenzivniji obrada ultrazvukom, kako je opisano u nastavku.
Protokol za ultrazvučno vađenje albumin iz sjemena bundeve
Za ultrazvučno ekstrakciju proteina albumina iz fino mljevenog praha-sjemenki bundeve, 10 g odmašćenu sjemenki bundeve praha i 100 ml deionizirane vode kao otapala se dodaju u staklenu čašu od 250 mL. Ekstrakcija proteina sastoji se u dva koraka: prvo je uzorak se sonificirani sa sondom tipa ultrasonicator Se (400W, 24kHz) s montiran sonotrode S24d7. Staklena posuda se stavi u kupelji s hladnom vodom u ultrazvučnu homogenizaciju. The Postavka ultrasonicator UP400St s priključnim temperaturnim senzorom osigurava da se temperatura uzorka uvijek drži ispod 30 ° C. Preciznom regulacijom temperature tijekom sonikacije izbjegava se denaturacija albumina. Drugo, ekstrakcija je provedena s miješalicom brzinom od 200 okr / min i na 30 ° C. Nakon toga, čaša se prenosi u termostatsku tresilicu. Globulin se uklanja putem dijalize destiliranom vodom. Nakon uklanjanja globulina, ekstrakt proteina može se uzorkovati za određivanje profila albumina i naknadno se podešava na pI = 3,0 upotrebom 0,1 M HCl za koagulaciju albumina. Čvrsta faza se odvoji centrifugiranjem na 5000g, 20 ° C i ponovno otopi u deioniziranoj vodi. Koagulacija albumina vrši se dva puta da se poveća omjer proteina u koncentraciji albumina.
Ultrazvučni ekstrakcije alkalnom proteina za dobivanje koncentrata proteina iz rižine mekinje pokazuje da ultrazvučni tretman rezultira visokom iskorištenju proteina u znatno kraće vrijeme ekstrakcije – u usporedbi s uobičajenim postupcima ekstrakcije.
VialTweeter za neizravno ultrazvučnoj kupelji.
- brz
- visoki prinosi
- vrlo učinkovit
- Precizna kontrola nad parametrima
- ponovljivih rezultata
- linearni skalabilnost
Uzorak protokol priprema za funkcionalnu iNOS enzima
Da bi se dobio potpuno funkcionalan iNOS enzima (na primjer za ispitivanje lijekova), sljedeći protokol Preporučuje: Suspenzija stanica treba staviti na led i sonificira s UP100H na 10 uM amplitude u modu ciklusa od 5 sekundi. ultrazvukom i 25 sek. odmor na ledu. Postupak treba ponoviti cca. 3 puta. Vrijeme odmara između ultrazvukom ciklusa smanjuje porast temperature i stoga će smanjiti rizik od denaturacije.
Ultrazvučno proteina Otapanje
Sonication može ubrzati proces otapanja proteina, što obično zahtijeva nekoliko sati. Kako se ne bi pregrijati uzorak i spriječili razgradnju proteina i izmjene u otopinama koje sadrže ureu, ultrazvučni izboji ne smije trajati duže od nekoliko sekundi.
Opće upute
Kontrola temperature: Kako bi se osiguralo visok prinos proteina bez toplinske denaturacije, temperatura tijekom ekstrakcije mora biti pod kontrolom. Hielscher je stanje-of-art ultrazvučni homogeniziranje – koji se nazivaju i ultrazvučni sitnjenje ili sonificator – su upravo kontrolirati. Oni dolaze s plugable senzor temperature. U mogućnosti podešavanja na ultrazvučni homogenizator, maksimalna temperatura može se namjestiti. Kada se dostigne ta temperatura max je ultrasonicator automatski zaustavlja dok uzorak ne ohladi.
Pufer: Choise od odgovarajućeg pufera i pravo volumenu pufera varira od tkiva do tkiva i mora biti shvaćen-out testiranjem pokušaja i pogreške.
Izolacija / pročišćavanje: Protein lizati mogu sadržavati suvišak biomolekule kao što je DNA ili ugljikohidrata, koji se može ukloniti za taloženje proteina (deoksikolat-trikloroctena kiselina) ili puferskom izmjenom.
Chittapalo i Noomhorm (2009) su izvijestili da iskorištenje protein povećana pomoću zvučnih valova i da ultrazvučni homogenizaciju tkiva i lize proces može poboljšati postojeće postupci ekstrakcije znatno – omogućavanje novih poslovnih mogućnosti za ekstrakciju.
homogenizatorom tkiva ultrazvučni UP200St za učinkovito ekstrakciju proteina
Kontrola preglednik za precizno rad i praćenje procesa ultrazvučnoj
Ultrazvučna oprema za protein ekstrakcija
Hielscher Ultrasonics nudi široki spektar ultrazvučnih homogenizator za dezintegraciju stanica, tkiva, bakterija, mikroorganizama, kvasce i spore.
Hielscher laboratorijski ultrasonicators su snažan i jednostavan za rukovanje. Izgrađen za 24/7 rad, oni su dizajnirani kao robustan i učinkovitih laboratorijskih i klupa-top uređaja. Za sve uređaje, energija izlaz i amplituda može precizno kontrolirati. Široka paleta Pribor otvara daljnje mogućnosti podešavanja. Digitalni uređaji, kao što su VialTweeter, Uf200 ः t, UP200St, i UP400St ima integriranu kontrolu temperature i ugrađeni SD karticu za automatsko snimanje podataka.
Za neizravne, unakrsne kontaminacije-free i istovremenog sonication više uzoraka, nudimo VialTweeter ili Ultrazvučno cuphorn,
Ovisno o vašoj prijavi, materijala i volumena uzorka, mi ćemo vam preporučiti najprikladnije postavke za svoj uzorak prep. Kontaktirajte nas već danas!
Literatura / Reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrazvučni pomoć alkalnog ekstrakciju proteina iz odmašćenu rižine mekinje i svojstva proteinskih koncentrata. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
- Simões, André E. S :; Pereira, Diana M .; Amaral Joana D .; Nunes, Ana F .; Gomes Sofia E .; Rodrigues, Pedro M .; Lo, Adrian C .; D'Hooge Rudi; Upravljati, J .; Clifforda Thibodeau, Stephen N .; Borralho, Pedro M .; Rodrigues, Cecilija gradska policija (2013): Učinkovita Oporavak proteina iz različitih izvora uzoraka nakon TRIZOL ili TRIZOL LS ekstrakciju RNA i dugotrajnog skladištenja. BMC Genomics 2013 14: 181.
Činjenice koje vrijedi znati
proteomika
Proteomika je istraživanje polje koje istražuje proteine i Proteom. Proteini ispunjavaju širok niz vitalnih funkcija unutar organizama. Proteom je cijeli niz proteina eksprimiranih genom, stanice, tkiva, ili organizma u određeno vrijeme. Proteom varira s vremenom i različite zahtjeve, ili stresom, da stanica ili organizam prolazi. Točnije, to je set eksprimiranih proteina u određenom tipu stanice ili organizma, u određenom trenutku, pod određenim uvjetima. Termin je mješavina proteina i genomu. Proteomika je proučavanje proteoma.
Proteina
Proteini su velike biomolekule, tzv makromolekule – koji se sastoje od jednog ili više dugih lanaca aminokiselinskih ostataka. Proteini su prisutni u svim organizmima biljnog i životinjskog podrijetla te su ključni za većinu bioloških funkcija. Budući da proteini sadrže puno bioloških informacija, oni se ekstrahiraju za analitičku svrhu, npr. Za proteomsko istraživanje. Najvažnija funkcija koju provode proteini uključuju katalizu metaboličkih reakcija, replikaciju DNA, odgovor na podražaje i transport molekula s jednog mjesta na drugo. Proteini se međusobno razlikuju prvenstveno u njihovom slijedu aminokiselina, što je diktirano nukleotidnim slijedom njihovih gena i koji obično rezultira skupljanjem proteina u specifičnu trodimenzionalnu strukturu koja određuje njegovu aktivnost. Proteini su – osim peptida – jedan od ključnih komponenti hrane. Dakle, proteomika je moćan alat u prehrambenoj znanosti za optimizaciju procesa, sigurnosti hrane i prehrambene procjene.
elektroforeza u gelu
Gel elektroforeza je glavni način za odvajanje i analizu makromolekula kao što je DNA, RNA i proteina, kao i njihove fragmente, na temelju svoje veličine i naboja. Se koristi u kliničkoj kemiji za odvajanje proteina od punjenja i / ili veličine (IEF agaroze, uglavnom veličina nezavisni) i biokemije, molekularne biologije i proteomike odvojiti mješanu populaciju DNA i RNA fragmenata duljine, za procjenu veličine DNA i RNA fragmenti ili odvajanje proteina od naboja.
stanične kulture
Kultura stanica je kontrolirani uzgoj proces kojim se stanice uzgajane u kontroliranim uvjetima. Uvjeti stanične kulture varirati za svaki stanični tip. Općenito, okolina za kulturu stanica sadrži prikladne posude (npr Petrijevoj zdjelici) sa supstratom ili medij koji opskrbljuje esencijalne hranjive tvari (amino kiseline, ugljikohidrati, vitamini, minerali), faktore rasta, hormone, i plinova (CO2The2), Te regulira fizikalno-kemijsko okruženje (pH pufera, osmotski tlak, temperaturu). Većina stanica treba površinu ili umjetni supstrat, dok druge stanične kulture može uzgajati bez pluta u mediju za kulture (kultura suspenzije, suspenzije stanica).
Masovna kultura staničnih linija životinjskog se koriste u industrijskoj proizvodnji virusnih cjepiva i drugih biotehnološki dobivenih proizvoda. Ljudske matične stanice su kultivirane proširiti broj stanica i razlikovati stanice u različitim tjelesnim tipovima stanica za potrebe transplantacije.
uzorci tkiva
Izraz opisuje tkivo stanični intermedijer, pri čemu je stanica materijal na razini organizacije između stanica i potpuni organa. U tkivu, slične stanice, iz istog podrijetla koji zajedno obavljaju određenu funkciju, su skupi. Do funkcionalnog grupiranja više tkiva, kompleksne strukture organa nastaju.
Tkivo je uzorkovano za istraživanja u biologiji, histologiju / histopatoloških, parazitologija, biokemije, imunohemije kao i njegovati i ekstrakt DNA. Može se razlikovati između životinja (podjele: sisavcu tkiva) i biljnog tkiva. Životinjska tkiva su grupirani u četiri osnovne vrste vezivnog, mišića, živčanog i epitelnog tkiva. Biljno tkivo je podijeljen u sljedeće tri sustava tkiva: epidermu, u prizemlju tkiva i krvnih žila tkiva.
Uzorci tkiva mogu se dobiti iz animalnih ili biljnih dijelova, npr kostiju, mišića, lišće, itd
Tjelesne tekućine
Krv, serum, plazma, cerebrospinalna tekućina, slina i sinovijalnoj tekućini su tjelesne tekućine, koji nude veliki izvor dijagnostički relevantnih informacija. Dakle, sofisticirani priprema uzoraka tjelesnih tekućina za analizu je važno. Prvi je problem povezan sa širokim dinamički raspon komponenata prisutnih u tjelesnim tekućinama.
Određivanje koncentracije proteina
Bradford test, test Lowry i bicinhoninička kiselina (BCA) Test Testovi su uobičajene za određivanje koncentracije proteina. Albumin iz goveđeg seruma (BSA) je jedan od najčešće korištenih standarda proteina.
liza pufera
Pufera mora biti izabran u skladu sa staničnog materijala ili tkiva (biljaka kulture tkiva,, bakterija, gljivica itd), te da li su stanice u strukturi i tipu konstrukcije. Širok raspon lize puferi za ekstrakciju proteina, membrane i organela se formuliraju s jednim ili više sredstava za pranje. Deterdžent obično se odabire putem testova suđenje i pogreške ili – ako je dostupno – skladu s postojećim protokolima za ekstrakciju proteina. Deterdžent mora biti kompatibilan s izvorom tkiva i bjelančevina. Općenito, najblaže deterdžent koji radi za određenu tkiva / proteina, je izabran kako bi se održala maksimalnu funkcionalnost ekstrakta. Nadalje, u slučaju ekstrakcije membrane i organela, blagi deterdžent zadržava membrana netaknut. Obično koriste sredstva za čišćenje u puferi lize uglavnom neionske ili zwitter-iona, npr CHAPS, deoksikolata, Triton ™ X-100, NP40 i Tween 20.
Na primjer, kao što su tkiva mozga, jetre, crijeva, bubrega, slezene, itd može jednostavno puferirana s RIPA – Međutim, inhibitori proteaze i DTT (na primjer za gel elektroforeze) treba uključiti.
Pufera za tkiva kosturnih mišića (ledeno hladan): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) glicerola, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitola i pomiješa s proteazom inhibitora fosfataze koktela
Tablica zajedničkih odbojnika i njihov raspon pH. Općenito, ovi odbojnici normalno koriste pri koncentracijama od 20-50 mM.
| Pufer | raspon pH |
|---|---|
| Limunska kiselina – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| Natrijev citrat – Limunska kiselina | 3,0 – 6,2 |
| Natrijev acetat – octena kiselina | 3,6 – 5,6 |
| kiselina natrijeva sol Cacodylic – Hcl | 5,0 – 7,4 |
| MOJ – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| Natrijev dihidrogen fosfat – dinatrijev hidrogen fosfat | 5,8 – 8,0 |
| imidazola – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| Krpe – Koh | 6,6 – 7,8 |
| trietanolamin hidroklorid – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| tris – Hcl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| Tricina – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| natrij tetraborat – Borna kiselina | 7,6 – 9,2 |
| Bićinama – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| glicin – Naoh | 8,6 – 10,6 |
Većina odbojnika pokazuju pH ovisnost o temperaturi. To posebno vrijedi za Tris pufer. PKa mijenja od 8.06 na 25 ° C do 8,85 na 0 ° C.
(PH i pKa pufera: pH mjeri koncentraciju vodikovih iona u vodenoj otopini pKa (= konstantnu disocijacije kiseline) je povezana, a određenije mjera, da pomaže predvidjeti kako molekule će djelovati na specifičan. pH vrijednost).
Trizola
Trizol je kemijska otopina se koristi za ekstrakciju RNA / DNA / proteina za vrijeme ekstrakcije gvanidinijevog tiocijanat-fenol-kloroformom. Upotreba ultrazvučno potpomognutih TRIZOL ekstrakcijske rezultira visokom DNA, RNA i proteina prinosa od istog uzorka, a odlikuje time druge metode ekstrakcije.