Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz kultura tkiva i stanica
- Ekstrakcija proteina bitan je korak pripreme uzorka u proteomici.
- Proteini se mogu ekstrahirati iz biljnog i životinjskog tkiva, kvasaca i mikroorganizama.
- Sonikacija je pouzdana, učinkovita metoda ekstrakcije proteina koja daje visoke prinose proteina u kratkom vremenu ekstrakcije.
Ekstrakcija proteina iz tkiva i stanica
Ekstrakcija proteina iz tkiva i kultiviranih stanica bitan je korak pripreme uzorka koji se izvodi tijekom mnogih biokemijskih i analitičkih tehnika kao što su ELISA, PAGE, Western blotting, spektrometrija mase ili pročišćavanje proteina. Ultrazvučno razbijanje stanica, liza i ekstrakcija je precizno kontrolirana, netermalna tehnika koja osigurava visoke prinose proteina.
Ekstrakcija proteina iz stanica pomoću ultrazvučna sonda UP200St
- Rapid
- visoki prinosi
- Visoko učinkovit
- Precizna kontrola nad parametrima
- ponovljivi rezultati
- linearna skalabilnost
Opće upute za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina
- Kontrola temperature: Kako bi se osigurao visok prinos proteina bez toplinske denaturacije, potrebno je kontrolirati temperaturu tijekom ekstrakcije. Hielscherovi vrhunski ultrazvučni homogenizatori – također se naziva ultrazvučni dezintegrator ili ultrasonifier – se mogu precizno kontrolirati. Dolaze s priključnim senzorom temperature. U opcijama postavki ultrazvučnog homogenizatora može se postaviti maksimalna temperatura. Kada se postigne ta maksimalna temperatura, ultrazvučni uređaj se automatski zaustavlja dok se uzorak ne ohladi.
- Pufer: Odabir prikladnog pufera i pravog volumena pufera varira od tkiva do tkiva i mora se utvrditi ispitivanjem pokušaja i pogrešaka.
- Izolacija / pročišćavanje: Proteinski lizati mogu sadržavati višak biomolekula kao što su DNA ili ugljikohidrati, koji se mogu ukloniti taloženjem proteina (dezoksikolat-trikloroctena kiselina) ili izmjenom pufera.
Chittapalo i Noomhorm (2009) izvijestili su u svojoj studiji da se prinos proteina povećao korištenjem sonikacije i da ultrazvučna homogenizacija tkiva i proces lize mogu značajno poboljšati postojeće procese ekstrakcije – omogućavajući nove mogućnosti komercijalnog vađenja.
Ultrazvučni CupHorn za simultanu, visoko učinkovitu pripremu višestrukih uzoraka pod istim uvjetima za izolaciju proteina i fragmentaciju DNA.
Ekstrakcija proteina iz životinjskog tkiva
Za pripremu tkiva cijele veličine (npr. bubrega, srca, pluća, mišića itd.), tkivo treba disecirati na vrlo male komadiće čistim alatima, po mogućnosti na ledu, i što je brže moguće kako bi se spriječila razgradnja proteazama (npr. pufer za lizu kao što je RIPA ili hipotonični pufer za lizu koji sadrži koktel inhibitora proteaze i fosfataze). Nakon seciranja, uzorak se uranja u tekući dušik radi brzog zamrzavanja. Uzorak se može pohraniti na -80°C za kasniju upotrebu ili se može držati na ledu za trenutnu homogenizaciju. Neposredno prije ultrazvučne ekstrakcije, ledeno hladni pufer za lizu (s inhibitorima proteaze DTT, leupeptinom i aprotininom) brzo se dodaje u epruvetu s uzorkom (po ~10 mg tkiva preporučuje se približno ~600 μL pufera). Cca. Preporučuje se 20-60 mg tkiva po epruveti s uzorkom.
Ultrazvučna homogenizacija, liza i ekstrakcija izvode se ultrazvučnim homogenizatorom kao što je UP100H ili UP200Ht, opremljenim sonotrodom s mikro vrhom. Trajanje sonikacije je 60-90 sekundi. pri ultrazvučnom ciklusu od 15 sekundi. ultrazvukom i 10 sek. vrijeme odmora. Uzorak treba cijelo vrijeme držati u ledu.
Nakon ultrazvučne homogenizacije / ekstrakcije, lizat se centrifugira na 27 000 g cca. 20 min. Nakon toga se skuplja supernatent, tako da se koncentracija proteina može odrediti proteinskim testom kao što je Pierceov proteinski test BCA.
Ekstrakcija proteina iz krvnog seruma
Za homogenu smjesu seruma i fosfatnog pufera, uzorak se prvo miješa prije ultrazvučne lize stanica. Za ultrazvučnu lizu, uzorak se sonicira ultrazvučnim laboratorijskim homogenizatorom kao što je UP100H tijekom 8 ciklusa pri 20% amplitude, za cikluse od svakih 5 sekundi uključenja i 15 sekundi isključenja. Ekstrakcija proteina provodi se sonikacijom u ciklusima (način pulsiranja) i stavljanjem uzorka na led kako bi se izbjeglo pregrijavanje i toplinska degradacija uzorka. Budući da serum sadrži veliku količinu proteina visoke molekularne težine (kao što su albumin, α1-antitripsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulin G i imunoglobulin A), koji ometaju odvajanje proteina niske molekularne težine tijekom IEF-a, preporučuje se njihovo smanjenje iz seruma pomoću deplecijske kolone.
Ekstrakcija proteina iz biljnog tkiva
Svježe, mekano biljno tkivo, npr. mahovina itd., može se lako poremetiti jednostavnim stavljanjem usitnjenog materijala uzorka u pufer za lizu za sonikaciju. Čvrsta, ligenska biljna tkiva, kao što su sjemenke, iglice jele itd., treba suho samljeti. Neki tvrdi, drvenasti biljni materijali moraju se zamrznuti i samljeti u tekućem dušiku prije ekstrakcije sonikacijom. Za suspenzije kultura biljnih stanica uglavnom je dovoljna ultrazvučna obrada između 30 i 150 sekundi u puferu za lizu. Tvrđi materijali poput sjemenki bundeve zahtijevaju intenzivniju sonikaciju kao što je opisano u nastavku.
Protokol za ultrazvučnu ekstrakciju albumina iz sjemenki bundeve
Za ultrazvučnu ekstrakciju proteina albumina iz praha fino mljevenih sjemenki bundeve, 10 g odmašćenih sjemenki bundeve u prahu i 100 mL deionizirane vode kao otapala dodaju se u staklenu čašu od 250 mL. Ekstrakcija proteina sastoji se od dva koraka: Prvo, uzorak se sonicira ultrazvučni uređaj tipa sonde UP400St (400W, 24kHz) opremljen sonotrodom S24d7. Staklena čaša se tijekom ultrazvučne homogenizacije stavlja u kupelj s hladnom vodom. Priključni senzor temperature i postavke kontrole temperature ultrazvučnog uređaja UP400St osiguravaju da se temperatura uzorka uvijek održava ispod 30°C. Preciznom kontrolom temperature tijekom sonikacije izbjegava se denaturacija albumina. Drugo, ekstrakcija je izvedena mikserom pri brzini od 200 okretaja u minuti i na 30°C. Nakon toga se čaša premjesti u termostatsku mućkalicu. Globulin se uklanja dijalizom destiliranom vodom. Nakon uklanjanja globulina, ekstrakt proteina može se uzorkovati za određivanje profila albumina i zatim se podešava na pI=3,0 upotrebom 0,1 M HCl za koagulaciju albumina. Čvrsta faza se odvoji centrifugiranjem na 5000 g, 20°C i ponovno otopi u deioniziranoj vodi. Albuminska koagulacija se izvodi dva puta kako bi se povećao omjer proteina u albuminskom koncentratu.
Ultrazvučna alkalna ekstrakcija proteina za pripremu proteinskog koncentrata iz rižinih mekinja pokazuje da ultrazvučna obrada rezultira većim prinosom proteina u znatno kraćem vremenu ekstrakcije – u usporedbi s konvencionalnim metodama ekstrakcije.
Protokol pripreme uzorka za funkcionalni iNOS enzim
Za dobivanje potpuno funkcionalnog enzima iNOS (npr. za probir lijekova), preporučuje se sljedeći protokol: suspenziju stanica treba staviti na led i sonicirati s UP100H pri amplitudi od 10 µm u ciklusu od 5 sekundi. ultrazvukom i 25 sek. odmoriti se na ledu. Postupak treba ponoviti cca. 3 puta. Vrijeme mirovanja između ciklusa sonikacije smanjuje porast temperature i stoga će smanjiti rizik od denaturacije.
ultrazvučna solubilizacija proteina
Sonikacija može ubrzati proces solubilizacije proteina, koji obično zahtijeva nekoliko sati. Kako ne bi došlo do pregrijavanja uzorka i spriječile degradaciju proteina i modifikacije u otopinama koje sadrže ureu, ultrazvučni udari ne bi smjeli trajati dulje od nekoliko sekundi.
Ultrazvučni aparat UP200Ht s mikrovrhom od 2 mm S26d2 za sonikaciju malih uzoraka.
Ultrazvučna oprema za ekstrakciju proteina
Hielscher Ultrasonics nudi širok raspon ultrazvučnih homogenizatora za dezintegraciju stanica, tkiva, bakterija, mikroorganizama, kvasca i spora.
Hielscher lab ultrasonicators su snažni i jednostavni za rukovanje. Izgrađeni za rad 24/7, dizajnirani su kao robusni i učinkoviti laboratorijski i stolni uređaji. Za sve uređaje, izlaz energije i amplituda mogu se precizno kontrolirati. Širok raspon dodatne opreme otvara daljnje mogućnosti postavljanja. Digitalni ultrazvučni uređaji kao što su VialTweeter, UP200Ht, UP200St i UP400St imaju integriranu kontrolu temperature i ugrađenu SD karticu za automatsko snimanje podataka.
Za neizravnu, bez unakrsne kontaminacije i simultanu sonikaciju više uzoraka, nudimo VialTweeter ili ultrazvučni CupHorn.
Tablica u nastavku daje vam pregled naših ultrazvučnih uređaja za pripremu uzorka, uništavanje stanica i ekstrakciju. Kliknite na vrstu uređaja kako biste dobili više informacija o svakom ultrazvučnom homogenizatoru. Naše dobro obučeno tehničko osoblje s dugogodišnjim iskustvom rado će vam pomoći u odabiru najprikladnijeg ultrazvučnog uređaja za pripremu uzorka!
| Volumen serije | Protok | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| do 10 bočica ili tuba | na | VialTweeter |
| više jažica / mikrotitarske ploče | na | UIP400MTP |
| više cijevi/posuda | na | kuphorn |
| 1 do 500 ml | 10 do 200 ml/min | UP100H |
| 10 do 1000 ml | 20 do 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml/min | UP400St |
Ovisno o vašoj primjeni, materijalu i volumenu uzorka, preporučit ćemo vam najprikladnije postavke za pripremu uzorka. Kontaktirajte nas danas!
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Hielscher digitalni ultrazvučni uređaji imaju daljinski upravljač preglednika i automatsko protokoliranje podataka na integriranoj SD kartici.
VialTweeter za neizravnu sonikaciju.
Činjenice koje vrijedi znati
proteomika
Proteomika je područje istraživanja koje istražuje proteine i proteome. Proteini ispunjavaju širok niz vitalnih funkcija u organizmu. Proteom je cijeli skup proteina eksprimiranih u genomu, stanici, tkivu ili organizmu u određeno vrijeme. Proteom varira s vremenom i različitim zahtjevima ili stresovima kojima stanica ili organizam prolazi. Točnije, to je skup eksprimiranih proteina u određenom tipu stanice ili organizma, u određeno vrijeme, pod definiranim uvjetima. Pojam je mješavina proteina i genoma. Proteomika je proučavanje proteoma.
protein
Proteini su velike biomolekule, takozvane makromolekule – koji se sastoje od jednog ili više dugih lanaca aminokiselinskih ostataka. Proteini su prisutni u svim organizmima biljnog i životinjskog podrijetla i ključni su za većinu bioloških funkcija. Budući da proteini sadrže mnogo bioloških informacija, ekstrahiraju se u analitičke svrhe, npr. za proteomska istraživanja. Najvažnija funkcija koju obavljaju proteini uključuje katalizu metaboličkih reakcija, replikaciju DNK, odgovor na podražaje i transport molekula s jednog mjesta na drugo. Proteini se međusobno razlikuju prvenstveno po slijedu aminokiselina, koji je određen slijedom nukleotida njihovih gena, a koji obično rezultira savijanjem proteina u specifičnu trodimenzionalnu strukturu koja određuje njegovu aktivnost. Proteini su – osim peptida – jedan od ključnih sastojaka hrane. Stoga je proteomika moćan alat u znanosti o hrani za optimizaciju procesa, sigurnost hrane i procjenu nutritivne vrijednosti.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je predanalitički postupak za odvajanje i predkoncentriranje analita. U kombinaciji s ultrazvučnom obradom, ekstrakcija točke zamućenja može se pojačati čineći proces učinkovitijim, bržim i ekološki prihvatljivijim. Uz ultrazvučnu obradu, ekstrakcija točke zamućenja značajno je učinkovitija metoda pripreme analita. Pročitajte više o ultrazvučno potpomognutoj ekstrakciji zamućenja!Gel elektroforeza
Gel elektroforeza je glavna metoda za odvajanje i analizu makromolekula kao što su DNA, RNA i proteini kao i njihovih fragmenata, na temelju njihove veličine i naboja. Koristi se u kliničkoj kemiji za odvajanje proteina prema naboju i/ili veličini (IEF agaroza, u osnovi neovisna o veličini) i u biokemiji, molekularnoj biologiji i proteomici za odvajanje miješane populacije fragmenata DNA i RNA prema duljini, za procjenu veličine DNA i fragmente RNA ili za razdvajanje proteina nabojem.
stanične kulture
Kultura stanica je kontrolirani proces uzgoja u kojem se stanice uzgajaju u kontroliranim uvjetima. Uvjeti kulture stanica razlikuju se za svaki tip stanice. Općenito, okoliš stanične kulture sastoji se od odgovarajuće posude (npr. Petrijeve zdjelice) sa supstratom ili medijem koji opskrbljuje esencijalne hranjive tvari (aminokiseline, ugljikohidrate, vitamine, minerale), faktore rasta, hormone i plinove (CO2, O2), te regulira fizikalno-kemijsko okruženje (pH pufer, osmotski tlak, temperatura). Većina stanica treba površinu ili umjetni supstrat, dok se druge stanične kulture mogu uzgajati slobodno plutajući u mediju kulture (suspenzijska kultura, stanična suspenzija).
Masovne kulture životinjskih staničnih linija koriste se u industrijskoj proizvodnji virusnih cjepiva i drugih proizvoda dobivenih biotehnološkim putem. Ljudske matične stanice uzgajaju se kako bi se povećao broj stanica i diferencirale u različite tipove somatskih stanica za potrebe transplantacije.
Uzorci tkiva
Pojam tkivo opisuje stanični intermedijer, gdje je stanični materijal na organizacijskoj razini između stanica i kompletnog organa. U tkivu se skupljaju slične stanice, istog podrijetla koje zajedno obavljaju određenu funkciju. Funkcionalnim grupiranjem više tkiva nastaju složene strukture organa.
Tkivo se uzorkuje za istraživanja u biologiji, histologiji/histopatologiji, parazitologiji, biokemiji, imunohistokemiji kao i za kultiviranje i izdvajanje DNK. Može se razlikovati između životinjskog (pododjel: tkivo sisavaca) i biljnog tkiva. Životinjska tkiva su grupirana u četiri osnovne vrste vezivnog, mišićnog, živčanog i epitelnog tkiva. Biljno tkivo je podijeljeno u sljedeća tri sustava tkiva: epidermis, osnovno tkivo i vaskularno tkivo.
Uzorci tkiva mogu se pripremiti iz životinjskih ili biljnih dijelova, npr. kostiju, mišića, lišća itd.
Tjelesne tekućine
Krv, serum, plazma, cerebrospinalna tekućina, slina i sinovijalna tekućina su tjelesne tekućine koje nude veliki izvor dijagnostički relevantnih informacija. Stoga je važna sofisticirana priprema uzoraka tjelesnih tekućina za analizu. Prva poteškoća povezana je sa širokim dinamičkim rasponom komponenti prisutnih u tjelesnim tekućinama.
Određivanje koncentracije proteina
Bradfordov test, Lowryjev test i test bicinhoninske kiseline (BCA) uobičajeni su testovi za određivanje koncentracije proteina. Goveđi serumski albumin (BSA) jedan je od najčešće korištenih proteinskih standarda.
pufer za lizu
Pufer za lizu mora biti odabran u skladu sa staničnim materijalom ili tkivom (kultura tkiva, biljka, bakterija, gljiva itd.), te jesu li stanice u strukturi i tipu strukture. Širok raspon pufera za lizu za ekstrakciju proteina, membrana i organela formuliran je s jednim ili više deterdženata. Deterdžent se obično bira putem testova pokušaja i pogrešaka ili – ako je dostupno – prema postojećem protokolu ekstrakcije proteina. Deterdžent mora biti kompatibilan s izvorom tkiva i proteinima. Općenito, odabire se najblaži deterdžent koji djeluje na određeno tkivo/protein kako bi se održala maksimalna funkcionalnost ekstrakta. Nadalje, u slučaju ekstrakcije membrana i organela, blagi deterdžent održava membranu netaknutom. Često korišteni deterdženti u puferima za lizu uglavnom su neionski ili zwitterionski, npr. CHAPS, deoksikolat, Triton™ X-100, NP40 i Tween 20.
Na primjer, tkiva poput mozga, jetre, crijeva, bubrega, slezene itd. mogu se jednostavno puferirati s RIPA-om – međutim treba uključiti inhibitore proteaze i DTT (npr. za elektroforezu u gelu).
Pufer za lizu za skeletno mišićno tkivo (ledeno hladan): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerola, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitola s dodatkom koktela inhibitora proteaze i fosfataze
Tablica uobičajenih pufera i njihov pH raspon. Općenito, ovi puferi se normalno koriste u koncentracijama od 20-50 mM.
| pufer | pH raspon |
|---|---|
| Limunska kiselina – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natrijev citrat – Limunska kiselina | 3.0 – 6.2 |
| Natrijev acetat – octena kiselina | 3.6 – 5.6 |
| Natrijeva sol kakodilne kiseline – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natrijev dihidrogenfosfat – dinatrijev hidrogen fosfat | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanolamin hidroklorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricin – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Natrijev tetraborat – Borna kiselina | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glicin – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Većina pufera pokazuje pH-ovisnost o temperaturi. Ovo posebno vrijedi za Tris međuspremnike. pKa se mijenja od 8,06 na 25°C do 8,85 na 0°C.
(pH i pKa pufera: pH mjeri koncentraciju vodikovih iona u vodenoj otopini. pKa (= konstanta disocijacije kiseline) je srodna, ali specifičnija mjera, jer pomaže predvidjeti kako će molekula djelovati na određenom pH vrijednost.)
TRIzol
TRIzol je kemijska otopina koja se koristi za ekstrakciju RNA/DNA/proteina tijekom ekstrakcije gvanidinij tiocijanat-fenol-kloroform. Korištenje ultrazvučno potpomognute TRIzol ekstrakcije rezultira visokim prinosima DNA, RNA i proteina iz istog uzorka i time nadmašuje druge metode ekstrakcije.
Literatura/Reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.