Ultrazvučna liza za Western Blotting

  • Western blot je analitički postupak za otkrivanje specifičnih proteina u uzorku homogenata tkiva ili staničnog ekstrakta.
  • Pokrenuti ili Western blot za mjerenje aktivnosti enzima, mnogi testovi zahtijevaju pristup materijalima (na primjer, DNA, proteina substanične fragmenti) uhvaćen u stanici.
  • Sonication je pouzdan i jednostavan za rukovanje metoda za kontrolirano poremećaja stanica i lize.

Ultrazvučno Cell Poremećaj

Ekstrakcija proteina iz tkiva i stanica u kulturi je prvi korak za mnoge bioloških, biokemijskih i analitičke tehnike (PAGE, Western blotting, ELISA, masena spektrometrija, itd) ili pročišćavanje proteina. Da biste dobili visok prinos proteina, stanični materijal i tkiva moraju biti učinkovito poremećen / lizira. Bilo biljne stanice ili životinjskog tkiva, ultrazvukom je metoda za pripremu vaše lizat stanica jednostavno i brzo.

Prednosti ultrazvuka

  • Brzo & učinkovit
  • Jednostavno upravljanje
  • visok prinos proteina
  • ponovljiv / ponovljive
  • precizno kontrolirati
  • skalabilan

Imunotaloženie Protokol za zapadne imunoupijač

A. Reagensi

Za pripravu otopina, koriste pročišćenu vodu kao Milli-Q.

  • 1X fosfatnog pufera (PBS)
  • 1X pufera za lizu stanica: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrijev pirofosfat, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml leupeptina
    Važno: Dodajte 1 mM PMSF neposredno prije uporabe.
  • 15 ul Protein A + 15 ul Protein G je dovoljna za IP, ali to može ovisiti o primarnom antitijela i uzorka volumena. Također koristiti pre-miješani Protein A / G agaroze (na primjer Protein A za kunića IgG povući prema dolje i Protein G za mišji IgG povuče prema dolje)
  • 3X SDS Sample Buffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 na 25 ° C), 6% w / v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0.03% w / v bromfenol plavilo

B. Pripravljanje staničnih lizata

  • Žetve stanica. Za žetvu stanica pod nondenaturing uvjetima, izvadite medij i isprati stanice jednom s ledeno hladnim PBS.
  • Uklanjanje PBS i dodavanje 0,5 ml ledeno hladnog pufera za lizu stanica 1X na svaku ploču (10 cm) i inkubira se ploča na ledu tijekom 5 minuta.
  • Ostrugati stanice s ploče i prijenos za epruvete za mikrocentrifugiranje. Imajte na ledu.
  • Sonificirano je dva puta tijekom 10 sekundi u ledeno hladnog pufera (imunoprecipitacije IP puferom: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 i inhibitora proteaze mix). Za ultrazvučne obrade, VialTweeter ili sonda ultrasonicator poput UP100H ili Uf200 ः t su najprikladniji.
  • Centrifugi lizata na 15,000 g tijekom 10 minuta na 4 ° C.
  • Prijenos supernatant u novu epruvetu. (Ako je potrebno, lizat se može pohraniti na -80 ° C).
  • Dodati primarnog antitijela u supernatant. Supernatant s primarnim protutijelom se inkubira 1 sat pri 4 ° C uz miješanje svjetlosti. Primarna protutijela se dodaje u količini od 10x koncentriraniji od koristi za Western blota. (Vi svibanj početi s 1 | ig po 100 ul.)
  • Supernatant se zatim inkubira dalje sa smjesom jednake količine proteina A-agaroze (Invitrogen) i protein G agarozom za još 1 h.
  • Opere agaroznog Granule tri puta s IP puferom. Nakon toga, ekstrakt proteina vezanih s SDS-PAGE pufera zagrijavanjem na 95 ° C tijekom 5 minuta.

C. Imunoprecipitacija

  • 200 jal uzeti stanični lizat i dodati primarnog protutijela. Inkubirati uz lagano ljulja preko noći na 4 ° C.
  • Dodavanje ili protein A ili G zrnca agaroze (20 ul 50% -tne guste otopine) kuglice. Inkubirati uz lagano ljulja 13 sati na 4 ° C.
  • Mikrocentrifugi tijekom 30 sekundi na temperaturi od 4 ° C. Ispiranje pelete pet puta sa 500 ul pufera za lizu stanica 1X. Imajte na ledu tijekom pranja.
  • Talog se ponovno suspendira s 20 ul 3x SDS pufer za uzorke. Vortex, a zatim Mikrocentrifuga za 30 sekundi.
  • Zagrijavanje uzorka na 95-100 ° C u trajanju od 2-5 minute i mikrocentrifugi tijekom 1 minute pri 14.000 x g.
  • Punjenja uzorka (15-30 ul) na SDS-PAGE gelu (12-15%).
  • Analizirajte uzorka Western blot.

Kontaktirajte nas / zatražite dodatne informacije

Razgovarajte s nama o svojim zahtjevima za obradu. Mi ćemo preporučiti najprikladnije za postavljanje i obrade parametara za svoj projekt.





Molimo, imajte na umu da je pravila o privatnosti,


Više zvučne obrade Protokoli

Western blot analiza s ultrasonicator UP50H

Nakon protokol je korišten u studiji Kriebisch et al. (2011):
Ukupni protein se izolira iz MC3T3-E1 tretirane s 1,25 (OH)2D3 (10-8 M) ili podloga. Stanice su lizirane s puferom koji sadrži 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrijev dodecil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0.5% natrij deoksiholat (Merck). Lizat stanica se zatim sonificira 2 × 10 s pri ciklusu 1 i 80 s amplitude UP50H Ultrazvučni procesor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Njemačka). Zatim je materijal centrifugiran 10 minuta pri 14.000 okretaja u minuti, a supernatant je korišten za Western blot. Dvadeset i pet μg proteina je kuhano u puferu uzorka i reducirajućem agensu (Invitrogen) i zatim razdvojeno SDS-PAGE pomoću 4-12% poliakrilamidnih gela (Invitrogen) i preneseno na nitroceluloznu membranu (GE zdravstvena zaštita). Membrana je blokirana 1 sat s TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) koji sadrži 1% kazein (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Nakon blokiranja, membrana je inkubirana laganim miješanjem preko noći na 4 ° C s primarnim protutijelom (zečji anti-human CBS 1/500, razvijen u laboratoriju prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubacija s konjugiranim sekundarnim protutijelom (Dako) hrena peroksidaze (HPR) provedena je 1 h na sobnoj temperaturi. Svi blotovi su razvijeni pojačanom kemiluminescencijom (Perkin Elmer).

Literatura / Reference

Povezane objave

O Western blot-a

Mrlje su analitički postupci u kojima DNA, RNA i proteina prenose na nosač tako da može razdvojiti.
Southern blot služi za detekciju DNA, Northern blot za RNA i Western blot analizom proteina.
Western blot također naziva protein imunobloting jer je protutijelo koristiti za specifičnu detekciju antigen. Western blot je jedna od najvažnijih metoda analize za otkrivanje specifičnih proteina u uzorku. U Western blot, proteini su imobilizirani na membranama ih detektirati pomoću monoklonskih ili poliklonskih antitijela.
SDS-poliakrilamidnim gel elektroforezom (SDS-PAGE) nativni proteini odvajaju se strukturom 3-D ili denaturiranim proteinima duljinom polipeptida. Proteini se zatim prenose na membranu (obično nitrocelulozu ili PVDF), gdje su obojeni antitijelima specifičnim za ciljni protein. Korak gela elektroforeze uključen je u Western blot analizu kako bi se riješio problem križne reaktivnosti protutijela.
Nakon toga, odvojeni proteini su blotirani na matricu (uglavnom na nitroceluloznoj ili PVDF membrani), gdje su obojeni protutijelima. Antitijela funkcioniraju kao sonda i odabiru se specifično ciljnom proteinu. Analiza mjesta i intenziteta specifične reakcije otkriva pojedinosti ekspresije ciljnih bjelančevina u danom uzorku. Western blotting mogao je otkriti ciljni protein koji je jednako niska kao 1ng zbog visoke rezolucije gel elektroforeze i jake specifičnosti i visoke osjetljivosti imunoanalize. Western blot metoda se koristi u molekularnoj biologiji, biokemiji, imunogenetici i drugim molekularnim istraživačkim poljima.
Ostali slični postupci uključuju dot blot analizu, imunohistokemije i imunocitokemiju gdje se antitijela koriste za detekciju proteina u stanicama tkiva i dobiveni imunobojanjem i imunoenzimnim testa (ELISA).

Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter za ultrazvučno uzorak prep

Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!





Molimo, imajte na umu da je pravila o privatnosti,


Sonication je važan korak za pripravu uzorka

UP200St sa mikro-tip uzorka za sonication