Hielscher Ultrasonics
Bit će nam drago razgovarati o vašem procesu.
Nazovite nas: +49 3328 437-420
Pošaljite nam e-mail: info@hielscher.com

Ultrazvučna liza za Western blotting

  • Western blot je analitički postupak za detekciju specifičnih proteina u uzorku homogenata tkiva ili staničnom ekstraktu.
  • Za provođenje Western blota ili mjerenje aktivnosti enzima, mnogi testovi zahtijevaju pristup materijalima (npr. proteinima, DNK, substaničnim fragmentima) zarobljenim u stanici.
  • Sonikacija je pouzdana i jednostavna metoda za kontrolirano uništavanje i lizu stanica.

Ultrazvučno razbijanje stanica

Ekstrakcija proteina iz tkiva i kultiviranih stanica prvi je korak za mnoge biološke, biokemijske i analitičke tehnike (PAGE, Western blotting, ELISA, masena spektrometrija itd.) ili pročišćavanje proteina. Da bi se dobio visok prinos proteina, stanični materijal i tkivo moraju biti učinkovito poremećeni/lizirani. Bilo da se radi o biljnim stanicama ili životinjskim tkivima, sonikacija je metoda za jednostavnu i brzu pripremu lizata stanica.

Prednosti sonikacije

  • Brzo & Učinkovit
  • Jednostavno rukovanje
  • visok prinos proteina
  • reproducibilan/ponovljiv
  • precizno kontrolirati
  • skalabilan

Zahtjev za informacije




Imajte na umu naše politika privatnosti.




Hielscherov VialTweeter idealan je za lizu višestrukih uzoraka

VialTweeter sonikator za ultrazvučnu pripremu uzoraka kao što je razbijanje stanica i izolacija proteina

Protokol imunoprecipitacije za Western Immunoblotting

A. Reagensi

Za pripremu otopina koristite pročišćenu vodu kao što je Milli-Q.

  • 1x fiziološka otopina puferirana fosfatom (PBS)
  • 1X pufer za lizu stanica: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrijev pirofosfat, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ ml leupeptina
    Važno: Dodajte 1 mM PMSF neposredno prije upotrebe.
  • 15 μl proteina A+15 μl proteina G dovoljno je za IP, ali može ovisiti o vašem primarnom antitijelu i volumenu uzorka. Također možete koristiti prethodno pomiješane proteine A/G agaroze (npr. Protein A za smanjenje zečjeg IgG i Protein G za smanjenje IgG miša)
  • 3X SDS pufer uzorka: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 na 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenol plavo

B. Priprema staničnih lizata

  • Sakupite stanice. Za prikupljanje stanica u nedenaturirajućim uvjetima, uklonite medij i jednom isperite stanice s ledeno hladnim PBS-om.
  • Uklonite PBS i dodajte 0,5 ml ledeno hladnog 1X pufera za lizu stanica u svaku ploču (10 cm) i inkubirajte ploče na ledu 5 minuta.
  • Sastružite stanice s ploča i prenesite ih u mikrocentrifugalne epruvete. Držite na ledu.
  • Sonicirati dvaput po 10 sekundi u ledeno hladnom puferu za imunoprecipitaciju (IP pufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i mješavina inhibitora proteaze). Za sonikaciju, VialTweeter ili sonda ultrasonicator kao što je UP100H ili UP200Ht su najprikladniji.
  • Centrifugirajte lizate na 15 000 g 10 minuta na 4°C.
  • Prenesite supernatant u novu epruvetu. (Ako je potrebno, lizat se može pohraniti na –80°C.)
  • Dodajte primarno antitijelo u supernatant. Supernatant s primarnim antitijelom se inkubira 1 h na 4°C uz lagano miješanje. Primarno antitijelo obično se dodaje u količini 10 puta većoj koncentraciji nego što se koristi za Western blot. (Možete početi s 1 μg na 100 μL.)
  • Supernatant se zatim dalje inkubira sa smjesom jednakih količina proteina A-agaroze (Invitrogen) i proteina G agaroze još 1 sat.
  • Isperite pelete agaroze tri puta s IP puferom. Nakon toga, ekstrahirajte vezane proteine sa SDS-PAGE puferom za punjenje zagrijavanjem na 95°C tijekom 5 minuta.

C. Imunoprecipitacija

  • Uzmite 200 μl lizata stanica i dodajte primarno protutijelo. Inkubirajte uz lagano ljuljanje preko noći na 4°C.
  • Dodajte zrnca proteina A ili G agaroze (20 μl 50% kaše zrna). Inkubirajte uz lagano ljuljanje 1-3 sata na 4°C.
  • Mikrocentrifugirajte 30 sekundi na 4°C. Isperite talog pet puta s 500 µl 1X pufera za lizu stanica. Držite na ledu tijekom pranja.
  • Resuspendirajte talog s 20 μl 3X SDS pufera za uzorke. Promiješajte, zatim mikrocentrifugirajte 30 sekundi.
  • Zagrijte uzorak na 95-100°C 2-5 minuta i mikrocentrifugirajte 1 minutu na 14 000 X g.
  • Stavite uzorak (15-30 μl) na SDS-PAGE gel (12-15%).
  • Analizirajte uzorak Western blotom.

Western Blot analiza sonicatorom UP50H

Sljedeći protokol koji koristi sonikator tipa UP50H korišten je u studiji Kriebisch et al. (2011.):
Homogenizator tipa ultrazvučne sonde UP50H obično se koristi za razbijanje stanica i izolaciju proteina kao korak pripreme uzorka prije Western BlottingaUkupni protein izoliran je iz stanica MC3T3-E1 tretiranih s 1,25(OH)2D3 (10−8 M) ili vozilo. Stanice su lizirane s puferom koji sadrži 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrij dodecil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% natrijevog deoksikolata (Merck). Stanični lizat je sonikiran 2 × 10 s u ciklusu 1 i amplitudi 80 s Ultrazvučni procesor UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Njemačka). Nakon toga materijal je centrifugiran 10 minuta na 14 000 okretaja u minuti, a supernatant je korišten za Western blotting. Dvadeset i pet μg proteina kuhano je u puferu uzorka i redukcijskom sredstvu (Invitrogen) i zatim odvojeno pomoću SDS-PAGE pomoću 4-12% poliakrilamidnih gelova (Invitrogen) i preneseno na nitroceluloznu membranu (GE health care). Membrana je blokirana 1 h s TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) koji sadrži 1% kazeina (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Nakon blokiranja, membrana je inkubirana uz lagano miješanje preko noći na 4°C s primarnim antitijelom (zečji anti-humani CBS 1/500, razvijen u laboratoriju prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, SAD). Inkubacija sa sekundarnim antitijelom konjugiranim s peroksidazom hrena (HPR) (Dako) provedena je 1 sat na sobnoj temperaturi. Sve mrlje razvijene su pojačanom kemiluminiscencijom (Perkin Elmer).
 

Ovaj vodič objašnjava koja je vrsta sonikatora najbolja za vaše zadatke pripreme uzorka kao što su liza, razbijanje stanica, izolacija proteina, fragmentacija DNK i RNK u laboratorijima, analiza i istraživanje. Odaberite idealan tip sonikatora za svoju primjenu, volumen uzorka, broj uzorka i protok. Hielscher Ultrasonics ima idealan ultrazvučni homogenizator za vas!

Kako pronaći savršen sonikator za razbijanje stanica i ekstrakciju proteina u znanosti i analizi

Video sličica

 

Kliknite ovdje da biste pročitali više o najboljim praksama za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju stanica, pripremu lizata i preporuke za poboljšanje procesa!
 
Donja tablica daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja laboratorijske veličine:

Preporučeni uređaji Volumen serije Protok
UIP400MTP sonikator ploča s 96 jažica ploče s više jažica / mikrotitarske ploče na
Ultrazvučni CupHorn CupHorn za bočice ili čaše na
GDmini2 ultrazvučni mikroprotočni reaktor na
VialTweeter 0.5 do 1,5 ml na
UP100H 1 do 500 ml 10 do 200 ml/min
UP200Ht, UP200St 10 do 1000 ml 20 do 200 ml/min
UP400St 10 do 2000 ml 20 do 400 ml/min
Ultrazvučna mućkalica sita na na

Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!

Pitajte za više informacija

Upotrijebite obrazac u nastavku kako biste zatražili dodatne informacije o našim sonikatorima za pripremu uzoraka prije Western Blots-a, detaljne protokole primjene i cijenu. Bit će nam drago razgovarati s vama o procesu pripreme uzorka i ponuditi vam ultrazvučni sustav koji ispunjava vaše zahtjeve!









Imajte na umu naše politika privatnosti.




Mikroploče, ploče s više jažica, PCR pločice i ploče s 96 jažica mogu se udobno i ravnomjerno sonicirati pomoću sonikatora ploča UIP400MTP

Sonikator ploča UIP400MTP za visokoučinkovitu sonikaciju ploča s 96 jažica



O Western Blottingu

Blotovi su analitički postupci u kojima se DNA, RNA i proteini prenose na nosač kako bi se mogli odvojiti.
Southern blot se koristi za detekciju DNA, Northern blot za RNA i Western blot za proteine.
Western blotting također se naziva proteinski imunoblotting jer se antitijelo koristi za specifično otkrivanje njegovog antigena. Western blotting jedna je od najvažnijih metoda analize za otkrivanje specifičnih proteina u uzorku. U Western blotu, proteini su imobilizirani na membranama kako bi se otkrili pomoću monoklonskih ili poliklonskih protutijela.
Elektroforezom u SDS-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) nativni proteini se odvajaju 3-D strukturom ili denaturirani proteini duljinom polipeptida. Proteini se zatim prenose na membranu (obično nitroceluloza ili PVDF), gdje se boje antitijelima specifičnim za ciljni protein. Korak gel elektroforeze uključen je u Western blot analizu kako bi se riješio problem unakrsne reaktivnosti protutijela.
Nakon toga, odvojeni proteini se upijaju na matricu (uglavnom na nitroceluloznoj ili PVDF membrani), gdje se boje antitijelima. Antitijela funkcioniraju kao sonda i odabrana su specifično za ciljni protein. Analiza mjesta i intenziteta specifične reakcije otkriva detalje ekspresije ciljnih proteina u danom uzorku. Western blot bi mogao detektirati ciljni protein koji je samo 1 ng zbog visoke rezolucije gel elektroforeze i jake specifičnosti i visoke osjetljivosti imunološkog testa. Western blot metoda koristi se u molekularnoj biologiji, biokemiji, imunogenetici i drugim područjima molekularnih istraživanja.
Druge srodne tehnike uključuju analizu mrljama, imunohistokemiju i imunocitokemiju gdje se antitijela koriste za otkrivanje proteina u tkivima i stanicama imunološkim bojanjem i enzimski imunoanalizu (ELISA).


Literatura / Reference

Kompletna postavka VialTweetera: VialTweeter sonotroda na ultrazvučnom procesoru UP200St

VialTweeter sonikator za istovremenu pripremu uzorka više bočica

Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!





Imajte na umu naše politika privatnosti.




Sonikacija je važan korak tijekom pripreme uzorka

UP200St s mikro vrhom za sonikaciju uzorka

Bit će nam drago razgovarati o vašem procesu.

Stupimo u kontakt.