Ultrazvučna liza za Western blotting

• Western blot je analitički postupak za detekciju specifičnih proteina u uzorku homogenata tkiva ili staničnom ekstraktu.
• Za provođenje Western blota ili mjerenje aktivnosti enzima, mnogi testovi zahtijevaju pristup materijalima (npr. proteinima, DNK, substaničnim fragmentima) zarobljenim u stanici.
• Sonikacija je pouzdana i jednostavna metoda za kontrolirano uništavanje i lizu stanica.

Ultrazvučno razbijanje stanica

Ekstrakcija proteina iz tkiva i kultiviranih stanica prvi je korak za mnoge biološke, biokemijske i analitičke tehnike (PAGE, Western blotting, ELISA, masena spektrometrija itd.) ili pročišćavanje proteina. Da bi se dobio visok prinos proteina, stanični materijal i tkivo moraju biti učinkovito poremećeni/lizirani. Bilo da se radi o biljnim stanicama ili životinjskim tkivima, sonikacija je metoda za jednostavnu i brzu pripremu lizata stanica.

Prednosti sonikacije

• Brzo & Učinkovit
• Jednostavno rukovanje
• visok prinos proteina
• reproducibilan/ponovljiv
• precizno kontrolirati
• skalabilan

Protokol imunoprecipitacije za Western Immunoblotting

A. Reagensi

Za pripremu otopina koristite pročišćenu vodu kao što je Milli-Q.

• 1x fiziološka otopina puferirana fosfatom (PBS)
• 1X pufer za lizu stanica: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrijev pirofosfat, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ ml leupeptina
  Važno: Dodajte 1 mM PMSF neposredno prije upotrebe.
• 15 μl proteina A+15 μl proteina G dovoljno je za IP, ali može ovisiti o vašem primarnom antitijelu i volumenu uzorka. Također možete koristiti prethodno pomiješane proteine A/G agaroze (npr. Protein A za smanjenje zečjeg IgG i Protein G za smanjenje IgG miša)
• 3X SDS pufer uzorka: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 na 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenol plavo

B. Priprema staničnih lizata

• Sakupite stanice. Za prikupljanje stanica u nedenaturirajućim uvjetima, uklonite medij i jednom isperite stanice s ledeno hladnim PBS-om.
• Uklonite PBS i dodajte 0,5 ml ledeno hladnog 1X pufera za lizu stanica u svaku ploču (10 cm) i inkubirajte ploče na ledu 5 minuta.
• Sastružite stanice s ploča i prenesite ih u mikrocentrifugalne epruvete. Držite na ledu.
• Sonicirati dvaput po 10 sekundi u ledeno hladnom puferu za imunoprecipitaciju (IP pufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i mješavina inhibitora proteaze). Za sonikaciju, VialTweeter ili sonda ultrasonicator kao što je UP100H ili UP200Ht su najprikladniji.
• Centrifugirajte lizate na 15 000 g 10 minuta na 4°C.
• Prenesite supernatant u novu epruvetu. (Ako je potrebno, lizat se može pohraniti na –80°C.)
• Dodajte primarno antitijelo u supernatant. Supernatant s primarnim antitijelom se inkubira 1 h na 4°C uz lagano miješanje. Primarno antitijelo obično se dodaje u količini 10 puta većoj koncentraciji nego što se koristi za Western blot. (Možete početi s 1 μg na 100 μL.)
• Supernatant se zatim dalje inkubira sa smjesom jednakih količina proteina A-agaroze (Invitrogen) i proteina G agaroze još 1 sat.
• Isperite pelete agaroze tri puta s IP puferom. Nakon toga, ekstrahirajte vezane proteine sa SDS-PAGE puferom za punjenje zagrijavanjem na 95°C tijekom 5 minuta.

C. Imunoprecipitacija

• Uzmite 200 μl lizata stanica i dodajte primarno protutijelo. Inkubirajte uz lagano ljuljanje preko noći na 4°C.
• Dodajte zrnca proteina A ili G agaroze (20 μl 50% kaše zrna). Inkubirajte uz lagano ljuljanje 1-3 sata na 4°C.
• Mikrocentrifugirajte 30 sekundi na 4°C. Isperite talog pet puta s 500 µl 1X pufera za lizu stanica. Držite na ledu tijekom pranja.
• Resuspendirajte talog s 20 μl 3X SDS pufera za uzorke. Promiješajte, zatim mikrocentrifugirajte 30 sekundi.
• Zagrijte uzorak na 95-100°C 2-5 minuta i mikrocentrifugirajte 1 minutu na 14 000 X g.
• Stavite uzorak (15-30 μl) na SDS-PAGE gel (12-15%).
• Analizirajte uzorak Western blotom.

Western Blot analiza sonicatorom UP50H

Sljedeći protokol koji koristi sonikator tipa UP50H korišten je u studiji Kriebisch et al. (2011.):
Ukupni protein izoliran je iz stanica MC3T3-E1 tretiranih s 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ili vozilo. Stanice su lizirane s puferom koji sadrži 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrij dodecil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% natrijevog deoksikolata (Merck). Stanični lizat je sonikiran 2 × 10 s u ciklusu 1 i amplitudi 80 s Ultrazvučni procesor UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Njemačka). Nakon toga materijal je centrifugiran 10 minuta na 14 000 okretaja u minuti, a supernatant je korišten za Western blotting. Dvadeset i pet μg proteina kuhano je u puferu uzorka i redukcijskom sredstvu (Invitrogen) i zatim odvojeno pomoću SDS-PAGE pomoću 4-12% poliakrilamidnih gelova (Invitrogen) i preneseno na nitroceluloznu membranu (GE health care). Membrana je blokirana 1 h s TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) koji sadrži 1% kazeina (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Nakon blokiranja, membrana je inkubirana uz lagano miješanje preko noći na 4°C s primarnim antitijelom (zečji anti-humani CBS 1/500, razvijen u laboratoriju prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, SAD). Inkubacija sa sekundarnim antitijelom konjugiranim s peroksidazom hrena (HPR) (Dako) provedena je 1 sat na sobnoj temperaturi. Sve mrlje razvijene su pojačanom kemiluminiscencijom (Perkin Elmer).
 

Kliknite ovdje da biste pročitali više o najboljim praksama za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju stanica, pripremu lizata i preporuke za poboljšanje procesa!
 
Donja tablica daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja laboratorijske veličine:

Literatura / Reference