Ultrazvučna liza za Western blot analizu

• Western blot je analitički postupak za otkrivanje specifičnih proteina u uzorku homogenata tkiva ili staničnog ekstrakta.
• Za provedbu Western blot analize ili mjerenje enzimske aktivnosti mnogi testovi zahtijevaju pristup tvarima (npr. proteinima, DNA, substaničnim fragmentima) zarobljenima u stanici.
• Sonikacija je pouzdana i jednostavna metoda za kontrolirano razaranje stanica i lizu.

Ultrazvučno razaranje stanica

Ekstrakcija proteina iz tkiva i uzgojenih stanica prvi je korak u mnogim biološkim, biokemijskim i analitičkim tehnikama (PAGE, Western blot analiza, ELISA, masena spektrometrija itd.) ili pročišćavanju proteina. Za postizanje visokog prinosa proteina stanični materijal i tkivo moraju se učinkovito razoriti/lizirati. Bilo da je riječ o biljnoj stanici ili životinjskom tkivu, sonikacija je metoda kojom se stanični lizat priprema jednostavno i brzo.

Prednosti sonikacije

• brza i učinkovita
• jednostavna primjena
• visok prinos proteina
• obnovljiva/ponovljiva
• precizno kontrolirana
• skalabilna

Protokol imunoprecipitacije za Western imunoblot analizu

A. Reagensi

Za pripremu otopina upotrebljavajte pročišćenu vodu, primjerice Milli-Q.

• 1X fiziološka otopina puferirana fosfatom (PBS)
• 1X pufer za lizu stanica: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrijeva pirofosfata, 1 mM β-glicerofosfata, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptina
  Važno: dodajte 1 mM PMSF neposredno prije upotrebe.
• 15 μl proteina A+15 μl proteina G dovoljno je za IP, ali to može ovisiti o vašem primarnom protutijelu i volumenu uzorka. Možete upotrijebiti i prethodno pripremljenu smjesu proteina A/G na agarozi (npr. protein A za izdvajanje zečjeg IgG-a i protein G za izdvajanje mišjeg IgG-a)
• 3X SDS pufer za uzorke: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 pri 25°C), 6% w/v SDS-a, 30% glicerola, 150 mM DTT-a, 0,03% w/v bromfenolnog modrila

B. Priprema staničnih lizata

• Prikupite stanice. Za prikupljanje stanica u nedenaturirajućim uvjetima uklonite medij i jednom isperite stanice ledeno hladnim PBS-om.
• Uklonite PBS i dodajte 0,5 ml ledeno hladnog 1X pufera za lizu stanica u svaku ploču (10 cm) te inkubirajte ploče na ledu 5 minuta.
• Ostružite stanice s ploča i prenesite ih u mikrocentrifugalne epruvete. Držite na ledu.
• Sonicirajte dvaput po 10 sekundi u ledeno hladnom puferu za imunoprecipitaciju (IP pufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i smjesa inhibitora proteaza). Za sonikaciju najprikladniji su VialTweeter ili ultrazvučni uređaj sa sondom kao što je UP100H ili UP200Ht .
• Centrifugirajte lizate pri 15.000 g tijekom 10 minuta pri 4°C.
• Prenesite supernatant u novu epruvetu. (Prema potrebi lizat se može čuvati pri –80°C.)
• Dodajte primarno protutijelo u supernatant. Supernatant s primarnim protutijelom inkubira se 1 h pri 4°C uz lagano miješanje. Primarno protutijelo obično se dodaje u 10x većoj koncentraciji nego za Western blot analizu. (Možete započeti s 1μg na 100μL.)
• Supernatant se zatim dodatno inkubira sa smjesom jednakih količina proteina A na agarozi (Invitrogen) i proteina G na agarozi još 1 h.
• Isperite taloge agaroze tri puta IP puferom. Zatim ekstrahirajte vezane proteine puferom za nanošenje uzoraka za SDS-PAGE zagrijavanjem pri 95°C tijekom 5 minuta.

C. Imunoprecipitacija

• Uzmite 200 μl staničnog lizata i dodajte primarno protutijelo. Inkubirajte preko noći pri 4°C uz lagano njihanje.
• Dodajte agarozne kuglice s proteinom A ili G (20 μl 50% suspenzije kuglica). Inkubirajte uz lagano njihanje 1–3 sata pri 4°C.
• Centrifugirajte u mikrocentrifugi 30 sekundi pri 4°C. Isperite talog pet puta s 500 µl 1X pufera za lizu stanica. Tijekom ispiranja držite na ledu.
• Resuspendirajte talog s 20 μl 3X SDS pufera za uzorke. Promiješajte na vorteks-miješalici, zatim centrifugirajte u mikrocentrifugi 30 sekundi.
• Zagrijte uzorak na 95–100°C tijekom 2–5 minuta i centrifugirajte u mikrocentrifugi 1 minutu pri 14.000 X g.
• Nanesite uzorak (15–30 μl) na SDS-PAGE gel (12–15%).
• Analizirajte uzorak Western blot metodom.

Western blot analiza sonikatorom UP50H

Sljedeći protokol sa sonikatorom sa sondom UP50H primijenjen je u istraživanju Kriebisch i sur. (2011):
Ukupni proteini izolirani su iz stanica MC3T3-E1 tretiranih s 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ili nosačem. Stanice su lizirane puferom koji je sadržavao 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrijeva dodecilsulfata (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% natrijeva deoksikolata (Merck). Stanični lizat soniciran je 2 × 10 s uz postavku ciklusa 1 i amplitudu 80 ultrazvučnim procesorom UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Njemačka). Zatim je materijal centrifugiran 10 min pri 14.000 rpm, a supernatant je upotrijebljen za Western blot analizu. Dvadeset pet μg proteina prokuhano je u puferu za uzorke i reducirajućem sredstvu (Invitrogen), a zatim razdvojeno metodom SDS-PAGE uz upotrebu 4–12% poliakrilamidnih gelova (Invitrogen) i preneseno na nitroceluloznu membranu (GE health care). Membrana je blokirana 1 h TBS-om (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) koji je sadržavao 1% kazeina (Sigma-Aldrich) i 1% Trisa (1 M). Nakon blokiranja membrana je inkubirana uz lagano miješanje preko noći pri 4°C s primarnim protutijelom (zečje protutijelo protiv ljudskog CBS-a 1/500, razvijeno u laboratoriju prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, SAD). Inkubacija sa sekundarnim protutijelom konjugiranim s peroksidazom hrena (HPR) (Dako) provedena je tijekom 1 h na sobnoj temperaturi. Svi blotovi razvijeni su pojačanom kemiluminiscencijom (Perkin Elmer).
 

Kliknite ovdje i pročitajte više o najboljim praksama za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju stanica, pripremi lizata i preporukama za poboljšanje postupka!
 
Tablica u nastavku daje okvirni prikaz približnog kapaciteta obrade naših laboratorijskih ultrazvučnih uređaja:

Literatura / Reference

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.