Hielscher ultrazvučna tehnologija

Ultrazvučna liza E. Coli

  • E. coli bakterije su najčešće korišteni bakterija u mikrobiologiji i biotehnologije.
  • Ultrazvučni stanica ometaju pružanje pouzdane i ponovljive rezultate za lizu E. coli.
  • Intenzivne još precizno kontrolirati kavitacije i smične sile dovesti u potpunoj poremećaja i visokim prinosima ekstrakcije proteina (npr, DNA).

Stanica Poremećaji uslijed kavitacije

bakterije Escherichia coli pouzdano liziraju pomoću ultrazvučnih homogeniziranje tkiva.Ultrazvučni sonda tipa homogeniziranje raditi sa cca. 20.000 ciklusa u sekundi (u 20kHz) i izazvati kavitacije u tekućinama ili supsensions. Akustični kavitacije mikroskopske područja vakuum kao tlakovima i visokim temperaturama koje tear stanice pored. Iako temperatura može doći do nekoliko tisuća Celzijevih stupnjeva, količine kavitacije su toliko mali da ne zagrijavaju proces značajno. Ultrazvuk generira akustičnu kavitacije i sile smicanja probiti ili slomiti stanične membrane E. coli – ovisno o postavkama uređaja ultrazvučnog homogenizatora.

Prednosti ultrazvučni za ližu

  • preciznu kontrolu lize (intenzitet, amplituda, temperature)
  • Optimalna privikavanje na određene uzorke
  • kontrola temperature
  • za vrlo male do vrlo velike uzorke (jal na litre)
  • čisti mehanička obrada
  • linearna skala iz laboratorija za proizvodnju
Uređaj ultrazvučni VialTweeter omogućava istovremenu pripremu uzorka do 10 ampule pod jednakim uvjetima postupka. (Kliknite za povećanje!)

VialTweeter za ultrazvučno lize

Zahtjev za informacijama




Primijetite naše pravila o privatnosti,


Dok kemijska i enzymtic lize može biti problematično – jer kemijski lize može promijeniti proteinskih struktura i uvesti probleme pročišćavanje i enzimsku liže zahtijeva puta dugo inkubacije i nije ponovljiv – ultrazvučni poremećaj je sofisticiran, brzo stanica metoda prekida.
Ultrazvučna Lize temelji se samo na mehaničkim snagama. Ne dodaju se kemikalije, sonication razbija stanične zidove po smicanja sile. Kemijska Lize može promijeniti strukturu proteina i uvesti probleme pročišćavanja. enzimski poremećaj zahtijeva dugo vrijeme inkubacije i ne može se ponovno reproducirati.

Opće preporuke

UP400St ultrasonicator s reaktorom za protokSonication je najpopularnija tehnika za ližu vrlo male, srednje i velike količine stanične suspenzije – od piko-litara do 100 L / h (pomoću ultrazvučne stanice protoka). Stanice se liziraju pomoću tekućinske smicanja i kavitacije. DNA također je presječena tijekom ultrazvučne obrade, tako da nije potrebno dodavati DNAsom u staničnu suspenziju.
Kontrola temperature:
Do prije hlađenja uzorka i održavajući uzorak tijekom ultrazvučne obrade na ledu, uzorak toplinske razgradnje uzorka mogu se lako spriječiti.
U idealnom slučaju, uzorci treba držati ledeno hladno tijekom Lize, ali za većinu uzoraka je dovoljno ako se temperatura ne diže iznad temperature kulture ili izvora tkiva. Stoga se preporučuje, kako bi suspenzija na ledu i sonificira s nekoliko kratkih ultrazvukom impulsa od 5-10 sec i pauze od 10-30 sec. Tijekom stanke, toplina se može trošiti kako bi se ponovno uspostavila niska temperatura. Za veće uzorke stanica dostupni su razni reaktori protoka s rashladnim jakni.

Protokoli za pripravu lizati E. coli

Analiza ekspresija i pročišćavanje rekombinantnog proteina

E. coli talog se ozvučuje s ultrazvukom sustavom UP100H (Hielscher). U tu svrhu, stanični talog je resuspendiran u ohlađenom puferu za lizu (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i ohlađen na ledu tijekom 10 minuta. Zatim se suspenzija stanica sonificira s 10 kratkih pucanja od 10 s, nakon čega slijedi interval od 30 s za hlađenje. Konačno, ostatke stanica uklonjene su ultracentrifugiranjem na 4 ° C tijekom 15 minuta pri 14000 rpm. Za potvrđivanje ekspresije rPR, supernatant se izvodi na 12% poliakrilamidnom gelu i analizira SDS-PAGE i Western blot. Pročišćavanje rPR učinjeno je upotrebom Ni2 +-NTA smola (Invitrogen, USA) prema priručniku proizvođača. U ovoj fazi, korištena je izvorni postupak pročišćavanja. Čistoća pročišćenog proteina je određena pomoću elektroforeze na 12% poliakrilamidnom gelu i zatim Coomassie blue bojenjem. Pročišćeni Koncentracija proteina je mjerena pomoću Micro BCA proteinski test kit (Pierce, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultrazvučni stanica disruptor UP100H (100 W) za lizu stanica i poremećaja, DNA smicanja.

ultrazvučni homogenizator UP100H 100W

Rast stanica, Umrežavanje i priprema E. coli ekstrakata

Za SeqA i RNA polimeraze čip-Chip E.coli MG1655 ili MG1655 ΔseqA rastu na 37 ° C do OD600 od oko 0.15 u 50 ml LB (+ 0.2% glukoze) prije nego što se doda 27 ul formaldehida (37%) po ml medija (konačna koncentracija 1%). Umrežavanje je provedeno pri polaganom tresku (100 rpm) pri sobnoj temperaturi tijekom 20 minuta nakon čega je uslijedilo gašenje 10 ml 2,5 M glicina (konačna koncentracija 0.5 M). Za pokuse s toplinskim šokom E. coli MG1655 je uzgojen u 65 ml LB medija na 30 ° C do OD600 od oko 0,3. Zatim se 30 ml kulture prenese u prethodno zagrijanu tikvicu na 43 ° C, a ostatak se drži na 30 ° C. Povezivanje i gašenje je gore opisano, osim što su stanice držane na 30 ili 43 ° C tijekom 5 minuta prije daljnjeg polaganog tresenja na sobnoj temperaturi. Stanice su sakupljene centrifugiranjem i dvaput isprane s hladnim TBS (pH = 7,5). Nakon ponovne suspenzije u 1 ml pufera za lizu (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozima) i inkubacijom na 37 ° C tijekom 30 minuta nakon čega slijedi dodavanje 4 ml IP pufer, stanice su sonicirane na ledu s 12 puta 30 sekundi i 30 sekundi stanki na UP400St ultrazvučni procesor (Ultrasonics Hielscher GmbH) sa 100% snage. Nakon centrifugiranja tijekom 10 minuta na 9000 g, 800 ul aliquotes supernatanta su pohranjeni na -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Prekomjerna i pročišćavanje enzima.

Za hiperprodukcijom decahistidine (His10) tag proteini E. coli BL21 (DE3) transformirane su s pET19b konstrukte. Preko noći Predkulturu se skupi centrifugiranjem, i 1% je korišten za inokuliranje ekspresije kulturu. Stanice su uzgajane nose pET19mgtB pri 22 ° C do optičke gustoće pri 600 nm (OD600) Od 0,7. Je kultura prebačena na 17 ° C i induciraju se 100 uM IPTG. Nakon 16 sati, kultura se prikupi centrifugiranjem na 7500 × g na 4 ° C. Stanice su ponovno suspendirane u 50 mM fosfatno puferirana fiziološka otopina (PBS), s 0,3 M NaCl na pH 7,4 i razoriti s ultrazvukom s S2 mikro vrha sonotrode Na UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Njemačka) na ciklus od 0,5 i amplitudom 75%.
Prekomjerna proizvodnja decahistidine-označeni GtfC izazvana je na 37 ° C pri OD600 0,6 sa 100 uM IPTG. Stanice su zatim inkubirane 4 sata, sakupljene i lizirane kako je naprijed navedeno za MgtB.
Sirovi stanični ekstrakti su centrifugirani na 15,000 x g i 4 ° C da bi se staložio dijelova stanica. Bistre ekstrakti se prebaci u 1 ml HisTrap koloni uz uporabu FF Sirovi sustav ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Enzimi se pročistiti u skladu s protokolom proizvođača za gradijent eluiranja His-označene proteine. Eluirani protein otopine dijalizirane dva puta s 1000 volumena 50 mM PBS, pH 7,4, s 0,3 M NaCl na 4 ° C. Pročišćavanje je analiziran pomoću 12% SDS-PAGE. Koncentracija proteina je određena Bradfordovim postupkom primjenom Roti-Quant (Carl Roth, Karlsruhe GmbH, Njemačka). (Rabausch et al. 2013)

Vađenje proteina iz coli bakterije E.
Mamce protein od interesa (u ovom slučaju, u Arabidopsis thaliana MTV1) je spojena s GST oznaku i eksprimiran u BL21 bakteriji Escherichia coli (E. coli) stanica.
1. uzeti jednu pilulu GST-dao televiziji MTV1 i GST (što odgovara 50 ml bakterijske kulture), te resuspendiraj svaki u 2,5 ml ledeno hladnog pufera za ekstrakciju.
2. Upotrijebi ultrasonicator UP100H (Opremljen s mikrotipom MS3-sonotrode malim količinama (2-5mL)) da bi ometale bakterijskih stanica dok su lizirani, što je označeno sniženim neprozirnost i povećanja viskoznosti. To se mora provesti na ledu, a preporuča se sonificira u intervalima (npr 10 sek ultrazvuka nakon 10 sekundi na ledu i tako dalje). Njega treba poduzeti da ne sonificira s previše visokim intenzitetom. Ako pjenjenja ili formiranje bijelog taloga se otkrije, intenzitet treba biti smanjena.
3. Prijenos liziranih bakterija otopine u 1,5 ml epruvete za mikrocentrifugiranje i centrifugiranjem pri 4 ° C, 16.000 x g tijekom 20 minuta.

Alicin modificirani proteini u E. coli

VialTweeter je udoban ultrasonicator za male uzorke homogenizacijeOdređivanje sadržaja sulfhidril od 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzojeve kiseline) (DTNB) Test
E.coli MG1655 noći kultura koristi se za inokulaciju MOPS minimalni medij (1: 100). Kulturu se uzgaja aerobno dok se postigne A600 0.4. Kultura je podijeljena na tri 15 ml kulture za tretman stresa. Netretiranog kultura služio kao negativna kontrola. 0,79 mM Alicin (128 ml ug-1) Ili 1 mM diamid doda se jedan od dva preostala kultura svaki. Kulture su inkubirane 15 min. 5 ml svake kulture su sakupljene centrifugiranjem (8525 x g, 4 ° C, 10 min). Stanice su isprane dva puta s 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, pohranjeni anaerobno prije upotrebe) i centrifugirani (13.000 x g, 4 ° C, 10 min). Stanice se resuspendiraju u puferu za lizu (PBS s 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) prije prekidanja na 4 ° C ultrasonikom (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Njemačka) (3 x 1 minuta). Stanični debris se peletira pomoću centrifugiranja (13000 x g, 4 ° C, 15 min). Supernatant se prenese u 3,5-mL QS-makro kiveti (10 mm) s magnetskom šipkom za miješanje i pomiješa s 1 ml pufera za lizu. Gašenje uzoraka je praćena na 412 nm pomoću Jasco V-650 spektrofotometra opremljena PSC-718 držač sa kontroliranom temperaturom stanica (Jasco) na sobnoj temperaturi. 100 ul 3 mM ditiobis (2-nitrobenzojeve kiseline) U otopinu se doda. Izumiranje je pratila dok se ne postigne zasićenje. Izračun tiol koncentracije je provedena upotrebom koeficijenta ekstinkcije eAEEA412 = 13,7 tisuća M-1 Cm-1 za tio-2-nitrobenzojeve kiseline (TNB). Stanični tiolni koncentracije su izračunate na temelju volumena stanica E. coli 6.7 x 10-15 litra i uz gustoću stanica od A600 = 0,5 (ekvivalent za 1 × 108 stanica ml-1 kultura). (Muller et al. 2016)

In vivo glutation Određivanje

E. coli MG1655 je odrastao u MOPS minimalnom mediju u ukupnom volumenu od 200ml do jedne A600 od 0,5. Kultura je podijeljena u 50 ml kulture za tretman stresa. Nakon 15 minuta inkubacije s 0,79 mM allicina, 1 mM diamida ili dimetil sulfoksida (kontrola), stanice su sakupljene na 4,000 g na 4 ° C tijekom 10 minuta. Stanice su dvaput isprane s KPE puferom prije resuspenzije peleta u 700 ul KPE pufera. Za deproteinciju dodano je 300 1 10% (w / v) sulfosalicilne kiseline prije prekidanja stanica ultrazvukom (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatanti su sakupljeni nakon centrifugiranja (30 minuta, 13,000g, 4 ° C). Koncentracije sulfosalicilna kiselina smanjene su na 1% dodatkom 3 volumena pufera KPE. Mjerenja ukupnog glutationa i GSSG su izvedeni kao što je gore opisano. Stanične koncentracije glutationa se izračunava na temelju volumena od E. coli stanice 6.7×10-15 litra i uz gustoću stanica od A600 0.5 (ekvivalent za 1×108 stanica ml-1 Kultura). Koncentracije GSH izračunate su oduzimanjem 2 [GSSG] od ukupnog glutationa. (Muller et al. 2016)

Ultrazvučno disruptor za razgradnje stanica i vađenje biološkog materijala (Kliknite za povećanje!)

Sonda tipa ultrasonicator UP400St

Ekspresija ljudskih mAspAT u E. coli

Ultrazvučni stanica disruptor UP400St (400 W) za ekstrakciju intracelularnog tvari (na primjer, proteina organele, DNA, RNA, itd)Jednostrukog kolonija E. coli BL21 (DE3) nose ekspresijski vektor u 30 ml Luria-Bertani (LB) medij koji sadrži 100 ug / ml ampicilina, i zatim su uzgajane na 37ºC do optičke gustoće (OD600) Dosegne 0.6. Stanice su sakupljene centrifugiranjem na 4000 × g tijekom 10 minuta, te ponovno suspendirane u 3L svježem LB mediju koji sadrži 100 ug / ml ampicilina.
Nakon toga, protein ekspresija je inducirana s 1 mM izopropil-p ᴅ-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) kroz 20 sati na 16ºC. Stanice su sakupljene centrifugiranjem na 8000 × g tijekom 15 minuta, te ispere s puferom A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7,4). Približno 45 g (mokra težina) stanice su dobivene od 3 L kulture. Nakon centrifugiranja, talog stanica se resuspendira u 40 ml (1 L), kultura ledeno hladnom ekstrakcijskom puferu A, te lizira ultrazvukom u ledeno hladnoj temperaturi korištenjem UP400St Instrument (dr Hielscher GmbH, Njemačka). Liza stanica je centrifugirana pri 12.000 okretaja u minuti u trajanju od 15 minuta, za odvajanje topljivi (supernatant) i istalože (kuglica) frakcija. (Jiang et al. 2015)

Tablica u nastavku daje vam pokazatelj približne mogućnosti obrade naših ultrazvučnih uređaja:

Batch Volumen Protok Preporučeni uređaji
00,5 do 1,5 ml N.a. VialTweeter
1 do 500 mL 10 do 200 mL / min UP100H
10 do 2000 ml 20 do 400 mL / min Uf200 ः t, UP400St
0.1 do 20L 0.2 do 4L / min UIP2000hdT
10 do 100L 2 do 10 l / min UIP4000
N.a. 10 do 100 l / min UIP16000
N.a. veći grozd UIP16000

Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!

Molimo Vas da koristite obrazac u nastavku, ako želite zatražiti dodatne informacije o ultrazvučnoj homogenizaciji. Rado ćemo vam ponuditi ultrazvučni sustav koji zadovoljava vaše zahtjeve.









Molimo, imajte na umu da je pravila o privatnosti,


Literatura / Reference



Činjenice koje vrijedi znati

E coli

Escherichia coli (E. coli) je gram-negativna, fakultativno anaerobna, štapićna, koliformna bakterija roda Escherichia koja se obično nalazi u donjem crijevu toplokrvnih organizama (endotermi). Postoji veliki broj E. coli sojeva (ili podtipova) s različitim karakteristikama. Većina E. coli sojeva je bezopasna za ljude, npr. B i K-12 sojeve koji se najčešće koriste za istraživanja u laboratorijima. Međutim, neki sojevi su štetni i mogu uzrokovati ozbiljnu bolest.
E. coli igra važnu ulogu u suvremenom biološkom inženjerstvu i industrijske mikrobiologije, jer bakterije lako manipulirati. Uobičajeni laboratorijski aplikacije koje uključuju često korištenje E. coli, na pr stvaranje rekombinantnog deoksiribonukleinske kiseline (DNA), ili djelovati kao modelni organizam.
E. coli je svestran domaćin za proizvodnju heterolognih proteina i mnogostruke proteinski ekspresijski sustavi su dostupni za proizvodnju rekombinantnih proteina u E. coli. Koristeći plazmide koji omogućuju visoke razine ekspresije proteina, geni mogu biti uvedeni u bakterija, što omogućuje za proizvodnju takvih proteina u velikim količinama u industrijskim procesima vrenja.
E.coli se koristi kao ćelija tvornice za proizvodnju inzulina. Daljnje primjene uključuju korištenje modificiranih stanica E. coli za razvoj i proizvodnju cjepiva i imobilizirani enzimi, za proizvodnju biogoriva, kao i za bioobnove.
Soj K-12 je mutantni oblik E. coli koje prekomjerno izražava enzima alkalne fosfataze (ALP). Ova mutacija nastaje zbog oštećenja na genu koji stalno kodovi za enzima. Ako je gen proizvodi proizvod bez inhibicija to je poznato kao konstitutivnog aktivnosti. Ovo specifično mutantni oblik koristi za izolaciju i purifikaciju ALP enzim.

Ultrasonic shearing DNA

Ultrazvučni smične sile su najčešće korištene metode odvojiti od stanica i razbiti lance DNA u komadiće. Akustički kavitacije razgrađuje stanične stijenke i membrane za izdvajanje DNA iz stanica i generirati fragmente oko 600 – 800 bp duljine, što je idealno za analizu.
Kliknite ovdje kako bi naučili više o ultrazvučni homogenizator za DNA fragmentacije!