Ultrazvučna liza bakterije E. Coli

Bakterije E. coli najčešće su korištene bakterije u mikrobiologiji i biotehnologiji.
Ultrazvučni uređaji za razaranje stanica daju pouzdane i ponovljive rezultate pri lizi bakterije E. coli.
Intenzivna kavitacija i smične sile kojima se ipak može precizno upravljati dovode do potpunog razaranja i visokih prinosa ekstrakcije (npr. proteina, DNA).

Zašto je ultrazvučno razaranje stanica E. coli preferirana metoda?

Ultrazvučni homogenizatori ili ultrazvučni uređaji sa sondom nude nekoliko prednosti za lizu bakterije E. coli jer intenzivan ultrazvuk učinkovito razara stanične stijenke i membrane. Ultrazvučni uređaji sa sondom široko se primjenjuju za lizu bakterije E. coli iz sljedećih razloga:

Učinkovito razaranje staničnih stijenki: E. coli ima polukrutu staničnu stijenku sastavljenu od peptidoglikana, koju može biti teško razgraditi tradicionalnim metodama lize. Ultrazvučni uređaj sa sondom stvara intenzivne ultrazvučne valove koji stvaraju kavitacijske mjehuriće u tekućini koja okružuje stanice. Kada ti mjehurići kolabiraju, stvaraju brze mlazove tekućine i udarne valove koji dovode do mehaničkog razaranja staničnih stijenki, učinkovito oslobađajući stanični sadržaj poput biomolekula.

Poboljšano prodiranje: Ultrazvučni valovi koje stvara sonda / sonotroda mogu prodrijeti duboko u uzorak, dosežući veći broj stanica E. coli i ravnomjerno ih obrađujući. To pomaže osigurati ujednačeniju lizu u cijelom uzorku, što rezultira većom učinkovitošću razaranja stanica.

Kraće vrijeme obrade: Energija koju isporučuje ultrazvučni uređaj sa sondom izrazito je koncentrirana i lokalizirana, što dovodi do brze i učinkovite lize stanica. U usporedbi s drugim metodama poput razaranja kuglicama ili enzimske lize, sonikacijom se liza bakterije E. coli može postići u roku od nekoliko minuta ili čak sekundi. Dok mnoge alternativne tehnike, poput zamrzavanja i odmrzavanja, zahtijevaju nekoliko ciklusa obrade, ultrazvučna liza otvara stanice u jednom procesnom koraku.

Kontrola temperature: Najsuvremeniji ultrazvučni uređaji opremljeni su temperaturnim senzorima i pametnim softverom koji omogućuje postavljanje maksimalne procesne temperature. Ultrazvučni uređaj automatski se zaustavlja kada se dosegne granična temperatura i pokreće postupak sonikacije kada se dosegne zadana temperatura. Hlađenje uzoraka u ledenoj kupelji jednostavna je metoda za održavanje niske temperature uzorka i sprječavanje toplinski uzrokovane razgradnje uzorka.

Mogućnost povećanja opsega: Ultrazvučni uređaji sa sondom dostupni su u različitim veličinama, od ručnih uređaja do velikih industrijskih modela. Zbog toga su prikladni za obradu malih volumena u laboratoriju ili za povećanje opsega za veće primjene u bioprocesiranju, npr. proizvodnju cjepiva ili biosintezu molekula.

Svestranost: Ultrazvučni uređaji mogu se koristiti za različite primjene osim lize stanica, poput fragmentacije DNA smičnim silama, ekstrakcije proteina, homogenizacije tkiva, dispergiranja nanočestica i emulgiranja. Stoga ulaganje u ultrazvučni uređaj sa sondom omogućuje svestranu primjenu u istraživačkom ili industrijskom okruženju.

Ultrazvučni uređaji sa sondom, poput UP200St, pouzdani su homogenizatori tkiva i uređaji za razaranje stanica te se stoga široko upotrebljavaju za pripremu uzoraka u genetici, primjerice za lizu bakterije E.coli

Ekstrakcija proteina iz stanica E.coli učinkovito se provodi pomoću ultrazvučne sonde UP200St

Ultrazvučni uređaj sa sondom nudi mnoge prednosti za lizu bakterije E. coli. Pouzdana i precizna kontrola parametara ultrazvučnog procesa omogućuje optimizaciju radnih parametara poput snage, trajanja i rukovanja uzorkom radi postizanja željenih rezultata.

Ovaj vodič objašnjava koja je vrsta sonikatora najprikladnija za vaše postupke pripreme uzoraka, poput lize, razaranja stanica, izolacije proteina te fragmentacije DNA i RNA u laboratorijima, analitici i istraživanju. Odaberite idealnu vrstu sonikatora za svoju primjenu, volumen i broj uzoraka te kapacitet obrade. Hielscher Ultrasonics ima idealan ultrazvučni homogenizator za vas!

Ultrazvučna fragmentacija DNA često se upotrebljava kao korak pripreme uzoraka u sekvenciranju sljedeće generacije (NGS)

Elektroforetske analize genomske DNA bakterije E. coli EDL933 podvrgnute ultrazvučnoj obradi u trajanju od 0 – 15 min. L označava DNA ljestvicu.
(studija i slika: ©Basselet et al. 2008)

Razaranje stanica ultrazvučnom kavitacijom

Ultrazvučni homogenizatori sa sondom rade s približno 20.000 ciklusa u sekundi (pri 20kHz) i uzrokuju kavitaciju u tekućinama ili suspenzijama. Akustička kavitacija stvara mikroskopska područja s tlakovima nalik vakuumu i visokim temperaturama koja razaraju stanice. Iako temperature mogu doseći nekoliko tisuća stupnjeva Celzija, kavitacijski su volumeni toliko mali da ne zagrijavaju proces u značajnoj mjeri. Akustička kavitacija i smične sile koje stvara ultrazvuk perforiraju ili razbijaju staničnu membranu bakterijskih stanica kao što je E.coli. Hielscher ultrazvučni uređaji omogućuju preciznu kontrolu procesnih parametara kao što su intenzitet ultrazvuka, amplituda, unos energije i temperatura. Time se proces ultrazvučne lize može optimalno prilagoditi vrsti stanica, staničnoj kulturi i cilju procesa.

Prednosti ultrazvučne lize

precizna kontrola lize (intenzitet, amplituda, temperatura)
pouzdani, reproducibilni rezultati
optimalna prilagodba specifičnim uzorcima
kontrola temperature
za vrlo male do vrlo velike uzorke (od µL do litara)
isključivo mehanička obrada
jednostavan i siguran rad
linearno povećanje mjerila od laboratorija do proizvodnje

Ultrazvučni uređaj VialTweeter omogućuje istodobnu pripremu uzoraka u do 10 bočica pod istim procesnim uvjetima. (Kliknite za povećanje!)

VialTweeter za ultrazvučnu lizu

Ultrazvučni homogenizator u usporedbi s drugim tehnikama lize

Dok kemijska i enzimska liza mogu biti problematične – jer kemijska liza može promijeniti strukture proteina i uzrokovati probleme pri pročišćavanju, a enzimska liza zahtijeva duga vremena inkubacije i nije reproducibilna – ultrazvučno razaranje sofisticirana je i brza metoda razaranja stanica.
Ultrazvučna liza temelji se isključivo na mehaničkim silama. Ne dodaju se kemikalije, a sonikacija razbija staničnu stijenku smičnim silama. Kemijska liza može promijeniti strukturu proteina i uzrokovati probleme pri pročišćavanju. Enzimsko razaranje zahtijeva duga vremena inkubacije i nije reproducibilno. Ultrazvučno razaranje stanica bakterije E.coli brzo je, jednostavno, pouzdano i reproducibilno. Zato se Hielscher ultrazvučni uređaji upotrebljavaju u biološkim i biokemijskim laboratorijima diljem svijeta za pripremu uzoraka, predanalitiku, in vitro dijagnostiku i raznovrsna ispitivanja.

Opće preporuke za ultrazvučnu lizu

Sonikacija je najpopularnija tehnika za lizu vrlo malih, srednjih i velikih količina staničnih suspenzija – od pikolitara do 100L/hr (uz upotrebu ultrazvučne protočne ćelije). Stanice se liziraju smičnim djelovanjem tekućine i kavitacijom. Tijekom sonikacije i DNA se fragmentira smičnim djelovanjem pa staničnoj suspenziji nije potrebno dodavati DNazu.

Kontrola temperature tijekom ultrazvučne lize E.coli
Prethodnim hlađenjem uzorka i njegovim držanjem na ledu tijekom sonikacije lako se može spriječiti toplinska razgradnja uzorka.
U idealnom slučaju uzorke tijekom lize treba držati hladnima poput leda, no za većinu je uzoraka dovoljno da temperatura ne poraste iznad temperature kulture ili izvornog tkiva. Stoga se preporučuje držati suspenziju na ledu i provoditi sonikaciju s nekoliko kratkih ultrazvučnih impulsa od 5–10 sec i stankama od 10–30 sec. Tijekom stanki toplina se može odvesti kako bi se ponovno uspostavila niska temperatura. Za veće uzorke stanica dostupni su različiti reaktori s protočnim ćelijama i rashladnim plaštevima.
Ovdje pročitajte detaljne savjete i preporuke za uspješnu ultrazvučnu lizu!

Protokoli za ultrazvučnu pripremu lizata E. coli

Istraživači upotrebljavaju Hielscher ultrazvučne homogenizatore za razaranje stanica E.coli. U nastavku možete pronaći različite ispitane i dokazane protokole za lizu E.coli primjenom Hielscher ultrazvučnih homogenizatora za različite primjene povezane s E. coli.

Rast stanica, umrežavanje i priprema staničnih ekstrakata E. coli primjenom ultrazvuka

Za ChIP-Chip analizu proteina SeqA i RNA-polimeraze E. coli MG1655 ili MG1655 ΔseqA uzgajana je pri 37°C do OD₆₀₀ od približno 0,15 u 50 ml LB medija (+ 0,2% glukoze) prije dodavanja 27 μl formaldehida (37%) po ml medija (konačna koncentracija 1%). Umrežavanje je provedeno uz polagano protresanje (100 rpm) na sobnoj temperaturi tijekom 20 min, nakon čega je reakcija zaustavljena dodavanjem 10 ml 2,5 M glicina (konačna koncentracija 0,5 M). Za pokuse toplinskog šoka E. coli MG1655 uzgajana je u 65 ml LB medija pri 30°C do OD₆₀₀ od približno 0,3. Zatim je 30 ml kulture preneseno u prethodno zagrijanu tikvicu pri 43°C, a ostatak je zadržan pri 30°C. Umrežavanje i zaustavljanje reakcije provedeni su kako je gore opisano, osim što su stanice držane pri 30 ili 43°C tijekom 5 min prije daljnjeg polaganog protresanja na sobnoj temperaturi. Stanice su prikupljene centrifugiranjem i dvaput isprane hladnim TBS-om (pH7.5). Nakon resuspendiranja u 1 ml pufera za lizu (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozima) i inkubacije pri 37°C tijekom 30 min te naknadnog dodavanja 4 ml IP pufera, stanice su sonikirane na ledu 12 puta po 30 sec uz stanke od 30 sec s pomoću ultrazvučnog procesora Hielscher UP400St pri postavci snage od 100%. Nakon centrifugiranja tijekom 10 min pri 9000 g, alikvoti supernatanta od 800 μl pohranjeni su pri -20°C. (Waldminghaus 2010)

Prekomjerna proizvodnja i pročišćavanje enzima ultrazvučnom sondom

Za prekomjernu proizvodnju proteina označenih dekahistidinskom oznakom (His10), E. coli BL21(DE3) transformirana je konstruktima pET19b. Prekultura uzgajana preko noći prikupljena je centrifugiranjem, a 1% upotrijebljen je za inokulaciju kulture za ekspresiju. Stanice koje su nosile pET19mgtB uzgajane su pri 22°C do optičke gustoće pri 600 nm (OD600) od 0,7. Kultura je prenesena na 17°C, a ekspresija je inducirana sa 100 μM IPTG-a. Nakon 16 h kultura je prikupljena centrifugiranjem pri 7.500 × g i 4°C. Stanice su resuspendirane u 50 mM fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatom (PBS) s 0,3 M NaCl pri pH 7,4 i razorene sonikacijom s pomoću sonotrode S2 s mikrovrhom na ultrazvučnom uređaju Hielscher UP200St uz ciklus od 0,5 i amplitudu od 75%.
Prekomjerna proizvodnja GtfC-a označenog dekahistidinskom oznakom inducirana je pri 37°C i OD₆₀₀ od 0,6 sa 100 μM IPTG-a. Stanice su zatim inkubirane tijekom 4 h, prikupljene i lizirane kako je gore navedeno za MgtB.
Sirovi stanični ekstrakti centrifugirani su pri 15.000 × g i 4°C radi taloženja staničnih ostataka. Izbistreni ekstrakti naneseni su na kolone HisTrap FF Crude od 1 ml s pomoću sustava ÄKTAprime Plus. Enzimi su pročišćeni prema protokolu proizvođača za gradijentnu eluciju proteina s His-oznakom. Eluirane otopine proteina dvaput su dijalizirane prema 1.000 volumena 50 mM PBS-a, pH 7,4, s 0,3 M NaCl pri 4°C. Pročišćavanje je analizirano 12% SDS-PAGE-om. Koncentracija proteina određena je Bradfordovom metodom uz uporabu proizvoda Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz bakterija E. coli
Protein mamac od interesa (u ovom slučaju MTV1 iz Arabidopsis thaliana) fuzionira se s GST-oznakom i eksprimira u stanicama Escherichia coli (E. coli) BL21.

Uzmite po jedan talog GST-MTV1 i GST (koji odgovara 50 ml bakterijske kulture) i svaki resuspendirajte u 2,5 mL ledeno hladnog pufera za ekstrakciju.
Upotrijebite ultrazvučni uređaj UP100H (opremljen sonotrodom MS3 s mikrovrhom za male volumene od približno 2–5mL) za razaranje bakterijskih stanica sve dok ne budu lizirane, na što upućuju smanjena neprozirnost i povećana viskoznost. Postupak se mora provoditi na ledu, a preporučuje se sonikacija u intervalima (npr. 10 sec sonikacije nakon čega slijedi stanka od 10 sec na ledu i tako dalje). Potrebno je paziti da intenzitet sonikacije ne bude previsok. Ako se primijeti pjenjenje ili stvaranje bijelog taloga, intenzitet treba smanjiti.
Prenesite otopinu liziranih bakterija u mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 mL i centrifugirajte pri 4°C i 16.000 x g tijekom 20 min.

Ultrazvučne sonde upotrebljavaju sile akustičke kavitacije za razaranje stanica te ekstrakciju molekula i DNA iz bakterije E.coli.

Ultrazvučni uređaji sa sondom poput uređaja UP400St primjenjuju načelo djelovanja akustične kavitacije za učinkovitu lizu E.coli.

Analiza ekspresije i pročišćavanje rekombinantnog proteina sonikacijom

Talog stanica E. coli soniciran je Hielscher ultrazvučnim uređajem UP100H. U tu je svrhu stanični talog resuspendiran u ohlađenom puferu za lizu (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i hlađen na ledu 10 min. Zatim je stanična suspenzija sonicirana s 10 kratkih impulsa u trajanju od 10 s, uz interval od 30 s za hlađenje nakon svakog impulsa. Na kraju su stanični ostaci uklonjeni ultracentrifugiranjem pri 4°C tijekom 15 min pri 14.000 rpm. Za potvrdu ekspresije rPR-a supernatant je podvrgnut elektroforezi na 12% poliakrilamidnom gelu i analiziran metodama SDS-PAGE i Western blot. Pročišćavanje rPR-a provedeno je smolom Ni2+-NTA (Invitrogen, SAD) prema uputama proizvođača. U ovoj je fazi primijenjena metoda pročišćavanja u nativnim uvjetima. Čistoća pročišćenog proteina procijenjena je elektroforezom na 12% poliakrilamidnom gelu i naknadnim bojenjem bojilom Coomassie blue. Koncentracija pročišćenog proteina izmjerena je kompletom Micro BCA za određivanje proteina (PIERCE, SAD). (Azarnezhad et al. 2016)

Ovaj video prikazuje ultrazvučnu čašastu sonotrodu snage 200 vata za dispergiranje, homogenizaciju, ekstrakciju ili otplinjavanje laboratorijskih uzoraka.

Ultrazvučni homogenizatori za lizu E. coli

Hielscher Ultrasonics projektira, proizvodi i isporučuje ultrazvučne homogenizatore visokih performansi za pouzdanu i učinkovitu lizu bakterija E. coli i drugih vrsta stanica, tkiva i staničnih kultura.
Širok portfelj ultrazvučnih sondi i sustava za neizravnu sonikaciju omogućuje nam da vam ponudimo idealan ultrazvučni homogenizator tkiva za vašu primjenu razaranja stanica i ekstrakcije.

Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj

Hielscher ultrazvučni uređaji poznati su po najvišim standardima kvalitete i dizajna. Pametan softver, intuitivan izbornik, programabilne postavke i automatsko bilježenje podataka samo su neke od značajki Hielscher ultrazvučnih uređaja. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju jednostavnu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u istraživačke i biotehnološke ustanove. Hielscher ultrazvučni uređaji lako se nose čak i s teškim uvjetima i zahtjevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics tvrtka je s ISO certifikatom i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne uređaje visokih performansi koji se odlikuju najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnošću upotrebe. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji sukladni su s CE zahtjevima i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Tablica u nastavku daje pregled približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja:

Volumen šarže	Protok	Preporučeni uređaji
ploče s više jažica / mikrotitarske ploče	n.a.	UIP400MTP
CupHorn za bočice ili laboratorijsku čašu	n.a.	Ultrazvučni CupHorn
ultrazvučni mikroprotočni reaktor	n.a.	GDmini2
do 10 bočica s 0,5 do 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 do 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 do 500mL	10 do 200mL/min	UP100H
10 do 2000mL	20 do 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 do 20L	0,2 do 4L/min	UIP2000hdT
10 do 100L	2 do 10L/min	UIP4000
n.a.	10 do 100L/min	UIP16000
n.a.	veći	skup uređaja UIP16000

Obratite nam se! / Pitajte nas!

Video prikazuje sustav za ultrazvučnu pripremu uzoraka UIP400MTP, koji omogućuje pouzdanu pripremu uzoraka u svim standardnim pločicama s više jažica primjenom ultrazvuka visokog intenziteta. Tipične primjene uređaja UIP400MTP uključuju lizu stanica, fragmentaciju DNA, RNA i kromatina te ekstrakciju proteina.

Dodatni protokoli za ultrazvučnu lizu E. coli

Proteini modificirani alicinom u E. coli uz upotrebu ultrazvučnog uređaja VialTweeter

Određivanje sadržaja sulfhidrilnih skupina testom s 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzojevom kiselinom) (DTNB)
Prekonoćna kultura E. coli MG1655 upotrijebljena je za inokulaciju minimalnog medija MOPS (1:100). Kultura je uzgajana u aerobnim uvjetima dok nije postignut A600 od 0,4. Kultura je podijeljena na tri kulture od 15 ml za tretman stresom. Netretirana kultura služila je kao negativna kontrola. U jednu od preostalih dviju kultura dodan je 0,79 mM alicin (128 μg ml-1), a u drugu 1 mM diamid. Kulture su inkubirane 15 min. Iz svake je kulture centrifugiranjem prikupljeno 5 ml (8.525 × g, 4°C, 10 min). Stanice su dvaput isprane s 1 ml PBS-a (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, čuvanog u anaerobnim uvjetima prije upotrebe) i centrifugirane (13.000 × g, 4°C, 10 min). Stanice su resuspendirane u puferu za lizu (PBS sa 6 mM gvanidinijeva klorida, pH 7,4) prije razaranja pri 4°C ultrazvučnom obradom (VialTweeter ultrazvučni uređaj, Hielscher GmbH, Njemačka) (3 × 1 min). Stanični ostaci istaloženi su centrifugiranjem (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant je prenesen u QS-makrokivetu volumena 3,5 ml (10 mm) s magnetskim štapićem za miješanje te pomiješan s 1 ml pufera za lizu. Apsorbancija uzoraka praćena je pri 412 nm spektrofotometrom Jasco V-650 opremljenim temperaturno reguliranim držačem kiveta PSC-718 pri sobnoj temperaturi. Dodano je 100μl otopine 3 mM ditiobis(2-nitrobenzojeve kiseline). Apsorbancija je praćena do zasićenja. Koncentracija tiola izračunata je primjenom ekstinkcijskog koeficijenta ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 za tio-2-nitrobenzojevu kiselinu (TNB). Stanične koncentracije tiola izračunate su na temelju volumena stanica E. coli od 6,7 × 10^-15 litara i gustoće stanica A600 = 0,5 (što odgovara 1 × 10⁸ stanica ml^-1 kulture). (Müller et al. 2016)

Određivanje glutationa in vivo ultrazvučnim razaračem stanica

E.coli MG1655 uzgajana je u minimalnom mediju MOPS u ukupnom volumenu od 200ml dok nije dosegnuta vrijednost A600 od 0,5. Kultura je podijeljena na kulture volumena 50 ml za tretman stresom. Nakon 15 min inkubacije s 0,79 mM alicina, 1 mM diamida ili dimetil sulfoksidom (kontrola), stanice su prikupljene centrifugiranjem pri 4.000g i 4°C tijekom 10 min. Stanice su dvaput isprane puferom KPE prije resuspendiranja taloga u 700µl pufera KPE. Za deproteinizaciju dodano je 300l 10% (w/v) sulfosalicilne kiseline prije razaranja stanica sonikacijom (3 x 1 min; VialTweeter ultrazvučni uređaj). Supernatanti su prikupljeni nakon centrifugiranja (30 min, 13.000g, 4°C). Koncentracije sulfosalicilne kiseline smanjene su na 1% dodavanjem 3 volumena pufera KPE. Mjerenja ukupnog glutationa i GSSG-a provedena su kako je prethodno opisano. Stanične koncentracije glutationa izračunate su na temelju volumena stanica E. coli od 6,7×10^-15 litara i gustoće stanica A600 0,5 (što odgovara 1×10⁸ stanica ml^-1 kulture). Koncentracije GSH-a izračunate su oduzimanjem 2[GSSG] od ukupnog glutationa. (Müller et al. 2016)

Ekspresija ljudskog mAspAT-a u E. coli uz primjenu ultrazvučnog homogenizatora

Pojedinačna kolonija E. coli BL21 (DE3) s ekspresijskim vektorom unesena je u 30 mL medija Luria-Bertani (LB) koji je sadržavao 100μg/mL ampicilina, a zatim je uzgajana pri 37ºC dok optička gustoća (OD₆₀₀) nije dosegnula 0,6. Stanice su prikupljene centrifugiranjem pri 4.000 × g tijekom 10 min i resuspendirane u 3L svježeg medija LB koji je sadržavao 100μg/mL ampicilina.
Zatim je ekspresija proteina inducirana s 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) tijekom 20 h pri 16ºC. Stanice su prikupljene centrifugiranjem pri 8.000 × g tijekom 15 min i isprane puferom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Iz 3 L kulture dobiveno je približno 45g stanica (mokra masa). Nakon centrifugiranja stanični talozi resuspendirani su u 40 mL (za 1 L kulture) ledeno hladnog ekstrakcijskog pufera A te lizirani sonikacijom pri ledeno hladnoj temperaturi primjenom Hielscher ultrazvučnog razarača stanica UP400St. Stanični lizat centrifugiran je pri 12.000 rpm tijekom 15 min kako bi se odvojile topljive (supernatant) i istaložene (talog) frakcije. (Jiang et al. 2015)

Povezane teme

Korisne činjenice

E.coli

Escherichia coli (E. coli) je gram-negativna, fakultativno anaerobna, štapićasta, koliformna bakterija roda Escherichia koja se uobičajeno nalazi u donjem dijelu crijeva toplokrvnih organizama (endoterma). Postoji velik broj sojeva (ili podtipova) bakterije E. coli s različitim svojstvima. Većina sojeva bakterije E. coli bezopasna je za ljude, primjerice sojevi B i K-12, koji se često upotrebljavaju za istraživanja u laboratorijima. Međutim, neki su sojevi štetni i mogu uzrokovati ozbiljne bolesti.
E. coli ima važnu ulogu u suvremenom biološkom inženjerstvu i industrijskoj mikrobiologiji jer je tom bakterijom lako manipulirati. Uobičajene laboratorijske primjene u kojima se često upotrebljava E. coli uključuju, primjerice, stvaranje rekombinantne deoksiribonukleinske kiseline (DNA) ili njezinu uporabu kao modelnog organizma.
E. coli vrlo je svestran domaćin za proizvodnju heterolognih proteina, a za proizvodnju rekombinantnih proteina u bakteriji E. coli dostupni su brojni sustavi za ekspresiju proteina. S pomoću plazmida koji omogućuju visoku razinu ekspresije proteina u bakterije se mogu unijeti geni, što omogućuje proizvodnju tih proteina u velikim količinama u industrijskim procesima fermentacije.
Bakterije E.coli upotrebljavaju se kao stanične tvornice za proizvodnju inzulina. Daljnje primjene uključuju uporabu modificiranih stanica bakterije E. coli za razvoj i proizvodnju cjepiva i imobiliziranih enzima, proizvodnju biogoriva te bioremedijaciju.
Soj K-12 mutantni je oblik bakterije E. coli koji prekomjerno eksprimira enzim alkalnu fosfatazu (ALP). Ta mutacija nastaje zbog oštećenja gena koji stalno kodira taj enzim. Ako gen proizvodi produkt bez ikakve inhibicije, to se naziva konstitutivnom aktivnošću. Taj specifični mutantni oblik upotrebljava se za izolaciju i pročišćavanje enzima ALP.
Bakterije E. coli također se široko upotrebljavaju kao stanične tvornice. Inženjerski izmijenjeni mikroorganizmi (npr. bakterije) i biljne stanice mogu se upotrebljavati kao takozvane stanične tvornice. Te genetički modificirane stanice proizvode molekule, kemikalije, polimere, proteine i druge tvari koje se upotrebljavaju, primjerice, u farmaceutskoj, prehrambenoj i kemijskoj industriji. Kako bi se oslobodile molekule proizvedene u unutrašnjosti takvih bioinženjerski izmijenjenih stanica, ultrazvučna liza uobičajena je metoda za razaranje staničnih stijenki i prijenos ciljnih tvari u okolnu tekućinu. Pročitajte više o lizi bioinženjerski izmijenjenih stanica!

Ultrazvučno cijepanje DNA smičnim silama

Ultrazvučne smične sile često se upotrebljavaju za oslobađanje molekula, organela i proteina iz unutrašnjosti stanica te za razbijanje lanaca DNA na dijelove. Akustička kavitacija razara stanične stijenke i membrane kako bi se DNA ekstrahirala iz stanica i dobili fragmenti duljine oko 600 – 800 bp, što je idealno za analizu.
Kliknite ovdje da biste saznali više o ultrazvučnim homogenizatorima za fragmentaciju DNA!

Literatura / reference

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Ultrazvučna tehnologija visokih performansi! Asortiman proizvoda Hielscher obuhvaća cijeli spektar od kompaktnog laboratorijskog ultrazvučnog uređaja preko stolnih uređaja do ultrazvučnih sustava za rad u punom industrijskom mjerilu.

Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorijskih do industrijskih veličina.