Ultrazvučna liza E. Coli
- Bakterije E. coli najčešće su korištene bakterije u mikrobiologiji i biotehnologiji.
- Ultrazvučni disruptori stanica daju pouzdane i ponovljive rezultate za lizu E. coli.
- Intenzivna, ali precizno kontrolirana kavitacija i sile smicanja rezultiraju potpunim prekidom i visokim prinosima ekstrakcije (npr. proteina, DNA).
Zašto je ultrazvučno uništavanje stanica E. coli preferirana metoda?
Ultrazvučni homogenizatori ili ultrazvučni uređaji tipa sonde nude nekoliko prednosti za lizu E. coli budući da intenzivni ultrazvuk učinkovito ometa stanične stijenke i membrane. Ultrazvučni uređaji tipa sonde naširoko se koriste za lizu E. coli zbog sljedećih razloga:

Ekstrakcija proteina iz stanica E.coli učinkovito se izvodi s ultrazvučna sonda UP200St
Ultrasonicator tipa sonde nudi mnoge prednosti za lizu E. coli. Pouzdana i precizna kontrola parametara ultrazvučnog procesa omogućuje optimizaciju radnih parametara kao što su snaga, trajanje i rukovanje uzorkom kako bi se postigli željeni rezultati.
Razbijanje stanica pomoću ultrazvučne kavitacije
Ultrazvučni homogenizatori tipa sonde rade s cca. 20 000 ciklusa u sekundi (pri 20 kHz) i uzrokuju kavitaciju u tekućinama ili suspenzijama. Akustična kavitacija mikroskopska područja tlakova sličnih vakuumu i visokih temperatura koje razbijaju stanice. Iako temperature mogu doseći nekoliko tisuća stupnjeva Celzijevih, volumeni kavitacije su toliko mali da ne zagrijavaju značajno proces. Ultrazvučna akustična kavitacija i sile smicanja perforiraju ili lome staničnu membranu bakterijskih stanica kao što je E.coli. Hielscher ultrasonicators omogućuju preciznu kontrolu nad procesnim parametrima kao što su ultrazvučni intenzitet, amplituda, unos energije i temperatura. Time se proces ultrazvučne lize može optimalno prilagoditi vrsti stanice, kulturi stanica i cilju procesa.
- precizna kontrola lize (intenzitet, amplituda, temperatura)
- pouzdani, ponovljivi rezultati
- optimalna prilagodba određenim uzorcima
- kontrola temperature
- za vrlo male do vrlo velike uzorke (µL u litre)
- Čisto mehanička obrada
- jednostavan za korištenje, siguran rad
- linearno povećanje od laboratorija do proizvodnje

VialTweeter za ultrazvučnu lizu
Ultrazvučni homogenizator u odnosu na druge tehnike lize
Dok kemijska i enzimska liza može biti problematična – budući da kemijska liza može promijeniti strukture proteina i uvesti probleme s pročišćavanjem, a enzimska liza zahtijeva dugo vrijeme inkubacije i nije ponovljiva – ultrazvučno ometanje je sofisticirana, brza metoda ometanja stanica.
Ultrazvučna liza temelji se samo na mehaničkim silama. Ne dodaju se kemikalije, sonikacija razbija stanične stijenke silama smicanja. Kemijska liza može promijeniti strukturu proteina i uvesti probleme s pročišćavanjem. Enzimski poremećaj zahtijeva dugo vrijeme inkubacije i ne može se ponoviti. Ultrazvučno razbijanje stanica bakterije E.coli je brzo, jednostavno, pouzdano i ponovljivo. Zato se Hielscherovi ultrazvučni uređaji koriste u biološkim i biokemijskim laboratorijima diljem svijeta za pripremu uzoraka, pre-analitiku, in-vitro dijagonistiku i mnogostruke analize.
Opće preporuke za ultrazvučnu lizu
Sonikacija je najpopularnija tehnika za lizu vrlo malih, srednjih i velikih količina staničnih suspenzija – od piko-litara do 100L/h (pomoću ultrazvučne protočne ćelije). Stanice se liziraju tekućim smicanjem i kavitacijom. DNK se također kida tijekom sonikacije, tako da nije potrebno dodavati DNazu staničnoj suspenziji.
Kontrola temperature tijekom ultrazvučne lize E.coli
Prethodnim hlađenjem uzorka i držanjem uzorka tijekom sonikacije na ledu može se lako spriječiti termička degradacija uzorka.
Idealno bi bilo da se uzorci drže ledeno hladni tijekom lize, ali za većinu uzoraka dovoljno je da temperatura ne poraste iznad temperature kulture ili izvora tkiva. Stoga se preporuča držati suspenziju na ledu i sonicirati s nekoliko kratkih ultrazvučnih impulsa od 5-10 sekundi i pauzama od 10-30 sekundi. Tijekom pauza, toplina se može raspršiti kako bi se ponovno uspostavila niska temperatura. Za veće uzorke ćelija dostupni su različiti protočni reaktori s rashladnim omotačima.
Ovdje pročitajte detaljne savjete i preporuke za uspješnu ultrazvučnu lizu!
Protokoli za ultrazvučnu pripremu lizata E. Coli
Istraživači koriste Hielscher ultrazvučne homogenizatore za razbijanje stanica E.coli. U nastavku možete pronaći različite testirane i dokazane protokole za lizu E.coli korištenjem Hielscher ultrazvučnih homogenizatora za različite primjene povezane s E.coli.
Stanični rast, umrežavanje i priprema ekstrakata stanica E. coli pomoću ultrazvuka
Za SeqA i RNA polimerazu ChIP-Chip E. coli MG1655 ili MG1655 ΔseqA je uzgajana na 37°C do OD600 od oko 0,15 u 50 ml LB (+ 0,2% glukoze) prije nego što je dodano 27 μl formaldehida (37%) po ml medija (konačna koncentracija 1%). Umrežavanje je izvedeno uz polagano mućkanje (100 okretaja u minuti) na sobnoj temperaturi tijekom 20 minuta nakon čega je uslijedilo gašenje s 10 ml 2,5 M glicina (konačna koncentracija 0,5 M). Za pokuse toplinskog šoka, E. coli MG1655 je uzgajana u 65 ml LB medija na 30°C do OD600 od oko 0,3. Zatim je 30 ml kulture preneseno u prethodno zagrijanu tikvicu na 43°C, a ostatak je držan na 30°C. Umrežavanje i gašenje su kao što je gore opisano osim što su stanice držane na 30 ili 43°C 5 minuta prije daljnjeg polaganog mućkanja na sobnoj temperaturi. Stanice su sakupljene centrifugiranjem i dva puta isprane hladnim TBS (pH 7,5). Nakon resuspendiranja u 1 ml pufera za lizu (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozima) i inkubacije na 37°C tijekom 30 minuta nakon čega slijedi dodavanje 4 ml IP pufera, stanice su sonicirane na ledu s 12 puta od 30 sekundi i 30 sekundi pauzama korištenjem Hielscher ultrazvučnog procesora UP400St pri postavci snage od 100%. Nakon centrifugiranja tijekom 10 minuta na 9000 g, alikvoti od 800 μl supernatanta pohranjeni su na -20°C. (Waldminghaus 2010.)
Prekomjerna proizvodnja i pročišćavanje enzima ultrazvučnom sondom
Za prekomjernu proizvodnju dekahistidinom (His10)-označenih proteina, E. coli BL21(DE3) je transformirana s pET19b konstruktima. Pretkultura preko noći sakupljena je centrifugiranjem, a 1% je korišten za inokulaciju ekspresijske kulture. Stanice koje nose pET19mgtB uzgajane su na 22°C do optičke gustoće na 600 nm (OD600) od 0,7. Kultura je prebačena na 17°C i inducirana sa 100 µM IPTG. Nakon 16 sati, kultura je sakupljena centrifugiranjem na 7500 × g na 4 °C. Stanice su resuspendirane u 50 mM fosfatno puferiranoj fiziološkoj otopini (PBS) s 0,3 M NaCl na pH 7,4 i razbijene ultrazvučnom obradom sa S2 sonotrodom s mikro vrhom na Hielscher ultrasonicatoru UP200St pri ciklusu od 0,5 i amplitudi od 75%.
Prekomjerna proizvodnja GtfC obilježenog dekahistidinom izazvana je na 37°C pri OD600 od 0,6 sa 100 µM IPTG. Stanice su zatim inkubirane 4 sata, sakupljene i lizirane kao što je gore navedeno za MgtB.
Sirovi stanični ekstrakti centrifugirani su na 15 000 x g i 4°C da se talože stanični ostaci. Pročišćeni ekstrakti naneseni su na 1-ml HisTrap FF Crude kolone pomoću ÄKTAprime Plus sustava. Enzimi su pročišćeni u skladu s protokolom proizvođača za gradijentnu eluaciju His-označenih proteina. Eluirane otopine proteina dijalizirane su dva puta protiv 1000 volumena 50 mM PBS, pH 7,4, s 0,3 M NaCl na 4°C. Pročišćavanje je analizirano pomoću 12% SDS-PAGE. Koncentracija proteina određena je Bradford metodom pomoću Roti-Quant. (Rabausch i dr. 2013.)
Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz E. coli bakterije
Protein mamca od interesa (u ovom slučaju, MTV1 Arabidopsis thaliana) spojen je s GST oznakom i eksprimiran u stanicama BL21 Escherichia coli (E. coli).
- Uzmite jednu peletu GST-MTV1 i GST (što odgovara 50 ml bakterijske kulture) i resuspendirajte svaku u 2,5 mL ledeno hladnog pufera za ekstrakciju.
- Upotrijebite ultrazvučni uređaj UP100H (opremljen MS3 sonotrodom s mikrovrhom za male volumene od približno 2-5 ml) za razbijanje bakterijskih stanica dok se ne liziraju, što je naznačeno smanjenom neprozirnošću i povećanom viskoznošću. To se mora izvesti na ledu, a preporučuje se sonikacija u intervalima (npr. 10 sekundi sonikacije nakon čega slijedi pauza od 10 sekundi na ledu i tako dalje). Treba paziti da se ne sonicira previsokim intenzitetom. Ako se uoči pjenjenje ili stvaranje bijelog taloga, potrebno je smanjiti intenzitet.
- Prenesite otopinu liziranih bakterija u mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 mL i centrifugirajte na 4°C, 16 000 xg 20 minuta.

Ultrazvučni uređaji tipa sonde kao što je UP400St koristiti princip rada akustične kavitacije za učinkovitu lizu E.coli.
Analiza ekspresije i pročišćavanje rekombinantnog proteina pomoću sonikacije
Peleta E. coli je sonicirana s Hielscher ultrasonicatorom UP100H. U tu svrhu, stanični talog je resuspendiran u ohlađenom puferu za lizu (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i ohlađen na ledu 10 minuta. Zatim je stanična suspenzija sonikirana s 10 kratkih izboja od 10 s nakon kojih je uslijedio interval od 30 s za hlađenje. Konačno, stanični ostaci su uklonjeni ultracentrifugiranjem na 4°C tijekom 15 minuta pri 14000 okretaja u minuti. Za potvrdu ekspresije rPR, supernatant je pušten na 12% poliakrilamidnom gelu i analiziran pomoću SDS-PAGE i Western blottinga. Pročišćavanje rPR-a provedeno je korištenjem Ni2+-NTA smole (Invitrogen, SAD) prema uputama proizvođača. U ovoj fazi korištena je nativna metoda pročišćavanja. Čistoća pročišćenog proteina procijenjena je korištenjem elektroforeze na 12% poliakrilamidnom gelu i naknadnog bojenja Coomassie blue. Koncentracija pročišćenog proteina je mjerena pomoću kompleta za analizu proteina Micro BCA (PIERCE, SAD). (Azarnezhad i dr. 2016.)
Ultrazvučni homogenizatori za lizu E. coli
Hielscher Ultrasonics dizajnira, proizvodi i isporučuje ultrazvučne homogenizatore visokih performansi za pouzdanu i učinkovitu lizu bakterija E. coli i drugih vrsta stanica, tkiva i staničnih kultura.
Široki portfelj ultrazvučnih sondi kao i neizravnih sustava sonikacije omogućuje nam da vam ponudimo idealan ultrazvučni homogenizator tkiva za vašu primjenu u razbijanju stanica i ekstrakciji.
Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – Kvaliteta Proizvedeno u Njemačkoj
Hielscher ultrasonicators su poznati po svojim najvišim standardima kvalitete i dizajna. Pametan softver, intuitivni izbornik, programabilne postavke i automatsko protokoliranje podataka samo su neke značajke Hielscher ultrasonicators. Robusnost i jednostavan rad omogućuju glatku integraciju naših ultrazvučnih uređaja u istraživačke i biotehnološke objekte. Hielscher ultrasonicators lako podnose čak i teške uvjete i zahtjevna okruženja.
Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana tvrtka i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne uređaje visokih performansi koji sadrže najsuvremeniju tehnologiju i jednostavnu su za korištenje. Naravno, Hielscher ultrasonicators sukladni su CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.
Donja tablica daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja:
Volumen serije | Protok | Preporučeni uređaji |
---|---|---|
ploče s više jažica / mikrotitarske ploče | na | UIP400MTP |
CupHorn za bočice ili čaše | na | Ultrazvučni CupHorn |
ultrazvučni mikroprotočni reaktor | na | GDmini2 |
do 10 bočica sa 0,5 do 1,5 ml | na | VialTweeter |
0.5 do 1,5 ml | na | VialTweeter |
1 do 500 ml | 10 do 200 ml/min | UP100H |
10 do 2000 ml | 20 do 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
0.1 do 20L | 0.2 do 4L/min | UIP2000hdT |
10 do 100l | 2 do 10L/min | UIP4000 |
na | 10 do 100L/min | UIP16000 |
na | veći | klaster od UIP16000 |
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Dodatni protokoli za ultrazvučnu lizu E. coli
Proteini modificirani alicinom u E. coli pomoću ultrazvučnog VialTweetera
Određivanje sadržaja sulfhidrila pomoću 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzojeve kiseline) (DTNB) testa
Kultura E. coli MG1655 preko noći korištena je za inokulaciju MOPS minimalnog medija (1:100). Kultura je uzgajana aerobno dok nije postignut A600 od 0,4. Kultura je podijeljena u tri kulture od 15 ml za liječenje stresa. Netretirana kultura služila je kao negativna kontrola. U jednu od preostale dvije kulture dodano je 0,79 mM alicina (128 μg ml-1) ili 1 mM diamida. Kulture su inkubirane 15 minuta. 5 ml svake kulture sakupljeno je centrifugiranjem (8,525 x g, 4°C, 10 min). Stanice su isprane dva puta s 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, pohranjene anaerobno prije upotrebe) i centrifugirane (13 000 x g, 4 °C, 10 min). Stanice su resuspendirane u puferu za lizu (PBS sa 6 mM gvanidin HCl, pH 7,4) prije razbijanja na 4°C ultrazvučnom obradom (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Njemačka) (3 × 1 min). Stanični ostaci su peletirani centrifugiranjem (13 000 x g, 4 °C, 15 min). Supernatant je prebačen u QS-macro kivetu od 3,5 ml (10 mm) s magnetskom mješalicom i pomiješan s 1 ml pufera za lizu. Ekstinkcija uzoraka je praćena na 412 nm sa Jasco V-650 spektrofotometrom opremljenim PSC-718 temperaturno kontroliranim držačem ćelija na sobnoj temperaturi. Dodano je 100 μl 3 mM otopine ditiobis(2-nitrobenzojeve kiseline). Ekstinkcija je praćena dok nije dosegla zasićenje. Izračun koncentracije tiola proveden je korištenjem koeficijenta ekstinkcije ϵ412 = 13.700 M-1 cm-1 za tio-2-nitrobenzojevu kiselinu (TNB). Stanične koncentracije tiola izračunate su na temelju volumena stanica E. coli od 6,7 × 10-15 litra i gustoća ćelija od A600 = 0,5 (ekvivalentno 1 × 108 stanice ml-1 Kultura). (Müller i dr. 2016.)
In vivo određivanje glutationa pomoću ultrazvučne drobilice stanica
E.coli MG1655 je uzgajana u MOPS minimalnom mediju u ukupnom volumenu od 200 ml dok nije postignut A600 od 0,5. Kultura je podijeljena u kulture od 50 ml za liječenje stresa. Nakon 15 minuta inkubacije s 0,79 mM alicina, 1 mM diamida ili dimetil sulfoksida (kontrola), stanice su sakupljene pri 4000 g na 4°C tijekom 10 minuta. Stanice su isprane dva puta s KPE puferom prije resuspendiranja peleta u 700 ul KPE pufera. Za deproteinaciju je dodano 300 l 10% (w/v) sulfosalicilne kiseline prije razbijanja stanica ultrazvukom (3 x 1 min; VialTweeter ultrazvučni uređaj). Supernatanti su sakupljeni nakon centrifugiranja (30 min, 13 000 g, 4°C). Koncentracije sulfosalicilne kiseline smanjene su na 1% dodatkom 3 volumena KPE pufera. Mjerenja ukupnog glutationa i GSSG izvedena su kako je gore opisano. Stanične koncentracije glutationa izračunate su na temelju volumena stanica E. coli od 6,7×10-15 litre i gustoće ćelija od A600 0,5 (ekvivalentno 1×108 stanice ml-1 Kultura). Koncentracije GSH izračunate su oduzimanjem 2[GSSG] od ukupnog glutationa. (Müller i dr. 2016.)
Ekspresija humanog mAspAT u E. coli pomoću ultrazvučnog homogenizatora
Pojedinačna kolonija E. coli BL21 (DE3) koja sadrži vektor ekspresije u 30 mL Luria-Bertani (LB) medija koji sadrži 100 μg/mL ampicilina, a zatim kultivirana na 37ºC do optičke gustoće (OD600) dosegla 0,6. Stanice su sakupljene centrifugiranjem na 4000 x g tijekom 10 minuta i resuspendirane u 3L svježeg LB medija koji sadrži 100 μg/mL ampicilina.
Zatim je ekspresija proteina inducirana s 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) tijekom 20 sati na 16ºC. Stanice su sakupljene centrifugiranjem na 8000 x g tijekom 15 minuta i isprane puferom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Približno 45 g (mokre težine) stanica dobiveno je iz 3 L kulture. Nakon centrifugiranja, stanične pelete su resuspendirane u 40 mL (za 1 L kulture) ledeno hladnog ekstrakcijskog pufera A, i lizirane ultrazvučnom obradom na ledeno hladnoj temperaturi korištenjem Hielscher ultrazvučne drobilice stanica UP400St. Liza stanica je centrifugirana na 12.000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta da se razdvoje topljive (supernatant) i istaložene (pelete) frakcije. (Jiang i dr. 2015.)
Činjenice koje vrijedi znati
E coli
Escherichia coli (E. coli) je gram-negativna, fakultativno anaerobna, štapićasta koliformna bakterija iz roda Escherichia koja se obično nalazi u donjem dijelu crijeva toplokrvnih organizama (endotermi). Postoji velik broj sojeva (ili podtipova) E. coli s različitim karakteristikama. Većina sojeva E. coli je bezopasna za ljude, npr. sojevi B i K-12 koji se obično koriste za istraživačke primjene u laboratorijima. Međutim, neki sojevi su štetni i mogu uzrokovati ozbiljne bolesti.
E. coli ima važnu ulogu u modernom biološkom inženjerstvu i industrijskoj mikrobiologiji budući da je bakterijom lako manipulirati. Uobičajene laboratorijske primjene koje često uključuju upotrebu E. coli, npr. za stvaranje rekombinantne deoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili za djelovanje kao model organizma.
E. coli je vrlo svestran domaćin za proizvodnju heterolognih proteina, a dostupni su brojni sustavi ekspresije proteina za proizvodnju rekombinantnih proteina u E. coli. Korištenjem plazmida koji omogućuju visoku razinu ekspresije proteina, geni se mogu uvesti u bakterije, što omogućuje proizvodnju takvih proteina u velikim količinama u procesima industrijske fermentacije.
E.coli se koristi kao tvornica stanica za proizvodnju inzulina. Daljnje primjene uključuju korištenje modificiranih stanica E. coli za razvoj i proizvodnju cjepiva i imobiliziranih enzima, za proizvodnju biogoriva, kao i za bioremedijaciju.
Soj K-12 je mutirani oblik E. coli koji prekomjerno eksprimira enzim alkalnu fosfatazu (ALP). Do ove mutacije dolazi zbog defekta u genu koji stalno kodira enzim. Ako gen proizvodi proizvod bez ikakve inhibicije, to je poznato kao konstitutivna aktivnost. Ovaj specifični mutirani oblik koristi se za izolaciju i pročišćavanje enzima ALP.
Bakterije E. coli također se naširoko koriste kao tvornice stanica. Proizvedeni mikrobi (npr. bakterije) i biljne stanice mogu se koristiti kao takozvane tvornice stanica. Ove genetski modificirane stanice proizvode molekule, kemikalije, polimere, proteine i druge tvari koje se koriste primjerice u farmaceutskoj, prehrambenoj i kemijskoj industriji. Kako bi se oslobodile molekule proizvedene u unutrašnjosti takvih bioinženjerskih stanica, ultrazvučna liza je uobičajena metoda za ometanje staničnih stijenki i prijenos ciljnih tvari u okolnu tekućinu. Pročitajte više o razgradnji stanica dobivenih bioinženjeringom!
Ultrazvučno rezanje DNK
Ultrazvučne sile smicanja često su korištena metoda za oslobađanje molekula, organela i proteina iz unutrašnjosti stanice, kao i za lomljenje lanaca DNK na dijelove. Akustična kavitacija razbija stanične stijenke i membrane kako bi izdvojila DNK iz stanica i stvorila fragmente od oko 600 – 800 bp duljine, što je idealno za analizu.
Kliknite ovdje da saznate više o ultrazvučnim homogenizatorima za fragmentaciju DNA!
Literatura / Reference
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorija do industrijska veličina.