Ultrazvučna liza E. Coli

  • E. coli bakterije su najčešće korišteni bakterija u mikrobiologiji i biotehnologije.
  • Ultrazvučni stanica ometaju pružanje pouzdane i ponovljive rezultate za lizu E. coli.
  • Intenzivne još precizno kontrolirati kavitacije i smične sile dovesti u potpunoj poremećaja i visokim prinosima ekstrakcije proteina (npr, DNA).

Zašto je ultrazvučni poremećaj stanica E. coli preferirana metoda?

Ultrazvučni homogenizatori ili sonda tipa ultrasonicators nude nekoliko prednosti za E. coli lizu kao intenzivan ultrazvuk učinkovito ometa stanične stijenke i membrane. Sonda tipa ultrasonicators su naširoko koristi za E. coli lizu iz sljedećih razloga:

  • Učinkovito ometanje staničnih stijenki: E. coli ima polu-krutu staničnu stijenku sastavljenu od peptidoglikana, koju je teško slomiti tradicionalnim metodama lize. Sonda tipa ultrasonicator generira intenzivne ultrazvučne valove koji stvaraju kavitaciju mjehurića u tekućini koja okružuje stanice. Kada se ti mjehurići uruše, stvaraju brze tekuće mlazove i udarne valove koji rezultiraju mehaničkim poremećajem staničnih stijenki, učinkovito oslobađajući stanične sadržaje poput biomolekula.
  • Poboljšana penetracija: Ultrazvučni valovi koje generira sonda / sonotrode mogu prodrijeti duboko u uzorak, dosežući veći broj stanica E. coli i tretirajući ih ravnomjerno. To pomaže osigurati da je liza ujednačenija u cijelom uzorku, što rezultira većom učinkovitošću poremećaja stanica.
  • Skraćeno vrijeme obrade: Energija koju isporučuje sonda tipa ultrasonicator je visoko koncentrirana i lokalizirana, što dovodi do brze i učinkovite stanične lize. U usporedbi s drugim metodama kao što su premlaćivanje kuglica ili enzimska liza, ultrazvukom može postići E. coli lizu u roku od nekoliko minuta ili čak sekundi. Dok mnoge alternativne tehnike kao što su zamrzavanje-odmrzavanje zahtijevaju nekoliko krugova liječenja, ultrazvučna liza otvara stanice u jednom koraku procesa.
  • Kontrola temperature: Najsuvremeniji ultrasonicators opremljeni su temperaturnim senzorima i pametnim softverom, koji omogućuje postavljanje maksimalne temperature procesa. Ultrasonicator se automatski zaustavlja kada se dostigne granica temperature i započne proces ultrazvukom kada se dostigne postavljena temperaturna točka. Hlađenje uzoraka u ledenoj kupelji jednostavna je metoda za održavanje niske temperature uzorka i sprječavanje razgradnje uzorka izazvanog toplinom.
  • Skalabilnost: Sonda tipa ultrasonicators su dostupni u različitim veličinama, od ručnih uređaja do velikih industrijskih modela. To ih čini prikladnim za preradu malih količina u laboratoriju ili povećanje za veće primjene bioprocesiranja, npr. proizvodnju cjepiva ili biosintezu molekula.
  • Svestranost: Ultrasonicators može se koristiti za različite primjene izvan stanične lize, kao što su DNA striženje, ekstrakcija proteina, homogenizacija tkiva, disperzija nanočestica, i emulgiranje. Stoga, ulaganje u sonda tipa ultrasonicator pruža svestranost u istraživanju ili industrijskim okruženjima.
  • Sonda tipa ultrasonicators kao što je UP200St su pouzdani tkiva homogenizatori i stanice drobilice, stoga naširoko koristi za pripremu uzoraka u genetici, npr, za E.coli lizu

    Ekstrakcija proteina iz stanica E.coli učinkovito se izvodi s ultrazvučna sonda UP200St

    Sonda tipa ultrasonicator nudi mnoge prednosti za E. coli lizu. Pouzdana i precizna kontrola nad ultrazvučnim parametrima procesa omogućuju optimizaciju radnih parametara kao što su snaga, trajanje i rukovanje uzorkom kako bi se postigli željeni rezultati.
     

    Zahtjev za informacijama




    Primijetite naše pravila o privatnosti,


     

    Ovaj vodič objašnjava koja je vrsta sonikatora najbolja za vaše zadatke pripreme uzorka kao što su liza, poremećaj stanica, izolacija proteina, fragmentacija DNA i RNA u laboratorijima, analiza i istraživanje. Odaberite idealnu vrstu sonikatora za svoju primjenu, volumen uzorka, broj uzorka i propusnost. Hielscher Ultrasonics ima idealan ultrazvučni homogenizator za vas!

    Kako pronaći savršen sonikator za poremećaj stanica i ekstrakciju proteina u znanosti i analizi

    Minijatura videozapisa

    Ultrazvučna fragmentacija DNA često se koristi kao korak pripreme uzorka u sekvenciranju sljedeće generacije (NGS)

    Elektroforetske analize genomske DNA E. coli EDL933 podvrgnute ultrazvuku od 0 do 15 min. L označava DNK ljestve.
    (studija i slika: ©Basselet et al. 2008)

    Poremećaj stanica pomoću ultrazvučne kavitacije

    Ultrazvučni homogenizatori tipa sonde rade s približno 20.000 ciklusa u sekundi (na 20kHz) i uzrokuju kavitaciju u tekućinama ili suspenzijama. Mikroskopska područja akustičnih kavitacija vakuumskih pritisaka i visokih temperatura koje razdiru stanice. Iako temperature mogu doseći nekoliko tisuća stupnjeva Celzija, volumeni kavitacije su toliko mali da ne zagrijavaju proces značajno. Ultrazvuk generira akustičnu kavitaciju i sile smicanja perforiraju ili razbijaju staničnu membranu bakterijskih stanica kao što je E.coli. Hielscher ultrasonicators omogućiti preciznu kontrolu nad parametrima procesa kao što su ultrazvučni intenzitet, amplituda, unos energije, i temperatura. Time se ultrazvučni proces lize može optimalno prilagoditi tipu stanice, kulturi stanica i cilju procesa.
     

    Prednosti ultrazvučni za ližu

    • preciznu kontrolu lize (intenzitet, amplituda, temperature)
    • pouzdani, ponovljivi rezultati
    • Optimalna privikavanje na određene uzorke
    • kontrola temperature
    • za vrlo male do vrlo velike uzorke (jal na litre)
    • Čisto mehanička obrada
    • Siguran rad prilagođen korisniku
    • linearna skala iz laboratorija za proizvodnju
    Uređaj ultrazvučni VialTweeter omogućava istovremenu pripremu uzorka do 10 ampule pod jednakim uvjetima postupka. (Kliknite za povećanje!)

    VialTweeter za ultrazvučno lize

    Zahtjev za informacijama




    Primijetite naše pravila o privatnosti,


    Ultrazvučni homogenizator vs druge tehnike lize

    Dok kemijska i enzimska liza može biti problematična – jer kemijski lize može promijeniti proteinskih struktura i uvesti probleme pročišćavanje i enzimsku liže zahtijeva puta dugo inkubacije i nije ponovljiv – ultrazvučni poremećaj je sofisticiran, brzo stanica metoda prekida.
    Ultrazvučna liza temelji se samo na mehaničkim silama. Ne dodaju se kemikalije, ultrazvukom se lomi stanična stijenka silama smicanja. Kemijska liza može promijeniti strukturu proteina i uvesti probleme s pročišćavanjem. Enzimski poremećaj zahtijeva dugo vrijeme inkubacije i ne može se reproducirati. Ultrazvučni poremećaj stanica stanica bakterija E.coli je brz, jednostavan, pouzdan i ponovljiv. Zato se Hielscher ultrasonicators koriste u biološkim i biokemijskim laboratorijima širom svijeta za pripremu uzoraka, pred-ananlitike, in vitro dijagonzike i višestruke testove.

    Opće preporuke za ultrazvučnu lizu

    Sonication je najpopularnija tehnika za ližu vrlo male, srednje i velike količine stanične suspenzije – od piko-litara do 100 L / h (pomoću ultrazvučne stanice protoka). Stanice se liziraju pomoću tekućinske smicanja i kavitacije. DNA također je presječena tijekom ultrazvučne obrade, tako da nije potrebno dodavati DNAsom u staničnu suspenziju.
     

    Kontrola temperature tijekom ultrazvučne E.coli lize
    Ultrazvučni stanični disruptor UP100H (100W) za poremećaj stanica i ekstrakciju biljnih spojeva.Do prije hlađenja uzorka i održavajući uzorak tijekom ultrazvučne obrade na ledu, uzorak toplinske razgradnje uzorka mogu se lako spriječiti.
    U idealnom slučaju, uzorke treba držati ledeno hladnim tijekom lize, ali za većinu uzoraka dovoljno je ako temperatura ne poraste iznad temperature kulture ili izvora tkiva. Stoga se preporučuje, zadržati suspenziju na ledu i sonificirati s nekoliko kratkih ultrazvučnih impulsa od 5-10 sek i pauze od 10-30 sek. Tijekom stanki toplina se može raspršiti kako bi se ponovno uspostavila niska temperatura. Za veće uzorke stanica dostupni su različiti reaktori stanica protoka s rashladnim jaknama.
    Ovdje pročitajte detaljne savjete i preporuke za uspješnu ultrazvučnu lizu!

    Protokoli za ultrazvučnu pripremu E. coli lizata

    Istraživači koriste Hielscher ultrazvučne homogenizatore za poremećaj stanica E.coli. Ispod možete pronaći razne testirane i dokazane protokole za E.coli lizu pomoću Hielscher ultrazvučnih homogenizatora za različite primjene povezane s E. coli.
     

    Ovaj video isječak prikazuje Hielscher ultrazvučni homogenizator UP100H, ultrasonicator naširoko koristi za pripremu uzoraka u laboratorijima.

    Ultrazvučni homogenizator UP100H

    Minijatura videozapisa

    Rast stanica, umrežavanje i priprema ekstrakata stanica E. coli pomoću ultrazvuka

    Za SeqA i RNA polimeraze čip-Chip E.coli MG1655 ili MG1655 ΔseqA rastu na 37 ° C do OD600 od oko 0.15 u 50 ml LB (+ 0.2% glukoze) prije nego što se doda 27 ul formaldehida (37%) po ml medija (konačna koncentracija 1%). Umrežavanje je provedeno pri polaganom tresku (100 rpm) pri sobnoj temperaturi tijekom 20 minuta nakon čega je uslijedilo gašenje 10 ml 2,5 M glicina (konačna koncentracija 0.5 M). Za pokuse s toplinskim šokom E. coli MG1655 je uzgojen u 65 ml LB medija na 30 ° C do OD600 od oko 0,3. Nakon toga 30 ml kulture preneseno je u prethodno zagrijanu tikvicu na 43 °C, a ostatak na 30 °C. Umrežavanje i gašenje bilo je kako je gore opisano, osim što su se stanice držale na 30 ili 43 °C 5 minuta prije daljnjeg sporog tresenja na sobnoj temperaturi. Stanice su prikupljene centrifugiranjem i dvaput oprane hladnim TBS-om (pH7.5). Nakon resuspenzije u puferu za lizu od 1 ml (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozima) i inkubacije na 37 ° C tijekom 30 minuta nakon čega slijedi dodavanje 4 ml IP pufera, stanice su ultrazvukom na ledu s 12 puta 30 sek i 30 sek pauze pomoću Hielscher ultrazvučni procesor UP400St na 100% podešavanje snage. Nakon centrifugiranja 10 minuta na 9000 g, 800 μl alicitata supernatanta pohranjeno je na -20 °C. (Waldminghaus 2010)
     

    Prekomjerna proizvodnja i pročišćavanje enzima ultrazvučnom sondom

    Ultrasonicator UP100H je laboratorijski homogenizator koji se često koristi za pripremu uzoraka ploča stanične kulture.Za prekomjernu proizvodnju proteina označenih decahistidinom (His10), E. coli BL21(DE3) transformirana je s pET19b konstruktima. Prekultura preko noći ubrana je centrifugiranjem, a 1% je korišteno za cijepljenje kulture izražavanja. Stanice koje su nosile pET19mgtB uzgajane su na 22 °C do optičke gustoće na 600 nm (OD600) od 0,7. Kultura je prenesena na 17°C i inducirana sa 100 μM IPTG. Nakon 16 sati kultura je ubrana centrifugiranjem na 7.500 × g na 4 °C. Stanice su resuspended u 50 mM fosfat-puferirana fiziološka otopina (PBS) s 0,3 M NaCl na pH 7,4 i poremećena ultrazvukom s S2 mikro-vrh sonotrode na Hielscher ultrasonicator UP200St u ciklusu od 0,5 i amplituda od 75%.
    Prekomjerna proizvodnja decahistidine-označeni GtfC izazvana je na 37 ° C pri OD600 0,6 sa 100 uM IPTG. Stanice su zatim inkubirane 4 sata, sakupljene i lizirane kako je naprijed navedeno za MgtB.
    Ekstrakti sirovih stanica centrifugirani su na 15.000 × g i 4 °C kako bi se taložili ostaci stanica. Pročišćeni ekstrakti utovareni su na 1-ml HisTrap FF Crude stupce pomoću sustava ÄKTAprime Plus. Enzimi su pročišćeni prema protokolu proizvođača za gradijentnu eluciju proteina označenih njegovim oznakama. Eluted proteinske otopine su dva puta dijalizirane u odnosu na 1.000 volumena od 50 mM PBS, pH 7.4, s 0.3 M NaCl na 4 °C. Pročišćavanje je analizirano s 12% SDS-PAGE. Koncentracija proteina određena je Bradfordovom metodom pomoću Roti-Quanta. (Rabausch i sur. 2013)
     

    Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz bakterija E. coli
    Mamce protein od interesa (u ovom slučaju, u Arabidopsis thaliana MTV1) je spojena s GST oznaku i eksprimiran u BL21 bakteriji Escherichia coli (E. coli) stanica.

    1. Uzmite jednu peletu GST-MTV1 i GST (što odgovara bakterijskoj kulturi od 50 ml) i ponovno suspendirajte svaki u 2,5 mL ledeno hladnog pufera za ekstrakciju.
    2. Koristite ultrasonicator UP100H (opremljen MS3 mikrotip-sonotrode za male volumene od oko 2-5mL) za ometanje bakterijskih stanica dok se ne lize, što ukazuje na smanjenu neprozirnost i povećanu viskoznost. To se mora provesti na ledu, a preporuča se sonificirati u intervalima (npr. 10 sek ultrazvukom nakon čega slijedi pauza od 10 sek na ledu i tako dalje). Mora se paziti da se ne sonificira s previsokim intenzitetom. Ako se otkrije pjenjenje ili stvaranje bijelog taloga, intenzitet treba smanjiti.
    3. Prenesite otopinu liziranih bakterija na cijevi mikrocentrifuge od 1,5 mL i centrifugu na 4 °C, 16.000 x g tijekom 20 minuta.

     

    Ultrazvučne sonde koriste sile akustične kavitacije kako bi poremetile stanice i izvukle molekule i DNK iz E.coli.

    Sonda tipa ultrasonicators kao što je UP400St koristiti princip rada akustične kavitacije za učinkovitu lizu E.coli.

    Analiza ekspresije i pročišćavanje rekombinantnih proteina pomoću ultrazvukom

    E. coli pelet je ultrazvukom s Hielscher ultrasonicator UP100H. U tu je svrhu stanična peleta ponovno potrošena u ohlađenom puferu za lizu (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i ohlađena na ledu 10 minuta. Zatim, stanična suspenzija je ultrazvukom s 10 kratkih rafala od 10 s nakon čega slijedi interval od 30 s za hlađenje. Konačno, ostaci stanica uklonjeni su ultracentrifugiranjem na 4 ° C tijekom 15 minuta pri 14000 okretaja u minuti. Za potvrdu rPR ekspresije, supernatant je pokrenut na 12% poliakrilamid gel i analiziran SDS-PAGE i Western blotting. Pročišćavanje rPR-a provedeno je pomoću smole Ni2+-NTA (Invitrogen, SAD) prema vodiču proizvođača. U ovoj fazi korištena je izvorna metoda pročišćavanja. Čistoća pročišćenog proteina procijenjena je elektroforezom na 12% poliakrilamidnom gelu i naknadnim Coomassie plavim bojenjem. Pročišćena koncentracija proteina mjerena je kompletom za analizu proteina Micro BCA (PIERCE, SAD). (Azarnezhad i sur. 2016)
     

    Ovaj video prikazuje ultrazvučni cuphorn od 200 W za raspršivanje, homogenizaciju, vađenje ili otplinjavanje laboratorijskih uzoraka.

    Ultrazvučni Cuphorn (200 vata)

    Minijatura videozapisa

    Ultrazvučni homogenizatori za E. coli lizu

    Hielscher Ultrasonics dizajnira, proizvodi i opskrbljuje ultrazvučne homogenizatore visokih performansi za pouzdanu i učinkovitu lizu bakterija E. coli i drugih tipova stanica, tkiva i staničnih kultura.
    Širok portfelj ultrazvučnih sondi kao i neizravnih sustava ultrazvukom omogućuje nam da vam ponudimo idealan ultrazvučni homogenizator tkiva za vašu primjenu poremećaja i ekstrakcije stanica.

    Dizajn, proizvodnja i savjetovanje – Kvaliteta proizvedena u Njemačkoj

    Hielscher ultrasonicators može se daljinski upravljati putem kontrole preglednika. Parametri ultrazvukom mogu se pratiti i prilagoditi upravo zahtjevima procesa.Hielscher ultrasonicators su poznati po svojim najvišim standardima kvalitete i dizajna. Pametni softver, intuitivan izbornik, programabilne postavke i automatsko protokoliranje podataka samo su neke od značajki Hielscher ultrasonicators. Robusnost i jednostavan rad omogućuju glatku integraciju naših ultrasonicators u istraživanja i biotehnološke objekte. Čak i grubi uvjeti i zahtjevna okruženja lako se nose s Hielscher ultrasonicators.

    Hielscher Ultrasonics je tvrtka s ISO certifikatom i poseban naglasak stavlja na ultrazvučne uređaje visokih performansi s najsuvremenijom tehnologijom i prilagođenošću korisnicima. Naravno, Hielscher ultrasonicators su CE sukladni i zadovoljavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

    Tablica u nastavku daje vam pokazatelj približne mogućnosti obrade naših ultrazvučnih uređaja:

    Batch Volumen Protok Preporučeni uređaji
    multi-well / mikrotiter ploče N.a. UIP400MTP
    CupHorn za bočice ili čaše N.a. Ultrazvučno cuphorn
    Ultrazvučni reaktor mikro-protoka N.a. GDmini2
    do 10 bočica s 0,5 do 1,5 ml N.a. VialTweeter
    00,5 do 1,5 ml N.a. VialTweeter
    1 do 500 mL 10 do 200 mL / min UP100H
    10 do 2000 ml 20 do 400 mL / min Uf200 ः t, UP400St
    0.1 do 20L 0.2 do 4L / min UIP2000hdT
    10 do 100L 2 do 10 l / min UIP4000
    N.a. 10 do 100 l / min UIP16000
    N.a. veći grozd UIP16000

    Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!

    Zatražite dodatne informacije

    Molimo koristite donji obrazac kako biste zatražili dodatne informacije o ultrazvučnim homogenizatorima tkiva i drobilicama stanica, primjenama lize i cijenama. Rado ćemo razgovarati o vašem procesu s vama i ponuditi vam ultrazvučni homogenizator koji ispunjava vaše zahtjeve!









    Molimo, imajte na umu da je pravila o privatnosti,


    Video prikazuje ultrazvučni sustav pripreme uzoraka UIP400MTP, koji omogućuje pouzdanu pripremu uzorka bilo koje standardne ploče s više bušotina pomoću ultrazvuka visokog intenziteta. Tipične primjene UIP400MTP uključuju lizu stanica, DNA, RNA, i kromatina striženje, kao i ekstrakciju proteina.

    Ultrasonicator UIP400MTP za ultrazvukom ploča s više bušotina

    Minijatura videozapisa

    Dodatni protokoli za ultrazvučnu E. coli lizu

    Allicin-modificirani proteini u E. coli pomoću Ultrazvučni VialTweeter

    VialTweeter na ultrazvučnom procesoru UP200STOdređivanje sadržaja sulfhidril od 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzojeve kiseline) (DTNB) Test
    Kultura E. coli MG1655 preko noći korištena je za cijepljenje MOPS minimalnog medija (1:100). Kultura je uzgajana aerobno sve dok nije postignut A600 od 0,4. Kultura je podijeljena u tri kulture od 15 ml za liječenje stresa. Neliječena kultura služila je kao negativna kontrola. U jednu od preostale dvije kulture dodano je 0,79 mM alicina (128 μg ml-1) ili 1 mM diamida. Kulture su inkubirane 15 min. 5 ml svake kulture ubrano je centrifugiranjem (8.525 × g, 4°C, 10 min). Stanice su dvaput oprane s 1 ml PBS-a (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, pohranjene anaerobno prije uporabe) i centrifugirane (13.000 × g, 4 °C, 10 min). Stanice su resuspended u puferu za lizu (PBS sa 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) prije poremećaja na 4 °C ultrazvukom (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Njemačka) (3 × 1 min). Ostaci stanica peletirani su centrifugiranjem (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant je prebačen u 3,5-ml QS-makro kivete (10 mm) s magnetskom šipkom za miješanje i pomiješan s 1 ml pufera za lizu. Izumiranje uzoraka praćeno je na 412 nm s Jasco V-650 spektrofotometrom opremljenim držačem stanica s kontroliranom temperaturom PSC-718 na sobnoj temperaturi. Dodano je 100μl otopine dithiobisa (2-nitrobenzojeve kiseline) od 3 mM. Izumiranje se pratilo sve dok nije doseglo zasićenje. Proračun koncentracije tiola proveden je pomoću koeficijenta izumiranja ε412 = 13,7 tisuća M-1 Cm-1 za tio-2-nitrobenzojeve kiseline (TNB). Stanični tiolni koncentracije su izračunate na temelju volumena stanica E. coli 6.7 x 10-15 litra i gustoća ćelija A600 = 0,5 (ekvivalent 1 × 108 stanica ml-1 kultura). (Muller et al. 2016)
     

    In vivo određivanje glutationa pomoću ultrazvučne drobilice stanica

    E.coli MG1655 uzgajana je u MOPS minimalnom mediju u ukupnom volumenu od 200 ml dok nije postignut A600 od 0,5. Kultura je podijeljena na kulture od 50 ml za liječenje stresa. Nakon 15 minuta inkubacije s alicinom od 0,79 mM, dijamidom od 1 mM ili dimetil sulfoksidom (kontrolom), stanice su ubrane na 4,000 g na 4 ° C tijekom 10 minuta. Stanice su dvaput oprane KPE puferom prije ponovne suspenzije peleta u 700 μl KPE pufera. Za deproteinaciju, 300l 10% (w / v) sulfosalicilne kiseline dodano je prije poremećaja stanica ultrazvukom (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatanti su sakupljeni nakon centrifugiranja (30 minuta, 13,000g, 4 ° C). Koncentracije sulfosalicilna kiselina smanjene su na 1% dodatkom 3 volumena pufera KPE. Mjerenja ukupnog glutationa i GSSG su izvedeni kao što je gore opisano. Stanične koncentracije glutationa se izračunava na temelju volumena od E. coli stanice 6.7×10-15 litra i gustoća ćelija A600 0,5 (ekvivalent 1×108 stanica ml-1 Kultura). Koncentracije GSH izračunate su oduzimanjem 2 [GSSG] od ukupnog glutationa. (Muller et al. 2016)

    Ekspresija ljudskog mAspAT u E. coli pomoću ultrazvučnog homogenizatora

    Ultrazvučni stanica disruptor UP400St (400 W) za ekstrakciju intracelularnog tvari (na primjer, proteina organele, DNA, RNA, itd)Jednostrukog kolonija E. coli BL21 (DE3) nose ekspresijski vektor u 30 ml Luria-Bertani (LB) medij koji sadrži 100 ug / ml ampicilina, i zatim su uzgajane na 37ºC do optičke gustoće (OD600) Dosegne 0.6. Stanice su sakupljene centrifugiranjem na 4000 × g tijekom 10 minuta, te ponovno suspendirane u 3L svježem LB mediju koji sadrži 100 ug / ml ampicilina.
    Nakon toga, ekspresija proteina inducirana je s 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG) tijekom 20 h na 16ºC. Stanice su ubrane centrifugiranjem na 8.000 × g tijekom 15 minuta i oprane puferom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Približne stanice od 45 g (mokre težine) dobivene su iz kulture 3 L. Nakon centrifugiranja, stanične pelete su ponovno potrošene u 40 mL (za 1 L kulturu) ledeno hladnog ekstrakcijskog pufera A, a lizirane ultrazvukom na ledeno hladnoj temperaturi pomoću Hielscher ultrazvučne stanične drobilice UP400St. Stanična liza centrifugirana je na 12.000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta kako bi se odvojile topljive (supernatantne) i taložene (peletne) frakcije. (Jiang i sur. 2015)
     



    Činjenice koje vrijedi znati

    E coli

    Escherichia coli (E. coli) je gram-negativna, fakultativno anaerobna, štapićna, koliformna bakterija roda Escherichia koja se obično nalazi u donjem crijevu toplokrvnih organizama (endotermi). Postoji veliki broj E. coli sojeva (ili podtipova) s različitim karakteristikama. Većina E. coli sojeva je bezopasna za ljude, npr. B i K-12 sojeve koji se najčešće koriste za istraživanja u laboratorijima. Međutim, neki sojevi su štetni i mogu uzrokovati ozbiljnu bolest.
    E. coli igra važnu ulogu u suvremenom biološkom inženjerstvu i industrijske mikrobiologije, jer bakterije lako manipulirati. Uobičajeni laboratorijski aplikacije koje uključuju često korištenje E. coli, na pr stvaranje rekombinantnog deoksiribonukleinske kiseline (DNA), ili djelovati kao modelni organizam.
    E. coli je svestran domaćin za proizvodnju heterolognih proteina i mnogostruke proteinski ekspresijski sustavi su dostupni za proizvodnju rekombinantnih proteina u E. coli. Koristeći plazmide koji omogućuju visoke razine ekspresije proteina, geni mogu biti uvedeni u bakterija, što omogućuje za proizvodnju takvih proteina u velikim količinama u industrijskim procesima vrenja.
    E.coli se koristi kao tvornice stanica za proizvodnju inzulina. Daljnje primjene uključuju uporabu modificiranih stanica E. coli za razvoj i proizvodnju cjepiva i imobiliziranih enzima, za proizvodnju biogoriva, kao i za bioremedijaciju.
    Soj K-12 je mutantni oblik E. coli koje prekomjerno izražava enzima alkalne fosfataze (ALP). Ova mutacija nastaje zbog oštećenja na genu koji stalno kodovi za enzima. Ako je gen proizvodi proizvod bez inhibicija to je poznato kao konstitutivnog aktivnosti. Ovo specifično mutantni oblik koristi za izolaciju i purifikaciju ALP enzim.
    Bakterije E. coli također se široko koriste kao tvornice stanica. Projektirani mikrobi (npr. Bakterije) i biljne stanice mogu se koristiti kao takozvane tvornice stanica. Te genetski modificirane stanice proizvode molekule, kemikalije, polimere, proteine i druge tvari koje se koriste, na primjer, u farmaceutskoj, prehrambenoj i kemijskoj industriji. Kako bi se oslobodile molekule proizvedene u unutrašnjosti takvih bioinženjerednih stanica, ultrazvučna liza je uobičajena metoda za ometanje staničnih stijenki i prijenos ciljnih tvari u okolnu tekućinu. Pročitajte više o lizi bioinženjered stanica!

    Ultrasonic shearing DNA

    Ultrazvučne sile smicanja su često korištena metoda za oslobađanje molekula, organela i proteina iz unutrašnjosti stanice, kao i za razbijanje DNA niti na komade. Akustična kavitacija razbija stanične stijenke i membrane kako bi izvukla DNK iz stanica i stvorila fragmente od oko 600 – 800 bp duljine, što je idealno za analizu.
    Kliknite ovdje kako bi naučili više o ultrazvučni homogenizator za DNA fragmentacije!

    Književnost / Reference


    High performance ultrazvuka! Hielscher asortiman proizvoda pokriva cijeli spektar od kompaktnog laboratorija ultrasonicator preko bench-top jedinica do full-industrial ultrazvučnih sustava.

    Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi Laboratorija do industrijske veličine.


    Rado ćemo razgovarati o vašem procesu.

    Stupimo u kontakt.