Ultrazvučna liza bioinženjerski modificiranih stanica u industrijskoj proizvodnji

Bioinženjerski modificirane bakterijske vrste poput E. coli, kao i genetički modificirani tipovi stanica sisavaca i biljaka, široko se upotrebljavaju u biotehnologiji za ekspresiju molekula. Za oslobađanje tih sintetiziranih biomolekula potrebna je pouzdana tehnika razaranja stanica. Ultrazvučna obrada visokih performansi dokazana je metoda za učinkovitu i pouzdanu lizu stanica – lako se skalira na velike kapacitete obrade. Hielscher Ultrasonics nudi vam ultrazvučnu opremu visokih performansi za učinkovitu lizu stanica radi proizvodnje velikih količina visokokvalitetnih biomolekula.

Ekstrakcija molekula iz staničnih tvornica

Za proizvodnju širokog raspona biomolekula kao mikrobne stanične tvornice mogu se upotrebljavati različiti modificirani mikroorganizmi i biljne stanice, uključujući Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana i alge, među mnogim drugima. Te stanične tvornice mogu proizvoditi proteine, lipide, biokemikalije, polimere, biogoriva i oleokemikalije, koji se upotrebljavaju kao hrana ili sirovine za industrijske primjene. Stanice koje se upotrebljavaju kao stanične tvornice uzgajaju se u zatvorenim bioreaktorima, gdje mogu postići visoku učinkovitost i specifičnost uz niske energetske zahtjeve.
Za izolaciju ciljnih molekula iz bioinženjerski modificiranih staničnih kultura stanice se moraju razoriti kako bi se oslobodio unutarstanični materijal. Uporaba ultrazvučnih uređaja za razaranje stanica dobro je etablirana kao vrlo pouzdana i učinkovita tehnika dezintegracije stanica i oslobađanja spojeva.

Mikrobne stanične tvornice stanice su modificirane metaboličkim inženjerstvom koje se upotrebljavaju za sintezu različitih vrijednih spojeva. Ultrazvučno razaranje stanica učinkovita je i pouzdana metoda oslobađanja vrijednih spojeva iz unutrašnjosti stanica.
istraživanje i grafički prikaz: ©Villaverde, 2010.

Prednosti ultrazvučnih uređaja za razaranje stanica

Kao netoplinska, blaga, a ipak vrlo učinkovita tehnologija, ultrazvučni uređaji za razaranje stanica upotrebljavaju se u laboratoriju i industriji za lizu stanica i proizvodnju visokokvalitetnih ekstrakata, primjerice za izolaciju molekula iz staničnih tvornica.

Ultrazvuk velike snage za učinkovito razaranje mikrobnih staničnih tvornica

Mehanizam i učinci ultrazvučnih uređaja za razaranje stanica:
Ultrazvučno razaranje stanica koristi snagu ultrazvučnih valova. Ultrazvučni homogenizator / uređaj za razaranje stanica opremljen je sondom (poznatom i kao sonotroda) izrađenom od titanijeve legure koja oscilira na visokoj frekvenciji od približno 20 kHz. To znači da ultrazvučna sonda prenosi 20.000 vibracija u sekundi u tekućinu koja se sonicira. Ultrazvučne valove koji se prenose u tekućinu karakteriziraju izmjenični ciklusi visokog / niskog tlaka. Tijekom ciklusa niskog tlaka tekućina se širi i nastaju sićušni vakuumski mjehurići. Ti vrlo mali mjehurići rastu tijekom nekoliko izmjeničnih ciklusa tlaka sve dok više ne mogu apsorbirati dodatnu energiju. U tom trenutku kavitacijski mjehurići silovito implodiraju i lokalno stvaraju okruženje iznimno visoke gustoće energije. Ta je pojava poznata kao akustična kavitacija, a karakteriziraju je lokalno vrlo visoke temperature, vrlo visoki tlakovi i smične sile. Ta smična naprezanja učinkovito razaraju stanične stijenke i povećavaju prijenos tvari između unutrašnjosti stanice i okolnog otapala. Ultrazvučno generirane smične sile, kao isključivo mehanička tehnika, široko se primjenjuju i preporučuju za razaranje bakterijskih stanica, kao i za izolaciju proteina. Kao jednostavna i brza metoda razaranja stanica, sonikacija je idealna za izolaciju iz malih, srednjih i velikih volumena. Digitalni ultrazvučni uređaji tvrtke Hielscher opremljeni su preglednim izbornikom postavki za precizno upravljanje sonikacijom. Svi podaci o sonikaciji automatski se pohranjuju na ugrađenu SD karticu i lako su dostupni. Napredne mogućnosti odvođenja topline, kao što su vanjsko hlađenje, sonikacija u pulsnom načinu rada itd., tijekom procesa ultrazvučnog razaranja osiguravaju održavanje idealne procesne temperature, a time i očuvanost ekstrahiranih spojeva osjetljivih na toplinu.

Istraživanja ističu prednosti ultrazvučnog razaranja stanica i ekstrakcije

Prof. Chemat i sur. (2017) u svojem istraživanju zaključuju da je „ekstrakcija potpomognuta ultrazvukom ekološki prihvatljiva i ekonomski održiva alternativa konvencionalnim tehnikama za hranu i prirodne proizvode. Glavne su prednosti smanjenje vremena ekstrakcije i obrade, količine upotrijebljene energije i otapala, broja jediničnih operacija te emisija CO₂ .“
Gabig-Ciminska i sur. (2014) u svojem su istraživanju upotrijebili visokotlačni homogenizator i ultrazvučni uređaj za razaranje stanica za lizu spora radi oslobađanja DNA. Uspoređujući obje metode razaranja stanica, istraživački tim u pogledu stanične lize radi dobivanja DNA iz spora zaključuje: „analiza je provedena upotrebom staničnih lizata dobivenih visokotlačnom homogenizacijom. Nakon toga shvatili smo da ultrazvučno razaranje stanica ima izvanredne prednosti za tu svrhu. Prilično je brzo i može se provoditi s malim volumenima uzoraka.“ (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekule iz staničnih tvornica za proizvodnju hrane

Mikrobne stanične tvornice održiva su i učinkovita proizvodna metoda koja upotrebljava mikrobne organizme za postizanje visokih prinosa nativnih i nenativnih metabolita metaboličkim bioinženjerstvom mikroorganizama kao što su bakterije, kvasci, gljive itd. Enzimi se, primjerice, proizvode u velikim količinama upotrebom mikroorganizama kao što su Aspergillus oryzae, gljive i bakterije. Ti se enzimi upotrebljavaju za proizvodnju hrane i pića te u poljoprivredi, bioenergetici i održavanju kućanstva.
Određene bakterije, kao što su Acetobacter xylinum i Gluconacetobacter xylinus, proizvode celulozu tijekom procesa fermentacije, pri čemu se nanovlakna sintetiziraju postupkom odozdo prema gore. Bakterijska celuloza (poznata i kao mikrobna celuloza) kemijski je istovjetna biljnoj celulozi, ali ima visok stupanj kristaliničnosti i visoku čistoću (bez lignina, hemiceluloze, pektina i drugih biogenih sastavnica) te jedinstvenu strukturu trodimenzionalne (3D) mreže isprepletene od celuloznih nanovlakana. (cf. Zhong, 2020) U usporedbi s celulozom biljnog podrijetla, bakterijska celuloza održivija je, a proizvedena celuloza čista je i ne zahtijeva složene korake pročišćavanja. Ultrazvučna obrada i ekstrakcija otapalom uz upotrebu NaOH ili SDS-a (natrijeva dodecil-sulfata) vrlo su učinkovite za izolaciju bakterijske celuloze iz bakterijskih stanica.

Biomolekule iz staničnih tvornica za proizvodnju lijekova i cjepiva

Jedan od najistaknutijih farmaceutskih proizvoda dobivenih iz staničnih tvornica jest ljudski inzulin. Za proizvodnju inzulina bioinženjerstvom pretežno se upotrebljavaju E. coli i Saccharomyces cerevisiae. Budući da biosintetizirane molekule nanometarskih dimenzija imaju visoku biokompatibilnost, biološke nanočestice kao što je feritin pružaju prednosti u brojnim primjenama bioproizvodnje. Osim toga, proizvodnja u metabolički modificiranim mikrobima često je znatno učinkovitija u pogledu ostvarenih prinosa. Primjerice, proizvodnja artemizininske kiseline, resveratrola i likopena povećala se od deset do nekoliko stotina puta te je već uspostavljena u industrijskim razmjerima ili je u fazi razvoja prema takvoj proizvodnji. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Primjerice, biomolekule nanometarskih dimenzija na bazi proteina koje imaju svojstva samosastavljanja, kao što su feritin i čestice nalik virusima, osobito su zanimljive za razvoj cjepiva jer oponašaju i veličinu i strukturu patogena te omogućuju konjugaciju antigena na svojoj površini radi poticanja interakcije s imunosnim stanicama. Takve se molekule eksprimiraju u takozvanim staničnim tvornicama (npr. modificiranim sojevima E. coli), koje proizvode određenu ciljnu molekulu.

Protokol za ultrazvučnu lizu E. coli BL21 radi oslobađanja feritina

Feritin je protein čija je primarna funkcija pohrana željeza. Feritin pokazuje obećavajući potencijal kao samosastavljajuće nanočestice u cjepivima, gdje se upotrebljava kao nosač za dostavu cjepiva (npr. proteina šiljka SARS-Cov-2). Znanstveno istraživanje Sun et. al. (2016) pokazuje da se rekombinantni feritin može osloboditi u topljivom obliku iz Escherichia coli pri niskim koncentracijama NaCl (≤50 mmol/L). Za ekspresiju feritina u E. coli BL21 i oslobađanje feritina uspješno je primijenjen sljedeći protokol. Rekombinantni plazmid pET-28a/ferritin unesen je transformacijom u soj E coli BL21 (DE3). Stanice E coli BL21 (DE3) koje proizvode feritin uzgajane su u hranjivim podlogama LB s 0,5% kanamicina pri 37°C te je pri OD600 od 0,6 provedena indukcija s 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranozida tijekom 3 sata pri 37°C. Završna kultura zatim je sakupljena centrifugiranjem pri 8000g tijekom 10 minuta pri 4°C te je prikupljen talog. Zatim je talog resuspendiran u podlozi LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstrakta kvasca)/puferu za lizu (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) i otopinama NaCl različitih koncentracija (0, 50, 100, 170 i 300 mmol/L), redom. Za lizu bakterijskih stanica primijenjena je sonikacija u pulsnom načinu rada: npr. primjenom ultrazvučnog uređaja UP400St pri amplitudi od 100% s radnim ciklusom od 5 sekundi uključeno, 10 sekundi isključeno, tijekom 40 ciklusa), a zatim je provedeno centrifugiranje pri 10 000g tijekom 15 minuta na 4°C. Supernatant i talog analizirani su elektroforezom u poliakrilamidnom gelu uz natrijev dodecil sulfat (SDS-PAGE). Svi gelovi obojeni natrijevim dodecil sulfatom skenirani su skenerom visoke razlučivosti. Slike gelova analizirane su softverom Magic Chemi 1D. Za optimalnu jasnoću proteinske vrpce detektirane su podešavanjem parametara. Podaci za vrpce dobiveni su iz tehničkih triplikata. (cf. Sun et al., 2016)

Ultrazvučni uređaji za razaranje stanica za industrijsku lizu staničnih tvornica

Ultrazvučna liza i ekstrakcija pouzdana je i praktična metoda oslobađanja metabolita iz staničnih tvornica, čime se pridonosi učinkovitoj proizvodnji ciljnih molekula. Ultrazvučni uređaji za razaranje stanica dostupni su u veličinama od laboratorijskih do industrijskih, a procesi se mogu povećavati potpuno linearno.
Hielscher Ultrasonics vaš je stručni partner za ultrazvučne uređaje za razaranje stanica visokih performansi te ima dugogodišnje iskustvo u ugradnji ultrazvučnih sustava u stolne i industrijske postave.
Kada je riječ o naprednom hardveru i softveru, sustavi za razaranje stanica tvrtke Hielscher Ultrasonics ispunjavaju sve zahtjeve za optimalnu kontrolu procesa, jednostavno rukovanje i praktičnost uporabe. Kupci i korisnici Hielscher ultrazvučnih uređaja cijene mogućnost preciznog praćenja i kontrole procesa koju pružaju Hielscher ultrazvučni uređaji za razaranje stanica i ekstraktori – putem digitalnog zaslona osjetljivog na dodir i daljinskog upravljanja putem preglednika. Svi važni podaci o sonikaciji (npr. neto energija, ukupna energija, amplituda, trajanje, temperatura, tlak) automatski se pohranjuju kao CSV datoteka na ugrađenu SD karticu. To pomaže u postizanju reproducibilnih i ponovljivih rezultata te olakšava standardizaciju procesa i ispunjavanje zahtjeva dobre proizvođačke prakse (cGMP).
Naravno, Hielscher ultrazvučni procesori izrađeni su za rad 24/7 pod punim opterećenjem te stoga mogu pouzdano raditi u industrijskim proizvodnim uvjetima. Zbog velike robusnosti i malih zahtjeva za održavanjem, vrijeme zastoja ultrazvučne opreme doista je kratko. Funkcije CIP (čišćenje na mjestu) i SIP (sterilizacija na mjestu) svode zahtjevno čišćenje na najmanju moguću mjeru, osobito zato što svi dijelovi u dodiru s tekućinom imaju glatke metalne površine (bez skrivenih otvora ili mlaznica).

Tablica u nastavku daje vam uvid u približni kapacitet obrade naših ultrazvučnih uređaja: