Bioinženjerirane vrste bakterija kao što su E. coli, kao i genetski modificirani tipovi sisavaca i biljnih stanica široko se koriste u biotehnologiji za izražavanje molekula. Da bi se oslobodile ove sintetizirane bio-molekule, potrebna je pouzdana tehnika poremećaja stanica. High-performance ultrasonication je dokazana metoda za učinkovitu i pouzdanu lizu stanica – lako skalabilna na velike propusnosti. Hielscher Ultrasonics nudi vam ultrazvučnu opremu visokih performansi za učinkovitu lizu stanica kako biste proizveli velike količine visokokvalitetnih bio-molekula.

Ekstrakcija molekula iz tvornica stanica

Za proizvodnju širokog raspona biomolekula, različiti projektirani mikrobi i biljne stanice mogu se koristiti kao tvornice mikrobnih stanica, uključujući Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrow Yaria lipolytica, Nicotiana benthamiana i alge, među mnogim drugima. Ove tvornice stanica mogu proizvoditi proteine, lipide, biokemikalije, polimere, biogoriva i oleokemikalije, koji se koriste kao hrana ili sirovina za industrijske primjene. Stanice koje se koriste kao tvornice stanica kultiviraju se u zatvorenim bioreaktorima, gdje mogu postići visoku učinkovitost, specifičnost i niske energetske potrebe.
Da bi se izolirale ciljne molekule iz kultura bioinženjerijerskih stanica, stanice moraju biti poremećene tako da se oslobodi unutarstanični materijal. Ultrazvučni stanični disruptori su dobro uspostavljeni kao vrlo pouzdana i učinkovita tehnika za dezintegraciju stanica i oslobađanje spoja.

Tvornice mikrobnih stanica su metabolički projektirane stanice koje se koriste za sintezu različitih vrijednih spojeva. Ultrazvučni poremećaj stanica je učinkovita i pouzdana metoda za oslobađanje vrijednih spojeva iz unutrašnjosti stanica.
studij i grafika: ©Villaverde, 2010.

Prednosti ultrazvučnih staničnih disruptora

Kao ne-termalna, blaga, ali vrlo učinkovita tehnologija, ultrazvučni disruptori se koriste u laboratoriju i industriji za lizanje stanica i za proizvodnju visokokvalitetnih ekstrakata, npr.

Power-ultrazvuk za učinkovito ometanje tvornica mikrobnih stanica

Mehanizam i učinci ultrazvučnih staničnih disruptora:
Ultrazvučni poremećaj stanica koristio je snagu ultrazvučnih valova. Ultrazvučni homogenizator / stanični disruptor opremljen je sondom (tzv. sonotrode) izrađenom od legure titana koja oscilira na visokoj frekvenciji od oko 20 kHz. To znači ultrazvučna sonda parovi 20.000 vibracija u sekundi u ultrazvukom tekućine. Ultrazvučni valovi spojeni u tekućinu karakteriziraju naizmjenični ciklusi visokog tlaka / niskog tlaka. Tijekom ciklusa niskog tlaka, tekućina se širi i nastaju minutni vakuumski mjehurići. Ovi vrlo mali mjehurići rastu tijekom nekoliko naizmjeničnih ciklusa tlaka dok ne mogu apsorbirati daljnju energiju. U ovom trenutku, mjehurići kavitacije nasilno implodirati i stvoriti lokalno izvanredno energetski gusto okruženje. Ovaj fenomen je poznat kao akustična kavitacija i karakteriziraju ga lokalno vrlo visoke temperature, vrlo visoki tlakovi i sile smicanja. Ovi naprezanja smicanja učinkovito razbijaju stanične zidove i povećavaju prijenos mase između unutrašnjosti stanice i okolnog otapala. Kao čisto mehanička tehnika, ultrazvučno generirane sile smicanja su široko korištene i preporučeni postupak za poremećaj bakterijskih stanica, kao i za izolaciju proteina. Kao jednostavna i brza metoda prekida stanica, ultrazvukom je idealan za izolaciju malih, srednjih i velikih volumena. Hielscherovi digitalni ultrasonicatori opremljeni su jasnim izbornikom postavki za preciznu kontrolu ultrazvukom. Svi podaci o ultrazvukom automatski se pohranjuju na ugrađenoj SD kartici i jednostavno su dostupni. Sofisticirane opcije rasipanja topline kao što su vanjsko hlađenje, ultrazvukom u pulsnom načinu rada itd. tijekom ultrazvučnog procesa dezintegracije osiguravaju održavanje idealne temperature procesa, a time i netaknutost ekstrahiranih spojeva osjetljivih na toplinu.

Istraživanje naglašava prednosti ultrazvučnih poremećaja stanica i ekstrakcije

(2017) nastavlja u svojoj studiji da je "ultrazvučno potpomognuta ekstrakcija zelena i ekonomski održiva alternativa konvencionalnim tehnikama za hranu i prirodne proizvode. Glavne prednosti su smanjenje vremena ekstrakcije i obrade, količina korištene energije i otapala, jedinične operacije i CO₂ emisije."
Gabig-Ciminska i sur. (2014) koristili su visokotlačni homogenizator i ultrazvučni stanični dsintegrator u svojoj studiji za lizu spora kako bi oslobodili DNA. Uspoređujući obje metode poremećaja stanica, istraživački tim zaključuje da je u vezi s lizom stanica za DNA spora "analiza provedena korištenjem lizata stanica iz homogenizacije visokog tlaka. Nakon toga smo shvatili da ultrazvučni poremećaj stanica ima izvanredne prednosti za tu svrhu. Prilično je brz i može se obraditi za male količine uzoraka." (Gabig-Ciminska i sur., 2014.)

Biomolekule iz tvornica stanica za proizvodnju hrane

Tvornice mikrobnih stanica održiva su i učinkovita metodologija proizvodnje pomoću mikrobnih organizama za proizvodnju visokih prinosa izvornih i ne-izvornih metabolita metaboličkim bioinženjeringom mikrobnih mikroorganizama kao što su bakterije, kvasci, gljivice itd. Rasuti enzimi se na primjer proizvode pomoću mikroorganizama auch kao Aspergillus oryzae, gljivice i bakterije. Ti se enzimi u rasutom stanju koriste za proizvodnju hrane i pića, kao i za poljoprivredu, bioenergiju i njegu kućanstava.
Određene bakterije kao što su Acetobacter xylinum i Gluconacetobacter xylinus proizvode celuloza tijekom procesa fermentacije, gdje se nanofiberi sintetiziraju u procesu odozdo prema gore. Bakterijska celuloza (također poznata kao mikrobna celuloza) kemijski je ekvivalentna biljnoj celulozi, ali ima visok stupanj kristalnosti i visoku čistoću (bez lignina, hemiceluloze, pektina i drugih biogenih komponenti), kao i jedinstvenu strukturu trodimenzionalne (3D) mreža s celulozom. (usp. Zhong, 2020.) U usporedbi s celuloza dobivena iz biljaka, bakterijska celuloza je održivija, a proizvedena celuloza čista ne zahtijeva složene korake pročišćavanja. Ultrazvuka i ekstrakcija otapala pomoću NaOH ili SDS (natrijev dodecil sulfat) vrlo su učinkoviti za izolaciju bakterijske celuloze iz bakterijskih stanica.

Biomolekule iz tvornica stanica za farmaceutsku proizvodnju i proizvodnju cjepiva

Jedan od najistaknutijih farmaceutskih proizvoda dobivenih iz tvornica stanica je ljudski inzulin. Za proizvodnju bioinženjered inzulina koriste se pretežno E. coli i Saccharomyces cerevisiae. Budući da biosintetizirane molekule nano veličine nude visoku biokompatibilnost, biološke nanočestice kao što je feritin povoljne su za brojne primjene bioproizvodnje. Osim toga, proizvodnja u metabolički projektiranim mikrobima često je znatno učinkovitija u dobivenim prinosima. Na primjer, proizvodnja artemisinske kiseline, resveratrola i likopena povećala se deset puta na nekoliko stotina puta, a već je uspostavljena ili je u razvoju za industrijsku proizvodnju. (usp. Liu et al.; Mikrob. Činjenica ćelije. 2017)
Na primjer, biomolekule na bazi proteina s svojstvima samosastavljanja kao što su feritin i čestice slične virusu posebno su zanimljive za razvoj cjepiva jer oponašaju i veličinu i strukturu patogena i podložne su iskrivljavanju antigena kako bi se promicala interakcija s imunološkim stanicama. Takve molekule izražavaju se u takozvanim tvornicama stanica (npr. projektirani sojevi E. coli), koji proizvode određenu ciljnu molekulu.

Protokol za ultrazvučnu lizu i E. coli BL21 za oslobađanje feritina

Feritin je protein, koji primarna funkcija je skladištenje željeza. Ferritin pokazuje obećavajuće sposobnosti kao samo-sastavljanje nanočestica u cjepivima, gdje se koristi kao vozilo za isporuku cjepiva (npr. SARS-Cov-2 proteini šiljaka). Znanstvena istraživanja Sun et. al. (2016. godine) pokazuje da se rekombinantni feritin može osloboditi kao topljivi oblik iz Escherichia coli pri niskim koncentracijama NaCl (≤50 mmol/L). Kako bi se izrazio feritin u E. coli BL21 i oslobodio fertin, uspješno je primijenjen sljedeći protokol. Rekombinantni pET-28a/feritin plazmid pretvoren je u soj E coli BL21 (DE3). Stanice feritina E coli BL21 (DE3) kultivirane su u LB medijima rasta s 0,5% kanamicina na 37 °C i inducirane na OD600 od 0,6 s 0,4% izopropil-β-D-tiogalactopyranoside 3 sata na 37 °C. Konačna kultura potom je ubrana centrifugiranjem na 8000g tijekom 10 minuta na 4°C, a kuglica je sakupljena. Zatim je kuglica ponovno upoštena u LB medij (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstrakt kvasca)/pufer za lizu (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) i različitim koncentracijama Otopine NaCl (0, 50, 100, 170 i 300 mmol/L). Za lizu bakterijskih stanica, ultrazvukom je primijenjena u pulsnom načinu rada: npr. ultrasonicator UP400St na 100% amplituda s e-ciklusom od 5 sekundi UKLJUČENO, 10 sekundi ISKLJUČENO, za 40 ciklusa), a zatim centrifugirati na 10 000g tijekom 15 minuta na 4 °C. Supernatant i talog analizirani su natrijevim dodecil sulfatnim poliakrilamidnim gelom elektroforezom (SDS-PAGE). Svi gelovi umrljani natrijevim dodecil sulfatom skenirani su skenerom visoke rezolucije. Gel slike analizirane su pomoću Magic Chemi 1D softvera. Radi optimalne jasnoće, proteinske trake otkrivene su podešavanjem parametara. Podaci za pojaseve generirani su iz tehničkih triplicates. (usp. Sun et al., 2016.)

Ultrazvučni stanični disruptori za industrijsku lizu tvornica stanica

Ultrazvučna liza i ekstrakcija je pouzdana i ugodna metoda za oslobađanje metabolita iz tvornica stanica i time pomaže učinkovitoj proizvodnji ciljnih molekula. Ultrazvučni stanični disruptori dostupni su od laboratorija do industrijske veličine i procesi se mogu skalirati potpuno linearno.
Hielscher Ultrasonics je vaš kompetentan partner za visoke performanse ultrazvučnih disruptora i ima dugogodišnje iskustvo u području implantacije ultrazvučnih sustava u klupa-top i industrijske postavke.
Kada je riječ o sofisticiranom hardveru i softveru, Hielscher Ultrasonics sustavi za prekide stanica ispunjavaju sve zahtjeve za optimalnu kontrolu procesa, jednostavan rad i jednostavnost korištenja. Kupci i korisnik Hielscher ultrasonicators vrijednost korist da Hielscher ultrazvučni stanični disruptori i ekstraktori omogućuju precizno praćenje i kontrolu procesa – putem digitalnog zaslona osjetljivog na dodir i daljinskog upravljača preglednika. Svi važni podaci o ultrazvukom (npr. neto energija, ukupna energija, amplituda, trajanje, temperatura, tlak) automatski se pohranjuju kao CSV datoteka na integriranoj SD kartici. To pomaže u postizanju ponovljivih i ponovljivih rezultata i olakšava standardizaciju procesa, kao i ispunjavanje dobrih proizvodnih praksi (cGMP).
Naravno, Hielscher ultrazvučni procesori su izgrađeni za 24/7 rad pod punim opterećenjem i stoga se pouzdano radi u industrijskim proizvodnim okruženjima. Zbog visoke robusnosti i niskog održavanja, zastoji ultrazvučne opreme su stvarno niski. CIP (clean-in-place) i SIP (sterilizirajte na mjestu) značajke minimiziraju naporno čišćenje, pogotovo zato što su svi mokri dijelovi glatke metalne površine (bez skrivenih otvora ili mlaznica).

Tablica u nastavku daje vam pokazatelj približne mogućnosti obrade naših ultrazvučnih uređaja: