Biosintetska proizvodnja oligosaharida ljudskog mlijeka
Biosinteza oligosaharida ljudskog mlijeka (HMO) putem fermentacije ili enzimatskih reakcija složen je, dugotrajan i često nizak proces. Ultrasonication povećava prijenos mase između supstrata i staničnih tvornica i stimulira rast stanica i metabolizam. Na taj način sonikacija intenzivira fermentaciju i biokemijske procese što rezultira ubrzanom i učinkovitijom proizvodnjom HMO-a.
Oligosaharidi ljudskog mlijeka
Oligosaharidi ljudskog mlijeka (HMO), također poznati kao glikani ljudskog mlijeka, su molekule šećera koje su dio grupe oligosaharida. Istaknuti primjeri HMO uključuju 2'-fukozilaktozu (2′-FL), lakto-N-neotetraoza (LNnT), 3'-galaktozilaktoza (3′-GL) i difukozilaktozu (DFL).
Dok se majčino mlijeko sastoji od više od 150 različitih HMO struktura, samo se 2'-fukozilaktoza (2'-FL) i lakto-N-neotetraoza (LNnT) trenutno proizvode na komercijalnoj razini i koriste kao prehrambeni dodaci u formulama za dojenčad.
Oligosaharidi ljudskog mlijeka (HMO) poznati su po svom značaju u prehrani beba. Oligosaharidi ljudskog mlijeka jedinstvena su vrsta hranjivih tvari, koje djeluju kao prebiotici, anti-adhezivni antimikrobici i imunomodulatori u crijevima dojenčeta i značajno pridonose razvoju mozga. HMO se nalaze isključivo u majčinom mlijeku; druga mlijeka sisavaca (npr. kravlje, kozje, ovčje, devino itd.) nemaju ove specifične oblike oligosaharida.
Oligosaharidi ljudskog mlijeka su treća najzastupljenija čvrsta komponenta u ljudskom mlijeku, koja može biti prisutna u otopljenom ili emulgiranom ili suspendiranom obliku u vodi. Laktoza i masne kiseline najzastupljenije su krute tvari koje se nalaze u ljudskom mlijeku. HMO su prisutni u koncentraciji od 0,35–0,88 unci (9,9–24,9 g)/L. Poznato je približno 200 strukturno različitih oligosaharida ljudskog mlijeka. Dominantni oligosaharid u 80% svih žena je 2′-fukozilaktoza, koja je prisutna u ljudskom majčinom mlijeku u koncentraciji od približno 2,5 g/L.
Budući da se HMO ne probavljaju, kalorijski ne doprinose prehrani. Budući da su neprobavljivi ugljikohidrati, djeluju kao prebiotici i selektivno ih fermentiraju poželjna crijevna mikroflora, posebice bifidobakterije.
- promicati razvoj dojenčadi
- važni su za razvoj mozga
- djeluje protuupalno i
- anti-adhezivni učinak u gastrointestinalnom traktu
- podržava imunološki sustav kod odraslih
The ultrazvučni procesor UIP2000hdT povećava prijenos mase i aktivira tvornice stanica za veće prinose biosintetiziranih bioloških molekula kao što su HMO
Biosinteza oligosaharida ljudskog mlijeka
Tvornice stanica i enzimski/kemoenzimatski sustavi trenutne su tehnologije koje se koriste za sintezu HMO-a. Za proizvodnju HMO-a u industrijskim razmjerima, fermentacija tvornica mikrobnih stanica, biokemijska sinteza i različite enzimske reakcije izvedivi su načini bioproizvodnje HMO-a. Zbog ekonomskih razloga, biosinteza putem tvornica mikrobnih stanica trenutno je jedina tehnika koja se koristi na razini industrijske proizvodnje HMO-a.
Fermentacija HMO-a pomoću tvornica mikrobnih stanica
E.coli, Saccharomyces cerevisiae i Lactococcus lactis često su korištene tvornice stanica koje se koriste za bioproizvodnju bioloških molekula kao što su HMO. Fermentacija je biokemijski proces koji koristi mikroorganizme za pretvaranje supstrata u ciljane biološke molekule. Tvornice mikrobnih stanica koriste jednostavne šećere kao supstrat koji pretvaraju u HMO. Budući da su jednostavni šećeri (npr. laktoza) obilan, jeftin supstrat, to čini proces biosinteze isplativim.
Na rast i brzinu biokonverzije uglavnom utječe prijenos mase hranjivih tvari (supstrat) do mikroorganizama. Brzina prijenosa mase je glavni faktor koji utječe na sintezu proizvoda tijekom fermentacije. Ultrasonication je dobro poznato da promiče prijenos mase.
Tijekom fermentacije uvjeti u bioreaktoru moraju se stalno nadzirati i regulirati kako bi stanice mogle rasti što je brže moguće kako bi potom proizvele ciljane biomolekule (npr. oligosaharidi kao što su HMO; inzulin; rekombinantni proteini). Teoretski, stvaranje proizvoda počinje čim stanična kultura počne rasti. Međutim, posebno u genetski modificiranim stanicama kao što su modificirani mikroorganizmi, obično se inducira kasnije dodavanjem kemijske tvari supstratu, što pojačava ekspresiju ciljane biomolekule. Ultrazvučni bioreaktori (sono-bioreactor) mogu se precizno kontrolirati i omogućuju specifičnu stimulaciju mikroba. To rezultira ubrzanom biosintezom i većim prinosima.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija: Fermentacija složenih HMO može biti ograničena niskim titrom fermentacije i produktima koji ostaju unutar stanica. Ultrazvučna liza i ekstrakcija koristi se za oslobađanje unutarstaničnog materijala prije pročišćavanja i nizvodnih procesa.
Ultrazvučno potaknuta fermentacija
Brzina rasta mikroba kao što su Escherichia coli, modificirana E.coli, Saccharomyces cerevisiae i Lactococcus lactis može se ubrzati povećanjem brzine prijenosa mase i propusnosti stanične stijenke primjenom kontroliranog niskofrekventnog ultrazvuka. Kao blaga, netermalna tehnika obrade, ultrazvučna obrada primjenjuje čisto mehaničke sile u fermentacijsku juhu.
Akustična kavitacija: Princip rada sonikacije temelji se na akustičnoj kavitaciji. Ultrazvučna sonda (sonotroda) spaja ultrazvučne valove niske frekvencije u medij. Ultrazvučni valovi putuju kroz tekućinu stvarajući naizmjenične cikluse visokog tlaka (kompresija) / niskog tlaka (razrjeđivanje). Komprimiranjem i istezanjem tekućine u izmjeničnim ciklusima nastaju sićušni vakuumski mjehurići. Ovi mali vakuumski mjehurići rastu tijekom nekoliko ciklusa dok ne dosegnu veličinu u kojoj više ne mogu apsorbirati energiju. U ovoj točki maksimalnog rasta, vakuumski mjehurić snažno implodira i stvara lokalno ekstremne uvjete, poznate kao fenomen kavitacije. U kavitacijskoj "vrućoj točki" mogu se uočiti visoke razlike tlaka i temperature te intenzivne sile smicanja s mlazovima tekućine do 280 m/s. Ovim kavitacijskim učincima postiže se temeljit prijenos mase i sonoporacija (probijanje staničnih stijenki i staničnih membrana). Hranjive tvari supstrata plutaju do živih cijelih stanica i u njih, tako da se stanične tvornice optimalno hrane i ubrzavaju rast i stope konverzije. Ultrazvučni bioreaktori su jednostavna, ali vrlo učinkovita strategija za obradu biomase u procesu biosinteze u jednom loncu.
Dobro je poznato da precizno kontrolirana, blaga sonikacija intenzivira procese fermentacije.
Sonikacija poboljšava "produktivnost mnogih bioprocesa koji uključuju žive stanice putem poboljšanja unosa supstrata, poboljšane proizvodnje ili rasta povećanjem poroznosti stanica i potencijalno poboljšanog otpuštanja staničnih komponenti." (Naveena i sur. 2015.)
Pročitajte više o ultrazvučno potpomognutoj fermentaciji!
- Povećani prinos
- Ubrzana fermentacija
- Stanično specifična stimulacija
- Poboljšano upijanje supstrata
- Povećana poroznost stanica
- Jednostavan za rukovanje
- Sef
- Jednostavna retro ugradnja
- Linearno povećanje
- Skupna ili Inline obrada
- Brzi ROI
Naveena i sur. (2015.) otkrili su da ultrazvučno pojačavanje nudi nekoliko prednosti tijekom bioprocesiranja, uključujući niske operativne troškove u usporedbi s drugim opcijama poboljšanja tretmana, jednostavnost rada i skromne zahtjeve za napajanjem.
MultiSonoReactor MSR-4 je industrijski inline homogenizator pogodan za poboljšanu biosintezu oligosaharida ljudskog mlijeka (HMO).
Ultrazvučni reaktori za fermentaciju visokih performansi
Procesi fermentacije uključuju žive mikroorganizme kao što su bakterije ili kvasci, koji funkcioniraju kao tvornice stanica. Dok se sonikacija primjenjuje za promicanje prijenosa mase i povećanje rasta i stope pretvorbe mikroorganizama, ključno je precizno kontrolirati intenzitet ultrazvuka kako bi se izbjeglo uništavanje tvornica stanica.
Hielscher Ultrasonics je specijalist za projektiranje, proizvodnju i distribuciju ultrazvučnih uređaja visokih performansi, koji se mogu precizno kontrolirati i nadzirati kako bi se osigurali vrhunski prinosi fermentacije.
Kontrola procesa nije samo neophodna za visoke prinose i vrhunsku kvalitetu, već omogućuje ponavljanje i reprodukciju rezultata. Osobito kada je riječ o stimulaciji tvornica stanica, prilagodba parametara ultrazvuka specifična za stanicu ključna je za postizanje visokih prinosa i sprječavanje degradacije stanica. Stoga su svi digitalni modeli Hielscher ultrasonicators opremljeni inteligentnim softverom, koji vam omogućuje podešavanje, praćenje i reviziju parametara sonikacije. Parametri ultrazvučnog procesa kao što su amplituda, temperatura, tlak, trajanje sonikacije, radni ciklusi i unos energije ključni su za promicanje proizvodnje HMO putem fermentacije.
Pametni softver Hielscher ultrasonicators automatski bilježi sve važne procesne parametre na integriranu SD-karticu. Automatsko snimanje podataka procesa ultrazvuka temelj je za standardizaciju procesa i obnovljivost/ponovljivost, koji su potrebni za dobru proizvodnu praksu (GMP).
Ultrazvučni rektori za fermentaciju
Hielscher nudi ultrazvučne sonde različitih veličina, duljina i geometrija, koje se mogu koristiti za šaržne ili kontinuirane protočne tretmane. Ultrazvučni reaktori, također poznati kao sono-bioreaktori, dostupni su za bilo koji volumen koji pokriva ultrazvučnu bioprocesu od malih laboratorijskih uzoraka do razine pilot i potpuno komercijalne proizvodnje.
Dobro je poznato da položaj ultrazvučne sonotrode u reakcijskoj posudi utječe na distribuciju kavitacije i mikrostrujanja unutar medija. Sonotrode i ultrazvučni reaktor treba odabrati u skladu s volumenom obrade stanične juhe. Dok se sonikacija može izvoditi u serijama kao iu kontinuiranom načinu rada, za velike proizvodne količine preporuča se korištenje instalacije kontinuiranog protoka. Prolazeći kroz ultrazvučnu protočnu ćeliju, svi ćelijski mediji dobivaju potpuno istu izloženost sonikaciji čime se osigurava najučinkovitiji tretman. Hielscher Ultrasonics širok raspon ultrazvučnih sondi i reaktora s protočnim ćelijama omogućuje sastavljanje idealne postavke za ultrazvučnu bioprocesu.
Hielscher Ultrasonics – Od laboratorija preko pilota do proizvodnje
Hielscher Ultrasonics pokriva cijeli spektar ultrazvučne opreme nudeći kompaktne ručne ultrazvučne homogenizatore za pripremu uzoraka za stolne i pilot sustave, kao i snažne industrijske ultrazvučne jedinice koje lako obrađuju teret kamiona po satu. Budući da su svestrani i fleksibilni u mogućnostima ugradnje i montaže, Hielscher ultrasonicators se lako mogu integrirati u sve vrste šaržnih reaktora, šaržnih ili kontinuiranih protočnih postavki.
Različiti dodaci kao i prilagođeni dijelovi omogućuju idealnu prilagodbu vašeg ultrazvučnog sustava zahtjevima vašeg procesa.
Izgrađeni za 24/7 rad pod punim opterećenjem i teškim uvjetima u zahtjevnim uvjetima, Hielscher ultrazvučni procesori su pouzdani i zahtijevaju samo malo održavanja.
Donja tablica daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja:
| Volumen serije | Protok | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| 1 do 500 ml | 10 do 200 ml/min | UP100H |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 do 20L | 0.2 do 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 do 100l | 2 do 10L/min | UIP4000hdT |
| na | 10 do 100L/min | UIP16000 |
| na | veći | klaster od UIP16000 |
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Ultrazvučni homogenizatori velike snage od laboratorija do pilot i industrijski mjerilo.
Literatura / Reference
- Muschiol, Jan; Meyer, Anne S. (2019): A chemo-enzymatic approach for the synthesis of human milk oligosaccharide backbone structures. Zeitschrift für Naturforschung C, Volume 74: Issue 3-4, 2019. 85-89.
- Birgitte Zeuner, David Teze, Jan Muschiol, Anne S. Meyer (2019): Synthesis of Human Milk Oligosaccharides: Protein Engineering Strategies for Improved Enzymatic Transglycosylation. Molecules 24, 2019.
- Yun Hee Choi, Bum Seok Park, Joo‐Hyun Seo, Byung‐Gee Ki (2019): Biosynthesis of the human milk oligosaccharide 3‐fucosyllactose in metabolically engineered Escherichia coli via the salvage pathway through increasing GTP synthesis and β‐galactosidase modification. Biotechnology and Bioengineering Volume 116, Issue 12. December 2019.
- Balakrishnan Naveena, Patricia Armshaw, J. Tony Pembroke (2015): Ultrasonic intensification as a tool for enhanced microbial biofuel yields. Biotechnology of Biofuels 8:140, 2015.
- Shweta Pawar, Virendra K. Rathod (2020): Role of ultrasound in assisted fermentation technologies for process enhancements. Preparative Biochemistry & Biotechnology 50(6), 2020. 1-8.
Činjenice koje vrijedi znati
Biosinteza pomoću tvornica stanica
Tvornica mikrobnih stanica je metoda bioinženjeringa koja koristi mikrobne stanice kao proizvodni pogon. Genetski inženjeringom mikroba modificira se DNK mikroorganizama poput bakterija, kvasaca, gljivica, stanica sisavaca ili algi pretvarajući mikrobe u tvornice stanica. Tvornice stanica koriste se za pretvaranje supstrata u vrijedne biološke molekule, koje se koriste npr. u hrani, farmaciji, kemiji i proizvodnji goriva. Različite strategije biosinteze temeljene na staničnoj tvornici usmjerene su na proizvodnju prirodnih metabolita, ekspresiju heterolognih biosintetskih putova ili ekspresiju proteina.
Stanične tvornice mogu se koristiti ili za sintetiziranje prirodnih metabolita, za ekspresiju heterolognih biosintetskih putova ili za ekspresiju proteina.
Biosinteza nativnih metabolita
Nativni metaboliti definirani su kao biološke molekule koje stanice koje se koriste kao tvornice stanica prirodno proizvode. Stanične tvornice proizvode ove biološke molekule ili unutarstanično ili kao izlučenu tvar. Potonji je poželjan budući da olakšava odvajanje i pročišćavanje ciljanih spojeva. Primjeri prirodnih metabolita su amino i nukleinske kiseline, antibiotici, vitamini, enzimi, bioaktivni spojevi i proteini proizvedeni anaboličkim staničnim putevima.
Heterologus biosintetski putevi
Kada se pokušava proizvesti zanimljiv spoj, jedna od najvažnijih odluka je odabir proizvodnje u izvornom domaćinu i optimizacija ovog domaćina ili prijenos puta na drugi poznati domaćin. Ako se izvorni domaćin može prilagoditi industrijskom procesu fermentacije, a pri tome nema zdravstvenih rizika (npr. proizvodnja toksičnih nusproizvoda), to može biti poželjna strategija (kao što je bio slučaj npr. za penicilin ). Međutim, u mnogim modernim slučajevima, potencijal korištenja industrijski preferirane tvornice ćelija i srodnih platformskih procesa nadmašuje poteškoće prijenosa puta.
ekspresija proteina
Ekspresija proteina može se postići homolognim i heterolognim putem. Kod homologne ekspresije, gen koji je prirodno prisutan u organizmu je prekomjerno izražen. Kroz ovu prekomjernu ekspresiju može se proizvesti veći prinos određene biološke molekule. Za heterolognu ekspresiju, specifični gen se prenosi u stanicu domaćina tako da gen nije prisutan prirodno. Koristeći stanični inženjering i tehnologiju rekombinantne DNK, gen se umeće u DNK domaćina tako da stanica domaćina proizvodi (velike) količine proteina koje ne bi proizvela prirodno. Ekspresija proteina se vrši u različitim domaćinima od bakterija, npr. E. coli i Bacillis subtilis, kvasaca, npr. Klyuveromyces lactis, Pichia pastoris, S. cerevisiae, filamentoznih gljiva, npr. A. niger, i stanica koje potječu od višestaničnih organizama kao što su kao sisavci i kukci. Bezbrojni proteini su od velikog komercijalnog interesa, uključujući enzime, složene biofarmaceutike, dijagnostičke i istraživačke reagense. (usp. AM Davy et al. 2017.)