Biosintetska proizvodnja oligosaharida ljudskog mlijeka
Biosinteza oligosaharida ljudskog mlijeka (HMOs) fermentacijom ili enzimskim reakcijama složen je proces koji troši resurse i često daje niske prinose. Ultrazvučna obrada povećava prijenos tvari između supstrata i staničnih tvornica te potiče rast i metabolizam stanica. Time sonikacija intenzivira fermentaciju i biokemijske procese, što rezultira ubrzanom i učinkovitijom proizvodnjom oligosaharida ljudskog mlijeka.
Oligosaharidi ljudskog mlijeka
Oligosaharidi ljudskog mlijeka (HMOs), poznati i kao glikani ljudskog mlijeka, molekule su šećera koje pripadaju skupini oligosaharida. Istaknuti primjeri oligosaharida ljudskog mlijeka uključuju 2’-fukozillaktozu (2′-FL), lakto-N-neotetraozu (LNnT), 3’-galaktozillaktozu (3′-GL) i difukozillaktozu (DFL).
Iako se ljudsko majčino mlijeko sastoji od više od 150 različitih struktura oligosaharida ljudskog mlijeka, trenutačno se samo 2′-fukozillaktoza (2′-FL) i lakto-N-neotetraoza (LNnT) proizvode na komercijalnoj razini i upotrebljavaju kao nutritivni dodaci u mliječnim pripravcima za dojenčad.
Oligosaharidi ljudskog mlijeka (HMOs) poznati su po svojoj važnosti u prehrani dojenčadi. Oligosaharidi ljudskog mlijeka jedinstvena su vrsta hranjivih tvari koje u crijevima dojenčeta djeluju kao prebiotici, antiadhezivna antimikrobna sredstva i imunomodulatori te znatno pridonose razvoju mozga. Oligosaharidi ljudskog mlijeka nalaze se isključivo u ljudskom majčinu mlijeku; mlijeka drugih sisavaca (npr. krava, koza, ovaca, deva itd.) ne sadržavaju te specifične oblike oligosaharida.
Oligosaharidi ljudskog mlijeka treća su najzastupljenija čvrsta sastavnica ljudskog mlijeka, koja može biti prisutna u otopljenom, emulgiranom ili suspendiranom obliku u vodi. Laktoza i masne kiseline najzastupljenije su čvrste tvari u ljudskom mlijeku. Oligosaharidi ljudskog mlijeka prisutni su u koncentraciji od 0,35–0,88 unci (9,9–24,9 g)/ L. Poznato je približno 200 strukturno različitih oligosaharida ljudskog mlijeka. Dominantni oligosaharid u 80% svih žena jest 2′-fukozillaktoza, koja je u ljudskom majčinu mlijeku prisutna u koncentraciji od približno 2,5 g/ L.
Budući da se oligosaharidi ljudskog mlijeka ne probavljaju, ne pridonose kalorijskoj vrijednosti prehrane. Kao neprobavljivi ugljikohidrati djeluju kao prebiotici, a poželjna crijevna mikroflora, osobito bifidobakterije, selektivno ih fermentira.
- potiču razvoj dojenčadi
- važni su za razvoj mozga
- imaju protuupalne i
- antiadhezivne učinke u probavnom traktu
- podupiru imunosni sustav odraslih
Ultrazvučni procesor UIP2000hdT povećava prijenos tvari i aktivira stanične tvornice radi većih prinosa biosintetiziranih bioloških molekula poput oligosaharida ljudskog mlijeka
Biosinteza oligosaharida ljudskog mlijeka
Stanične tvornice i enzimski / kemoenzimski sustavi tehnologije su koje se trenutačno upotrebljavaju za sintezu oligosaharida ljudskog mlijeka. Za proizvodnju oligosaharida ljudskog mlijeka u industrijskim razmjerima fermentacija mikrobnih staničnih tvornica, biokemijska sinteza i različite enzimske reakcije izvedivi su načini njihove bioproizvodnje. Iz ekonomskih razloga biosinteza putem mikrobnih staničnih tvornica trenutačno je jedina tehnika koja se upotrebljava na razini industrijske proizvodnje oligosaharida ljudskog mlijeka.
Fermentacija oligosaharida ljudskog mlijeka pomoću mikrobnih staničnih tvornica
E.coli, Saccharomyces cerevisiae i Lactococcus lactis često se upotrebljavaju kao stanične tvornice za bioproizvodnju bioloških molekula poput HMO-a. Fermentacija je biokemijski proces u kojem se mikroorganizmi upotrebljavaju za pretvorbu supstrata u ciljane biološke molekule. Mikrobne stanične tvornice upotrebljavaju jednostavne šećere kao supstrat koji pretvaraju u HMO-e. Budući da su jednostavni šećeri (npr. laktoza) obilan i jeftin supstrat, proces biosinteze ostaje troškovno učinkovit.
Na brzinu rasta i biokonverzije uglavnom utječe prijenos hranjivih tvari (supstrata) do mikroorganizama. Brzina prijenosa tvari jedan je od glavnih čimbenika koji utječu na sintezu proizvoda tijekom fermentacije. Dobro je poznato da ultrazvučna obrada pospješuje prijenos tvari.
Tijekom fermentacije uvjeti u bioreaktoru moraju se stalno pratiti i regulirati kako bi stanice mogle rasti što brže te zatim proizvoditi ciljane biomolekule (npr. oligosaharide poput HMO-a; inzulin; rekombinantne proteine). Teoretski, stvaranje proizvoda započinje čim stanična kultura počne rasti. Međutim, osobito kod genetički modificiranih stanica poput genetički modificiranih mikroorganizama, ono se obično inducira kasnije dodavanjem kemijske tvari u supstrat koja pojačava ekspresiju ciljane biomolekule. Ultrazvučni bioreaktori (sonobioreaktori) mogu se precizno kontrolirati i omogućuju specifičnu stimulaciju mikroorganizama. To rezultira ubrzanom biosintezom i većim prinosima.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija: fermentacija složenih HMO-a može biti ograničena niskim fermentacijskim titrima i zadržavanjem proizvoda unutar stanica. Ultrazvučna liza i ekstrakcija upotrebljavaju se za oslobađanje unutarstaničnog materijala prije pročišćavanja i daljnjih postupaka obrade.
Ultrazvučno potpomognuta fermentacija
Brzina rasta mikroorganizama kao što su Escherichia coli, genetički modificirana E.coli, Saccharomyces cerevisiae i Lactococcus lactis može se povećati povećanjem brzine prijenosa tvari i propusnosti stanične stijenke primjenom kontrolirane niskofrekventne ultrazvučne obrade. Kao blaga, netoplinska tehnika obrade, ultrazvučna obrada unosi isključivo mehaničke sile u fermentacijsku juhu.
Akustična kavitacija: načelo rada sonikacije temelji se na akustičnoj kavitaciji. Ultrazvučna sonda (sonotroda) prenosi niskofrekventne ultrazvučne valove u medij. Ultrazvučni valovi putuju kroz tekućinu stvarajući naizmjenične cikluse visokog tlaka (kompresije) / niskog tlaka (razrjeđivanja). Sabijanjem i rastezanjem tekućine u naizmjeničnim ciklusima nastaju sićušni vakuumski mjehurići. Ti mali vakuumski mjehurići rastu tijekom nekoliko ciklusa dok ne dosegnu veličinu pri kojoj više ne mogu apsorbirati energiju. U toj točki maksimalnog rasta vakuumski mjehurić snažno implodira i stvara lokalno ekstremne uvjete, poznate kao pojava kavitacije. U kavitacijskoj „vrućoj točki” mogu se uočiti velike razlike tlaka i temperature te intenzivne smične sile s mlazovima tekućine brzine do 280m/sec. Tim kavitacijskim učincima postižu se temeljit prijenos tvari i sonoporacija (perforacija staničnih stijenki i staničnih membrana). Hranjive tvari iz supstrata prenose se do živih cjelovitih stanica i u njih, tako da su stanične tvornice optimalno opskrbljene hranjivim tvarima, a brzine rasta i pretvorbe povećane. Ultrazvučni bioreaktori jednostavna su, ali vrlo učinkovita strategija za obradu biomase u procesu biosinteze u jednoj posudi.
Dobro je poznato da precizno kontrolirana, blaga sonikacija intenzivira fermentacijske procese.
Sonikacija poboljšava „produktivnost mnogih bioprocesa koji uključuju žive stanice poboljšanjem unosa supstrata, povećanom proizvodnjom ili rastom zahvaljujući povećanju poroznosti stanica te potencijalno pojačanim oslobađanjem staničnih sastavnica.” (Naveena et al. 2015)
Pročitajte više o ultrazvučno potpomognutoj fermentaciji!
- Povećan prinos
- Ubrzana fermentacija
- Stimulacija specifična za stanice
- Poboljšan unos supstrata
- Povećana poroznost stanica
- Jednostavno rukovanje
- Sigurno
- Jednostavna naknadna ugradnja
- Linearno povećanje razmjera
- Šaržna ili protočna obrada
- Brz povrat ulaganja
Naveena i sur. (2015) utvrdili su da ultrazvučno intenziviranje nudi nekoliko prednosti tijekom bioprocesiranja, uključujući niske operativne troškove u usporedbi s drugim mogućnostima obrade za poboljšanje procesa, jednostavnost rukovanja i skromne zahtjeve za snagom.
MultiSonoReactor MSR-4 je industrijski protočni homogenizator prikladan za poboljšanu biosintezu oligosaharida humanog mlijeka (HMO).
Ultrazvučni reaktori visokih performansi za fermentaciju
Fermentacijski procesi uključuju žive mikroorganizme poput bakterija ili kvasaca, koji djeluju kao stanične tvornice. Pri primjeni sonikacije za poticanje prijenosa mase te povećanje brzine rasta mikroorganizama i brzine pretvorbe ključno je precizno kontrolirati intenzitet ultrazvuka kako bi se izbjeglo uništavanje staničnih tvornica.
Hielscher Ultrasonics specijaliziran je za projektiranje, proizvodnju i distribuciju ultrazvučnih uređaja visokih performansi, koji se mogu precizno kontrolirati i nadzirati kako bi se osigurali vrhunski prinosi fermentacije.
Kontrola procesa nije samo ključna za visoke prinose i vrhunsku kvalitetu, već omogućuje i ponavljanje i reproduciranje rezultata. Osobito pri stimulaciji staničnih tvornica, prilagodba parametara sonikacije specifična za pojedine stanice ključna je za postizanje visokih prinosa i sprječavanje razgradnje stanica. Stoga su svi digitalni modeli Hielscher ultrazvučnih uređaja opremljeni inteligentnim softverom koji omogućuje podešavanje, praćenje i izmjenu parametara sonikacije. Parametri ultrazvučnog procesa poput amplitude, temperature, tlaka, trajanja sonikacije, radnih ciklusa i unosa energije ključni su za poticanje proizvodnje HMO-a fermentacijom.
Pametni softver Hielscher ultrazvučnih uređaja automatski bilježi sve važne parametre procesa na ugrađenu SD karticu. Automatsko bilježenje podataka o procesu sonikacije temelj je standardizacije procesa i obnovljivosti / ponovljivosti, koje su potrebne za dobru proizvođačku praksu (GMP).
Ultrazvučni reaktori za fermentaciju
Hielscher nudi ultrazvučne sonde različitih veličina, duljina i geometrija, koje se mogu koristiti za šaržnu i kontinuiranu protočnu obradu. Ultrazvučni reaktori, poznati i kao sonobioreaktori, dostupni su za bilo koji volumen te pokrivaju ultrazvučno bioprocesiranje od malih laboratorijskih uzoraka do pilotne i potpuno komercijalne proizvodnje.
Dobro je poznato da položaj ultrazvučne sonotrode u reakcijskoj posudi utječe na raspodjelu kavitacije i mikrostrujanja unutar medija. Sonotrodu i ultrazvučni reaktor treba odabrati u skladu s volumenom stanične suspenzije koji se obrađuje. Iako se sonikacija može provoditi šaržno i kontinuirano, za velike proizvodne volumene preporučuje se uporaba sustava s kontinuiranim protokom. Prolaskom kroz ultrazvučnu protočnu ćeliju sav stanični medij izlaže se potpuno jednakoj sonikaciji, čime se osigurava najučinkovitija obrada. Širok izbor ultrazvučnih sondi i reaktora s protočnim ćelijama tvrtke Hielscher Ultrasonics omogućuje sastavljanje idealnog sustava za ultrazvučno bioprocesiranje.
Hielscher Ultrasonics – od laboratorija preko pilotne do proizvodne razine
Hielscher Ultrasonics pokriva cijeli spektar ultrazvučne opreme, nudeći kompaktne ručne ultrazvučne homogenizatore za pripremu uzoraka, stolne i pilotne sustave te snažne industrijske ultrazvučne uređaje koji s lakoćom obrađuju kamionske količine materijala na sat. Zahvaljujući svestranosti i fleksibilnim mogućnostima ugradnje i montaže, Hielscher ultrazvučni uređaji mogu se jednostavno integrirati u sve vrste šaržnih reaktora, šaržnih sustava s prihranjivanjem ili sustava s kontinuiranim protokom.
Raznovrsna dodatna oprema i dijelovi izrađeni po narudžbi omogućuju idealnu prilagodbu vašeg ultrazvučnog sustava zahtjevima vašeg procesa.
Izrađeni za rad 24/7 pod punim opterećenjem i intenzivan rad u zahtjevnim uvjetima, Hielscher ultrazvučni procesori pouzdani su i zahtijevaju samo minimalno održavanje.
Tablica u nastavku prikazuje približni kapacitet obrade naših ultrazvučnih uređaja:
| Volumen šarže | Protok | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| 1 do 500mL | 10 do 200mL/min | UP100H |
| 10 do 2000mL | 20 do 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 do 20L | 0,2 do 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 do 100L | 2 do 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 do 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | veći | skupina uređaja UIP16000 |
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Ultrazvučni homogenizatori velike snage od laboratorijskog do pilotnog i industrijskog mjerila.
Literatura / Reference
- Muschiol, Jan; Meyer, Anne S. (2019): A chemo-enzymatic approach for the synthesis of human milk oligosaccharide backbone structures. Zeitschrift für Naturforschung C, Volume 74: Issue 3-4, 2019. 85-89.
- Birgitte Zeuner, David Teze, Jan Muschiol, Anne S. Meyer (2019): Synthesis of Human Milk Oligosaccharides: Protein Engineering Strategies for Improved Enzymatic Transglycosylation. Molecules 24, 2019.
- Yun Hee Choi, Bum Seok Park, Joo‐Hyun Seo, Byung‐Gee Ki (2019): Biosynthesis of the human milk oligosaccharide 3‐fucosyllactose in metabolically engineered Escherichia coli via the salvage pathway through increasing GTP synthesis and β‐galactosidase modification. Biotechnology and Bioengineering Volume 116, Issue 12. December 2019.
- Balakrishnan Naveena, Patricia Armshaw, J. Tony Pembroke (2015): Ultrasonic intensification as a tool for enhanced microbial biofuel yields. Biotechnology of Biofuels 8:140, 2015.
- Shweta Pawar, Virendra K. Rathod (2020): Role of ultrasound in assisted fermentation technologies for process enhancements. Preparative Biochemistry & Biotechnology 50(6), 2020. 1-8.
Činjenice koje vrijedi znati
Biosinteza s pomoću staničnih tvornica
Mikrobna stanična tvornica metoda je bioinženjerstva koja upotrebljava mikrobne stanice kao proizvodni pogon. Genetičkim inženjerstvom mikroba mijenja se DNA mikroorganizama kao što su bakterije, kvasci, gljive, stanice sisavaca ili alge, čime se mikrobi pretvaraju u stanične tvornice. Stanične tvornice upotrebljavaju se za pretvorbu supstrata u vrijedne biološke molekule koje se upotrebljavaju, primjerice, u proizvodnji hrane, farmaceutskih proizvoda, kemikalija i goriva. Različite strategije biosinteze temeljene na staničnim tvornicama usmjerene su na proizvodnju nativnih metabolita, ekspresiju heterolognih biosintetskih putova ili ekspresiju proteina.
Stanične tvornice mogu se upotrebljavati za sintezu nativnih metabolita, ekspresiju heterolognih biosintetskih putova ili ekspresiju proteina.
Biosinteza nativnih metabolita
Nativni metaboliti definiraju se kao biološke molekule koje stanice upotrijebljene kao stanična tvornica prirodno proizvode. Stanične tvornice proizvode te biološke molekule ili unutar stanica ili kao izlučene tvari. Potonji je način poželjniji jer olakšava odvajanje i pročišćavanje ciljanih spojeva. Primjeri nativnih metabolita su aminokiseline i nukleinske kiseline, antibiotici, vitamini, enzimi, bioaktivni spojevi i proteini proizvedeni anaboličkim putovima stanice.
Heterologni biosintetski putovi
Pri pokušaju proizvodnje spoja od interesa jedna je od najvažnijih odluka odabir između proizvodnje u nativnom domaćinu uz njegovu optimizaciju i prijenosa biosintetskog puta u drugog dobro poznatog domaćina. Ako se izvorni domaćin može prilagoditi industrijskom procesu fermentacije i ako pritom nema zdravstvenih rizika (npr. proizvodnje toksičnih nusproizvoda), to može biti poželjnija strategija (kao što je bio slučaj, primjerice, s penicilinom). Međutim, u mnogim suvremenim slučajevima potencijal uporabe stanične tvornice poželjne za industrijsku primjenu i povezanih platformskih procesa nadmašuje poteškoće prijenosa biosintetskog puta.
Ekspresija proteina
Ekspresija proteina može se postići homolognim i heterolognim putem. Pri homolognoj ekspresiji gen koji je prirodno prisutan u organizmu prekomjerno se eksprimira. Takvom prekomjernom ekspresijom može se postići veći prinos određene biološke molekule. Pri heterolognoj ekspresiji određeni gen prenosi se u stanicu domaćina u kojoj taj gen nije prirodno prisutan. Primjenom staničnog inženjerstva i tehnologije rekombinantne DNA gen se umeće u DNA domaćina tako da stanica domaćina proizvodi (velike) količine proteina koji prirodno ne bi proizvodila. Ekspresija proteina provodi se u različitim domaćinima, od bakterija, npr. E. coli i Bacillis subtilis, kvasaca, npr. Klyuveromyces lactis, Pichia pastoris, S. cerevisiae, filamentoznih gljiva, npr. A. niger, do stanica dobivenih iz višestaničnih organizama poput sisavaca i kukaca. Bezbrojni proteini od velikog su komercijalnog interesa, uključujući enzime koji se proizvode u velikim količinama, složene biofarmaceutike, dijagnostičke reagense i reagense za istraživanja. (cf. A.M. Davy et al. 2017)