Sinteza peptida u krutoj fazi – Učinkovitije uz sonikaciju

Sinteza peptida u čvrstoj fazi (SPPS) je uobičajena metoda za sintezu peptida. Ultrasonication je pouzdan alat za intenziviranje čvrste faze peptida sinteze rezultira višim prinosima, poboljšanom čistoćom, bez racemizacije i značajno ubrzanom brzinom reakcije. Hielscher Ultrasonics nudi različita ultrazvučna rješenja za sintezu, cijepanje i otapanje peptida.

Ultrasonic Solid-Phase Peptide Synthesis

Ultrasonication se već naširoko primjenjuje kao intenzivirajuća metoda u organskoj sintezi i dobro je poznata po svojim prednostima kao što su drastično smanjeno vrijeme reakcije, veći prinosi, manje nusproizvoda, pokretanje putova koji se ne mogu postići na druge načine, i/ili bolja selektivnost. Velike prednosti mogu se također postići kada se sonikacija spoji u reakcije sinteze peptida. Rezultati istraživanja su pokazali da ultrazvučno potpomognuta sinteza peptida postiže optimizirani prinos peptida visoke čistoće, bez racemizacije unutar kratkog vremena reakcije.

Prednosti ultrazvučne sinteze peptida

Visoki prinosi peptida
Znatno brža sinteza
Veća čistoća peptida
Nema racemizacije
Paralelna sinteza raznih peptida
Scalable to any volume

Ultrazvučni cuphorn za jednoliku sonikaciju nekoliko reaktorskih posuda, npr. za poboljšanu sintezu peptida.

Ultrazvučni cuphorn za jednoliku sonikaciju nekoliko reaktorskih posuda za poboljšanu sintezu peptida.

Shematski prikaz Merrifieldove sinteze peptida čvrste faze, koja se može pojačati sonikacijom.

Graphic demonstrating the Merrifield solid phase peptide synthesis. Ultrasonication is used to promote and enhance the synthesis reaction as well as for cleavage of the synthesized peptides from the resin.
Grafika: ©Conejos-Sanchez et al., 2014.)

Study	Peptide(s) Studied	Reaction Time (Classical vs US-SPPS)	Crude Purity (Classical vs US-SPPS)	Racemization and Side Reactions	Key Takeaways
Wołczański et al. (2019)	Met-enkephalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorphin	600–1920 min → 48–284 min	24.2–71.3% → 60.6–89.9%	None observed for Cys/His, even at 70°C	~7–12x faster synthesis; major purity improvements, especially for aggregation-prone sequences like TAT.
Silva et al. (2021)	Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer)	>3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (US only)	73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2)	Not tested; slight purity drop in Pep2 noted	14x time reduction for Pep1; crude yields significantly increased.
Merlino et al. (2019)	Model pentapeptides, peptides up to 44-mer, “teške sekvence” (Aβ 1-42, ACP 65-74)	60 min → 30 min (model)	84% → 93% (model); significantly higher than thermal heating (~45°C)	No significant increase for Cys/His enantiomers	Highly effective for difficult/aggregation-prone sequences; allows reduced reagent excess while maintaining high purity.

Sinteza peptida čvrste faze poboljšana ultrazvukom

Sinteza peptida u čvrstoj fazi (SPPS) je kemijska reakcija koja omogućuje sastavljanje peptidnog lanca uzastopnim reakcijama derivata aminokiselina na netopivoj poroznoj podlozi. Međutim, tradicionalna sinteza peptida u čvrstoj fazi je relativno neučinkovit i spor proces. Stoga je ultrazvučno pojačavanje sinteze peptida visoko cijenjen alat za učinkovitiju i bržu sintezu peptida.
Silva i sur. (2021.) u usporedbi “klasični” fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc)-čvrsta faza peptidne sinteze (SPPS) uz ultrazvuk (US) potpomognut SPPS koji se temelji na pripremi triju peptida, odnosno peptida Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) specifičnog za receptor faktora rasta fibroblasta 3 (FGFR3) i novih peptida Pep2 (RQMATADEA-NH2) i Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS uz pomoć SAD-a doveo je do 14-strukog (Pep1) i 4-strukog smanjenja vremena (Pep2) u sklapanju peptida u usporedbi s “klasični” metoda. Zanimljivo je da je SPPS potpomognut ultrazvukom dao Pep1 veće čistoće (82%) od “klasični” SPPS (73%). Značajno smanjenje vremena u kombinaciji s visokom postignutom čistoćom sirovog peptida potaknulo je istraživački tim da primijeni SPPS uz pomoć SAD-a na veliki peptid Pep3, koji pokazuje veliki broj hidrofobnih aminokiselina i homooligo-sekvenci. Zanimljivo je da je sinteza ovog 25-mernog peptida postignuta unutar manje od 6 sati (347 min) umjerene čistoće (približno 49%).

Ultrazvučna sinteza peptida na čvrstoj fazi (US-SPPS) je učinkovita tehnika za sintezu peptida koja sprječava racemizaciju.

Brža sinteza peptida putem sinteze peptida na čvrstoj fazi pomoću ultrazvučne agitacije.
(Studija i analiza: Wołczański et al., 2019.)

Merlino i sur. (2019) također su proveli sveobuhvatnu studiju ultrazvučnih učinaka na sintezu peptida temeljenih na Fmoc-u, što je omogućilo sintezu različitih biološki aktivnih peptida (do 44-mer), uz izvanrednu uštedu materijala i vremena reakcije. Pokazali su da ultrazvuk nije pogoršao glavne nuspojave i poboljšao sintezu peptida opremljenih s “teške sekvence”, stavljajući ultrazvučno promoviranu sintezu peptida čvrste faze (US-SPPS) među trenutne visoko učinkovite strategije sinteze peptida.

Dostupnost sustava visokih performansi za ultrazvučnu (soničnu) sintezu peptida omogućuje značajno poboljšane stope sinteze i povećanje čistoće sirovih proizvoda. (usp. Wołczański i sur., 2019.)

Ultrazvučna sinteza peptida daje visoke prinose peptida visoke čistoće, dok je racemizacija spriječena.

Istraživanje racemizacije. Usporedba značajnih 1H NMR spektara modela peptida sintetiziranih ručno klasičnim pristupom na sobnoj temperaturi u odnosu na ultrazvučnu metodu na povišenoj temperaturi. Kemijski pomaci His i Cys α-protona i metilenske skupine Acm (lijeve ploče), ɣ-metil protona Val (desne ploče) pokazuju da sonikacija na 70°C ne uzrokuje racemizaciju.
(Studija i analiza: Wołczański et al., 2019.)

Ultrazvučno cijepanje peptida

Nakon sinteze peptida u čvrstoj fazi (SPPS), sintetizirani peptidi moraju se odcijepiti od polimernih smola. Ovaj korak je također poznat kao uklanjanje zaštite. Kada se usporede uobičajeno mućkanje i ultrazvučna obrada za cijepanje peptida iz smole, metoda mućkanja zahtijeva cca. 1 sat, dok se ultrazvučno cijepanje može postići za 15 do 20 min. Ultrazvučno cijepanje peptida može se primijeniti na cijepanje zaštićenih aminokiselina i peptida povezanih s polistirenskim smolama preko benzilnih esterskih veza.

Ultrazvučno cijepanje je brza i pouzdana tehnika za odvajanje sintetiziranih peptida od polistirenske smole.

Ultrazvučno cijepanje peptida iz polistirenske smole daje visoke prinose peptida visoke čistoće, bez racemizacije, unutar brzog postupka.
(studija i grafika: ©Anuradha i Ravindranath, 1995.)

Ultrazvučno miješani reaktor za poboljšanu sintezu peptida.

Ultrazvučno miješani reaktor za poboljšanu i ubrzanu sintezu peptida. Slika prikazuje ultrazvučni uređaj UP200St u staklenom reaktoru s miješanjem.

Ultrazvučni uređaji visokih performansi za sintezu peptida

Hielscher Ultrasonics nudi različita ultrazvučna rješenja za izravnu i neizravnu sonikaciju. Snažni i precizno kontrolirani ultrazvučni procesori opskrbljuju reakcijsku posudu točno odgovarajućom količinom ultrazvučne energije. Bilo da koristite štrcaljke, cijevi, ploče s više jažica ili staklene reaktore kao posudu za sintezu, Hielscher Ultrasonics nudi najprikladniji ultrazvučni uređaj za vašu primjenu peptida.

Hielscher ultrazvučni sustavi idealni su za sintezu

prilagođeni peptidi
velika proizvodnja peptida
biblioteke peptida

Mnoge sinteze peptida izvode se u štrcaljkama (npr. reaktorima s fritiranim štrcaljkama). Hielscherova ultrazvučna mješalica za štrcaljku sonicira otopinu peptida povezujući ultrazvučne valove kroz stijenku štrcaljke u tekućinu. Ultrazvučna mješalica sa štrcaljkom jedno je od najpopularnijih ultrazvučnih rješenja za ultrazvučno potpomognutu sintezu peptida.
Ultrazvučni cuphorn prikladan je alat za sonikaciju do 5 reaktorskih posuda, dok VialTweeter može primiti do deset reakcijskih cijevi plus dodatnih pet većih posuda putem pribora za stezanje.
For other reactor types such as the Merrifield or Kamysz solid-phase reactor and other polypropylene or borosilicate vessels and reactors, Hielscher offers sonicators for indirect and direct sonication with customized clamp-on mounting or flange.

Naravno, veći stakleni reaktori s miješanjem, npr. za sintezu u fazi otopine, može se lako opremiti ultrazvučnim sondama (a.k.a. sonotrode ili ultrazvučne rogove) bilo koje veličine.

Prednosti Hielscher Ultrasonicators za sintezu peptida

razne vrste ultrazvučnih uređaja
izravna i neizravna sonikacija
precizna kontrola intenziteta
precizna kontrola temperature
kontinuirani ili pulsirajući ultrazvuk
pametne značajke, programabilni uređaji
dostupan za bilo koji volumen
linearna skalabilnost

Za sintezu peptida na čvrstoj fazi u pločama s više jažica/mikrotitarskim pločama, UIP400MTP je idealan uređaj. Ultrazvučna kavitacija neizravno je ravnomjerno spojena u brojne jažice za uzorke za vrhunski prijenos mase i reakciju sinteze. Pogledajte videozapis u nastavku da vidite mikropločni sonikator UIP400MTP u akciji!

Ultrazvučni homogenizator UIP400MTP može ultrazvučno obrađivati ploče s više jažica i mikrotitarske ploče za lizu stanica, fragmentaciju DNA, disperziju ili homogenizaciju.

Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!

Ultrazvučni homogenizatori visokog smicanja koriste se u laboratorijskoj, stolnoj, pilotskoj i industrijskoj obradi.

Hielscher Ultrasonics proizvodi visokoučinkovite ultrazvučne homogenizatore za aplikacije miješanja, disperziju, emulzifikaciju i ekstrakciju u laboratorijskim, pilotskim i industrijskim razmjerima.

Povezane teme

Činjenice koje vrijedi znati o ultrazvučnoj sintezi peptida

Što su peptidi?

Peptidi su spojevi u kojima je više aminokiselina povezano preko amidnih veza, takozvanih peptidnih veza. Kad su vezani u složene strukture – obično se sastoje od 50 ili više aminokiselina - te velike peptidne strukture nazivaju se proteinima. Peptidi su bitan građevni blok života i ispunjavaju brojne funkcije u tijelu.

Kako funkcionira sinteza peptida?

U organskoj kemiji, molekularnoj biologiji i znanosti o životu, sinteza peptida je proces proizvodnje peptida. Peptidi se kemijski sintetiziraju reakcijom kondenzacije karboksilne skupine jedne aminokiseline na amino skupinu druge aminokiseline. Strategije zaštitnih skupina (također zaštitnih skupina) obično se koriste kako bi se izbjegle neželjene nuspojave s različitim bočnim lancima aminokiselina.
Kemijska (in vitro) sinteza peptida najčešće počinje spajanjem karboksilne skupine ulazne aminokiseline (C-kraj) na N-kraj rastućeg peptidnog lanca. Za razliku od ove C-to-N sinteze, prirodna proteinska biosinteza dugih peptida u živim organizmima odvija se u suprotnom smjeru. To znači da je u biosintezi N-završetak ulazne aminokiseline povezan s C-završetkom proteinskog lanca (N-na-C).
Većina istraživačkih i razvojnih protokola za sintezu peptida temelji se na metodama čvrste faze, dok se metode sinteze u fazi otopine mogu naći u velikoj industrijskoj proizvodnji peptida.

Koje je trenutno stanje tehnike u sintezi peptida?
SUS-SPPS (Održivi SPPS potpomognut ultrazvukom) has been demonstrated to reduce the process to just two steps per cycle (combined coupling/capping/deprotection + single wash), significantly reducing solvent consumption and time. (cf. Mottola et al., 2025)
SLAVINE potpomognute ultrazvukom je nastajuća kombinacija s dokazanim uspjehom u ukupnim sintezama (npr. lipobaktin) i istražuju je CDMO-i za proizvodnju API-ja.
Otkrijte prednosti ultrazvučno potpomognute TAGGING sinteze peptida!
Kontinuirana obrada istražuje se kao daljnje poboljšanje – opisane su platforme kontinuirane one-pot sinteze uz pomoć silyliranih tagova.
Područje se kreće prema principima zelene kemije, pri čemu i ultrazvuk i TAPS doprinose smanjenju upotrebe otapala, nižoj potrošnji reagenasa i poboljšanoj održivosti.

Literatura / Reference

Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.

High performance ultrasonics! Hielscher's product range covers the full spectrum from the compact lab ultrasonicator over bench-top units to full-industrial ultrasonic systems.

Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorija do industrijska veličina.