Sinteza peptida na čvrstoj fazi – učinkovitija uz sonikaciju
Sinteza peptida na čvrstoj fazi (SPPS) uobičajena je metoda sinteze peptida. Ultrazvuk je pouzdan alat za intenziviranje sinteze peptida na čvrstoj fazi, čime se postižu veći prinosi, poboljšana čistoća, izostanak racemizacije i znatno veća brzina reakcije. Hielscher Ultrasonics nudi različita ultrazvučna rješenja za sintezu, odcjepljivanje i otapanje peptida.
Ultrazvučna sinteza peptida na čvrstoj fazi
Ultrazvuk se već široko primjenjuje kao metoda intenziviranja u organskoj sintezi te je dobro poznat po svojim prednostima, kao što su drastično skraćena vremena reakcije, veći prinosi, manje nusproizvoda, pokretanje reakcijskih putova koji se ne bi mogli ostvariti na druge načine i/ili bolja selektivnost. Velike koristi mogu se postići i primjenom sonikacije u reakcijama sinteze peptida. Rezultati istraživanja pokazali su da sinteza peptida potpomognuta ultrazvukom omogućuje postizanje optimiziranog prinosa peptida visoke čistoće, bez racemizacije i uz kratko vrijeme reakcije.
- Visoki prinosi peptida
- Znatno brža sinteza
- Veća čistoća peptida
- Bez racemizacije
- Paralelna sinteza različitih peptida
- Mogućnost skaliranja na bilo koji volumen
Ultrazvučni cuphorn za ravnomjernu sonikaciju više reaktorskih posuda radi poboljšanja sinteze peptida.
Grafički prikaz Merrifieldove sinteze peptida na čvrstoj fazi. Ultrazvuk se upotrebljava za poticanje i poboljšanje reakcije sinteze te za odcjepljivanje sintetiziranih peptida sa smole.
Grafički prikaz: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Istraživanje | Ispitivani peptid(i) | Vrijeme reakcije (klasična sinteza u usporedbi s US-SPPS-om) | Čistoća sirovog proizvoda (klasična sinteza u usporedbi s US-SPPS-om) | Racemizacija i sporedne reakcije | Ključni zaključci |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkefalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfin | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Nisu opažene za Cys/His, čak ni pri 70°C | ~7–12x brža sinteza; velika poboljšanja čistoće, osobito za sekvence sklone agregaciji poput TAT-a. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (samo uz ultrazvuk) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Nije ispitano; zabilježen je blag pad čistoće za Pep2 | 14x kraće vrijeme za Pep1; prinosi sirovih proizvoda znatno su povećani. |
| Merlino et al. (2019) | Modelni pentapeptidi, peptidi duljine do 44-mera, “zahtjevne sekvence” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (model) | 84% → 93% (model); znatno viša nego pri toplinskom zagrijavanju (~45°C) | Nema značajnog povećanja udjela enantiomera Cys/His | Vrlo učinkovito za zahtjevne sekvence i sekvence sklone agregaciji; omogućuje smanjenje suviška reagensa uz zadržavanje visoke čistoće. |
Sinteza peptida na čvrstoj fazi poboljšana ultrazvukom
Sinteza peptida na čvrstoj fazi (SPPS) kemijska je reakcija koja omogućuje sastavljanje peptidnog lanca uzastopnim reakcijama derivata aminokiselina na netopljivom poroznom nosaču. Međutim, tradicionalna sinteza peptida na čvrstoj fazi relativno je neučinkovit i spor proces. Stoga je ultrazvučno intenziviranje sinteze peptida vrlo cijenjeno sredstvo za učinkovitiju i bržu sintezu peptida.
Silva et al. (2021) usporedili su „klasičnu” sintezu peptida na čvrstoj fazi (SPPS) uz primjenu fluorenilmetoksikarbonila (Fmoc) sa SPPS-om potpomognutim ultrazvukom (US) na temelju priprave triju peptida, odnosno peptida Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), specifičnog za receptor 3 faktora rasta fibroblasta (FGFR3), te novih peptida Pep2 (RQMATADEA-NH2) i Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS potpomognut ultrazvukom skratio je vrijeme sastavljanja peptida 14 puta (Pep1) i 4 puta (Pep2) u usporedbi s „klasičnom” metodom. Zanimljivo je da je SPPS potpomognut ultrazvukom dao Pep1 veće čistoće (82%) od „klasičnog” SPPS-a (73%). Znatno skraćenje vremena u kombinaciji s postignutom visokom čistoćom sirovog peptida potaknulo je istraživački tim da primijeni SPPS potpomognut ultrazvukom na veliki peptid Pep3, koji sadržava velik broj hidrofobnih aminokiselina i homooligomernih sekvenci. Osobito je značajno da je sinteza tog 25-mernog peptida ostvarena za manje od 6 sati (347 min) uz umjerenu čistoću (približno 49%).
Brža sinteza peptida sintezom na čvrstoj fazi uz ultrazvučno miješanje.
(Istraživanje i analiza: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) također su proveli sveobuhvatno istraživanje učinaka ultrazvuka na sintezu peptida na čvrstoj fazi temeljenu na Fmoc-u, koja je omogućila sintezu različitih biološki aktivnih peptida (do 44-mera) uz znatnu uštedu materijala i vremena reakcije. Pokazali su da sonikacija nije pogoršala glavne sporedne reakcije te da je poboljšala sintezu peptida sa „zahtjevnim sekvencama”, čime je ultrazvučno potpomognuta sinteza peptida na čvrstoj fazi (US-SPPS) svrstana među suvremene visokoučinkovite strategije sinteze peptida.
Dostupnost sustava visokih performansi za ultrazvučnu (soničnu) sintezu peptida omogućuje znatno povećanje brzine sinteze i čistoće sirovih proizvoda. (usp. Wołczański et al., 2019)
Istraživanje racemizacije. Usporedba značajnih 1H NMR spektara modelnih peptida sintetiziranih ručno klasičnim pristupom pri sobnoj temperaturi i ultrazvučnom metodom pri povišenoj temperaturi. Kemijski pomaci α-protona His i Cys te metilenske skupine Acm (lijevi prikazi) i ɣ-metilnih protona Val (desni prikazi) pokazuju da sonikacija pri 70°C ne uzrokuje racemizaciju.
(Istraživanje i analiza: Wołczański et al., 2019)
Ultrazvučno odcjepljivanje peptida
Nakon sinteze peptida na čvrstoj fazi (SPPS), sintetizirani peptidi moraju se odcijepiti s polimernih smola. Taj je korak poznat i kao uklanjanje zaštitnih skupina. Pri usporedbi uobičajenog protresanja i sonikacije za odcjepljivanje peptida sa smole, metoda protresanja zahtijeva približno 1 sat, dok se ultrazvučno odcjepljivanje može provesti za 15 do 20 min. Ultrazvučno odcjepljivanje peptida može se primijeniti za odcjepljivanje zaštićenih aminokiselina i peptida vezanih za polistirenske smole benzilnim esterskim vezama.
Ultrazvučno odcjepljivanje peptida s polistirenske smole brzim postupkom daje visoke prinose peptida visoke čistoće, bez racemizacije.
(istraživanje i grafički prikaz: ©Anuradha i Ravindranath, 1995)
Reaktor s ultrazvučnim miješanjem za poboljšanu i ubrzanu sintezu peptida. Na slici je prikazan ultrazvučni uređaj UP200St u staklenom reaktoru s miješanjem.
Ultrazvučni uređaji visokih performansi za sintezu peptida
Hielscher Ultrasonics nudi različita ultrazvučna rješenja za izravnu i neizravnu sonikaciju. Snažni ultrazvučni procesori kojima se može precizno upravljati dovode točno odgovarajuću količinu ultrazvučne energije u reakcijsku posudu. Bez obzira na to upotrebljavate li štrcaljke, epruvete, ploče s više jažica ili staklene reaktore kao posude za sintezu, Hielscher Ultrasonics nudi najprikladniji ultrazvučni uređaj za vašu primjenu s peptidima.
- sintezu prilagođenih peptida
- proizvodnju peptida u velikim razmjerima
- sintezu peptidnih knjižnica
Mnoge sinteze peptida provode se u štrcaljkama (npr. u reaktorima u obliku štrcaljke s fritom). Ultrazvučni uređaj za miješanje u štrcaljkama tvrtke Hielscher sonicira otopinu peptida prenoseći ultrazvučne valove kroz stijenku štrcaljke u tekućinu. Ultrazvučni uređaj za miješanje u štrcaljkama jedno je od najpopularnijih ultrazvučnih rješenja za ultrazvukom potpomognutu sintezu peptida.
Ultrazvučni cuphorn prikladan je alat za sonikaciju do 5 reaktorskih posuda, dok VialTweeter može primiti do deset reakcijskih epruveta te dodatnih pet većih posuda putem steznog dodatka.
Za druge vrste reaktora, poput Merrifieldova ili Kamyszova reaktora za sintezu na čvrstoj fazi, te druge polipropilenske ili borosilikatne posude i reaktore, Hielscher nudi sonikatore za neizravnu i izravnu sonikaciju s prilagođenim steznim nosačem ili prirubnicom.
Naravno, veći stakleni reaktori s miješanjem, npr. za sintezu u otopini, mogu se jednostavno opremiti ultrazvučnim sondama (poznatima i kao sonotrode ili ultrazvučni rogovi) bilo koje veličine.
- različite vrste ultrazvučnih uređaja
- izravna i neizravna sonikacija
- precizna kontrola intenziteta
- precizna kontrola temperature
- kontinuirani ili pulsni ultrazvuk
- pametne funkcije, programabilni uređaji
- dostupni za bilo koji volumen
- linearna skalabilnost
Za sintezu peptida na čvrstoj fazi u pločama s više jažica / mikrotitarskim pločama UIP400MTP idealan je uređaj. Ultrazvučna kavitacija neizravno se i ravnomjerno prenosi u brojne jažice s uzorcima radi izvrsnog prijenosa mase i reakcije sinteze. Pogledajte videozapis u nastavku kako biste vidjeli sonikator za mikroploče UIP400MTP u radu!
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi za primjene miješanja, dispergiranja, emulgiranja i ekstrakcije u laboratorijskim, pilotnim i industrijskim razmjerima.
Korisne činjenice o ultrazvučnoj sintezi peptida
Što su peptidi?
Peptidi su spojevi u kojima je više aminokiselina povezano amidnim vezama, takozvanim peptidnim vezama. Kada su povezani u složene strukture – koje se obično sastoje od 50 ili više aminokiselina – te se velike peptidne strukture nazivaju proteinima. Peptidi su ključni građevni elementi života i obavljaju brojne funkcije u tijelu.
Kako funkcionira sinteza peptida?
U organskoj kemiji, molekularnoj biologiji i znanostima o životu sinteza peptida postupak je proizvodnje peptida. Peptidi se kemijski sintetiziraju reakcijom kondenzacije karboksilne skupine jedne aminokiseline s amino-skupinom druge aminokiseline. Obično se primjenjuju strategije sa zaštitnim skupinama kako bi se izbjegle neželjene sporedne reakcije s različitim bočnim lancima aminokiselina.
Kemijska sinteza peptida (in vitro) najčešće započinje povezivanjem karboksilne skupine dolazeće aminokiseline (C-kraj) s N-krajem rastućeg peptidnog lanca. Za razliku od te sinteze u smjeru od C-kraja prema N-kraju, prirodna biosinteza proteina sastavljenih od dugih peptida u živim organizmima odvija se u suprotnom smjeru. To znači da se u biosintezi N-kraj dolazeće aminokiseline povezuje s C-krajem proteinskog lanca (od N-kraja prema C-kraju).
Većina istraživačkih i razvojnih protokola za sintezu peptida temelji se na metodama na čvrstoj fazi, dok se metode sinteze u otopini primjenjuju u industrijskoj proizvodnji peptida u velikim razmjerima.
Koje je trenutačno stanje tehnike u sintezi peptida?
SUS-SPPS (održiva ultrazvukom potpomognuta SPPS) dokazano svodi postupak na samo dva koraka po ciklusu (kombinirano spajanje/blokiranje/uklanjanje zaštitnih skupina + jedno ispiranje), čime se znatno smanjuju potrošnja otapala i potrebno vrijeme. (usp. Mottola et al., 2025)
TAPS potpomognut ultrazvukom predstavlja kombinaciju u razvoju s dokazanim uspjehom u totalnim sintezama (npr. lipobactin), koju organizacije CDMO istražuju za proizvodnju API-ja.
Otkrijte prednosti sinteze peptida postupkom TAGGING potpomognute ultrazvukom!
Kontinuirana obrada istražuje se kao dodatno poboljšanje – opisane su platforme za kontinuiranu sintezu u jednoj posudi potpomognutu sililiranim oznakama.
Područje se razvija prema načelima zelene kemije, pri čemu i ultrazvuk i TAPS pridonose smanjenju uporabe otapala, manjoj količini reagensa i poboljšanoj održivosti.
Literatura / Reference
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorijske do industrijske veličine.