Ultrazvučna solubilizacija proteinskih peleta
U proteomici priprema uzoraka nikada nije nevažan detalj. Ona je temelj na kojem počivaju točnost identifikacije, pouzdanost kvantifikacije i reproducibilnost. Jedan od najupornijih izazova u pripremi proteinskih uzoraka jest učinkovito ponovno otapanje proteinskih peleta nakon koraka precipitacije ili koncentriranja. Upravo zato ultrazvučna solubilizacija proteinskih peleta postaje sve važnija. Primjenom kontrolirane sonikacije laboratoriji mogu poboljšati iskorištenje proteina, ubrzati otapanje peleta i učinkovitije pripremiti uzorke za naknadnu masenu spektrometriju i biokemijsku analizu.
Solubilizacija proteina: zašto je sonikacija važna u suvremenoj proteomici
Proteinski peleti često nastaju tijekom precipitacije acetonom, etanolom, smjesom metanola i kloroforma, amonijevim sulfatom ili TCA. Ti se postupci široko primjenjuju za uklanjanje kontaminanata, koncentriranje proteina i pročišćavanje ekstrakata prije analize. Međutim, nakon završetka precipitacije nastali pelet može biti teško ponovno solubilizirati. Gusti agregati, hidrofobne domene, proteini povezani s membranama i proteinski kompleksi sa snažnim međusobnim interakcijama često se opiru uobičajenom miješanju ili vorteksiranju. Nepotpuna solubilizacija tada može dovesti do gubitka uzorka, pristrane zastupljenosti proteina i slabe reproducibilnosti među eksperimentima.
Sonikacija rješava upravo to usko grlo. Stvaranjem mehaničke energije u tekućem mediju sonikacija razbija kompaktne strukture peleta, potiče prodiranje pufera i raspršuje agregirani materijal u otopinu. Rezultat je brža i često potpunija rekonstitucija proteina, što je osobito vrijedno pri radu s ograničenim količinama uzoraka, složenim lizatima ili zahtjevnim proteomskim ciljevima.
Sonikator za mikroploče UIP400MTP za ekstrakciju proteina i solubilizaciju peleta
Zašto je proteinske pelete teško solubilizirati
Precipitacija proteina učinkovita je jer izdvaja proteine iz otopine. Međutim, isti proces koji precipitaciju čini korisnom stvara i problem ponovnog dobivanja proteina iz peleta. Nakon što se istalože u pelet, proteini mogu postati gusto zbijeni i djelomično denaturirani. Hidrofobne interakcije mogu se pojačati, međumolekulsko vezanje može se povećati, a neki proteini mogu zarobiti soli, lipide, nukleinske kiseline ili druge sastavnice matriksa. Čak i kada se upotrebljava snažan pufer za solubilizaciju, pasivno resuspendiranje često je sporo i nepotpuno.
U proteomici je to važno jer nepotpuno otapanje peleta ne smanjuje samo ukupni prinos. Ono može selektivno isključiti određene klase proteina, osobito membranske proteine, strukturne proteine ili proteinske vrste sklone agregaciji. To znači da konačni analitički rezultat možda više neće odražavati stvarni sastav izvornog uzorka. U proteomici visoke razlučivosti, u kojoj suptilne razlike u zastupljenosti ili posttranslacijskim modifikacijama mogu biti biološki presudne, takva pristranost uzrokovana pripremom ozbiljno je ograničenje.
Kako sonikacija poboljšava solubilizaciju proteinskih peleta
Ultrazvučna obrada poboljšava solubilizaciju unošenjem visokofrekventne mehaničke energije u uzorak. Ta energija pomaže razbiti kompaktni materijal peleta i povećava kontakt između pufera za solubilizaciju i proteina sadržanih u peletu. Umjesto oslanjanja samo na difuziju i ručno miješanje, proces aktivno raspršuje pelet u manje frakcije koje se lakše otapaju.
Praktični učinak je značajan. Sonikacija može:
- ubrzati otapanje gustih ili teško topljivih proteinskih peleta
- poboljšati iskorištenje slabo topljivih i agregiranih proteina
- skratiti vrijeme pripreme u proteomskim radnim postupcima
- pridonijeti dobivanju homogenijih uzoraka za digestiju i analizu
Takvo poboljšano dispergiranje osobito je korisno kada se talozi resuspendiraju u puferima koji sadržavaju ureju, tioureju, detergente, kaotropne tvari ili druge reagense koji se uobičajeno upotrebljavaju u proteomici. Sonikacija pomaže tim sastojcima da učinkovitije prodru do taloga i solubiliziraju ga, čime nastaje ujednačenija otopina uzorka.
Prednosti ultrazvučne solubilizacije u proteomici
Ključna prednost ultrazvučne solubilizacije jest to što često podcijenjen korak pripreme pretvara u učinkovit proces koji se može kontrolirati. U proteomici to ima izravne posljedice za analizu.
- Prvo, poboljšana solubilizacija povećava vjerojatnost da uzorak koji ulazi u enzimsku razgradnju bude reprezentativan za cjelokupnu populaciju proteina. Primjerice, razgradnja tripsinom ovisi o tome jesu li proteini dovoljno odmotani i dostupni u otopini. Ako dijelovi taloga ostanu neotopljeni, ti su proteini praktički isključeni iz stvaranja peptida, a time i iz detekcije.
- Drugo, sonikacija može poboljšati reproducibilnost. Ručno resuspendiranje taloga inherentno je varijabilno, osobito kada ga provode različiti operateri ili kada se razlikuju veličine taloga ili matrice uzoraka. Kontrolirana ultrazvučna obrada standardizira fizikalnu energiju primijenjenu na uzorak, što može smanjiti varijabilnost između priprema i poboljšati dosljednost u naknadnim radnim postupcima koji se temelje na tehnici LC-MS ili na gelovima.
- Treće, ultrazvučna obrada iznimno je korisna za uzorke s malom količinom polaznog materijala i dragocjene uzorke. Klinička proteomika, otkrivanje biomarkera, pokusi na staničnim kulturama i istraživanja tkiva često se oslanjaju na ograničenu količinu materijala. Svaki gubitak proteina tijekom solubilizacije smanjuje informacijsku vrijednost uzorka. Učinkovito ponovno otapanje ultrazvukom pomaže očuvati što veću količinu analita.
- Naposljetku, sonikacija pridonosi brzini radnog procesa. Proteomičkim laboratorijima koji obrađuju više uzoraka potrebne su pouzdane i vremenski učinkovite metode pripreme. Talog koji se brzo i potpuno otapa nije samo praktičan; on smanjuje kašnjenja, smanjuje rizik od pogrešaka pri rukovanju i povećava kapacitet obrade uzoraka.
Sonikacija u usporedbi s konvencionalnim metodama resuspendiranja
Tradicionalne metode resuspendiranja taloga obično uključuju pipetiranje, miješanje, vorteksiranje, produljenu inkubaciju ili ponovljene korake zagrijavanja. Iako te tehnike mogu biti učinkovite za rahlo zbijene taloge, često su slabije učinkovite kod izrazito zbijenog ili hidrofobnog proteinskog materijala. Samo mehaničko miješanje možda neće uspjeti potpuno razgraditi strukturu taloga, pri čemu zaostaju vidljive čestice ili nevidljive netopljive frakcije.
Sonikacija pruža aktivniji i ciljaniji pristup. Umjesto oslanjanja na sporu difuziju pufera, ona fizički razara talog i potiče brzu homogenizaciju. Time se ne uklanja potreba za odgovarajućim puferom za resuspendiranje, ali se znatno povećava učinkovitost tog pufera.
U usporedbi s isključivo ručnim metodama, ultrazvučna solubilizacija često omogućuje bolju kontrolu procesa, veću učinkovitost i bolju prikladnost za zahtjevne primjene u proteomici. Za laboratorije koji teže i analitičkoj kvaliteti i operativnoj pouzdanosti, to sonikaciju čini privlačnim izborom.
Najprikladnije primjene ultrazvučne solubilizacije proteinskih taloga
Ultrazvučna solubilizacija osobito je korisna u radnim procesima koji uključuju:
- taloženje proteina prije masene spektrometrije,
- rekonstituciju taloga iz staničnih lizata ili tkivnih ekstrakata,
- oporavak proteina bogatih membranama ili sklonih agregaciji,
- i pripremu uzoraka za kvantitativnu proteomiku u kojoj je reproducibilnost ključna.
Također je vrlo važna kada su talozi bili pohranjeni, prekomjerno osušeni ili dobiveni iz složenih bioloških matrica. U takvim slučajevima pasivno resuspendiranje može postati osobito neučinkovito, dok sonikacija pomaže ponovno učiniti uzorak upotrebljivim uz manje ručnog rada.
Sonikator VialTweeter za istodobnu sonikaciju 10 uzoraka, npr. za ekstrakciju i solubilizaciju proteina
Pronađite najbolji sonikator za svoj radni proces solubilizacije proteina!
Za laboratorije koji rade s dragocjenim uzorcima, malim količinama polaznog materijala ili proteomikom s velikim kapacitetom obrade uzoraka, portfelj tvrtke Hielscher nudi nekoliko izvedbi uređaja za sonikaciju koje se mogu precizno prilagoditi radnom postupku.
Bilo da odaberete sonikator sa sondom tvrtke Hielscher, VialTweeter Multi-Tube Sonicator ili UIP400MTP Microplate Sonicator – svaki model ultrazvučnog uređaja namijenjen je drukčijem scenariju pripreme uzoraka, a svi dijele istu ključnu prednost: reproducibilnu ultrazvučnu energiju za učinkovitu i kontroliranu obradu uzoraka.
Sonikatori sa sondom
Ultrazvučne sonde poput UP200Ht posebno su prikladne za izravnu sonikaciju pojedinačnih uzoraka. Za proteomičke laboratorije UP200Ht izvrstan je izbor kada proteinski peleti zahtijevaju intenzivno resuspendiranje u malim do srednjim volumenima, osobito kada su važni kontrola metode i ponovljivost. Izravna sonikacija sondom može brzo razbiti kompaktni materijal peleta i pomoći puferima za solubilizaciju da dopru do proteina koji bi inače ostali djelomično neotopljeni.
Pregled svih sonikatora sa sondom!
Sonikator za više epruveta VialTweeter
Kada je potrebno obraditi više zatvorenih bočica u identičnim uvjetima, sonikator za više epruveta VialTweeter nudi jasnu prednost. VialTweeter omogućuje intenzivnu sonikaciju malih volumena sonikacijom nekoliko zatvorenih bočica u sterilnim uvjetima. Istodobna priprema uzoraka u više epruveta u istim uvjetima, kao i smanjeni rizik od unakrsne kontaminacije, gubitka uzorka i stvaranja aerosola tijekom obrade u zatvorenim bočicama, čine VialTweeter pouzdanim alatom za pripremu uzoraka. U proteomici je to vrlo važno pri rukovanju dragocjenim peletima iz više ponovljenih uzoraka ili kliničkih uzoraka, pri čemu je ujednačenost između epruveta ključna.
Saznajte više o uređaju VialTweeter!
Sonikator za mikrotitarske pločice UIP400MTP
Za laboratorije s velikim kapacitetom obrade uzoraka sonikator za mikrotitarske pločice UIP400MTP proširuje prednosti sonikacije na radne postupke koji se temelje na pločicama. UIP400MTP opisan je kao sonikator za mikrotitarske pločice i pločice s više jažica za ujednačenu ultrazvučnu obradu svih jažica standardnih pločica, uključujući formate s 96 jažica, a naglašava se njegova prikladnost za automatiziranu pripremu uzoraka u područjima poput proteomike, dijagnostike i otkrivanja lijekova. Platforma je osmišljena za istodobnu obradu velikog broja uzoraka, uz prednosti poput smanjenog rizika od unakrsne kontaminacije, manje potrebe za radom, boljeg iskorištenja uzoraka i integracije u automatizirane radne postupke.
U praktičnoj proteomici to znači da se opseg solubilizacije peleta, lize stanica, ekstrakcije i povezanih koraka pripreme može povećavati mnogo učinkovitije. Umjesto obrade uzoraka jednog po jednog, laboratoriji mogu sonicirati cijele pločice uz ujednačen unos energije. To je vrijedno kad god radni postupci trebaju objediniti velik kapacitet obrade uzoraka s analitičkom rigoroznošću, primjerice u probirnim istraživanjima, kvantitativnoj proteomici ili standardiziranim nizovima postupaka pripreme uzoraka. UIP400MTP stoga nije samo alat koji olakšava rad; to je platforma koja podupire širi trend automatizacije, ponovljivosti i robusne proteomike s velikim kapacitetom obrade uzoraka.
Saznajte više o sonikatoru za mikrotitarske pločice UIP400MTP!
VialTweeter u rashladnoj komori – kontrolirani procesni parametri tijekom sonikacije.
Ekstrakcija i solubilizacija proteina s velikim kapacitetom obrade uzoraka pomoću sonikatora za mikrotitarske pločice UIP400MTP
Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj
Ultrazvučni uređaji Hielscher poznati su po najvišim standardima kvalitete i projektiranja. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Ultrazvučni uređaji Hielscher lako podnose teške uvjete i zahtjevna okruženja.
Hielscher Ultrasonics tvrtka je s ISO certifikatom koja poseban naglasak stavlja na ultrazvučne uređaje visokih performansi s najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnom uporabom. Naravno, ultrazvučni uređaji Hielscher sukladni su zahtjevima CE i zadovoljavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.
Literatura / Reference
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
- Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
Često postavljana pitanja
Zašto ultrazvučne kupelji nisu prikladne za solubilizaciju proteina?
U ultrazvučnim kupeljima kavitacija, načelo djelovanja sonikacije, nastaje vrlo neravnomjerno, zbog čega su uzorci izloženi različitim sonikacijskim tretmanima. Ovisno o položaju epruveta s uzorcima u ultrazvučnoj kupelji, na svaki uzorak djeluju različiti intenziteti. Proteomika ovisi o usporedivosti. Ako je jedan talog nepotpuno otopljen, a drugi potpuno resuspendiran, dobiveni podaci mogu odražavati pristranost uzrokovanu pripremom umjesto stvarnih bioloških značajki. Za razliku od ultrazvučnih kupelji, beskontaktni sonikatori kao što su VialTweeter ili sonikator za mikrotitarske pločice UIP400MTP omogućuju standardiziraniji rad jer omogućuju paralelnu obradu nekoliko uzoraka pod jednakim ultrazvučnim uvjetima, što može pomoći u poboljšanju ponovljivosti među eksperimentima. To je osobito korisno u istraživanjima biomarkera, usporednoj proteomici i radnim postupcima s više bioloških ili tehničkih replikata.
Koji su najčešći testovi u proteomici?
Najčešći testovi u proteomici jesu testovi za kvantifikaciju proteina i metode karakterizacije proteina koje se primjenjuju tijekom pripreme i analize uzoraka. Često korišteni testovi uključuju Bradfordov test, BCA test, Lowryjev test i mjerenje UV apsorbancije pri 280 nm za određivanje koncentracije proteina. U širim proteomičkim radnim postupcima također se često primjenjuju SDS-PAGE, Western blotting, ELISA, digestija u gelu i analize temeljene na masenoj spektrometriji za procjenu zastupljenosti, čistoće, molekulske mase i identiteta proteina.
Što je Coomassie Brilliant Blue?
Coomassie Brilliant Blue je trifenilmetansko bojilo koje se široko primjenjuje u istraživanju proteina za bojenje proteina u gelovima i za kolorimetrijsku kvantifikaciju proteina. Veže se prvenstveno na bazične i aromatske aminokiselinske ostatke, osobito arginin, te pri vezanju na proteine dolazi do spektralnog pomaka. Zbog tog je svojstva korisno i za vizualizaciju proteina nakon elektroforeze i za Bradfordov test za određivanje proteina.
Kako funkcionira Bradfordov test?
Bradfordov test temelji se na miješanju proteinskog uzorka s bojilom Coomassie Brilliant Blue u kiselim uvjetima. Kada se bojilo veže na proteine, njegov se apsorpcijski maksimum pomiče s približno 465 nm na 595 nm, što uzrokuje mjerljivu promjenu boje iz crvenkastosmeđe u plavu. Povećanje apsorbancije pri 595 nm proporcionalno je koncentraciji proteina unutar definiranog raspona, što omogućuje kvantifikaciju usporedbom sa standardnom krivuljom, koja se obično izrađuje s goveđim serumskim albuminom.
Usmjerena sonikacija uzoraka u pločicama s više jažica
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorijskih do industrijskih veličina.