Smicanje kromatina sonikacijom

Smicanje kromatina ključan je korak u mnogim radnim postupcima u epigenetici i molekularnoj biologiji, osobito u imunoprecipitaciji kromatina (ChIP), ChIP-seq i srodnim analizama. Cilj je fragmentirati kromatin u reproducibilne komplekse DNA i proteina uz očuvanje cjelovitosti epitopa i smanjenje gubitka uzorka na najmanju moguću mjeru. Među dostupnim metodama ultrazvučna fragmentacija kromatina postala je široko primjenjivan pristup jer omogućuje pouzdanu fragmentaciju bez reagensa uz izvrsnu reproducibilnost.

Što trebam uzeti u obzir pri smicanju kromatina?

Učinkovito smicanje kromatina zahtijeva pažljivu kontrolu eksperimentalnih parametara. Neodgovarajuća fragmentacija može ugroziti naknadne eksperimente ChIP stvaranjem fragmenata koji su preveliki, prekomjerno razgrađeni ili neujednačeni među uzorcima.
Jedan od najvažnijih čimbenika jest željena raspodjela veličina fragmenata. Za većinu primjena ChIP i ChIP-seq optimalni su fragmenti kromatina veličine između 100 i 600 parova baza. Taj raspon veličina omogućuje učinkovitu imunoprecipitaciju uz dovoljnu razlučivost za genomsko mapiranje.

Drugi ključan čimbenik jest učinkovitost umrežavanja prije sonikacije. Većina radnih postupaka ChIP uključuje fiksaciju formaldehidom radi stabilizacije interakcija između proteina i DNA. Međutim, prekomjerno umrežavanje može kromatin učiniti otpornijim na fragmentaciju, zbog čega je potrebna dulja sonikacija, što potencijalno povećava izloženost toplini.
Kontrola temperature također je ključna. Sonikacija lokalno stvara energiju koja može povisiti temperaturu uzorka. Povišene temperature mogu oštetiti DNA ili denaturirati proteine, što utječe na prepoznavanje antigena protutijelima tijekom postupka ChIP. Mnogi istraživači stoga provode cikluse pulsne sonikacije u kombinaciji s intervalima hlađenja kako bi održali stabilnost uzorka.
Koncentracija i volumen uzorka također utječu na učinkovitost fragmentacije. Visoko koncentrirane suspenzije kromatina mogu zahtijevati dulju sonikaciju, dok mali volumeni uzoraka zahtijevaju precizno dovođenje energije kako bi se spriječila prekomjerna obrada.
Naposljetku, izbor uređaja za sonikaciju snažno utječe na reproducibilnost eksperimenata. Uređaji namijenjeni smicanju kromatina obično omogućuju kontrolirano dovođenje ultrazvučne energije i standardizirano rukovanje uzorcima, čime se postiže ujednačena fragmentacija u više uzoraka.

Koji sonikator odabrati za smicanje kromatina?

Različiti laboratorijski radni postupci zahtijevaju različite konfiguracije za sonikaciju. Optimalan sustav uvelike ovisi o kapacitetu obrade uzoraka, volumenu i eksperimentalnom formatu.

Sonikator sa sondom

Sonikator sa sondom dovodi ultrazvučnu energiju izravno u uzorak putem titanijske sonde. Ta konfiguracija osigurava vrlo visoku gustoću energije te je stoga prikladna za snažno razaranje kromatina u pojedinačnim uzorcima.

Sonikatori sa sondom osobito su korisni za:

• Mali do srednji broj uzoraka
• Kromatin koji se teško fragmentira
• Fleksibilne eksperimentalne protokole

Sonikator za više epruveta – VialTweeter

Za laboratorije koji istodobno obrađuju više uzoraka sonikator za više epruveta VialTweeter pruža rješenje s visokom reproducibilnošću. Sustav prenosi ultrazvučnu energiju neizravno preko držača bočica, omogućujući fragmentaciju sadržaja više zatvorenih epruveta u identičnim uvjetima.

Ta konfiguracija pruža važne prednosti:

• Paralelno smicanje kromatina u više uzoraka
• Uklanjanje kontaminacije sondom
• Visoka reproducibilnost među epruvetama
• Pojednostavljen radni postupak pripreme uzoraka za ChIP

Takvi sustavi za više epruveta vrlo su prikladni za rutinske eksperimente ChIP i istraživanja sa srednjim kapacitetom obrade uzoraka.
 

Sonikator za mikroploče – UIP400MTP

Epigenetička istraživanja s visokim kapacitetom obrade uzoraka sve se više oslanjaju na obradu uzoraka u mikropločama. Sonikator za mikroploče UIP400MTP namijenjen je fragmentaciji kromatina izravno u standardnim mikropločama bez prijenosa uzoraka.

Taj pristup omogućuje:

• Istodobnu obradu desetaka ili stotina uzoraka
• Radne postupke prikladne za automatizaciju
• Ravnomjerna raspodjela ultrazvučne energije među jažicama
• Znatno smanjenje broja koraka rukovanja uzorcima

Za velike projekte probira metodom ChIP-seq ili epigenetička istraživanja s velikim kapacitetom obrade uzoraka, sonikacija u mikrotitarskim pločicama pruža iznimnu skalabilnost i učinkovitost. Sonikator za pločice s više jažica UIP400MTP vrlo je prikladan za integraciju u sustave za rukovanje tekućinama i automatizirane laboratorijske radne postupke.
 

Zašto odabrati sonikaciju umjesto drugih tehnika smičnog usitnjavanja kromatina?

U usporedbi s enzimskim pristupima, sonikacija za ChIP omogućuje nepristranu fragmentaciju jer proces ne ovisi o enzimskoj aktivnosti specifičnoj za određenu sekvencu. To je osobito važno za epigenetička istraživanja na razini cijelog genoma, u kojima je ravnomjerna pokrivenost ključna.
Druga je velika prednost skalabilnost. Ultrazvučni sustavi mogu obrađivati pojedinačne uzorke, više epruveta ili cijele mikrotitarske pločice, što laboratorijima omogućuje odabir najprikladnije konfiguracije za njihov kapacitet obrade u eksperimentima.
Konačno, sonikacija omogućuje izvrsnu kontrolu parametara fragmentacije. Prilagodbom pulsnih ciklusa, trajanja i razina snage istraživači mogu pouzdano postići željenu raspodjelu veličina fragmenata.

Kako kvantificirati prinos kromatina i procijeniti njegovu kvalitetu nakon ultrazvučne fragmentacije?

Nakon sonikacije za ChIP istraživači moraju procijeniti i količinu i kvalitetu fragmentiranog kromatina. Ovaj korak provjere osigurava da fragmentacija kromatina ispunjava zahtjeve daljnjih primjena kao što su ChIP-qPCR ili ChIP-seq.
Kvantifikacija obično započinje mjerenjem koncentracije DNA. Spektrofotometrijske metode kao što je analiza uređajem Nanodrop ili fluorometrijski testovi poput kvantifikacije DNA uređajem Qubit pružaju pouzdane procjene prinosa kromatina nakon uklanjanja poprečnih veza i pročišćavanja.
Međutim, sama koncentracija DNA ne otkriva je li fragmentacija bila uspješna. Istraživači stoga procjenjuju raspodjelu veličina fragmenata elektroforetskim tehnikama. Elektroforeza u agaroznom gelu i dalje je često korišten pristup za vizualizaciju fragmenata DNA i provjeru nalazi li se većina unutar ciljnog raspona veličina.
Napredniji laboratoriji često upotrebljavaju sustave za kapilarnu elektroforezu, kao što su Agilent Bioanalyzer ili TapeStation. Te platforme pružaju precizne profile raspodjele veličina i omogućuju istraživačima otkrivanje prekomjerne fragmentacije ili nepotpunog smičnog usitnjavanja.

Pri procjeni kvalitete kromatina nakon ultrazvučne fragmentacije istraživači obično potvrđuju sljedeće:

• Većina fragmenata DNA nalazi se u rasponu 100–600 bp
• Raspodjela fragmenata ujednačena je među ponovljenim uzorcima
• Razgradnja DNA minimalna je
• Ukupni prinos kromatina dovoljan je za planiranu analizu ChIP

Pravilna kontrola kvalitete osigurava da korak ultrazvučne fragmentacije kromatina smicanjem daje reproducibilne i biološki smislene rezultate.

Zaključak: Ultrazvučna fragmentacija kromatina smicanjem za pouzdana istraživanja

Pouzdana fragmentacija kromatina smicanjem temelj je uspješnih istraživanja metodom ChIP i istraživanja u području epigenetike. Ultrazvučna fragmentacija nudi snažno rješenje jer omogućuje precizno i reproducibilno razaranje kromatina bez reagensa u širokom rasponu eksperimentalnih formata.
Pažljivom optimizacijom parametara sonikacije, provjerom raspodjele veličina fragmenata i odabirom odgovarajućeg sustava za sonikaciju – bilo sonikatora sa sondom, sustava VialTweeter za više epruveta ili sonikatora za mikroploče UIP400MTP za obradu velikog broja uzoraka – istraživači mogu postići ujednačenu fragmentaciju kromatina koja omogućuje visokokvalitetne rezultate analiza ChIP i ChIP-seq.
Kako se epigenetička istraživanja nastavljaju razvijati prema obradi sve većeg broja uzoraka i većoj reproducibilnosti eksperimenata, ultrazvučna fragmentacija kromatina smicanjem ostaje jedna od najsvestranijih i najpouzdanijih metoda dostupnih suvremenim laboratorijima za molekularnu biologiju.

Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj

Ultrazvučni uređaji Hielscher poznati su po najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Ultrazvučni uređaji Hielscher lako se nose s teškim uvjetima i zahtjevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics tvrtka je s ISO certifikatom koja poseban naglasak stavlja na ultrazvučne uređaje visokih performansi s najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnim rukovanjem. Naravno, ultrazvučni uređaji Hielscher sukladni su zahtjevima za oznaku CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Literatura / reference

• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
• Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
• José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
• Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)