ટ્યુમર પેશીમાંથી સોનિકેશનની સહાયથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ – પ્રોટોકોલ

આ પ્રોટોકોલ ટ્યુમર પેશીમાંથી સોનિકેશનની સહાયથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણની એક પદ્ધતિ વર્ણવે છે, જે પેશીના વિઘટન દરમિયાન નિયંત્રિત પ્રોબ-સોનિકેશનનું પગલું ઉમેરીને પ્રમાણભૂત CPTAC યુરિયા લાયસિસ કાર્યપ્રવાહને વધુ વિકસાવે છે. પ્રોટિઓમ અને ફોસ્ફોપ્રોટિઓમની વ્યાપક અને ઊંડાણપૂર્વકની તૈયારી માટેની સ્થાપિત CPTAC વ્યૂહરચના પર આધારિત આ ફેરફાર કોષો અને ઉપકોષીય રચનાઓનું વિઘટન સુધારે છે, નમૂનાની શ્યાનતા ઘટાડે છે અને સામાન્ય રીતે માત્ર યુરિયા લાયસિસ દ્વારા મેળવવા વધુ મુશ્કેલ હોય તેવા પ્રોટીન, ખાસ કરીને પટલ સાથે બંધાયેલા અને DNA સાથે બંધન કરતા અથવા કોષકેન્દ્ર સાથે સંકળાયેલા પ્રોટીન, વધુ સારી રીતે મુક્ત કરે છે. આધારભૂત અભ્યાસમાં, સોનિકેશનની સહાયવાળા કાર્યપ્રવાહે ત્યારપછીની CPTAC શૈલીની પાચન, TMT લેબલિંગ, અંશીકરણ, ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ સંવર્ધન અને LC-MS/MS વિશ્લેષણ પ્રક્રિયાક્રમ સાથેની સુસંગતતા જાળવી રાખીને પ્રોટીન અને ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ બંનેની શોધમાં વધારો કર્યો હતો.

ઊંડાણપૂર્વકના પ્રોટિઓમિક અને ફોસ્ફોપ્રોટિઓમિક વિશ્લેષણ માટે ટ્યુમર પેશીમાંથી સોનિકેશનની સહાયથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ

નીચેનો પ્રોટોકોલ અતિશીત સ્થિતિમાં ચૂર્ણ કરેલી ટ્યુમર પેશીમાંથી 8 M યુરિયા લાયસિસ બફરમાં પ્રોટીનના નિષ્કર્ષણ માટે અનુકૂલિત કરેલો છે: ઉમેરવામાં આવેલું પ્રોબ પ્રકારના સોનિકેશનનું પગલું પાચન અને ત્યારપછીના LC-MS/MS વિશ્લેષણ પહેલાં નિષ્કર્ષણમાં મુશ્કેલ પ્રોટીન વર્ગો, ખાસ કરીને પટલ સાથે સંકળાયેલા અને DNA/કોષકેન્દ્ર સાથે સંકળાયેલા પ્રોટીનની પ્રાપ્તિ સુધારે છે. Li et al. (2025)ના આધારભૂત અભ્યાસમાં, સોનિકેશન ઉમેરવાથી પટલ અને કોષકેન્દ્ર સાથે સંકળાયેલા પ્રોટીનની શોધમાં વધારો થયો હતો અને તેમના કાર્યપ્રવાહ હેઠળ >12,000 પ્રોટીન અને >25,000 ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડનું વ્યાપક અને ઊંડાણપૂર્વકનું આવરણ પ્રાપ્ત કરવામાં સહાય મળી હતી.

પ્રોટોકોલનું ઉપયોગક્ષેત્ર

આ પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ નીચેના માટે કરો:

• તાજી અવસ્થામાં હિમિત કરેલી અને અતિશીત સ્થિતિમાં ચૂર્ણ કરેલી ટ્યુમર પેશી
• કોષોના પેલેટ અથવા અન્ય જૈવિક નમૂનાઓ, જેના માટે યુરિયા આધારિત નિષ્કર્ષણ પહેલેથી સ્થાપિત છે
• ટ્રિપ્સિન દ્વારા પાચન અને વૈકલ્પિક TMT લેબલિંગનો ઉપયોગ કરતા સમગ્ર પ્રોટિઓમિક્સ અને ફોસ્ફોપ્રોટિઓમિક્સના કાર્યપ્રવાહો

Li et al. (2025)નો અભ્યાસ જણાવે છે કે આ કાર્યપ્રવાહ સેલ લાઇન્સ, રક્ત અને મૂત્ર જેવા અન્ય પ્રકારના નમૂનાઓ માટે પણ લાગુ પડે છે, જોકે નમૂનાના પ્રકાર અનુસાર અનુકૂલનની જરૂર પડી શકે છે.

સોનિકેશનનું પગલું અમલમાં મૂકીને અનુકૂલિત કરેલો નમૂના તૈયારીનો કાર્યપ્રવાહ. આ અનુકૂલિત કાર્યપ્રવાહ અને પ્રાયોગિક આયોજન સમગ્ર પ્રોટિઓમિક અને ફોસ્ફોપ્રોટિઓમિક વિશ્લેષણ માટેના CPTAC નમૂના તૈયારી પ્રોટોકોલ પર આધારિત છે.
અભ્યાસ અને રૂપરેખા: ©Li et al., 2025

કાર્યસિદ્ધાંત

મૂળ અભ્યાસમાં પ્રમાણભૂત CPTAC યુરિયા લાયસિસ કાર્યપ્રવાહમાં સોનિકેશન ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને પટલો તથા કોષકેન્દ્રો સાથે સંકળાયેલા પ્રોટીનની શોધમાં સુધારો જોવા મળ્યો હતો. લેખકો જણાવે છે કે નમૂનાના કદ/સાંદ્રતાને ધ્યાનમાં રાખીને સોનિકેશનનાં પરિમાણોનું સૂક્ષ્મ સમાયોજન કરવું આવશ્યક છે – સોનોટ્રોડનું કદ, ઊર્જા ઇનપુટ અને પલ્સનો સમયક્રમ પસંદ કરીને.

ઉદાહરણ તરીકે, Hielscher UP200Ht અને UP200St માટે આનો અર્થ નીચે મુજબ થાય છે:

• કંપનવિસ્તાર અને પલ્સ મોડનો મુખ્ય નિયંત્રણ ચલો તરીકે ઉપયોગ કરો
• સમગ્ર પ્રક્રિયા દરમિયાન નમૂનાઓને ઠંડા રાખો (એટલે કે બરફ પર)
• સાવચેતીભરી સેટિંગ્સથી શરૂઆત કરો
• નમૂનાની સ્વચ્છતા, તાપમાન, પ્રોટીનની ઉપજ અને ત્યારપછી પ્રાપ્ત થતા પેપ્ટાઇડની ગુણવત્તાને ધ્યાનમાં રાખીને અનુકૂલન કરો

 
Hielscher ના બંને 200 watts સોનિકેટર મોડેલો UP200Ht અને UP200St નાના અને મધ્યમ નમૂના આયતનો માટે બનાવવામાં આવ્યાં છે અને તેમાં કંપનવિસ્તાર તથા પલ્સની સેટિંગ્સ સમાયોજિત કરી શકાય છે; બંને અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર પરિમાણોના ચોક્કસ સમાયોજન માટે ડિજિટલ ટચસ્ક્રીન નિયંત્રણ, સ્વચાલિત ડેટા રેકોર્ડિંગ, જોડીને વાપરી શકાય એવો તાપમાન સેન્સર, દૂરસ્થ નિયંત્રણ અને નમૂનાને પ્રકાશિત કરવાની સુવિધા પૂરી પાડે છે.
 

સોનિકેશનની સહાયથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ માટેનાં અભિકર્મકો

યુરિયા લાયસિસ બફર

ઉપયોગના તરત પહેલાં તાજું તૈયાર કરો:

• 8 M યુરિયા
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8.0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL એપ્રોટિનિન
• 10 µg/mL લ્યુપેપ્ટિન
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• ફોસ્ફેટેઝ અવરોધક મિશ્રણ 2, 1:100 (v/v)
• ફોસ્ફેટેઝ અવરોધક મિશ્રણ 3, 1:100 (v/v)

ઉમેરણો ઉમેરતાં પહેલાં યુરિયા સંપૂર્ણપણે ઓગળેલું હોવું આવશ્યક છે; અવરોધકો ઉપયોગના તરત પહેલાં ઉમેરવા જોઈએ; બફરને બરફ પર રાખવું જોઈએ; અને ઉમેરણો ઉમેર્યા પછી જોરશોરથી વોર્ટેક્સ કરવાને બદલે હળવેથી ગોળાકારે ફેરવવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.
 

વધારાનાં અભિકર્મકો:

• BCA પ્રોટીન પરિમાપન માટેનાં અભિકર્મકો
• 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
• DTT
• આયોડોએસિટામાઇડ
• LysC
• ટ્રિપ્સિન
• ફોર્મિક એસિડ
• મલ્ટિપ્લેક્સ્ડ માત્રાત્મક પ્રોટિઓમિક્સનો ઉપયોગ કરતા હો તો TMT અભિકર્મકો
• ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ સંવર્ધન કરતા હો તો IMAC અભિકર્મકો

સોનિકેશનની સહાયથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ માટેનાં સાધનો

જરૂરી

પ્રોબની ભલામણ કરેલી પસંદગી

આશરે 200–1000 µL ના નમૂનાઓ માટે, ઓછા આયતનના સીધા ઉચ્ચ-તીવ્રતાવાળા પ્રક્રમણ માટે યોગ્ય નાના વ્યાસના સોનોટ્રોડનો ઉપયોગ કરો. Hielscher વિવિધ વ્યાસના સોનોટ્રોડ પ્રદાન કરે છે, અને ટિપનો વ્યાસ નાનો હોય ત્યારે ટિપ પર વધુ તીવ્રતા મળે છે.

વ્યવહારુ નોંધ: વધુ પડતો ફીણ ઉત્પન્ન કર્યા વિના અથવા પાત્રની દીવાલને સ્પર્શ કર્યા વિના કાર્યક્ષમ મિશ્રણ કરતી સૌથી નાની પ્રોબનો ઉપયોગ કરો.

જો તમે એક જ સમયે અનેક નમૂનાઓ સાથે કામ કરતા હો, તો તમે મલ્ટિ-ટ્યૂબ સોનિકેટર VialTweeter અથવા માઇક્રોપ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP વિશે વિચાર કરી શકો છો!

પગલાવાર સૂચનાઓ: સોનિકેશનની સહાયથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણની પ્રક્રિયા

A. અગાઉથી ઠંડું કરો અને તૈયારી કરો

1. સેન્ટ્રિફ્યુજને 4°C સુધી ઠંડું કરો.
2. તાજું યુરિયા લાયસિસ બફર તૈયાર કરો અને તેને બરફ પર રાખો.
3. ધ્વનિરોધક આવરણની અંદર સ્ટૅન્ડ પર UP200Ht અથવા UP200St ગોઠવો.
4. નમૂનાની ટ્યૂબોને ઊભી અને સ્થિર રાખી શકાય એટલું મોટું બરફનું સ્નાન તૈયાર કરો.

તાજું બફર તૈયાર કરવું અને ઠંડી સ્થિતિમાં નમૂનાઓનું સંચાલન કરવું અત્યંત જરૂરી છે.

B. પ્રારંભિક યુરિયા નિષ્કર્ષણ

1. અતિશીત સ્થિતિમાં ચૂર્ણ કરેલી પેશીને બરફ પર રાખો.
2. દર 50 mg ભીની પેશી દીઠ 200 µL ઠંડું કરેલું યુરિયા લાયસિસ બફર ઉમેરો.
3. ઊંચી ઝડપે 5–10 s સુધી વોર્ટેક્સ કરો.
4. 4°C પર 15 min સુધી ઇન્ક્યુબેટ કરો.
5. વોર્ટેક્સ અને ત્યારબાદ ઇન્ક્યુબેશનનું પગલું વધુ એક વાર પુનરાવર્તિત કરો.
6. 4°C પર 20,000g પર 10 min સુધી સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો.
7. લાયસેટ/અધિસ્તર પ્રવાહીને પ્રોટીનનું ઓછું બંધન કરતી સ્વચ્છ ટ્યૂબમાં સ્થાનાંતરિત કરો.

C. UP200Ht અથવા UP200St નો ઉપયોગ કરીને સોનિકેશન

સોનિકેશન માટેની પ્રારંભિક પરિસ્થિતિઓ

• કંપવિસ્તાર: 20–30% થી શરૂ કરો
• પલ્સની અવધિ: 5 s ચાલુ
• શીતલન: પલ્સ વચ્ચે બરફ પર 2 min
• ચક્રોની સંખ્યા: 4 ચક્ર
• કુલ સક્રિય સોનિકેશન સમય: 20 s
• શીતલન સહિત કુલ પ્રક્રિયા સમય: આશરે 8–10 min

સોનિકેશનનાં પગલાં

1. લાયસેટને સોનિકેશન માટે યોગ્ય ટ્યૂબમાં સ્થાનાંતરિત કરો. સારી ઉષ્મા આપલે અને પ્રોબને સુરક્ષિત રીતે ડુબાડવાની સુવિધા આપતી સાંકડી, પાતળી દીવાલવાળી ટ્યૂબનો ઉપયોગ કરો.
2. ટ્યૂબને બરફના સ્નાનમાં મૂકો. સંશોધનપત્રમાં ઉષ્માથી થતું નુકસાન અટકાવવા માટે સોનિકેશન દરમિયાન શીતલનને અત્યંત જરૂરી ગણાવ્યું છે.
3. પ્રોબની ટિપને નમૂનામાં ડુબાડો. સ્થિર કેવિટેશન માટે ટિપને પૂરતા પ્રમાણમાં ડૂબેલી રાખો, પરંતુ તેને ટ્યૂબની દીવાલ કે તળિયાને સ્પર્શ કરવા દો નહીં.
4. પ્રારંભિક કંપવિસ્તાર પર 5 s નો એક પલ્સ ચલાવો.
5. તરત જ નમૂનાને સંપૂર્ણપણે ફરી બરફ પર 2 min માટે મૂકો.
6. 4 ચક્ર પૂરાં થાય ત્યાં સુધી પુનરાવર્તન કરો.
7. ચક્ર પછી લાયસેટનું નિરીક્ષણ કરો.
8. જરૂર હોય તો જ આગળ ચાલુ રાખો, એક સમયે 5 s નો એક વધારાનો પલ્સ આપો અને તે પછી હંમેશાં સંપૂર્ણ શીતલન કરો.
9. લાયસેટ વધુ એકરૂપ બને અને તેની તાંતણાપણાની/શ્યાનતાની માત્રા ઓછી થાય ત્યારે બંધ કરો.
   અંતિમ અવસ્થા વધુ અર્ધપારદર્શક લાયસેટ છે, જે સતત શ્યાન પ્રવાહને બદલે ટીપાં બનાવે છે.
10. 4°C પર આશરે 16,000g પર 15 min સુધી સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો.
11. સ્પષ્ટ કરેલા અધિસ્તર પ્રવાહીને નવી ટ્યૂબમાં સ્થાનાંતરિત કરો અને પ્રોટીનની સાંદ્રતા માપો.

સોનિકેશન કરેલા અને સોનિકેશન ન કરેલા નમૂનાઓ વચ્ચે વૈશ્વિક પ્રોટિઓમિક્સ અને ફોસ્ફોપ્રોટિઓમિક્સની સરખામણી.
a. સોનિકેશન સાથે અથવા તેના વિના તમામ PDX ટ્યુમર પેશીઓમાં ઓળખાયેલાં પ્રોટીનની સંખ્યા (વૈશ્વિક પ્રોટિઓમિક્સ). b. સોનિકેશન સાથે અથવા તેના વિના તમામ PDX ટ્યુમર પેશીઓમાં ઓળખાયેલા ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડની સંખ્યા (IMAC સંવર્ધન). માત્ર 25મા પર્સેન્ટાઇલ કરતાં વધુ અથવા તેના જેટલો વિપુલતા ગુણોત્તર ધરાવતાં પ્રોટીન અને ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડની ગણતરી કરવામાં આવી હતી. વિપુલતા ગુણોત્તરની ગણતરી સમાન પ્રકારના નમૂનાઓ વચ્ચે કરવામાં આવી હતી.
અભ્યાસ અને આલેખો: ©Li et al., 2025

ત્યારબાદનું પાચન અને વિશ્લેષણ

સોનિકેશન અને સ્પષ્ટીકરણ પછી, મૂળ CPTAC-શૈલીની કાર્યપ્રણાલીમાં વર્ણવ્યા મુજબ આગળ વધો:

1. યુરિયાની સાંદ્રતા ઘટાડીને <2 M કરવા માટે 50 mM Tris-HCl pH 8.0 વડે લાયસેટને 1:3 (v/v) ના પ્રમાણમાં પાતળું કરો.
2. દર 50 µg પ્રોટીન દીઠ 1 mAU LysC ઉમેરો અને 25°C પર 2 h સુધી ઇન્ક્યુબેટ કરો.
3. 1:49 એન્ઝાઇમ:સબસ્ટ્રેટ (w/w) ના પ્રમાણમાં ટ્રિપ્સિન ઉમેરો અને 25°C પર આખી રાત પાચન કરો.
4. અંતિમ સાંદ્રતા 1% થાય એટલું ફોર્મિક એસિડ ઉમેરીને પ્રતિક્રિયા અટકાવો.
5. જરૂર મુજબ ક્ષાર દૂર કરવાની પ્રક્રિયા, TMT લેબલિંગ, અંશીકરણ, ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ સંવર્ધન અને LC-MS/MS સાથે આગળ વધો.

TMT લેબલવાળા MS માંથી ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સની વિભેદક અભિવ્યક્તિ.
a. બેઝલ ઉપપ્રકાર, જેમાં સોનિકેશન ન કરેલા નમૂનાઓની સરખામણીમાં સોનિકેશન કરેલા નમૂનાઓમાં વધેલી અભિવ્યક્તિ ધરાવતા કેટલાક માનવ ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સ (protein-sequenceની શરૂઆત અને અંત) દર્શાવ્યા છે. b. લ્યુમિનલ ઉપપ્રકાર, જેમાં સોનિકેશન ન કરેલા નમૂનાઓની સરખામણીમાં સોનિકેશન કરેલા નમૂનાઓમાં વધેલી અભિવ્યક્તિ ધરાવતા કેટલાક માનવ ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સ (protein_sequenceની શરૂઆત અને અંત) દર્શાવ્યા છે. c. સોનિકેશન કરેલા ગાંઠોના બેઝલ ઉપપ્રકારમાં વધેલી અભિવ્યક્તિ ધરાવતા ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સના પ્રોટીન પર આધારિત સંવર્ધિત KEGG માર્ગો. d. સોનિકેશન કરેલા ગાંઠોના લ્યુમિનલ ઉપપ્રકારમાં વધેલી અભિવ્યક્તિ ધરાવતા ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સના પ્રોટીન પર આધારિત સંવર્ધિત KEGG માર્ગો.
અભ્યાસ અને આલેખો: ©Li et al., 2025

ડિઝાઇન, ઉત્પાદન અને પરામર્શ – જર્મનીમાં નિર્મિત ગુણવત્તા

Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ તેમની સર્વોચ્ચ ગુણવત્તા અને ડિઝાઇનનાં ધોરણો માટે જાણીતા છે. મજબૂતાઈ અને સરળ સંચાલનને કારણે અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સને ઔદ્યોગિક સુવિધાઓમાં સરળતાથી એકીકૃત કરી શકાય છે. Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ કઠોર પરિસ્થિતિઓ અને પડકારજનક વાતાવરણનો સરળતાથી સામનો કરે છે.

Hielscher Ultrasonics એક ISO પ્રમાણિત કંપની છે અને અત્યાધુનિક ટેકનોલોજી તથા વપરાશકર્તા માટેની સરળતા ધરાવતા ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ પર વિશેષ ભાર મૂકે છે. અલબત્ત, Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ CE અનુરૂપ છે અને UL, CSA તથા RoHsની આવશ્યકતાઓ પૂર્ણ કરે છે.

સાહિત્ય / સંદર્ભો

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.