ગાંઠ પેશીમાંથી સોનિકેશન-સહાયિત પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ – પ્રોટોકોલ

આ પ્રોટોકોલ ગાંઠ પેશીઓ માટે સોનિકેશન-સહાયિત પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ પદ્ધતિનું વર્ણન કરે છે જે પેશીઓના વિક્ષેપ દરમિયાન નિયંત્રિત પ્રોબ-સોનિકેશન પગલું ઉમેરીને પ્રમાણભૂત CPTAC યુરિયા લિસિસ વર્કફ્લોને આગળ ધપાવે છે. સ્થાપિત ડીપ-સ્કેલ CPTAC પ્રોટીઓમ અને ફોસ્ફોપ્રોટીઓમ તૈયારી વ્યૂહરચના પર નિર્માણ કરીને, આ ફેરફાર કોષ અને સબસેલ્યુલર માળખાના વિક્ષેપને સુધારે છે, નમૂના સ્નિગ્ધતા ઘટાડે છે, અને પ્રોટીનના પ્રકાશનને વધારે છે જે સામાન્ય રીતે ફક્ત યુરિયા લિસિસથી પુનઃપ્રાપ્ત કરવા મુશ્કેલ હોય છે, ખાસ કરીને પટલ-બાઉન્ડ અને DNA-બંધનકર્તા અથવા ન્યુક્લિયસ-સંકળાયેલ પ્રોટીન. અંતર્ગત અભ્યાસમાં, સોનિકેશન-સહાયિત વર્કફ્લોએ ડાઉનસ્ટ્રીમ CPTAC-શૈલી પાચન, TMT લેબલિંગ, ફ્રેક્શનેશન, ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ સંવર્ધન અને LC-MS/MS વિશ્લેષણ પાઇપલાઇન સાથે સુસંગતતા જાળવી રાખતા પ્રોટીન અને ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સ બંનેની શોધમાં વધારો કર્યો.

ડીપ પ્રોટીઓમિક અને ફોસ્ફોપ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ માટે ગાંઠ પેશીમાંથી સોનિકેશન-સહાયિત પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

પ્રોટોકોલ માટે અરજી ક્ષેત્ર

આ પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ આ માટે કરો:

• તાજા થીજી ગયેલા, ક્રાયોપલ્વરાઇઝ્ડ ગાંઠ પેશી
• કોષ ગોળીઓ અથવા અન્ય જૈવિક નમૂનાઓ જ્યાં યુરિયા-આધારિત નિષ્કર્ષણ પહેલાથી જ સ્થાપિત થયેલ છે
• ટ્રિપ્ટિક પાચન અને વૈકલ્પિક TMT લેબલિંગનો ઉપયોગ કરીને વૈશ્વિક પ્રોટીઓમિક્સ અને ફોસ્ફોપ્રોટીઓમિક્સ વર્કફ્લો

લી એટ અલ. (2025) દ્વારા કરવામાં આવેલા અભ્યાસમાં જણાવાયું છે કે કાર્યપ્રણાલી કોષ રેખાઓ, રક્ત અને પેશાબ જેવા અન્ય નમૂના પ્રકારોને પણ લાગુ પડે છે, જોકે નમૂના પ્રકાર દ્વારા ઑપ્ટિમાઇઝેશનની જરૂર પડી શકે છે.

અમલમાં મૂકાયેલા સોનિકેશન સ્ટેપ સાથે ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ નમૂના તૈયારી વર્કફ્લો. ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ વર્કફ્લો અને પ્રાયોગિક ડિઝાઇન વૈશ્વિક પ્રોટીઓમિક અને ફોસ્ફોપ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ માટે CPTAC નમૂના તૈયારી પ્રોટોકોલ પર આધારિત છે.
અભ્યાસ અને યોજના: ©Li et al., 2025

કાર્યકારી સિદ્ધાંત

મૂળ અભ્યાસમાં પ્રમાણભૂત CPTAC યુરિયા લિસિસ વર્કફ્લોમાં સોનિકેશન ઉમેરાયું હતું અને પટલ અને ન્યુક્લી સાથે સંકળાયેલા પ્રોટીનની શોધમાં સુધારો જોવા મળ્યો હતો. લેખકો જણાવે છે કે નમૂનાના કદ/સાંદ્રતાના સંદર્ભમાં સોનિકેશન પરિમાણોને ફાઇન-ટ્યુન કરવા જોઈએ. – સોનોટ્રોડનું કદ, ઉર્જા ઇનપુટ અને પલ્સ ટાઇમિંગ પસંદ કરીને.

ઉદાહરણ તરીકે, Hielscher UP200Ht અને UP200St માટે, આનો અર્થ છે:

• મુખ્ય નિયંત્રણ ચલો તરીકે કંપનવિસ્તાર અને પલ્સ મોડનો ઉપયોગ કરો
• નમૂનાઓને આખા સમય દરમિયાન ઠંડા રાખો (એટલે કે બરફ પર)
• રૂઢિચુસ્ત સેટિંગ્સથી શરૂઆત કરો
• નમૂના સ્પષ્ટતા, તાપમાન, પ્રોટીન ઉપજ અને ડાઉનસ્ટ્રીમ પેપ્ટાઇડ ગુણવત્તા સામે ઑપ્ટિમાઇઝ કરો

 
Hielscher 200 વોટ સોનિકેટર મોડેલ UP200Ht અને UP200St બંને નાના અને મધ્યમ નમૂના વોલ્યુમો માટે ડિઝાઇન કરવામાં આવ્યા છે, જેમાં એડજસ્ટેબલ કંપનવિસ્તાર અને પલ્સ સેટિંગ્સ છે; બંને અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર્સ ચોક્કસ પરિમાણ ગોઠવણ, સ્વચાલિત ડેટા રેકોર્ડિંગ, પ્લગેબલ તાપમાન સેન્સર, રિમોટ કંટ્રોલ, નમૂના પ્રકાશ માટે ડિજિટલ ટચસ્ક્રીન નિયંત્રણ પ્રદાન કરે છે.
 

સોનિકેશન-સહાયિત પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ માટે રીએજન્ટ્સ

યુરિયા લિસિસ બફર

ઉપયોગ કરતા પહેલા તરત જ તાજું તૈયાર કરો:

• ૮ મિલિયન યુરિયા
• ૭૫ મીમી NaCl
• ૫૦ મીમી ટ્રિસ, પીએચ ૮.૦
• ૧ મીમી ઇડીટીએ
• 2 µg/mL એપ્રોટીનિન
• ૧૦ µg/mL લ્યુપેપ્ટિન
• ૧ મીમી પીએમએસએફ
• ૧૦ મીમી NaF
• 20 µM પ્યુગ્નેક
• ફોસ્ફેટેઝ ઇન્હિબિટર કોકટેલ 2, 1:100 (v/v)
• ફોસ્ફેટેઝ ઇન્હિબિટર કોકટેલ 3, 1:100 (v/v)

ઉમેરણો ઉમેરતા પહેલા યુરિયા સંપૂર્ણપણે ઓગળી જવું જોઈએ; ઉપયોગ કરતા પહેલા તરત જ અવરોધકો ઉમેરવા જોઈએ; બફરને બરફ પર રાખવો જોઈએ; અને ઉમેરણો ઉમેર્યા પછી જોરશોરથી વમળ બનાવવાને બદલે ફરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.
 

વધારાના રીએજન્ટ્સ:

• BCA પ્રોટીન એસે રીએજન્ટ્સ
• ૫૦ મીમી ટ્રિસ-એચસીએલ, પીએચ ૮.૦
• ડીટીટી
• આયોડોએસેટામાઇડ
• એલવાયએસસી
• ટ્રિપ્સિન
• ફોર્મિક એસિડ
• TMT રીએજન્ટ્સ, જો મલ્ટિપ્લેક્સ્ડ ક્વોન્ટિટેટિવ પ્રોટીઓમિક્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે તો
• IMAC રીએજન્ટ્સ, જો ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ સંવર્ધન કરી રહ્યા હોય

સોનિકેશન-સહાયિત પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ માટેના સાધનો

જરૂરી

ભલામણ કરેલ પ્રોબ પસંદગી

200-1000 µL ની આસપાસના નમૂનાઓ માટે, નાના વોલ્યુમોની સીધી ઉચ્ચ-તીવ્રતા પ્રક્રિયા માટે યોગ્ય નાના-વ્યાસના સોનોટ્રોડનો ઉપયોગ કરો. હિલ્સચર બહુવિધ સોનોટ્રોડ વ્યાસ પ્રદાન કરે છે, અને નાના ટીપ વ્યાસ ટીપ પર વધુ તીવ્રતા પ્રદાન કરે છે.

વ્યવહારુ નોંધ: સૌથી નાના પ્રોબનો ઉપયોગ કરો જે વધુ પડતા ફોમિંગ અથવા વાસણની દિવાલના સંપર્ક વિના કાર્યક્ષમ મિશ્રણ આપે છે.

જો તમે એક જ સમયે બહુવિધ નમૂનાઓ સાથે કામ કરો છો, તો તમે વિચારી શકો છો મલ્ટી-ટ્યુબ સોનિકેટર વાયલટ્વીટર અથવા માઇક્રોપ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP!

સ્ટેપ-બાય-સ્ટેપ સૂચનાઓ: સોનિકેશન-સહાયિત પ્રોટીન નિષ્કર્ષણની પ્રક્રિયા

A. પ્રી-કૂલ અને તૈયારી કરો

1. સેન્ટ્રીફ્યુજને 4°C સુધી ઠંડુ કરો.
2. તાજો યુરિયા લિસિસ બફર તૈયાર કરો અને તેને બરફ પર રાખો.
3. UP200Ht અથવા UP200St ને સાઉન્ડ એન્ક્લોઝરની અંદર સ્ટેન્ડ પર સેટ કરો.
4. સેમ્પલ ટ્યુબને સીધી અને સ્થિર રાખવા માટે પૂરતું મોટું બરફનું સ્નાન તૈયાર કરો.

તાજા બફરની તૈયારી અને ઠંડા હેન્ડલિંગ મહત્વપૂર્ણ છે.

B. પ્રારંભિક યુરિયા નિષ્કર્ષણ

1. ક્રાયોપલ્વરાઇઝ્ડ ટીશ્યુ બરફ પર રાખો.
2. ૫૦ મિલિગ્રામ ભીના પેશી દીઠ ૨૦૦ µL ઠંડુ યુરિયા લિસિસ બફર ઉમેરો.
3. હાઇ સ્પીડ પર 5-10 સેકન્ડનો વમળ.
4. ૪°C પર ૧૫ મિનિટ માટે ઉકાળો.
5. વમળ-પ્લસ-ઇન્ક્યુબેશન સ્ટેપ ફરી એકવાર પુનરાવર્તિત કરો.
6. 4°C પર 10 મિનિટ માટે 20,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ.
7. લાયસેટ/સુપરનેટન્ટને સ્વચ્છ લો-બાઇન્ડ ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરો.

સી. UP200Ht અથવા UP200St નો ઉપયોગ કરીને સોનિકેશન

સોનિકેશન માટે શરૂઆતની શરતો

• કંપનવિસ્તાર: 20-30% થી શરૂ કરો
• પલ્સ લંબાઈ: 5 સેકન્ડ ચાલુ
• ઠંડક: કઠોળ વચ્ચે બરફ પર 2 મિનિટ
• ચક્રની સંખ્યા: 4 ચક્ર
• કુલ સક્રિય સોનિકેશન સમય: 20 સેકન્ડ
• કુલ પ્રક્રિયા સમય, ઠંડક સહિત: લગભગ 8-10 મિનિટ

સોનિકેશન પગલાં

1. સોનિકેશન માટે યોગ્ય ટ્યુબમાં લાયસેટ ટ્રાન્સફર કરો. સાંકડી, પાતળી-દિવાલોવાળી ટ્યુબનો ઉપયોગ કરો જે સારી ગરમીનું વિનિમય અને સુરક્ષિત પ્રોબ નિમજ્જનને મંજૂરી આપે છે.
2. ટ્યુબને બરફના સ્નાનમાં મૂકો. પેપર સોનિકેશન દરમિયાન ઠંડકને ગરમીના નુકસાનને રોકવા માટે મહત્વપૂર્ણ તરીકે ઓળખે છે.
3. પ્રોબ ટીપને નમૂનામાં બોળી દો. સ્થિર પોલાણ માટે ટીપને પૂરતી પાણીમાં ડૂબી રાખો, પરંતુ તેને ટ્યુબની દિવાલ અથવા તળિયે સ્પર્શવા ન દો.
4. શરૂઆતના કંપનવિસ્તાર પર એક 5 સેકન્ડ પલ્સ ચલાવો.
5. તરત જ નમૂનાને સંપૂર્ણપણે 2 મિનિટ માટે બરફમાં પાછું મૂકો.
6. 4 ચક્ર પૂર્ણ થાય ત્યાં સુધી પુનરાવર્તન કરો.
7. ચક્ર પછી લાયસેટનું નિરીક્ષણ કરો.
8. જરૂર પડે તો જ ચાલુ રાખો, એક સમયે એક વધારાના 5 સેકન્ડ પલ્સનો ઉપયોગ કરો, અને પછી હંમેશા સંપૂર્ણ ઠંડક આપો.
9. એકવાર લાયસેટ વધુ એકસમાન અને ઓછું સ્ટ્રેન્ઝી/ચીકણું બને પછી બંધ કરો.
   અંતિમ બિંદુ એ વધુ અર્ધપારદર્શક લાયસેટ છે જે સતત ચીકણા પ્રવાહને બદલે ટીપાં બનાવે છે.
10. ૪°C તાપમાને ૧૫ મિનિટ માટે લગભગ ૧૬,૦૦૦ ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ.
11. સ્પષ્ટ સુપરનેટન્ટને તાજી નળીમાં સ્થાનાંતરિત કરો અને પ્રોટીન સાંદ્રતા માપો.

સોનિકેટેડ અને નોન-સોનિકેટેડ નમૂનાઓ વચ્ચે વૈશ્વિક પ્રોટીઓમિક્સ અને ફોસ્ફોપ્રોટીઓમિક્સની સરખામણી.
a. સોનિકેશન સાથે અથવા વગરના બધા PDX ગાંઠ પેશીઓમાં ઓળખાયેલ પ્રોટીન (વૈશ્વિક પ્રોટીઓમિક્સ) ની સંખ્યા. b. સોનિકેશન સાથે અથવા વગરના બધા PDX ગાંઠ પેશીઓમાં ઓળખાયેલ ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સ (IMAC સંવર્ધન) ની સંખ્યા. ફક્ત 25મા ટકાવારી કરતા વધારે અથવા તેના બરાબર વિપુલતા ગુણોત્તર ધરાવતા પ્રોટીન અને ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સની ગણતરી કરવામાં આવી હતી. સમાન પ્રકારના નમૂનાઓ વચ્ચે વિપુલતા ગુણોત્તરની ગણતરી કરવામાં આવી હતી.
અભ્યાસ અને આલેખ: ©Li et al., 2025

ડાઉનસ્ટ્રીમ પાચન અને વિશ્લેષણ

સોનિકેશન અને સ્પષ્ટતા પછી, મૂળ CPTAC-શૈલીના વર્કફ્લોમાં વર્ણવ્યા મુજબ આગળ વધો:

1. યુરિયા ઘટાડવા માટે લાયસેટ 1:3 (v/v) ને 50 mM ટ્રિસ-HCl pH 8.0 સાથે પાતળું કરો <2 M.
2. ૫૦ µg પ્રોટીન દીઠ ૧ mAU પર LysC ઉમેરો અને ૨૫°C પર ૨ કલાક માટે સેવન કરો.
3. ટ્રિપ્સિન 1:49 એન્ઝાઇમ: સબસ્ટ્રેટ (w/w) પર ઉમેરો અને 25°C પર રાત્રે પચાવો.
4. ફોર્મિક એસિડથી ૧% સુધી ધીમા તાપે શાંત કરો.
5. જરૂર મુજબ ડિસોલ્ટિંગ, TMT લેબલિંગ, ફ્રેક્શનેશન, ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ સંવર્ધન અને LC-MS/MS ચાલુ રાખો.

TMT-લેબલવાળા MS માંથી ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સની વિભેદક અભિવ્યક્તિ.
a. બેઝલ સબટાઇપ, જે સોનિકેટેડ નમૂનાઓમાં અપરેગ્યુલેટેડ કેટલાક માનવ ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સ (પ્રોટીન-સિક્વન્સ શરૂઆત અને અંત) ને હાઇલાઇટ કરે છે જે નોનસોનિકેટેડ નમૂનાઓની તુલનામાં સોનિકેટેડ નમૂનાઓમાં અપરેગ્યુલેટેડ કેટલાક માનવ ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સ (પ્રોટીન-સિક્વન્સ શરૂઆત અને અંત) ને હાઇલાઇટ કરે છે. c. ગાંઠોના સોનિકેટેડ બેઝલ સબટાઇપમાં અપરેગ્યુલેટેડ ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સના પ્રોટીન પર આધારિત સમૃદ્ધ KEGG માર્ગો. d. ગાંઠોના સોનિકેટેડ લ્યુમિનલ સબટાઇપમાં અપરેગ્યુલેટેડ ફોસ્ફોપેપ્ટાઇડ્સના પ્રોટીન પર આધારિત સમૃદ્ધ KEGG માર્ગો.
અભ્યાસ અને આલેખ: ©Li et al., 2025

ડિઝાઇન, ઉત્પાદન અને કન્સલ્ટિંગ – જર્મનીમાં બનાવેલ ગુણવત્તા

Hielscher ultrasonicators તેમના ઉચ્ચતમ ગુણવત્તા અને ડિઝાઇન ધોરણો માટે જાણીતા છે. મજબૂતાઈ અને સરળ કામગીરી ઔદ્યોગિક સુવિધાઓમાં અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સના સરળ એકીકરણને મંજૂરી આપે છે. ખરબચડી પરિસ્થિતિઓ અને માંગવાળા વાતાવરણને Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ દ્વારા સરળતાથી નિયંત્રિત કરવામાં આવે છે.

Hielscher Ultrasonics એ ISO પ્રમાણિત કંપની છે અને ઉચ્ચ-પ્રદર્શન અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ પર વિશેષ ભાર મૂકે છે જેમાં અત્યાધુનિક ટેકનોલોજી અને વપરાશકર્તા-મિત્રતા દર્શાવવામાં આવે છે. અલબત્ત, Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ CE અનુરૂપ છે અને UL, CSA અને RoHs ની જરૂરિયાતોને પૂર્ણ કરે છે.

સાહિત્ય / સંદર્ભો