પેશીઓ અને કોષ સંવર્ધનોમાંથી અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ
- પ્રોટિઓમિક્સમાં પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ એ નમૂનાની તૈયારીનું એક આવશ્યક પગલું છે.
- વનસ્પતિ અને પ્રાણીઓની પેશીઓ, યીસ્ટ અને સૂક્ષ્મજીવોમાંથી પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ કરી શકાય છે.
- સોનિકેશન એ પ્રોટીન નિષ્કર્ષણની વિશ્વસનીય અને કાર્યક્ષમ પદ્ધતિ છે, જે નિષ્કર્ષણના ટૂંકા સમયમાં પ્રોટીનની ઊંચી ઉપજ આપે છે.
પેશીઓ અને કોષોમાંથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ
પેશીઓ અને સંવર્ધિત કોષોમાંથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ એ નમૂનાની તૈયારીનું એક આવશ્યક પગલું છે, જે ELISA, PAGE, વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ, માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી અથવા પ્રોટીન શુદ્ધિકરણ જેવી ઘણી જૈવરાસાયણિક અને વિશ્લેષણાત્મક તકનીકો દરમિયાન કરવામાં આવે છે. અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટન, લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણ એ પ્રોટીનની ઊંચી ઉપજ સુનિશ્ચિત કરવા માટેની ચોકસાઈથી નિયંત્રિત કરી શકાય તેવી, બિનતાપીય તકનીક છે.
કોષોમાંથી પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ UP200St વડે
- ઝડપી
- ઊંચી ઉપજ
- અત્યંત કાર્યક્ષમ
- પરિમાણો પર ચોક્કસ નિયંત્રણ
- પુનરુત્પાદિત કરી શકાય તેવાં પરિણામો
- રેખીય રીતે પ્રક્રિયાનું પ્રમાણ વધારવાની ક્ષમતા
અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ માટે સામાન્ય સૂચનાઓ
- તાપમાન નિયંત્રણ: તાપીય વિકૃતીકરણ વિના પ્રોટીનની ઊંચી ઉપજ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, નિષ્કર્ષણ દરમિયાન તાપમાન નિયંત્રિત કરવું આવશ્યક છે. Hielscher ના અદ્યતન અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝરો – જેને અલ્ટ્રાસોનિક ડિસઇન્ટિગ્રેટર અથવા અલ્ટ્રાસોનિફાયર પણ કહેવાય છે – ચોકસાઈથી નિયંત્રિત કરી શકાય છે. તે પ્લગ દ્વારા જોડી શકાય તેવા તાપમાન સેન્સર સાથે આવે છે. અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝરના સેટિંગ વિકલ્પોમાં મહત્તમ તાપમાન સેટ કરી શકાય છે. જ્યારે તાપમાન આ મહત્તમ મર્યાદાએ પહોંચે છે, ત્યારે અલ્ટ્રાસોનિકેટર આપમેળે બંધ થઈ જાય છે અને નમૂનો ઠંડો થાય ત્યાં સુધી બંધ રહે છે.
- બફર: યોગ્ય બફરની પસંદગી અને બફરનું યોગ્ય પ્રમાણ પેશી પ્રમાણે બદલાય છે અને પ્રયત્ન અને ભૂલ આધારિત પરીક્ષણો દ્વારા નક્કી કરવું આવશ્યક છે.
- અલગીકરણ / શુદ્ધિકરણ: પ્રોટીન લાયસેટમાં DNA અથવા કાર્બોહાઇડ્રેટ જેવા જૈવઅણુઓની અધિક માત્રા હોઈ શકે છે, જેને પ્રોટીન અવક્ષેપન (ડિઓક્સિકોલેટ-ટ્રાઇક્લોરોએસિટિક એસિડ) અથવા બફર વિનિમય દ્વારા દૂર કરી શકાય છે.
Chittapalo અને Noomhorm (2009)એ તેમના અભ્યાસમાં અહેવાલ આપ્યો હતો કે સોનિકેશનના ઉપયોગથી પ્રોટીનની ઉપજ વધી હતી અને અલ્ટ્રાસોનિક પેશી સમાનાંગીકરણ અને લાયસિસની પ્રક્રિયા હાલની નિષ્કર્ષણ પ્રક્રિયાઓને નોંધપાત્ર રીતે સુધારી શકે છે – જેનાથી વ્યાવસાયિક નિષ્કર્ષણની નવી તકો શક્ય બને છે.
અલ્ટ્રાસોનિક CupHorn પ્રોટીન અલગીકરણ અને DNA ખંડન માટે સમાન પરિસ્થિતિઓમાં અનેક નમૂનાઓની એકસાથે અત્યંત અસરકારક તૈયારી કરવા માટે વપરાય છે.
પ્રાણીઓની પેશીઓમાંથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ
સંપૂર્ણ કદની પેશીઓની તૈયારી માટે (દા.ત. મૂત્રપિંડ, હૃદય, ફેફસાં, સ્નાયુ વગેરે), પ્રોટિએઝ દ્વારા થતા વિઘટનને અટકાવવા માટે સ્વચ્છ સાધનો વડે પેશીને ખૂબ નાના ટુકડાઓમાં કાપવી જોઈએ, શક્ય હોય તો બરફ પર અને શક્ય તેટલી ઝડપથી (દા.ત. RIPA જેવા લાયસિસ બફર અથવા પ્રોટિએઝ અને ફોસ્ફેટેઝ અવરોધકોનું મિશ્રણ ધરાવતા હાઇપોટોનિક લાયસિસ બફર). કાપ્યા પછી, ત્વરિત હિમીકરણ માટે નમૂનાને પ્રવાહી નાઇટ્રોજનમાં ડુબાડવામાં આવે છે. નમૂનાને પછીના ઉપયોગ માટે -80°C પર સંગ્રહિત કરી શકાય છે અથવા તાત્કાલિક સમાનાંગીકરણ માટે બરફ પર રાખી શકાય છે. અલ્ટ્રાસોનિક નિષ્કર્ષણની તરત પહેલાં, બરફ જેટલું ઠંડું લાયસિસ બફર (પ્રોટિએઝ અવરોધકો DTT, લ્યુપેપ્ટિન અને એપ્રોટિનિન સાથે) નમૂનાની ટ્યુબમાં ઝડપથી ઉમેરવામાં આવે છે (પેશીના દર ~10 mg માટે આશરે ~600 μL બફરની ભલામણ કરવામાં આવે છે). નમૂનાની દરેક ટ્યુબ દીઠ આશરે 20–60mg પેશીની ભલામણ કરવામાં આવે છે.
અલ્ટ્રાસોનિક સમાનાંગીકરણ, લાયસિસ અને નિષ્કર્ષણ માઇક્રો-ટિપ સોનોટ્રોડથી સજ્જ UP100H અથવા UP200Ht જેવા અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર વડે કરવામાં આવે છે. 15 sec. સોનિકેશન અને 10 sec. વિરામના અલ્ટ્રાસોનિક ચક્ર મોડમાં સોનિકેશનનો સમયગાળો 60–90 sec. હોય છે. નમૂનાને સમગ્ર સમય દરમિયાન બરફમાં રાખવો જોઈએ.
અલ્ટ્રાસોનિક સમાનાંગીકરણ / નિષ્કર્ષણ પછી, લાયસેટને આશરે 20 min. માટે 27,000g પર અપકેન્દ્રિત કરવામાં આવે છે. ત્યારબાદ ઉપરનું સ્વચ્છ પ્રવાહી એકત્રિત કરવામાં આવે છે, જેથી Pierce protein assay BCA જેવા પ્રોટીન પરીક્ષણ દ્વારા પ્રોટીનની સાંદ્રતા નક્કી કરી શકાય.
રક્ત સીરમમાંથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ
સીરમ અને ફોસ્ફેટ બફરનું સમાન મિશ્રણ મેળવવા માટે, અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાયસિસ પહેલાં નમૂનાને વોર્ટેક્સ કરીને મિશ્રિત કરવામાં આવે છે. અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ માટે, UP100H જેવા અલ્ટ્રાસોનિક લેબ હોમોજેનાઇઝર વડે 20% કંપવિસ્તાર પર 8 ચક્ર સુધી નમૂનાનું સોનિકેશન કરવામાં આવે છે, જેમાં દરેક ચક્રમાં 5 સેકન્ડ ચાલુ અને 15 સેકન્ડ બંધ રાખવામાં આવે છે. ચક્રોમાં સોનિકેશન કરીને (પલ્સેશન મોડમાં) અને નમૂનાને બરફ પર રાખીને પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ કરવામાં આવે છે, જેથી નમૂનો અતિશય ગરમ થતો અને તેનું ઉષ્મીય વિઘટન થતું અટકે. સીરમમાં ઊંચા અણુભારવાળાં પ્રોટીન (જેમ કે આલ્બ્યુમિન, α1-એન્ટિટ્રિપ્સિન, ટ્રાન્સફેરિન, હેપ્ટોગ્લોબ્યુલિન, ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન G અને ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન A) મોટી માત્રામાં હોય છે, જે IEF દરમિયાન ઓછા અણુભારવાળાં પ્રોટીનના વિભાજનમાં અવરોધ ઊભો કરે છે, તેથી ડિપ્લીશન કૉલમનો ઉપયોગ કરીને સીરમમાંથી તેમની માત્રા ઘટાડવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.
વનસ્પતિ પેશીમાંથી પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ
તાજી, નરમ વનસ્પતિ પેશી, દા.ત. શેવાળ વગેરેને, સોનિકેશન માટે કાપેલી નમૂના સામગ્રીને લાયસિસ બફરમાં મૂકવા માત્રથી સરળતાથી વિઘટિત કરી શકાય છે. બીજ, ફર વૃક્ષનાં સોયાકાર પાંદડાં વગેરે જેવી કઠિન, કાષ્ઠમય વનસ્પતિ પેશીઓને સૂકી અવસ્થામાં પીસવી જોઈએ. કેટલીક સખત, કાષ્ઠમય વનસ્પતિ સામગ્રીને સોનિકેશન વડે નિષ્કર્ષણ કરતાં પહેલાં પ્રવાહી નાઇટ્રોજનમાં જમાવીને પીસવી આવશ્યક છે. વનસ્પતિ કોષ સંવર્ધનનાં સસ્પેન્શન માટે, લાયસિસ બફરમાં 30 થી 150 સેકન્ડની અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયા મોટે ભાગે પૂરતી હોય છે. કોળાનાં બીજ જેવી વધુ કઠિન સામગ્રી માટે નીચે વર્ણવ્યા મુજબ વધુ તીવ્ર સોનિકેશન જરૂરી છે.
કોળાનાં બીજમાંથી આલ્બ્યુમિનના અલ્ટ્રાસોનિક નિષ્કર્ષણ માટેનો પ્રોટોકોલ
બારીક પીસેલા કોળાનાં બીજના પાવડરમાંથી આલ્બ્યુમિનના અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ માટે, 250mLના કાચના બીકરમાં ચરબી દૂર કરેલા કોળાનાં બીજનો 10 g પાવડર અને દ્રાવક તરીકે 100 mL વિઆયનીકૃત પાણી ઉમેરવામાં આવે છે. પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ બે તબક્કામાં થાય છે: પ્રથમ, નમૂનાનું સોનિકેશન સોનોટ્રોડ S24d7 થી સજ્જ પ્રોબ પ્રકારના અલ્ટ્રાસોનિકેટર UP400St (400W, 24kHz) વડે કરવામાં આવે છે. અલ્ટ્રાસોનિક સમાનાંગીકરણ દરમિયાન કાચના બીકરને ઠંડા પાણીના બાથમાં મૂકવામાં આવે છે. અલ્ટ્રાસોનિકેટર UP400St નું પ્લગ દ્વારા જોડી શકાય તેવું તાપમાન સેન્સર અને તાપમાન નિયંત્રણ સેટિંગ્સ નમૂનાનું તાપમાન હંમેશાં 30°C થી નીચે જળવાઈ રહે તેની ખાતરી કરે છે. સોનિકેશન દરમિયાન તાપમાનના ચોક્કસ નિયંત્રણથી આલ્બ્યુમિનનું વિકૃતીકરણ ટાળવામાં આવે છે. બીજા તબક્કામાં, 200 rpm ની ઝડપે અને 30°C પર મિક્સર વડે નિષ્કર્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ બીકરને તાપમાન નિયંત્રિત શેકરમાં ખસેડવામાં આવે છે. નિસ્યંદિત પાણી સાથે ડાયાલિસિસ દ્વારા ગ્લોબ્યુલિન દૂર કરવામાં આવે છે. ગ્લોબ્યુલિન દૂર કર્યા પછી, આલ્બ્યુમિનની પ્રોફાઇલ નક્કી કરવા માટે પ્રોટીનના અર્કમાંથી નમૂનો લઈ શકાય છે અને ત્યારબાદ આલ્બ્યુમિનના સ્કંદન માટે 0.1 M HCl નો ઉપયોગ કરીને અર્કને pI=3.0 પર સમાયોજિત કરવામાં આવે છે. ઘન પ્રાવસ્થાને 5000g, 20°C પર અપકેન્દ્રણ દ્વારા અલગ કરવામાં આવે છે અને વિઆયનીકૃત પાણીમાં ફરી ઓગાળવામાં આવે છે. આલ્બ્યુમિનના સાંદ્રિત અર્કમાં પ્રોટીનનું પ્રમાણ વધારવા માટે આલ્બ્યુમિનનું સ્કંદન બે વાર કરવામાં આવે છે.
ચોખાની કુશકીમાંથી પ્રોટીનનો સાંદ્રિત અર્ક તૈયાર કરવા માટેનું અલ્ટ્રાસોનિક ક્ષારીય પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ દર્શાવે છે કે પરંપરાગત નિષ્કર્ષણ પદ્ધતિઓની સરખામણીમાં અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયાથી નોંધપાત્ર રીતે ઓછા નિષ્કર્ષણ સમયમાં પ્રોટીનની વધુ ઉપજ મળે છે.
કાર્યશીલ iNOS એન્ઝાઇમ માટે નમૂના તૈયારીનો પ્રોટોકોલ
સંપૂર્ણપણે કાર્યશીલ iNOS એન્ઝાઇમ મેળવવા માટે (દા.ત. દવાઓની સ્ક્રીનિંગ માટે), નીચેના પ્રોટોકોલની ભલામણ કરવામાં આવે છે: કોષ સસ્પેન્શનને બરફ પર મૂકવું જોઈએ અને UP100H વડે 10µm કંપવિસ્તાર પર, 5 sec. સોનિકેશન અને બરફ પર 25 sec. વિરામના ચક્ર મોડમાં તેનું સોનિકેશન કરવામાં આવે છે. આ પ્રક્રિયા આશરે 3 વાર પુનરાવર્તિત કરવી જોઈએ. સોનિકેશન ચક્રો વચ્ચેનો વિરામ તાપમાનમાં થતો વધારો ઘટાડે છે અને તેથી વિકૃતીકરણનું જોખમ ઘટાડશે.
અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોટીન દ્રાવ્યીકરણ
સોનિકેશન પ્રોટીનના દ્રાવ્યીકરણની પ્રક્રિયાને વેગ આપી શકે છે, જેમાં સામાન્ય રીતે કેટલાક કલાકો લાગે છે. નમૂનો અતિશય ગરમ ન થાય અને યુરિયા ધરાવતાં દ્રાવણોમાં પ્રોટીનનું વિઘટન તથા ફેરફારો અટકે તે માટે, અલ્ટ્રાસોનિક સ્પંદનો થોડા સેકન્ડથી વધુ સમય સુધી ચાલવાં જોઈએ નહીં.
અલ્ટ્રાસોનિકેટર UP200Ht નાના નમૂનાઓના સોનિકેશન માટે 2mm માઇક્રોટિપ S26d2 સાથે.
પ્રોટીનના નિષ્કર્ષણ માટે અલ્ટ્રાસોનિક ઉપકરણો
Hielscher Ultrasonics કોષો, પેશીઓ, બેક્ટેરિયા, સૂક્ષ્મજીવો, યીસ્ટ અને બીજાણુઓના વિઘટન માટે અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર્સની વિશાળ શ્રેણી પ્રદાન કરે છે.
Hielscher પ્રયોગશાળાના અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ શક્તિશાળી છે અને ચલાવવામાં સરળ છે. 24/7 કાર્ય માટે બનાવવામાં આવેલાં આ ઉપકરણો મજબૂત અને કાર્યક્ષમ પ્રયોગશાળા તથા બેન્ચ-ટોપ ઉપકરણો તરીકે રચાયેલાં છે. તમામ ઉપકરણોમાં ઊર્જા આઉટપુટ અને કંપવિસ્તારને ચોકસાઈથી નિયંત્રિત કરી શકાય છે. સહાયક સાધનોની વિશાળ શ્રેણી ગોઠવણીના વધુ વિકલ્પો ઉપલબ્ધ કરાવે છે. VialTweeter, UP200Ht, UP200St અને UP400St જેવા ડિજિટલ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સમાં સંકલિત તાપમાન નિયંત્રણ અને સ્વચાલિત ડેટા રેકોર્ડિંગ માટે આંતરિક SD કાર્ડ હોય છે.
અનેક નમૂનાઓના પરોક્ષ, પરસ્પર દૂષણમુક્ત અને એકસાથે સોનિકેશન માટે અમે VialTweeter અથવા અલ્ટ્રાસોનિક CupHorn પ્રદાન કરીએ છીએ.
નીચેનું કોષ્ટક નમૂનાની તૈયારી, કોષ વિઘટન અને નિષ્કર્ષણ માટેના અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સની ઝાંખી આપે છે. દરેક અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર વિશે વધુ માહિતી મેળવવા માટે ઉપકરણના પ્રકાર પર ક્લિક કરો. અમારા સુપ્રશિક્ષિત અને લાંબા સમયનો અનુભવ ધરાવતા તકનીકી કર્મચારીઓ તમારા નમૂનાની તૈયારી માટે સૌથી યોગ્ય અલ્ટ્રાસોનિકેટર પસંદ કરવામાં તમને ખુશીથી મદદ કરશે!
| બેચનું આયતન | પ્રવાહ દર | ભલામણ કરેલાં ઉપકરણો |
|---|---|---|
| 10 સુધીની વાયલ અથવા ટ્યુબ | n.a. | VialTweeter |
| મલ્ટીવેલ / માઇક્રોટાઇટર પ્લેટ્સ | n.a. | UIP400MTP |
| અનેક ટ્યુબ / પાત્રો | n.a. | CupHorn |
| 1 થી 500mL | 10 થી 200mL/min | UP100H |
| 10 થી 1000mL | 20 થી 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 થી 2000mL | 20 થી 400mL/min | UP400St |
તમારા ઉપયોગ, સામગ્રી અને નમૂનાના આયતનના આધારે અમે તમારા નમૂનાની તૈયારી માટે સૌથી યોગ્ય ગોઠવણીની ભલામણ કરીશું. આજે જ અમારો સંપર્ક કરો!
અમારો સંપર્ક કરો! / અમને પૂછો!
Hielscher ડિજિટલ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સમાં બ્રાઉઝર દ્વારા દૂરસ્થ નિયંત્રણ અને સંકલિત SD કાર્ડ પર સ્વચાલિત ડેટા નોંધણીની સુવિધા હોય છે.
VialTweeter પરોક્ષ સોનિકેશન માટે.
જાણવા યોગ્ય તથ્યો
પ્રોટીઓમિક્સ
પ્રોટીઓમિક્સ એ પ્રોટીન અને પ્રોટીઓમની તપાસ કરતું સંશોધન ક્ષેત્ર છે. પ્રોટીન સજીવોમાં અત્યંત આવશ્યક કાર્યોની વિશાળ શ્રેણી નિભાવે છે. પ્રોટીઓમ એ ચોક્કસ સમયે જિનોમ, કોષ, પેશી અથવા સજીવ દ્વારા અભિવ્યક્ત થતા પ્રોટીનનો સંપૂર્ણ સમૂહ છે. સમય સાથે અને કોષ અથવા સજીવની વિશિષ્ટ જરૂરિયાતો અથવા તેના પર આવતા તણાવ અનુસાર પ્રોટીઓમ બદલાય છે. વધુ ચોક્કસ રીતે કહીએ તો, તે નિર્ધારિત પરિસ્થિતિઓમાં, ચોક્કસ સમયે, ચોક્કસ પ્રકારના કોષ અથવા સજીવમાં અભિવ્યક્ત થતા પ્રોટીનનો સમૂહ છે. આ શબ્દ પ્રોટીન અને જિનોમ શબ્દોના સંયોજનથી બનેલો છે. પ્રોટીઓમિક્સ એ પ્રોટીઓમનો અભ્યાસ છે.
પ્રોટીન
પ્રોટીન મોટા જૈવઅણુઓ છે, જેને મહાઅણુઓ કહેવામાં આવે છે – તે એમિનો એસિડના અવશેષોની એક અથવા વધુ લાંબી શૃંખલાઓથી બનેલા હોય છે. વનસ્પતિ અને પ્રાણી બંને મૂળના તમામ સજીવોમાં પ્રોટીન હાજર હોય છે અને મોટાભાગનાં જૈવિક કાર્યો માટે તે અત્યંત આવશ્યક હોય છે. પ્રોટીનમાં ઘણી જૈવિક માહિતી રહેલી હોવાથી, વિશ્લેષણના હેતુ માટે, દા.ત. પ્રોટીઓમિક સંશોધન માટે, તેમનું નિષ્કર્ષણ કરવામાં આવે છે. પ્રોટીન દ્વારા કરવામાં આવતાં સૌથી મહત્ત્વપૂર્ણ કાર્યોમાં ચયાપચયની પ્રતિક્રિયાઓનું ઉત્પ્રેરણ, DNA પ્રતિકૃતિ, ઉત્તેજનાઓ પ્રત્યે પ્રતિભાવ અને અણુઓનું એક સ્થાનેથી બીજા સ્થાને પરિવહન સામેલ છે. પ્રોટીન એકબીજાથી મુખ્યત્વે તેમના એમિનો એસિડના ક્રમમાં જુદાં પડે છે, જે તેમના જનીનોના ન્યુક્લિયોટાઇડ ક્રમ દ્વારા નિર્ધારિત થાય છે અને સામાન્ય રીતે તેના પરિણામે પ્રોટીન વળીને ચોક્કસ ત્રિપરિમાણીય રચના બનાવે છે, જે તેની સક્રિયતા નક્કી કરે છે. પ્રોટીન – પેપ્ટાઇડ્સ ઉપરાંત – ખોરાકના મુખ્ય ઘટકોમાંના એક છે. તેથી, પ્રક્રિયાઓને શ્રેષ્ઠ બનાવવા, ખાદ્ય સુરક્ષા અને પોષણ મૂલ્યાંકન માટે ખાદ્ય વિજ્ઞાનમાં પ્રોટીઓમિક્સ એક શક્તિશાળી સાધન છે.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction વિશ્લેષ્યોને અલગ કરવાની અને પૂર્વસાંદ્રિત કરવાની વિશ્લેષણપૂર્વ પ્રક્રિયા છે. અલ્ટ્રાસોનિકેશન સાથે સંયોજનમાં, ક્લાઉડ પોઇન્ટ નિષ્કર્ષણને વધુ તીવ્ર બનાવી શકાય છે, જેનાથી પ્રક્રિયા વધુ કાર્યક્ષમ, વધુ ઝડપી અને વધુ પર્યાવરણમૈત્રી બને છે. અલ્ટ્રાસોનિકેશન સાથે, ક્લાઉડ પોઇન્ટ નિષ્કર્ષણ વિશ્લેષ્યની તૈયારી માટે નોંધપાત્ર રીતે વધુ કાર્યક્ષમ પદ્ધતિ છે. અલ્ટ્રાસોનિક સહાયથી કરવામાં આવતા ક્લાઉડ પોઇન્ટ નિષ્કર્ષણ વિશે વધુ વાંચો!
જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ
જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ એ DNA, RNA અને પ્રોટીન જેવા મહાઅણુઓ તેમજ તેમના ખંડોને તેમના કદ અને વિદ્યુતભારના આધારે અલગ પાડવા અને તેમનું વિશ્લેષણ કરવાની મુખ્ય પદ્ધતિ છે. તેનો ઉપયોગ ક્લિનિકલ રસાયણશાસ્ત્રમાં પ્રોટીનને વિદ્યુતભાર અને/અથવા કદના આધારે અલગ પાડવા માટે (IEF એગરોઝ, જે મૂળભૂત રીતે કદથી સ્વતંત્ર છે) અને જૈવરસાયણશાસ્ત્ર, આણ્વિક જીવવિજ્ઞાન તથા પ્રોટીઓમિક્સમાં DNA અને RNA ખંડોના મિશ્ર સમૂહને લંબાઈના આધારે અલગ પાડવા, DNA અને RNA ખંડોના કદનો અંદાજ કાઢવા અથવા પ્રોટીનને વિદ્યુતભારના આધારે અલગ પાડવા માટે થાય છે.
કોષ સંવર્ધનો
કોષ સંવર્ધન એ નિયંત્રિત વૃદ્ધિ પ્રક્રિયા છે, જેમાં નિયંત્રિત પરિસ્થિતિઓમાં કોષો ઉછેરવામાં આવે છે. દરેક પ્રકારના કોષ માટે કોષ સંવર્ધનની પરિસ્થિતિઓ અલગ હોય છે. સામાન્ય રીતે, કોષ સંવર્ધનના પર્યાવરણમાં સબસ્ટ્રેટ અથવા માધ્યમ ધરાવતા યોગ્ય પાત્રનો (દા.ત. પેટ્રી ડિશ) સમાવેશ થાય છે, જે આવશ્યક પોષક તત્ત્વો (એમિનો એસિડ, કાર્બોહાઇડ્રેટ, વિટામિન, ખનિજો), વૃદ્ધિ પરિબળો, હોર્મોન્સ અને વાયુઓ (CO2, O2) પૂરાં પાડે છે અને ભૌતિક–રાસાયણિક પર્યાવરણનું (pH બફર, પરાસરણ દબાણ, તાપમાન) નિયમન કરે છે. મોટાભાગના કોષોને સપાટી અથવા કૃત્રિમ સબસ્ટ્રેટની જરૂર પડે છે, જ્યારે અન્ય કોષ સંવર્ધનોને સંવર્ધન માધ્યમમાં મુક્તપણે તરતી સ્થિતિમાં ઉછેરી શકાય છે (નિલંબન સંવર્ધન, કોષ નિલંબન).
પ્રાણીઓની કોષ રેખાઓનાં મોટા પાયાનાં સંવર્ધનોનો ઉપયોગ વિષાણુજન્ય રસીઓ અને જૈવપ્રૌદ્યોગિકી દ્વારા મેળવવામાં આવતાં અન્ય ઉત્પાદનોના ઔદ્યોગિક ઉત્પાદનમાં થાય છે. પ્રત્યારોપણના હેતુઓ માટે કોષોની સંખ્યા વધારવા અને કોષોને વિવિધ પ્રકારના દૈહિક કોષોમાં વિભેદિત કરવા માટે માનવ સ્ટેમ કોષોનું સંવર્ધન કરવામાં આવે છે.
પેશીના નમૂનાઓ
પેશી શબ્દ કોષીય મધ્યવર્તી રચનાને વર્ણવે છે, જેમાં કોષીય સામગ્રીનું સંગઠન સ્તર કોષો અને સંપૂર્ણ અંગની વચ્ચે હોય છે. પેશીમાં એક જ ઉદ્ભવ ધરાવતા સમાન કોષો એકત્રિત થયેલા હોય છે, જે સાથે મળીને ચોક્કસ કાર્ય કરે છે. અનેક પેશીઓના કાર્યાત્મક સમૂહીકરણથી અંગોની જટિલ રચનાઓ બને છે.
જીવવિજ્ઞાન, પેશીવિજ્ઞાન/પેશીરોગવિજ્ઞાન, પરોપજીવીવિજ્ઞાન, જૈવરસાયણશાસ્ત્ર, ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રીમાં સંશોધન માટે તેમજ પેશીનું સંવર્ધન કરવા અને DNA નિષ્કર્ષણ કરવા માટે પેશીના નમૂના લેવામાં આવે છે. પ્રાણી પેશી (પેટાવિભાગ: સસ્તન પ્રાણીની પેશી) અને વનસ્પતિ પેશી વચ્ચે ભેદ પાડી શકાય છે. પ્રાણી પેશીઓને ચાર મૂળભૂત પ્રકારોમાં વર્ગીકૃત કરવામાં આવે છે: સંયોજક, સ્નાયુ, ચેતા અને અધિચ્છદીય પેશી. વનસ્પતિ પેશીને નીચેની ત્રણ પેશી પ્રણાલીઓમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે: બાહ્યત્વચા, મૂળભૂત પેશી અને વાહક પેશી.
પેશીના નમૂના પ્રાણી અથવા વનસ્પતિના ભાગોમાંથી, દા.ત. હાડકાં, સ્નાયુ, પાંદડાં વગેરેમાંથી તૈયાર કરી શકાય છે.
શારીરિક પ્રવાહીઓ
લોહી, સીરમ, પ્લાઝ્મા, મસ્તિષ્કમેરુ પ્રવાહી, લાળ અને સાંધાનો સાયનોવિયલ પ્રવાહી એ શારીરિક પ્રવાહીઓ છે, જે નિદાનની દૃષ્ટિએ સંબંધિત માહિતીનો સમૃદ્ધ સ્રોત પૂરો પાડે છે. તેથી, વિશ્લેષણ માટે શારીરિક પ્રવાહીના નમૂનાઓની સુવિકસિત પદ્ધતિથી તૈયારી કરવી મહત્વપૂર્ણ છે. પ્રથમ મુશ્કેલી શારીરિક પ્રવાહીઓમાં હાજર ઘટકોની સાંદ્રતાની વિશાળ ગતિશીલ શ્રેણી સાથે સંકળાયેલી છે.
પ્રોટીનની સાંદ્રતાનું નિર્ધારણ
બ્રેડફોર્ડ પરીક્ષણ, લોરી પરીક્ષણ અને બાઇસિન્કોનિનિક એસિડ (BCA) પરીક્ષણ એ પ્રોટીનની સાંદ્રતા નક્કી કરવા માટેનાં સામાન્ય પરીક્ષણો છે. બોવાઇન સીરમ આલ્બ્યુમિન (BSA) એ સૌથી વધુ વાર ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રોટીન માનકોમાંનું એક છે.
કોષલયન બફર
લાયસિસ બફરની પસંદગી કોષીય સામગ્રી અથવા પેશી (પેશી સંવર્ધન, વનસ્પતિ, બેક્ટેરિયા, ફૂગ વગેરે), કોષો કોઈ સંરચનામાં છે કે નહીં અને તે સંરચનાના પ્રકાર અનુસાર કરવી આવશ્યક છે. પ્રોટીન, પટલો અને કોષાંગોના નિષ્કર્ષણ માટેના વિવિધ લાયસિસ બફર એક અથવા વધુ ડિટર્જન્ટ સાથે તૈયાર કરવામાં આવે છે. ડિટર્જન્ટની પસંદગી સામાન્ય રીતે અજમાયશ અને ભૂલ દ્વારા થતા પરીક્ષણોથી અથવા – ઉપલબ્ધ હોય તો – હાલના પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ પ્રોટોકોલ અનુસાર કરવામાં આવે છે. ડિટર્જન્ટ પેશીના સ્રોત અને પ્રોટીન સાથે સુસંગત હોવું આવશ્યક છે. સામાન્ય રીતે, નિષ્કર્ષની મહત્તમ કાર્યક્ષમતા જાળવવા માટે ચોક્કસ પેશી / પ્રોટીન માટે અસરકારક હોય તેવા સૌથી હળવા ડિટર્જન્ટની પસંદગી કરવામાં આવે છે. વધુમાં, પટલો અને કોષાંગોના નિષ્કર્ષણના કિસ્સામાં હળવું ડિટર્જન્ટ પટલને અખંડ રાખે છે. લાયસિસ બફરમાં સામાન્ય રીતે વપરાતા ડિટર્જન્ટ મોટે ભાગે બિનઆયનિક અથવા દ્વિધ્રુવીય આયનિક હોય છે, દા.ત. CHAPS, ડિઓક્સિકોલેટ, Triton™ X-100, NP40 અને Tween 20.
ઉદાહરણ તરીકે, મગજ, યકૃત, આંતરડું, મૂત્રપિંડ, બરોળ વગેરે જેવી પેશીઓને માત્ર RIPA વડે બફર કરી શકાય છે – જોકે પ્રોટિએઝ અવરોધકો અને DTT (દા.ત. જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ માટે) સામેલ કરવા જોઈએ.
કંકાલ સ્નાયુ પેશી માટેનું લાયસિસ બફર (બરફ જેટલું ઠંડું): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) ગ્લિસરોલ, 1 mM EDTA, 1 mM ડાઇથાયોથ્રેઇટોલ, સાથે પ્રોટિએઝ અને ફોસ્ફેટેઝ અવરોધકોનું મિશ્રણ ઉમેરેલું હોય છે.
સામાન્ય બફર અને તેમની pH શ્રેણીનું કોષ્ટક. સામાન્ય રીતે, આ બફરનો ઉપયોગ સામાન્યપણે 20–50 mM સાંદ્રતાએ કરવામાં આવે છે.
| બફર | pH શ્રેણી |
|---|---|
| સિટ્રિક એસિડ – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| સોડિયમ સાઇટ્રેટ – સિટ્રિક એસિડ | 3.0 – 6.2 |
| સોડિયમ એસિટેટ – એસિટિક એસિડ | 3.6 – 5.6 |
| કેકોડિલિક એસિડનું સોડિયમ ક્ષાર – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| સોડિયમ ડાઇહાઇડ્રોજન ફોસ્ફેટ – ડાઇસોડિયમ હાઇડ્રોજન ફોસ્ફેટ | 5.8 – 8.0 |
| ઇમિડાઝોલ – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| ટ્રાઇઇથેનોલએમાઇન હાઇડ્રોક્લોરાઇડ – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| ટ્રાઇસીન – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| સોડિયમ ટેટ્રાબોરેટ – બોરિક એસિડ | 7.6 – 9.2 |
| બાઇસીન – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| ગ્લાયસીન – NaOH | 8.6 – 10.6 |
મોટા ભાગના બફરમાં pH તાપમાન પર આધારિત હોય છે. Tris બફર માટે આ ખાસ કરીને સાચું છે. pKa 25°C પર 8.06 થી બદલાઈને 0°C પર 8.85 થાય છે.
(બફરના pH અને pKa: pH જલીય દ્રાવણમાં હાઇડ્રોજન આયનોની સાંદ્રતા માપે છે. pKa (= એસિડ વિયોજન અચળાંક) એ સંબંધિત, પરંતુ વધુ વિશિષ્ટ માપ છે, કારણ કે તે ચોક્કસ pH મૂલ્ય પર અણુ કેવી રીતે વર્તશે તેનું પૂર્વાનુમાન કરવામાં મદદ કરે છે.)
TRIzol
TRIzol એ ગ્વાનિડિનિયમ થાયોસાયનેટ–ફિનોલ–ક્લોરોફોર્મ નિષ્કર્ષણ દરમિયાન RNA/DNA/પ્રોટીન કાઢવા માટે વપરાતું રાસાયણિક દ્રાવણ છે. અલ્ટ્રાસોનિક સહાયથી થતા TRIzol નિષ્કર્ષણના ઉપયોગથી એક જ નમૂનામાંથી DNA, RNA અને પ્રોટીનની ઊંચી ઉપજ મળે છે અને આમ તે અન્ય નિષ્કર્ષણ પદ્ધતિઓ કરતાં ચડિયાતું સાબિત થાય છે.
સાહિત્ય/સંદર્ભો
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.