અલ્ટ્રાસોનિક DNA શિયરિંગ

DNA અને RNA શિયરિંગ દરમિયાન, લાંબા DNA અણુઓને નાના ટુકડાઓમાં ખંડિત કરવામાં આવે છે, જે નેક્સ્ટ-જનરેશન સિક્વન્સિંગ (NGS) લાઇબ્રેરીના નિર્માણ માટે નમૂનાઓ તૈયાર કરવાનું એક નિર્ણાયક પગલું છે. અલ્ટ્રાસોનિક DNA શિયરિંગમાં DNA અથવા RNAને 100 bp થી 5 kb સુધીના ખંડોમાં તોડવા માટે ધ્વનિજન્ય કેવિટેશન બળોનો ઉપયોગ થાય છે. આ પદ્ધતિ ખંડોના કદ પર ચોક્કસ નિયંત્રણ શક્ય બનાવે છે, જેથી શ્રેષ્ઠ સિક્વન્સિંગ પરિણામો માટે ઇચ્છિત DNA લંબાઈ અનુસાર તેને અનુકૂળ બનાવી શકાય છે.

અલ્ટ્રાસોનિકેશન દ્વારા DNA શિયરિંગ

Hielscher Ultrasonics DNA, RNA અને ક્રોમેટિન શિયરિંગ માટે અલ્ટ્રાસાઉન્ડ આધારિત વિવિધ ઉકેલો પ્રદાન કરે છે. માઇક્રોટિપનો ઉપયોગ કરીને પ્રત્યક્ષ સોનિકેશન માટે પ્રોબ-પ્રકારનું અલ્ટ્રાસોનિકેટર (દા.ત. UP100H) પસંદ કરો, અથવા એકસાથે વિવિધ નમૂનાઓની પરોક્ષ DNA તૈયારી માટે VialTweeeter અથવા અલ્ટ્રાસોનિક cuphornનો ઉપયોગ કરો. Hielscher તમારી જરૂરિયાતોને ધ્યાનમાં રાખીને આદર્શ ઉપકરણ પ્રદાન કરે છે: તમારી પાસે 1 નમૂનો હોય કે 10 સુધીના નમૂનાઓ હોય, અને તેમનું કદ માઇક્રોલિટરથી લિટર સુધીનું હોય – Hielscher સોનિકેટર્સ યોગ્ય લંબાઈના DNA, RNA અને ક્રોમેટિન ખંડો તૈયાર કરવાની તમારી જરૂરિયાતો પૂરી કરશે. પુનરુત્પાદકતા, સરળ સંચાલન અને ચોક્કસ નિયંત્રણ નેક્સ્ટ-જનરેશન સિક્વન્સિંગ માટે વિશ્વસનીય લાઇબ્રેરી તૈયાર કરવાનું શક્ય બનાવે છે.
ઉત્સેચકીય DNA ખંડનથી વિપરીત, અલ્ટ્રાસોનિક શિયરિંગ કોઈપણ રસાયણો ઉમેર્યા વિના શુદ્ધ યાંત્રિક શિયર બળો લાગુ કરે છે. પ્રક્રિયાના પરિમાણોને ચોક્કસ રીતે સેટ કરીને, અલ્ટ્રાસોનિક શિયરિંગ ઉચ્ચ અણુભાર ધરાવતા DNA ખંડો (પ્લાઝ્મિડ અને જિનોમિક DNA) ઉત્પન્ન કરે છે.
શુદ્ધ કરેલા ન્યુક્લિક એસિડ્સનું ખંડનના પગલા પહેલાં અથવા પછી એમ્પ્લિફિકેશન કરી શકાય છે.
સોનિકેશનના પરિમાણો (પાવર, પલ્સ ચક્ર / બર્સ્ટ્સ, સમય અને તાપમાન) સોફ્ટવેર સેટિંગ્સ દ્વારા સુરક્ષિત રીતે નિયંત્રિત કરી શકાય છે.

અલ્ટ્રાસોનિક DNA શિયરિંગ માટેના પ્રોટોકોલ

ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન પરીક્ષણ માટે

સંક્ષેપમાં, કોષોને 60mm વ્યાસની ડિશોમાં (ડિશ દીઠ 4,00,000) પ્લેટ કરવામાં આવ્યા અને RhoA siRNA વડે ટ્રાન્સફેક્ટ કરવામાં આવ્યા (વર્ણવ્યા મુજબ); 72 h પછી, પ્રોટીનને DNA સાથે ક્રોસ-લિંક કરવા માટે તેમને ફોર્માલ્ડિહાઇડ (અંતિમ સાંદ્રતા, 1%) સાથે 37°C પર 10 min સુધી ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા. 1.25 mol/L ગ્લાયસિનનું દસમા ભાગ જેટલું કદ ઉમેરીને ક્રોસ-લિંકિંગ પ્રતિક્રિયા અટકાવવામાં આવી, જેથી અંતિમ સાંદ્રતા 125 mmol/L થઈ. કોષોને બરફ જેટલા ઠંડા PBSથી બે વાર ધોવામાં આવ્યા, 1 mmol/L ફિનાઇલમિથાઇલસલ્ફોનિલ ફ્લોરાઇડ, 1 Ag/mL એપ્રોટિનિન અને 1 Ag/mL પેપસ્ટેટિન A ધરાવતા રેડિયોઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન પરીક્ષણ બફર [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% ડિઓક્સિકોલેટ, 0.1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)]માં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવ્યા અને 30 min સુધી બરફ પર રાખવામાં આવ્યા. ત્યારબાદ, કોષ લાઇસેટ્સનું બરફ પર Hielscher UP200S અલ્ટ્રાસાઉન્ડ સોનિકેટર (3 x 40 s, એમ્પ્લિટ્યુડ 40%, ચક્ર 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) વડે ત્યાં સુધી સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું જ્યાં સુધી ક્રોસ-લિંક થયેલા ક્રોમેટિનનું શિયરિંગ થઈને 200 થી 1,000 bp વચ્ચેના DNA ખંડો પ્રાપ્ત ન થયા. સમગ્ર લાઇસેટના દસમા ભાગનો ઉપયોગ વિવિધ નમૂનાઓમાં હાજર DNAનું પ્રમાણ માપવા માટે કરવામાં આવ્યો અને તેને “કુલ ઇનપુટ DNA” ગણવામાં આવ્યું. બિનવિશિષ્ટ પૃષ્ઠભૂમિ ઘટાડવા માટે સુપરનેટન્ટ્સને સૅલ્મન શુક્રાણુ DNA/પ્રોટીન અગરોઝની 50% સ્લરી સાથે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા. ત્યારબાદ 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) સાથે અથવા એન્ટિબોડી વિના (નેગેટિવ કન્ટ્રોલ) 4°C પર રાતભર ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન કરવામાં આવ્યું. આ સુપરનેટન્ટ્સમાં 5 mol/L NaCl ઉમેરવામાં આવ્યું અને પ્રોટીન-DNA ક્રોસ-લિંક્સને ઉલટાવવા માટે 65°C પર રાતભર ગરમ કરવામાં આવ્યા. ઇમ્યુનોકોમ્પ્લેક્સની આગળ DNase- અને RNase-મુક્ત પ્રોટીનેઝ K વડે પ્રક્રિયા કરવામાં આવી, અને ફિનોલ/ક્લોરોફોર્મ નિષ્કર્ષણ તથા ઇથેનોલ અવક્ષેપન દ્વારા DNA શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું. માનવ iNOS જનીનના પ્રમોટર પ્રદેશની અંદરના અનુક્રમને અનુરૂપ વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ વડે PCR કરવામાં આવ્યું (p1 પ્રાઇમર: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 પ્રાઇમર: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP અભિવ્યક્તિના અભ્યાસો

અભિવ્યક્તિના અભ્યાસો માટે, ક્રોમોઝોમલ ssuમાં સંકલિત EGFP (વર્ધિત લીલો પ્રતિદીપ્ત પ્રોટીન)ના જનીન ધરાવતા પુનઃસંયોજિત સ્ટ્રેન L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, જર્મની)નું અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ વિવિધ સંવર્ધન માધ્યમોમાં સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું અને તેમાં વધારાના પૂરક તરીકે 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, જર્મની) ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. સંવર્ધન દરમિયાન, 1 ml નમૂનાઓ લેવામાં આવ્યા હતા, તેમનું સેન્ટ્રિફ્યુગેશન (2000 × g, 20°C, 10 min) કરવામાં આવ્યું હતું અને તેમને 0.9% NaCl દ્રાવણથી ધોવામાં આવ્યા હતા. પેલેટને બફર (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT)માં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવ્યું હતું અને અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર UP400S (ઊર્જાનો ઉપયોગ ∼ 400 Ws) વડે સોનિકેશન કરીને વિઘટિત કરવામાં આવ્યું હતું. કોષીય અવશેષોને સેન્ટ્રિફ્યુગેશન (6000 × g, 4°C, 5 min) દ્વારા દૂર કરવામાં આવ્યા હતા અને 12.5% પોલિએક્રિલામાઇડ જેલ સાથે Laemmli (1970)ની પદ્ધતિ અનુસાર અપચાયક પરિસ્થિતિઓમાં સોડિયમ ડોડેસિલ સલ્ફેટ – પોલિએક્રિલામાઇડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ (SDS-PAGE) દ્વારા તેમનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. હલાવવામાં આવતા સંવર્ધનમાં EGFPની અભિવ્યક્તિ તપાસવામાં આવી હતી. (Fritsche et al. 2007)

ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન

ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન પરીક્ષણ માટે ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA)નો ઉપયોગ ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર કેટલાક ફેરફારો સાથે કરવામાં આવ્યો હતો. સંક્ષેપમાં, વિભેદિત માનવ પોડોસાઇટ્સને ઓરડાના તાપમાને 10 min માટે 1% ફોર્માલ્ડિહાઇડ વડે ક્રોસ-લિંક કરવામાં આવ્યા હતા. કોષોને બરફ જેવા ઠંડા PBSથી ધોવામાં આવ્યા હતા અને ઓરડાના તાપમાને 5 min માટે 0.125 M ગ્લાયસિન ઉમેરીને સ્થિરીકરણની પ્રતિક્રિયા રોકવામાં આવી હતી. કોષોને ફરીથી બરફ જેવા ઠંડા PBSથી ધોવામાં આવ્યા હતા અને ડિશમાંથી ખરેડીને એકત્ર કરવામાં આવ્યા હતા. સેન્ટ્રિફ્યુગેશન દ્વારા કોષોના પેલેટ બનાવવામાં આવ્યા હતા અને તેમને લાઇસિસ બફરમાં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવ્યા હતા. સેન્ટ્રિફ્યુગેશન પછી, પેલેટ સ્વરૂપે એકત્ર થયેલા કોષકેન્દ્રોને શિયરિંગ બફરમાં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવ્યા હતા, બરફ પર 30 min માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા અને સોનિકેશન દ્વારા ક્રોમેટિનનું શિયરિંગ કરવામાં આવ્યું હતું, દા.ત. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, જર્મની) વડે બરફ પર 25% પાવરે, દરેક 20 secના 5 પલ્સ આપીને આશરે 200–600 bpના ટુકડાઓ બનાવવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ શિયરિંગ કરાયેલા ક્રોમેટિનનું સેન્ટ્રિફ્યુગેશન કરવામાં આવ્યું હતું અને ઉપરનું પ્રવાહી એકત્ર કરવામાં આવ્યું હતું. ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન માટે, 60 μl ક્રોમેટિનને 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) અથવા NF-κB p50 (Abcam) એન્ટિબોડીઝ સાથે અથવા નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે સસલાના IgG (Zymed Laboratories) સાથે, હળવેથી ફેરવતાં 4°C પર રાતભર ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું. ચુંબકીય મણકાઓ સાથે બંધાયેલા ઇમ્યુનોકોમ્પ્લેક્સને ચુંબકીય સ્ટેન્ડ વડે એકત્ર કરવામાં આવ્યા હતા, સારી રીતે ધોવામાં આવ્યા હતા અને પ્રોટીન/DNA ક્રોસ-લિંક્સને ઉલટાવવામાં આવ્યા હતા તથા રિયલ-ટાઇમ PCR વિશ્લેષણ માટે DNAનું ઇલ્યુશન કરવામાં આવ્યું હતું. (Ristola et al. 2009)

ચિપ એરે વિશ્લેષણ માટે EHEC DNAની તૈયારી

કોષ લાઇસેટ્સ અને નિષ્કર્ષિત DNAની ગોઠવણી
ઇચ્છિત અંતિમ સાંદ્રતા સુધી PBSમાં નિલંબિત કરાયેલા બેક્ટેરિયલ પેલેટ્સની સારવાર અલ્ટ્રાસાઉન્ડ વિઘટક UP100H (Hielscher GmbH, જર્મની) વડે કરવામાં આવી હતી, જે માઇક્રોટિપ MS1 (વ્યાસમાં 1mm) સાથે સજ્જ હતું. કાર્યકારી આવૃત્તિ 30 kHz હતી અને અસરકારક આઉટપુટ પાવર 100 W હતો. પ્રક્રિયા દરમિયાન, નમૂનાઓને બરફ-પાણીના બાથમાં ઠંડા કરવામાં આવ્યા, મિશ્રિત કરવામાં આવ્યા અને સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવ્યા. નમૂનાઓનો ઉપયોગ ફ્લો સાયટોમેટ્રી અભ્યાસો માટે કરવામાં આવ્યો હતો, જ્યારે પછીની પ્રક્રિયા માટે નમૂનાઓને ઉષ્મા સારવાર (95°C, 5 min) આપવામાં આવી હતી. અશુદ્ધ કોષ લાઇસેટની પ્રક્રિયા ફિનોલ:ક્લોરોફોર્મ:આઇસોએમાઇલ આલ્કોહોલ (25:24:1)ના મિશ્રણ વડે કરવામાં આવી હતી. લાઇસેટના નમૂનામાં આ મિશ્રણનું સમાન ઘનફળ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું, દ્રાવણને 15 s સુધી જોરશોરથી વોર્ટેક્સ કરવામાં આવ્યું હતું અને આશરે 22°C ઓરડાના તાપમાને (RT) 15,000 x g પર 2 min સુધી સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. જીનોમિક DNA ધરાવતો ઉપરનો જલીય તબક્કો કાળજીપૂર્વક અલગ કરવામાં આવ્યો હતો અને નવી જંતુરહિત Eppendorf ટ્યુબમાં એકત્રિત કરવામાં આવ્યો હતો.
ત્યારબાદ, DNAનું ખંડન કરવા માટે નમૂનાઓનું સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું હતું. સોનિકેશનનું પગલું ઉપર વર્ણવેલી સમાન પરિસ્થિતિઓમાં હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું. જીનોમિક DNA પર ખંડનની અસરોનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, એગારોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસનો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
(…) અગાઉ 2.5 min સુધી સોનિકેશન કરેલા નમૂનાઓને ઉષ્મા સારવાર અને સેન્ટ્રિફ્યુગેશન પછી નિષ્કર્ષણના પગલામાંથી પસાર કરવામાં આવ્યા હતા. મુક્ત થયેલા DNAનું ફિનોલ:ક્લોરોફોર્મ:આઇસોએમાઇલ આલ્કોહોલના મિશ્રણ વડે બે વખત નિષ્કર્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ 0 – 15 min સુધી બીજી વાર સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું હતું. નિષ્કર્ષણ પછી અલ્ટ્રાસોનિક ખંડન કરેલા DNAના કદનું વિતરણ નક્કી કરવા માટે એગારોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો (ઉપર જમણી બાજુનું ચિત્ર). ઉચ્ચ અણુભાર ધરાવતા પટ્ટાઓને બદલે DNA સ્મિયરની હાજરીથી અત્યંત ખંડિત DNA સ્પષ્ટ થતું હતું; આ પટ્ટાઓ 2.5 min કે તેથી વધુ સમય સુધી સોનિકેશન કરેલા નમૂનાઓમાંથી દૂર થઈ ગયા હતા. વધુ સમય સુધી સોનિકેશન કરવાથી ખંડોની લંબાઈ ધીમે ધીમે ઘટીને આશરે 150 – 600 bp થઈ હતી, અને 15 min સુધી સોનિકેશન કરવાથી આ ખંડોનું વધુ વિઘટન થયું હતું, જે મુખ્યત્વે સ્મિયરના ઉપરના ભાગમાં જોઈ શકાય છે. આમ, અલ્ટ્રાસોનિકેશનના સમય સાથે DNAના ખંડોનું સરેરાશ કદ ધીમે ધીમે ઘટ્યું હતું અને 5 minની સારવારથી ચિપ એરે પરીક્ષણો માટે સૌથી યોગ્ય કદના DNA ખંડો મેળવવાનું શક્ય બન્યું હતું. અંતે, પ્રથમ 2 minની અલ્ટ્રાસોનિક સારવાર, DNA નિષ્કર્ષણ (2×) અને ત્યારબાદ 5 minના સોનિકેશનનો સમાવેશ કરતી DNA વિશ્લેષ્યની તૈયારીની પ્રક્રિયા સ્થાપિત કરવામાં આવી હતી. (Basselet et al. 2008)

ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન (ChIP)

HEK293 કોષોનું સંવર્ધન ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ કરવામાં આવ્યું હતું અને ઓરડાના તાપમાને 45 min સુધી 2 mM ડિસક્સિનિમિડાઇલ-ગ્લુટારેટ વડે તેમનું સ્થિરીકરણ કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ, કોષોને PBS વડે બે વખત ધોવામાં આવ્યા હતા. 1% (v/v) ફોર્માલ્ડિહાઇડનો ઉપયોગ કરીને ઓરડાના તાપમાને 10 min સુધી ક્રોમેટિનનું ક્રોસ-લિંકિંગ કરવામાં આવ્યું હતું અને તેને બરફ જેટલા ઠંડા PBS વડે બે વખત ધોવામાં આવ્યું હતું. ઓરડાના તાપમાને 5 min સુધી 0.125 Mની અંતિમ સાંદ્રતાવાળા ગ્લાયસિન સાથે ઇન્ક્યુબેશન કરીને ક્રોસ-લિંકિંગની પ્રતિક્રિયા અટકાવવામાં આવી હતી. ટ્રિપ્સિન સાથે ઇન્ક્યુબેશન કર્યા પછી, કોષોને કોષ સંવર્ધન ડિશમાંથી ખોતરીને કાઢવામાં આવ્યા હતા અને PBS વડે બે વખત ધોવામાં આવ્યા હતા. કોષ પેલેટને લાઇસિસ બફર (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl અને 0.5% (v/v) Nonidet P-40)માં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવ્યો હતો, બરફ પર 10 min સુધી ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યો હતો અને Dounce હોમોજેનાઇઝર વડે સમાનરૂપ કરવામાં આવ્યો હતો. ત્યારબાદ, સેન્ટ્રિફ્યુગેશન (3500 x g, 5 min, 4 °C) દ્વારા કેન્દ્રકોનો પેલેટ બનાવવામાં આવ્યો હતો અને તેમને કેન્દ્રક બફર (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA અને 1% (w/v) SDS)માં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવ્યા હતા. કેન્દ્રકોનું સોનિકેશન દ્વારા વિઘટન કરવા માટે ત્રણ 20-s પલ્સ સાથે UP50H સોનિકેટર (Hielscher Ultraschall Technologie)નો ઉપયોગ ચક્ર 0.5 અને કંપવિસ્તાર 30%ના સેટિંગ પર કરવામાં આવ્યો હતો, જેનાથી મુખ્યત્વે 200 – 1000 bp કદના જીનોમિક DNA ખંડો પ્રાપ્ત થયા હતા. ChIP માટે, 50g DNAને ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન બફર (16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% (v/v) Triton X-100 અને 0.01% (w/v) SDS)માં 4-ગણું મંદ કરવામાં આવ્યું હતું. (Weiske et al. 2006)

ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન (ChIP) દ્વારા હિસ્ટોન સંશોધનનું વિશ્લેષણ

સંક્ષેપમાં, 6 x 10⁶ કોષોને PBS વડે બે વાર ધોવામાં આવ્યા અને 0.5% ફોર્માલ્ડિહાઇડની હાજરીમાં ઓરડાના તાપમાને 15 min માટે કલ્ચર પ્લેટ પર ક્રોસ-લિંક કરવામાં આવ્યા. 0.125 M ગ્લાઇસિન ઉમેરીને ક્રોસ-લિંકિંગ પ્રતિક્રિયા અટકાવવામાં આવી. ત્યારપછીનાં તમામ પગલાં 48°C પર કરવામાં આવ્યાં. તમામ બફરને અગાઉથી ઠંડાં કરવામાં આવ્યાં હતાં અને તેમાં પ્રોટીએઝ અવરોધકો (Complete Mini, Roche) હતાં. કોષોને PBS વડે બે વાર ધોયા પછી ખરડીને એકત્રિત કરવામાં આવ્યા. એકત્રિત પેલેટને 1 ml લાઇસિસ બફર (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) માં ઓગાળવામાં આવ્યા અને ઠંડા ઇથેનોલ બાથમાં 100% કંપનવિસ્તાર પર 10 ચક્ર માટે સોનિકેશન કરવા માટે UP50H સોનિકેટર (Hielscher, Teltow, જર્મની) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો. ક્રોમેટિનનું ખંડન 1% એગારોઝ જેલમાં દૃશ્યમાન કરવામાં આવ્યું. પ્રાપ્ત ખંડો 200–500pb ની શ્રેણીમાં હતા. સોનિકેશન કરેલા નમૂનાઓને 48°C પર 14,000g પર 10 min માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરીને દ્રાવ્ય ક્રોમેટિન મેળવવામાં આવ્યું. દ્રાવ્ય અંશને મંદન બફર (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) માં 1/10 સુધી મંદ કરવામાં આવ્યો, પછી તેને નાના નિર્ધારિત ભાગોમાં વહેંચીને ઉપયોગ સુધી 80°C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યો. (Rodriguez et al. 2008)