અલ્ટ્રાસોનિક ડીએનએ શીયરિંગ

ડીએનએ અને આરએનએ શીયરિંગ દરમિયાન, લાંબા ડીએનએ પરમાણુઓ નાના ટુકડાઓમાં વિભાજિત થાય છે, જે નેક્સ્ટ જનરેશન સિક્વન્સિંગ (એનજીએસ) લાઇબ્રેરીના નિર્માણ માટે નમૂનાઓ તૈયાર કરવામાં એક નિર્ણાયક પગલું છે. અલ્ટ્રાસોનિક ડીએનએ શીયરિંગ ડીએનએ અથવા આરએનએને 100 bp થી 5 kb સુધીના ટુકડાઓમાં તોડવા માટે એકોસ્ટિક પોલાણ દળોનો ઉપયોગ કરે છે. આ પદ્ધતિ ફ્રેગમેન્ટના કદ પર ચોક્કસ નિયંત્રણને સક્ષમ કરે છે, શ્રેષ્ઠ અનુક્રમ પરિણામો માટે ઇચ્છિત ડીએનએ લંબાઈમાં કસ્ટમાઇઝેશનની સુવિધા આપે છે.

અલ્ટ્રાસોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને ડીએનએ શીયરિંગ

Hielscher Ultrasonics DNA, RNA અને ક્રોમેટિન શીયરિંગ માટે વિવિધ અલ્ટ્રાસાઉન્ડ-આધારિત ઉકેલો પ્રદાન કરે છે. માઇક્રોટીપનો ઉપયોગ કરીને ડાયરેક્ટ સોનિકેશન માટે પ્રોબ-ટાઇપ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ (દા.ત. UP100H) વચ્ચે પસંદ કરો અથવા વારાફરતી વિવિધ નમૂનાઓની પરોક્ષ ડીએનએ તૈયારી માટે VialTweeeter અથવા અલ્ટ્રાસોનિક કપહોર્નનો ઉપયોગ કરો. Hielscher તમારી જરૂરિયાતોને ધ્યાનમાં રાખીને આદર્શ ઉપકરણ પ્રદાન કરે છે: ભલે તમારી પાસે 1 અથવા 10 જેટલા નમૂના હોય, માઇક્રોલિટરથી લિટર સુધીના વોલ્યુમ – Hielscher sonicators યોગ્ય લંબાઈ પર DNA, RNA અને ક્રોમેટિન ટુકડાઓ તૈયાર કરવા માટે તમારી જરૂરિયાતોને પૂર્ણ કરશે. પુનઃઉત્પાદનક્ષમતા, સરળ કામગીરી અને ચોક્કસ નિયંત્રણ આગામી પેઢીના સિક્વન્સિંગ માટે વિશ્વસનીય લાઇબ્રેરી માટે પરવાનગી આપે છે.
એન્ઝાઈમેટિક ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટેશનથી વિપરીત, અલ્ટ્રાસોનિક શીયરિંગ કોઈપણ રસાયણો ઉમેર્યા વિના શુદ્ધ યાંત્રિક શીયર ફોર્સ લાગુ કરે છે. પ્રક્રિયાના પરિમાણોની ચોક્કસ સેટિંગ દ્વારા, અલ્ટ્રાસોનિક શીયરિંગ ઉચ્ચ પરમાણુ વજનના ડીએનએ ટુકડાઓ (પ્લાઝમિડ અને જીનોમિક ડીએનએ) ઉત્પન્ન કરે છે.
શુદ્ધ કરેલ ન્યુક્લિક એસિડને ફ્રેગમેન્ટેશન સ્ટેપ પહેલા અથવા પછી વિસ્તૃત કરી શકાય છે.
સોનિકેશન પેરામીટર્સ (પાવર, પલ્સ સાયકલ/બર્સ્ટ, સમય અને તાપમાન) સોફ્ટવેર સેટિંગ્સ દ્વારા સુરક્ષિત રીતે નિયંત્રિત કરી શકાય છે.

અલ્ટ્રાસોનિક ડીએનએ શીયરિંગ માટે પ્રોટોકોલ્સ

ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન એસે માટે

સંક્ષિપ્તમાં, કોષોને 60 મીમી-વ્યાસની ડીશમાં (400,000 ડીશ દીઠ) પ્લેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા અને RhoA siRNA (વર્ણવ્યા પ્રમાણે) સાથે ટ્રાન્સફેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા; 72 કલાક પછી, તેઓ ડીએનએ સાથે પ્રોટીનને ક્રોસ-લિંક કરવા માટે 37 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર 10 મિનિટ માટે ફોર્માલ્ડિહાઇડ (અંતિમ સાંદ્રતા, 1%) સાથે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. ક્રોસ-લિંકિંગ પ્રતિક્રિયા 1.25 mol/L ગ્લાયસીનના એક-દસમા વોલ્યુમના ઉમેરા દ્વારા શાંત કરવામાં આવી હતી, જે 125 mmol/L અંતિમ સાંદ્રતા આપે છે. કોષોને બરફ-ઠંડા પીબીએસથી બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા, જે રેડિયો ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન એસે બફર [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% ડીઓક્સીકોલેટ, 0.1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L8CH (Trimol/L. )] જેમાં 1 mmol/L ફિનાઇલમેથાઇલ સલ્ફોનીલ ફ્લોરાઇડ, 1 Ag/mL aprotinin, અને 1 Ag/mL પેપસ્ટેટિન A હોય છે અને તેને 30 મિનિટ સુધી બરફ પર રાખવામાં આવે છે. પછી, સેલ lysates એક સાથે બરફ પર sonicated હતા Hielscher UP200S અલ્ટ્રાસાઉન્ડ સોનિકેટર (3 x 40 s, કંપનવિસ્તાર 40%, ચક્ર 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) જ્યાં સુધી ક્રોસ-લિંક્ડ ક્રોમેટિન્સને 200 અને 1,000 bp વચ્ચેના DNA ટુકડાઓ મેળવવા માટે કાપવામાં ન આવે ત્યાં સુધી. આખા લાયસેટના દસમા ભાગનો ઉપયોગ વિવિધ નમૂનાઓમાં હાજર ડીએનએની માત્રા નક્કી કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો અને “કુલ ઇનપુટ ડીએનએ”. બિન-વિશિષ્ટ પૃષ્ઠભૂમિને ઘટાડવા માટે સૅલ્મોન શુક્રાણુ DNA/પ્રોટીન એગેરોઝ-50% સ્લરી સાથે સુપરનેટન્ટ્સનું સેવન કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ એન્ટિ-એનએફ-એનબી p65 (અપસ્ટેટ) ના 5 Ag સાથે અથવા એન્ટિબોડી (નકારાત્મક નિયંત્રણ) વિના 4°C પર રાતોરાત ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન કરવામાં આવ્યું હતું. આ સુપરનેટન્ટ્સને 5 mol/L NaCl સાથે પૂરક કરવામાં આવ્યા હતા અને પ્રોટીન-DNA ક્રોસ-લિંક્સને પાછું લાવવા માટે 65°C પર રાતોરાત ગરમ કરવામાં આવ્યા હતા. ઇમ્યુનોકોમ્પ્લેક્સની વધુ સારવાર DNase- અને RNase-મુક્ત પ્રોટીનનેઝ K સાથે કરવામાં આવી હતી, અને DNA ફિનોલ/ક્લોરોફોર્મ નિષ્કર્ષણ અને ઇથેનોલ અવક્ષેપ દ્વારા શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું. પીસીઆર માનવ iNOS જનીન (p1 પ્રાઈમર: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 પ્રાઇમર: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶) ના પ્રમોટર ક્ષેત્રની અંદર અનુરૂપ ચોક્કસ પ્રાઇમર્સ સાથે કરવામાં આવ્યું હતું. (ડબલિયર એટ અલ., 2008)

EGFP-અભિવ્યક્તિ અભ્યાસ

અભિવ્યક્તિ અભ્યાસ માટે, EGFP (ઉન્નત ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન), રંગસૂત્ર ssu સંકલિત, માટેના જનીન સાથે રિકોમ્બિનન્ટ સ્ટ્રેન L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (જેના બાયોસાયન્સ, જર્મની) અગાઉના અને વિવિધ માધ્યમોમાં વર્ણવવામાં આવ્યું હતું. વધુમાં 100 mg l સાથે પૂરક^-1 નોર્સોથ્રીસિન (જેના બાયોસાયન્સ, જર્મની). ખેતી દરમિયાન, 1 મિલી સેમ્પલ લેવામાં આવ્યા હતા, સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા (2000 × g, 20°C, 10 મિનિટ) અને 0.9% NaCl સોલ્યુશનથી ધોવામાં આવ્યા હતા. પેલેટને બફર (20 એમએમ HEPES, 5 એમએમ ઇડીટીએ, 2 એમએમ ડીટીટી) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું અને અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર સાથે સોનિફિકેશન દ્વારા વિઘટન કરવામાં આવ્યું હતું. UP400S (ઊર્જાનો ઉપયોગ ∼ 400 Ws). સેન્ટ્રીફ્યુગેશન (6000 × g, 4°C, 5 મિનિટ) દ્વારા કોષના ભંગાર દૂર કરવામાં આવ્યા હતા અને 12.5% પોલિએક્રાયલેમ સાથે લેમ્મલી (1970) ની પદ્ધતિ અનુસાર ઘટાડવાની પરિસ્થિતિઓ હેઠળ સોડિયમ ડોડેસીલ સલ્ફેટ - પોલિએક્રાયલામાઇડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ (SDS-PAGE) દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. . ઉત્તેજિત સંસ્કૃતિમાં EGFP- અભિવ્યક્તિની તપાસ કરવામાં આવી હતી. (ફ્રિશે એટ અલ. 2007)

ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન

ChIP-IT નો ઉપયોગ કરીને ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન એસે કરવામાં આવ્યું હતું^ટીએમ Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions with some modifications. Briefly, differentiated human podocytes were cross-linked with 1% formaldehyde for 10 min at room temperature. Cells were washed with ice-cold PBS and the fixation reaction was stopped by adding 0.125 M glycine for 5 min at room temperature. Cells were washed again with ice-cold PBS and scraped from the dish. Cells were pelleted by centrifugation and resuspended in the lysis buffer. After centrifugation, pelleted nuclei were resuspended in the shearing buffer, incubated on ice for 30 min and the chromatin was sheared by sonication, e.g. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany) લગભગ 200-600 bp ના ટુકડાઓમાં બરફ પર 20 સેકન્ડના 5 કઠોળ 25% પાવર પર. પછી કાપેલા ક્રોમેટિનને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું અને સુપરનેટન્ટ એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. રોગપ્રતિકારક શક્તિ માટે, 60 μl ક્રોમેટિનને 1 μg Sp1 (સાંતા ક્રુઝ બાયોટેક્નોલોજી, સાન્ટા ક્રુઝ, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) અથવા NF-κB p50 (Abcam) એન્ટિબોડીઝ સાથે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું અથવા IgG (Zymed Laboratories), નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે, રાતોરાત 4°C પર હળવા પરિભ્રમણ સાથે. ચુંબકીય માળખા સાથે બંધાયેલા ઇમ્યુનોકોમ્પ્લેક્સને ચુંબકીય સ્ટેન્ડનો ઉપયોગ કરીને એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા, વ્યાપકપણે ધોવાઇ ગયા હતા, અને પ્રોટીન/ડીએનએ ક્રોસલિંક્સને ઉલટાવી દેવામાં આવ્યા હતા અને વાસ્તવિક સમયના પીસીઆર વિશ્લેષણ માટે ડીએનએ એલ્યુટ કરવામાં આવ્યા હતા. (રિસ્ટોલા એટ અલ. 2009)

ચિપ એરે વિશ્લેષણ માટે EHEC DNA તૈયારી

સેલ લિસેટ્સ અને એક્સટ્રેક્ટેડ ડીએનએની ગોઠવણી
પીબીએસમાં ઇચ્છિત અંતિમ સાંદ્રતામાં સસ્પેન્ડ કરાયેલ બેક્ટેરિયલ ગોળીઓની સારવાર કરવામાં આવી હતી અલ્ટ્રાસાઉન્ડ ડિસપ્ટર UP100H (Hielscher GmbH, જર્મની) માઇક્રોટીપ MS1 (1 મીમી વ્યાસ) થી સજ્જ છે. ઓપરેટિંગ ફ્રીક્વન્સી 30 kHz હતી અને અસરકારક આઉટપુટ પાવર 100 W હતી. ઓપરેશન દરમિયાન, સેમ્પલને બરફના પાણીના સ્નાનમાં ઠંડુ કરવામાં આવ્યું હતું, મિશ્રિત અને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. નમૂનાઓનો ઉપયોગ ફ્લો સાયટોમેટ્રી અભ્યાસ માટે કરવામાં આવ્યો હતો, જ્યારે બાદમાં હેન્ડલિંગ માટે, નમૂનાઓને હીટ ટ્રીટમેન્ટ (95°C, 5 મિનિટ) આધિન કરવામાં આવ્યા હતા. ક્રૂડ સેલ લિસેટ્સ પર ફિનોલ:ક્લોરોફોર્મ:આઇસોઆમિલ આલ્કોહોલ (25:24:1) ના મિશ્રણ સાથે પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી. આ મિશ્રણની સમાન માત્રા લાઇસેટ નમૂનામાં ઉમેરવામાં આવી હતી, સોલ્યુશનને 15 સેકન્ડ માટે જોરશોરથી વમળવામાં આવ્યું હતું અને 22 °C આસપાસ ઓરડાના તાપમાને (RT) પર 2 મિનિટ માટે 15,000 xg પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. જીનોમિક ડીએનએ ધરાવતા ટોચના જલીય તબક્કાને કાળજીપૂર્વક અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને નવી જંતુરહિત એપેનડોર્ફ ટ્યુબમાં એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.
ત્યારબાદ, ડીએનએના ટુકડા કરવા માટે નમૂનાઓ સોનિક કરવામાં આવ્યા હતા. ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે સોનિકેશન પગલું એ જ પરિસ્થિતિઓમાં સમજાયું હતું. જીનોમિક ડીએનએ પર ફ્રેગમેન્ટેશન અસરોનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસનો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
(…) અગાઉ 2.5 મિનિટ માટે સોનિકેટ કરેલ નમૂનાઓ હીટ ટ્રીટમેન્ટ અને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી એક નિષ્કર્ષણ પગલાને આધિન હતા. રીલીઝ થયેલ ડીએનએ ફિનોલ:ક્લોરોફોર્મ:આઈસોઆમિલ આલ્કોહોલ મિશ્રણ સાથે બે વખત કાઢવામાં આવ્યું હતું, અને પછીથી 0 - 15 મિનિટ માટે બીજું સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું હતું. Agarose જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસનો ઉપયોગ પોસ્ટ-એસ્ટ્રેક્શન અલ્ટ્રાસોનિક ફ્રેગમેન્ટેશન (ફિગ. ઉપર જમણી બાજુએ) ને આધિન ડીએનએના કદના વિતરણને નિર્ધારિત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. 2.5 મિનિટ કે તેથી વધુ સમય માટે સોનિકેટેડ સેમ્પલમાંથી કાઢી નાખવામાં આવેલા ઉચ્ચ-મોલેક્યુલર વેઇટ બેન્ડને બદલે ડીએનએ સ્મીયરની હાજરીથી અત્યંત ખંડિત ડીએનએ સ્પષ્ટ થયું હતું. લાંબા સમય સુધી સોનિકેશન ધીમે ધીમે ટુકડાની લંબાઈને આશરે 150 - 600 bp સુધી ઘટાડે છે, અને 15 મિનિટ માટે સોનિકેશન આ ટુકડાઓને વધુ ડિગ્રેડ કરે છે, જેમ કે મોટાભાગે સ્મીયરના ઉપરના ભાગ દ્વારા જોઈ શકાય છે. આમ, અલ્ટ્રાસોનિકેશન સમય સાથે સરેરાશ DNA ટુકડાનું કદ ધીમે ધીમે ઘટતું ગયું અને 5 મિનિટની સારવારથી ચિપ એરે એસે માટે સૌથી યોગ્ય ડીએનએ ટુકડાઓનાં કદ મેળવવાની મંજૂરી મળી. અંતે, ડીએનએ વિશ્લેષણ તૈયારી પ્રક્રિયા જેમાં પ્રથમ 2 મિનિટ અલ્ટ્રાસોનિક સારવાર, ડીએનએ નિષ્કર્ષણ (2×), અને અનુગામી 5 મિનિટ સોનિકેશનનો સમાવેશ થાય છે, સ્થાપિત કરવામાં આવી હતી. (બેસેલેટ એટ અલ. 2008)

ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (ChIP)

HEK293 કોશિકાઓ ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે સંવર્ધિત કરવામાં આવી હતી અને ઓરડાના તાપમાને 45 મિનિટ માટે 2 એમએમ ડિસ્કિનિમિડિલ-ગ્લુટેરેટ સાથે નિશ્ચિત કરવામાં આવી હતી. ત્યારબાદ, કોષોને પીબીએસ સાથે બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા. ક્રોમેટિનને ઓરડાના તાપમાને 1% (v/v) ફોર્માલ્ડિહાઇડનો ઉપયોગ કરીને 10 મિનિટ માટે ક્રોસ-લિંક કરવામાં આવ્યું હતું અને બરફ-ઠંડા પીબીએસ સાથે બે વાર ધોવામાં આવ્યું હતું. ઓરડાના તાપમાને 5 મિનિટ માટે 0.125 M ની અંતિમ સાંદ્રતામાં ગ્લાયસીન સાથેના સેવન દ્વારા ક્રોસ-લિંકિંગ પ્રતિક્રિયા બંધ કરવામાં આવી હતી. ટ્રિપ્સિન સાથે સેવન કર્યા પછી, કોષોને સેલ કલ્ચર ડીશમાંથી સ્ક્રેપ કરવામાં આવ્યા હતા અને પીબીએસ સાથે બે વાર ધોવાયા હતા. સેલ પેલેટને લિસિસ બફર (5 mM પાઇપ્સ, pH 8.0, 85 mM KCl, અને 0.5% (v/v) નોનિડેટ P-40) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવી હતી, 10 મિનિટ માટે બરફ પર ઉકાળવામાં આવી હતી, અને ડાઉન્સ હોમોજેનાઇઝર સાથે એકરૂપ કરવામાં આવી હતી. ત્યારબાદ, ન્યુક્લીને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન (3500 xg, 5 મિનિટ, 4 °C) દ્વારા પેલેટ કરવામાં આવ્યા હતા અને ન્યુક્લી બફર (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA, અને 1% (w/v) SDS) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા. ન્યુક્લી એ ત્રણ 20-s કઠોળ સાથે sonication દ્વારા વિક્ષેપિત થયા હતા UP50H સોનિકેટર (Hielscher Ultraschall Technologie) ચક્ર 0.5 અને કંપનવિસ્તાર 30% ના સેટિંગ પર, 200 - 1000 bp ના જથ્થાબંધ કદ સાથે જીનોમિક ડીએનએ ટુકડાઓ આપે છે. ChIP માટે, 50g DNA ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન બફર (16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% (v/v) ટ્રાઇટોન X-100, અને 0.01% (0.01%) માં 4 ગણું પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું. v) SDS). (વેઇસ્કે એટ અલ. 2006)

ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (ChIP) દ્વારા હિસ્ટોન ફેરફારનું વિશ્લેષણ

સંક્ષિપ્તમાં, 6 x 10⁶ કોષોને PBS વડે બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા અને 0.5% ફોર્માલ્ડીહાઈડની હાજરીમાં ઓરડાના તાપમાને 15 મિનિટ માટે કલ્ચર પ્લેટ પર ક્રોસ-લિંક કરવામાં આવ્યા હતા. 0.125 M ગ્લાયસીન ઉમેરીને ક્રોસ-લિંકિંગ પ્રતિક્રિયા બંધ કરવામાં આવી હતી. પછીના તમામ પગલાં 48 ° સે પર હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા. બધા બફર્સ પૂર્વ-ઠંડા હતા અને તેમાં પ્રોટીઝ અવરોધકો (કમ્પલીટ મીની, રોચે) સમાવિષ્ટ હતા. કોષોને પીબીએસ સાથે બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા અને પછી સ્ક્રેપ કરવામાં આવ્યા હતા. એકત્રિત ગોળીઓ 1 ml લિસિસ બફર (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) માં ઓગળવામાં આવી હતી અને 100% કંપનવિસ્તાર પર 10 ચક્ર માટે ઠંડા ઇથેનોલ બાથમાં સોનિક કરવામાં આવી હતી. UP50H સોનિકેટર (Hielscher, Teltow, Germany). ક્રોમેટિન ફ્રેગમેન્ટેશન 1% એગેરોઝ જેલમાં જોવામાં આવ્યું હતું. પ્રાપ્ત ટુકડાઓ 200–500pb રેન્જમાં હતા. સોનીકેટેડ સેમ્પલને 14,000 ગ્રામ પર 10 મિનિટ માટે 48 ° સે પર સેન્ટ્રીફ્યુગ કરીને દ્રાવ્ય ક્રોમેટિન મેળવવામાં આવ્યું હતું. દ્રાવ્ય અપૂર્ણાંકને મંદન બફરમાં 1/10 પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું (1% ટ્રાઇટોન X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) પછી અલિકોટ કરવામાં આવ્યું હતું અને ઉપયોગ થાય ત્યાં સુધી 80°C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું. (રોડ્રિગ્ઝ એટ અલ. 2008)