સોનિકેશન વડે SARS-CoV-2 કોરોનાવાયરસને નિષ્ક્રિય કરવા માટેનો પ્રોટોકોલ

Hielscher VialTweeter એક અનન્ય અલ્ટ્રાસોનિક બહુ-નમૂના તૈયારી એકમ છે, જેનો ઉપયોગ SARS-COV-2 કોરોનાવાયરસને નિષ્ક્રિય કરવા માટે થાય છે. VialTweeter વડે એકસાથે 10 સુધી નમૂનાની વાયલ તૈયાર કરી શકાય છે અને તેથી તે મોટા પાયે નમૂના પ્રક્રિયા માટે આદર્શ એકમ છે.

VialTweeter વડે SARS-CoV-2 કોરોનાવાયરસનું નિષ્ક્રિયકરણ

ફિક્સેટિવ દૂર કર્યા પછી, કોષોને ખુરચીને 1mL MEM/5% FBSમાં એકત્ર કરતાં પહેલાં એકસ્તરીય કોષસ્તરોને ફોસ્ફેટ-બફર્ડ સેલાઇન (PBS) વડે ત્રણ વખત ધોવામાં આવ્યા, અને ત્યારબાદ 100% પાવર અને એમ્પ્લિટ્યુડ પર (3 × 10 સેકન્ડ ચાલુ, 10 સેકન્ડ બંધ) સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું – આ માટે Hielscher અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર UP200St સાથે VialTweeter જોડાણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો. 3000 × g પર 10 મિનિટ માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરીને ઉપરના પ્રવાહીઓને સ્પષ્ટ કરવામાં આવ્યા. નીચે Welch et al. (2020) દ્વારા SARS-CoV-2 કોરોનાવાયરસના નિષ્ક્રિયકરણ માટેનો સંપૂર્ણ પ્રોટોકોલ અહીં વાંચો:

કોષો અને વાયરસ

Vero E6 કોષો (Vero C1008; ATCC CRL-1586)ને 10% (v/v) ફીટલ કાફ સીરમ (FCS) ઉમેરેલા મોડિફાઇડ ઈગલ્સ મિનિમમ એસેન્શિયલ મીડિયમ (MEM)માં સંવર્ધિત કરવામાં આવ્યા. વપરાયેલ વાયરસ SARS-CoV-2 સ્ટ્રેન hCOV-19/England/2/2020 હતો, જેને PHEએ 29/01/2020ના રોજ યુકેના પ્રથમ દર્દી સમૂહમાંથી અલગ કર્યો હતો. આ વાયરસ પેસેજ 1 પર પ્રાપ્ત કરવામાં આવ્યો હતો અને નિષ્ક્રિયકરણના અભ્યાસો માટે પેસેજ 2 અથવા 3 પર વપરાયો હતો.
SARS-CoV-2ના નિષ્ક્રિયકરણ માટે વપરાયેલા અભિકારકો અને રસાયણો તેમજ અભિકારકોની કોષવિષાક્તતા દૂર કરવા વિશે જાણવા માટે કૃપા કરીને Welch et al. (2020)નો વૈજ્ઞાનિક અહેવાલ જુઓ.

ડિટર્જન્ટ વડે વાયરસનું નિષ્ક્રિયકરણ – Welch et al. 2020 દ્વારા SARS-CoV-2 કોરોનાવાયરસના નિષ્ક્રિયકરણનો પ્રોટોકોલ

SARS-CoV-2નું નિષ્ક્રિયકરણ


વાણિજ્યિક ઉત્પાદનો માટે, વાયરસની તૈયારીઓ (ટિશ્યૂ કલ્ચર પ્રવાહી, જેમાં ટાઇટર 1 × 10⁶ થી 1 × 10⁸ PFU/ml સુધી હતા) પર અભિકારકો વડે ત્રણ પુનરાવર્તનમાં પ્રક્રિયા કરવામાં આવી. જ્યાં ઉત્પાદકની ઉપયોગ માટેની સૂચનાઓ ઉપલબ્ધ હતી ત્યાં તેમાં ભલામણ કરેલી સાંદ્રતાઓ અને સંપર્ક સમય અપનાવવામાં આવ્યા, અથવા પરીક્ષણ પ્રયોગશાળાઓએ ખાસ વિનંતી કરેલી સાંદ્રતાઓ અને સમય અપનાવવામાં આવ્યા. ઉત્પાદકે સાંદ્રતાઓની શ્રેણી આપી હોય ત્યાં ઉત્પાદન અને નમૂનાના સૌથી નીચા ગુણોત્તરનું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું (એટલે કે પરીક્ષણ હેઠળના ઉત્પાદનની સૌથી નીચી ભલામણ કરેલી સાંદ્રતા). નમૂના પરિવહન ટ્યુબના અભિકારકોનું પરીક્ષણ ટિશ્યૂ કલ્ચર પ્રવાહીના એક કદભાગ સામે અભિકારકના દસ કદભાગના ગુણોત્તરથી કરવામાં આવ્યું, સિવાય કે ઉત્પાદકે નમૂના પ્રવાહી અને અભિકારકનો કદ ગુણોત્તર નિર્દિષ્ટ કર્યો હોય. ડિટર્જન્ટ, ફિક્સેટિવ અને દ્રાવકોનું પરીક્ષણ દર્શાવેલી સાંદ્રતાઓ પર દર્શાવેલા સમય માટે કરવામાં આવ્યું. નિષ્ક્રિયકરણના તમામ પગલાં આસપાસના ઓરડાના તાપમાને (18 – 25°C) કરવામાં આવ્યા. વૈકલ્પિક નમૂના પ્રકારોના પરીક્ષણ માટે, દર્શાવેલા નમૂના મેટ્રિક્સમાં 1:9ના ગુણોત્તરે વાયરસ ઉમેરવામાં આવ્યો અને ત્યારબાદ ઉપર જણાવ્યા મુજબ પરીક્ષણ અભિકારકો વડે પ્રક્રિયા કરવામાં આવી. તમામ પ્રયોગોમાં પરીક્ષણ અભિકારકના સ્થાને PBSના સમકક્ષ કદ સાથે મોક-પ્રક્રિયા કરેલા નિયંત્રણ નમૂનાઓનાં ત્રણ પુનરાવર્તન સામેલ હતાં. જરૂરી સંપર્ક સમય પૂરો થયા પછી તરત જ, પ્રક્રિયા કરેલા નમૂનાના 1mLને યોગ્ય રીતે પસંદ કરેલા ફિલ્ટ્રેશન મેટ્રિક્સ વડે પ્રક્રિયા કરવામાં આવી. નિષ્ક્રિયકરણના પરીક્ષણ માટે અભિકારક દૂર કરવાની પ્રક્રિયા મોટા સ્પિન કોલમ સ્વરૂપમાં Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) વડે કરવામાં આવી, અથવા ખાલી Pierce 10mL ક્ષમતાના સેન્ટ્રિફ્યુજ કોલમ (Thermo Fisher)માં SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR અથવા Sephadex LH-20 ભરીને 4mL ભરેલા બીડ્સ/રેઝિન તૈયાર કરવામાં આવ્યા. Amicon ફિલ્ટર વડે શુદ્ધિકરણ માટે, અગાઉ વર્ણવેલી પદ્ધતિથી બે સેન્ટ્રિફ્યુગલ ફિલ્ટર વડે 2 × 500μl નમૂનાઓનું શુદ્ધિકરણ કરવામાં આવ્યું અને પછી તેમને એકત્ર કરવામાં આવ્યા. ફોર્માલ્ડિહાઇડ અને ગ્લુટારાલ્ડિહાઇડ સાથેના ફોર્માલ્ડિહાઇડને દૂર કરવા માટે, 1× 500μl નમૂના કદ સાથે એક ફિલ્ટરનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો; પ્રક્રિયા પછી તેને 500μl PBSમાં ફરી સસ્પેન્ડ કરીને 400ul MEM/5% FBSમાં ઉમેરવામાં આવ્યો. ચેપગ્રસ્ત એકસ્તરીય કોષસ્તરોના નિષ્ક્રિયકરણ માટે, 12.5 cm² ના Vero E6 કોષો ધરાવતા ફ્લાસ્ક (2.5 × 10⁶ કોષો/ફ્લાસ્ક, 2.5mL MEM/5% FBSમાં)ને MOI 0.001 પર સંક્રમિત કરવામાં આવ્યા અને ત્યારબાદ 37°C/5% CO₂ પર 24 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા. ઉપરનું પ્રવાહી દૂર કરવામાં આવ્યું, અને ઓરડાના તાપમાને 15 અથવા 60 મિનિટ માટે 5mL ફોર્માલ્ડિહાઇડ અથવા ફોર્માલ્ડિહાઇડ અને ગ્લુટારાલ્ડિહાઇડ વડે કોષોને સ્થિર કરવામાં આવ્યા. ફિક્સેટિવ દૂર કરવામાં આવ્યું, અને કોષોને ખુરચીને 1mL MEM/5% FBSમાં એકત્ર કરતાં પહેલાં એકસ્તરીય કોષસ્તરોને PBS વડે ત્રણ વખત ધોવામાં આવ્યા અને ત્યારબાદ VialTweeter જોડાણ ધરાવતા UP200St (Hielscher Ultrasound Technology) વડે 100% પાવર અને એમ્પ્લિટ્યુડ પર (3 × 10 સેકન્ડ ચાલુ, 10 સેકન્ડ બંધ) સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું. 3000 × g પર 10 મિનિટ માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરીને ઉપરના પ્રવાહીઓને સ્પષ્ટ કરવામાં આવ્યા.


Welch et al. 2020ના પ્રોટોકોલ અનુસાર અલ્ટ્રાસોનિક VialTweeter વડે SARS-CoV-2 કોરોનાવાયરસના નિષ્ક્રિયકરણ માટે વપરાયેલા અભિકારકની વિગતો

Hielscher VialTweeterના ઉપયોગ સહિતનો સંપૂર્ણ પ્રોટોકોલ અહીં મળી શકે છે:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

અદ્યતન અલ્ટ્રાસોનિક ડિસ્મેમ્બ્રેટર અને કોષ વિઘટકો

બહુ-નમૂના અલ્ટ્રાસોનિકેટર VialTweeter એ જૈવિક, જૈવરાસાયણિક અને ક્લિનિકલ પ્રયોગશાળાઓમાં નમૂના તૈયારી માટેનાં અનેક અલ્ટ્રાસોનિક ઉકેલોમાંથી માત્ર એક છે. Hielscher Ultrasonics તમારી એપ્લિકેશન માટે આદર્શ અલ્ટ્રાસોનિક ડિસ્મેમ્બ્રેટર પ્રદાન કરે છે, જેમ કે કોષ લાયસિસ, કોષ નિષ્કર્ષણ, પેશીનું સમાનાંગીકરણ, લાયસેટનું દ્રાવ્યીકરણ, ઓગાળવું, નમૂનામાંથી વાયુ દૂર કરવો વગેરે.
તમારે દર કલાકે અને દરરોજ કેટલા નમૂનાઓ પર પ્રક્રિયા કરવાની છે, તમે પ્રત્યક્ષ કે પરોક્ષ સોનિકેશન પસંદ કરો છો અને નમૂનાની અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયાનો હેતુ શું છે તે અમને જણાવો. અમે તમારી દૈનિક કાર્યદિનચર્યા માટે સૌથી યોગ્ય અલ્ટ્રાસોનિક એકમની ભલામણ કરીશું!
Hielscher Ultrasonicsના ડિજિટલ અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસરોમાં સ્માર્ટ સોફ્ટવેર, સ્વચાલિત ડેટા રેકોર્ડિંગ, તાપમાન નિયંત્રણ, સોનિકેશનની અવધિ અને સાઇકલ/પલ્સ મોડ માટે સરળ પૂર્વ-સેટિંગ વિકલ્પો તેમજ નમૂના માટે પ્રકાશવ્યવસ્થા અને બ્રાઉઝર દ્વારા રિમોટ કંટ્રોલ ઉપલબ્ધ છે. અમે અમારા અલ્ટ્રાસોનિક ઉપકરણોને શક્ય તેટલા સ્માર્ટ બનાવવાનો પ્રયત્ન કરીએ છીએ, જેથી તમારું સંશોધન અને કાર્યદિનચર્યા શક્ય તેટલાં સુવિધાજનક અને સફળ બને.
VialTweeter વડે અલ્ટ્રાસોનિક નમૂના તૈયારીના પ્રોટોકોલ સહિત વધુ એપ્લિકેશનો શોધવા માટે અહીં ક્લિક કરો!