ELISA પરીક્ષણો માટે અલ્ટ્રાસોનિક નમૂના તૈયારી

ELISA જેવાં પરીક્ષણોનો ઇન-વિટ્રો નિદાન, રોગસંબંધિત પ્રોટીનની શોધ અને ગુણવત્તા નિયંત્રણ (દા.ત. ખાદ્ય એલર્જનનું નિરીક્ષણ) માટે વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે. અલ્ટ્રાસોનિક નમૂના તૈયારી એ કોષોનું લયન કરવા અને અંતઃકોષીય પ્રોટીન, DNA, RNA અને કોષાંગોને અલગ કરવા માટેની ઝડપી, વિશ્વસનીય અને પુનરુત્પાદનક્ષમ તકનીક છે. Hielscher Ultrasonics એકલ નમૂનાઓ, અનેક વાયલો તેમજ માઇક્રોટાઇટર પ્લેટો અને 96-વેલ પ્લેટોની સુવિધાજનક તૈયારી માટે વિવિધ અલ્ટ્રાસોનિક ઉકેલો પ્રદાન કરે છે.

ELISA – એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે

ELISA એટલે એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે, અને તે લિગેન્ડ-બંધન પરીક્ષણોની શ્રેણીમાં આવતી, વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાતી જૈવરાસાયણિક વિશ્લેષણ તકનીક છે. ELISAમાં, વિશિષ્ટ બંધન ગુણધર્મો ધરાવતી સ્થિર ઘન અવસ્થા પર પ્રવાહી નમૂનો ઉમેરવામાં આવે છે. સામાન્ય રીતે, સ્થિર ઘન અવસ્થાને વેલ પ્લેટ અથવા ELISA પ્લેટ પર આવરણ તરીકે લગાવવામાં આવે છે. ત્યારબાદ, વિવિધ પ્રવાહી અભિકારકો ક્રમશઃ ઉમેરવામાં આવે છે, તેમનું ઇન્ક્યુબેશન કરવામાં આવે છે અને ધોવામાં આવે છે, જેથી અંતે વેલમાં રહેલા અંતિમ પ્રવાહીમાં પ્રકાશીય ફેરફાર (દા.ત. એન્ઝાઇમેટિક પ્રતિક્રિયાના ઉત્પાદનથી રંગનો વિકાસ) થાય છે. આ પ્રકાશીય ફેરફાર કહેવાતા જથ્થાત્મક “વાંચન” દ્વારા વિશ્લેષ્યની માત્રા માપવાનું શક્ય બનાવે છે. જથ્થાત્મક વાંચન માટે, પસાર થતા પ્રકાશની તીવ્રતા શોધવા અને માપવા સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર, ફ્લોરોમીટર અથવા લ્યુમિનોમીટરનો ઉપયોગ થાય છે. વિશ્લેષણાત્મક પ્રતિક્રિયાઓ દરમિયાન સંકેતના પ્રવર્ધનથી શોધની સંવેદનશીલતા પ્રભાવિત થાય છે. એન્ઝાઇમ પ્રતિક્રિયાઓ સારી રીતે અભ્યાસ કરાયેલી અને વિશ્વસનીય પ્રવર્ધન પ્રક્રિયાઓ હોવાથી, સંકેત ઉત્પન્ન કરવા માટે એન્ઝાઇમનો ઉપયોગ થાય છે. સચોટ જથ્થાત્મક માપન શક્ય બનાવવા માટે એન્ઝાઇમને શોધ અભિકારકો સાથે નિશ્ચિત પ્રમાણમાં જોડવામાં આવે છે, જે ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસેના “એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ” નામને પણ સમજાવે છે.
ELISA પરીક્ષણો માઇક્રોટાઇટર પ્લેટો / 96-વેલ પ્લેટોમાં કરવામાં આવતાં હોવાથી, તેને પ્લેટ-આધારિત પરીક્ષણ તકનીક તરીકે ઓળખવામાં આવે છે અને તેનો ઉપયોગ દા.ત. ક્લિનિકલ ઇન-વિટ્રો નિદાન, સંશોધન, દવા વિકાસ વગેરેમાં એન્ટિબોડી, પેપ્ટાઇડ, પ્રોટીન અને હોર્મોન શોધવા તથા તેમનું જથ્થાત્મક માપન કરવા માટે થાય છે.
ELISA તકનીકનો ઉપયોગ ચિકિત્સા, જૈવપ્રૌદ્યોગિકી અને વનસ્પતિ રોગવિજ્ઞાનમાં નિદાન સાધન તરીકે વારંવાર થાય છે અને અનેક ઉદ્યોગોમાં તે ગુણવત્તા નિયંત્રણનું એક મહત્વપૂર્ણ માપન પણ છે.

ELISA પહેલાં અલ્ટ્રાસોનિક નમૂના તૈયારી

ELISA પરીક્ષણ કરી શકાય તે પહેલાં, નમૂનાઓ માટે કોષલયન અને અંતઃકોષીય પ્રોટીન, DNA, RNA વગેરેના નિષ્કર્ષણ જેવાં તૈયારીનાં પગલાં જરૂરી હોય છે. અલ્ટ્રાસોનિક કોષલયન અને પ્રોટીન અલગીકરણનો લાભ તેમની ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા, વિશ્વસનીયતા અને પુનરુત્પાદનક્ષમતા છે. ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળાં નિદાન અને સંશોધન પરિણામો મેળવવા માટે આ તમામ પરિબળો મહત્વપૂર્ણ છે

ELISA પહેલાં અલ્ટ્રાસોનિક કોષલયન માટેની કાર્યપદ્ધતિ

• કોષ સંવર્ધનો માટે: અલ્ટ્રાસોનિક કોષલયન પહેલાં, માઇક્રોસેન્ટ્રિફ્યુજમાં કોષોને 270 x g પર 5 mins માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો. એસ્પિરેશન દ્વારા ઉપરનું પ્રવાહી દૂર કરો અને કોષોને 30 – 100 μL RIPA બફરમાં ફરીથી નિલંબિત કરો. ત્યારબાદ, કોષોના તળિયે જમા થયેલા સમૂહને બરફ પર 30 min માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો.
• હવે કોષનો નમૂનો અલ્ટ્રાસોનિક લયન માટે તૈયાર છે:
  પ્રોબ-પ્રકારના અલ્ટ્રાસોનિકેટર (દા.ત. UP200Ht S26d2 પ્રોબ સાથે) અથવા અલ્ટ્રાસોનિક બહુ-નમૂના ઉપકરણનો (દા.ત. એકસાથે 10 વાયલો સુધીના સોનિકેશન માટે VialTweeter અથવા માઇક્રોટાઇટર પ્લેટો / 96-વેલ પ્લેટો માટે UIP400MPT) ઉપયોગ કરો; ઉપકરણની પસંદગી તમારે તૈયાર કરવાના નમૂનાઓની સંખ્યા પર આધારિત છે.
  એકલ નમૂનાના પ્રોબ-પ્રકારના સોનિકેશન માટે, કોષોને 1.5 mL માઇક્રોસેન્ટ્રિફ્યુજ ટ્યુબોમાં મૂકો.
• અલ્ટ્રાસોનિકેટરના ડિજિટલ મેનૂમાં તમારો અલ્ટ્રાસોનિક સમયગાળો, કુલ ઊર્જા ઇનપુટ, ચક્ર મોડ અને/અથવા તાપમાનની મર્યાદાઓ અગાઉથી સેટ કરો. આ અત્યંત વિશ્વસનીય સોનિકેશન અને પુનરાવર્તનીયતા સુનિશ્ચિત કરે છે.
• સોનોટ્રોડ દાખલ કરો અને અલ્ટ્રાસોનિક ઉપકરણ ચાલુ કરો. નમૂનાનું સમાનરૂપે સોનિકેશન કરવા માટે અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબની માઇક્રો-ટિપને નમૂનામાં હળવેથી ફેરવો.
  મોટાભાગના કોષો માટે, 10 sec સોનિકેશનનાં 2–4 ચક્ર પછી અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ પૂર્ણ થશે.
• સોનિકેશન પછી, નમૂનામાંથી સોનોટ્રોડ બહાર કાઢો. નમૂનાઓને બરફ પર 5 min માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવા જોઈએ. ત્યારબાદ, કોષીય અવશેષોની પેલેટ બનાવવા માટે 10,000 x g પર 20 min માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો. ઉપરના પ્રવાહી અંશોને નવી માઇક્રોસેન્ટ્રિફ્યુજ ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરો. વિશ્લેષ્ય પદાર્થોને લેબલ કરો અને -20°C પર સંગ્રહિત કરો.
• અલ્ટ્રાસોનિક સોનોટ્રોડને આલ્કોહોલથી યોગ્ય રીતે લૂછીને અથવા આલ્કોહોલ, દા.ત. 70% ઇથેનોલ, ભરેલા બીકરમાં સોનિકેશન કરીને સાફ કરી શકાય છે. ટાઇટેનિયમમાંથી બનેલા તમામ અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબને ઓટોક્લેવમાં નિર્જંતુ કરી શકાય છે.

• વધારાનું હીમોલાઇઝ થયેલું લોહી સંપૂર્ણપણે દૂર કરવા માટે પેશીને બરફ જેવા ઠંડા PBS (0.01M, pH=7.4) વડે ધુઓ.
• પેશી (મૂત્રપિંડ, હૃદય, ફેફસું, બરોળ વગેરે)નું વજન કરો અને તેને મસળી નાના ટુકડા કરો, જેનું PBSમાં સમાનાંગીકરણ કરવામાં આવે છે. જરૂરી PBSનું પ્રમાણ પેશીના વજન સાથે સંબંધિત છે. સામાન્ય અંદાજ મુજબ, 1g પેશી માટે આશરે 9mL PBS જરૂરી છે. PBSમાં થોડું પ્રોટિએઝ અવરોધક ઉમેરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે. (વૈકલ્પિક રીતે, પ્રોટિએઝ અને ફોસ્ફેટેઝ અવરોધકોનું મિશ્રણ ધરાવતું RIPA અથવા હાઇપોટોનિક લાયસિસ બફર વાપરી શકાય છે.)
• પેશીના કદના આધારે, પેશીની પૂર્વસારવાર માટે ટૂંકી વોર્ટેક્સ સારવાર (15 secના પલ્સમાં આશરે 1–2 min) મદદરૂપ થઈ શકે છે.
• તમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર પર માઇક્રો-ટિપ, દા.ત. S26d2, લગાવો. પેશી ધરાવતી નમૂનાની ટ્યુબને બરફના સ્નાનમાં મૂકો.
• તમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર, દા.ત. UP200St (80% કંપનવિસ્તાર), વડે નમૂનાનું પલ્સ મોડમાં (15sec ચાલુ, 15sec વિરામ) 1 min માટે સોનિકેશન કરો. નમૂનાને બરફના સ્નાનમાં રાખો.
• વિશ્લેષણ માટે પ્રોટીનનું સંવર્ધન કરવા હેતુથી ચોક્કસ અંશો (સાયટોસોલિક, ન્યુક્લિયર, માઇટોકોન્ડ્રિયલ અથવા લાયસોસોમલ) મેળવવા માટે ત્યારબાદ હોમોજિનેટ્સને સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવે છે. નમૂનાને 5000×g પર 5 મિનિટ માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરીને ઉપરનો પ્રવાહી અંશ મેળવવામાં આવે છે.

સોનિકેશન દરમિયાન વિશ્વસનીય તાપમાન નિયંત્રણ

તાપમાન એ પ્રક્રિયાને પ્રભાવિત કરતું એક નિર્ણાયક પરિબળ છે, જે જૈવિક નમૂનાઓની સારવાર માટે, દા.ત. પ્રોટીનનું ઉષ્મીય વિઘટન અટકાવવા માટે, ખાસ મહત્વનું છે. નમૂના તૈયાર કરવાની બધી યાંત્રિક તકનીકોની જેમ, સોનિકેશનથી પણ ગરમી ઉત્પન્ન થાય છે. જોકે, Hielscher Ultrasonicsનાં ઉપકરણો વાપરતી વખતે નમૂનાઓનું તાપમાન સારી રીતે નિયંત્રિત કરી શકાય છે. વિશ્લેષણ પહેલાં પ્રોબ-પ્રકારના અલ્ટ્રાસોનિકેટર અથવા VialTweeter વડે તમારા નમૂનાઓ તૈયાર કરતી વખતે તેમનું તાપમાન નિરીક્ષણ અને નિયંત્રિત કરવા માટે અમે તમને વિવિધ વિકલ્પો રજૂ કરીએ છીએ.

1. નમૂનાના તાપમાનનું નિરીક્ષણ: Hielscher ના તમામ ડિજિટલ અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસરો બુદ્ધિશાળી સોફ્ટવેર અને પ્લગ દ્વારા જોડી શકાય તેવા તાપમાન સેન્સરથી સજ્જ છે. તાપમાન સેન્સરને અલ્ટ્રાસોનિક ઉપકરણમાં જોડો (દા.ત., UP200Ht, UP200St, VialTweeter, મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP) અને તાપમાન સેન્સરની ટિપને નમૂનાની કોઈ એક ટ્યુબમાં દાખલ કરો. ડિજિટલ રંગીન ટચ-ડિસ્પ્લે દ્વારા તમે અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસરના મેનૂમાં તમારા નમૂનાના સોનિકેશન માટે ચોક્કસ તાપમાન શ્રેણી સેટ કરી શકો છો. મહત્તમ તાપમાન પહોંચતાં અલ્ટ્રાસોનિકેટર આપમેળે બંધ થઈ જશે અને નમૂનાનું તાપમાન સેટ કરેલા તાપમાન ∆ના નીચલા મૂલ્ય સુધી ઘટે ત્યાં સુધી વિરામ લેશે. ત્યારબાદ સોનિકેશન આપમેળે ફરી શરૂ થાય છે. આ બુદ્ધિશાળી સુવિધા ગરમીથી થતા વિઘટનને અટકાવે છે.
2. અલ્ટ્રાસોનિક મલ્ટિ-સેમ્પલ યુનિટ VialTweeter માં નમૂનાની ટ્યુબોને ધારણ કરતો ટાઇટેનિયમ બ્લોક અગાઉથી ઠંડો કરી શકાય છે. ટાઇટેનિયમ બ્લોકને અગાઉથી ઠંડો કરવા માટે VialTweeter બ્લોકને (ટ્રાન્સડ્યુસર વિના માત્ર સોનોટ્રોડ!) ફ્રિજ અથવા ફ્રીઝરમાં મૂકો; આથી નમૂનામાં તાપમાનનો વધારો વિલંબિત કરવામાં મદદ મળે છે. શક્ય હોય તો, નમૂનાને પણ અગાઉથી ઠંડો કરી શકાય છે.
3. સોનિકેશન દરમિયાન ઠંડક માટે બરફના સ્નાન અથવા સૂકા બરફનો ઉપયોગ કરો. સોનિકેશન દરમિયાન તમારી નમૂનાની ટ્યુબ(ઓ)ને બરફના સ્નાનમાં મૂકો. VialTweeter માટે, સૂકા બરફથી ભરેલી છીછરી ટ્રેનો ઉપયોગ કરો અને VialTweeter ને સૂકા બરફ પર મૂકો, જેથી ઉષ્મા ઝડપથી વિખેરાઈ શકે.

વિશ્વભરના ગ્રાહકો જૈવિક, જૈવરાસાયણિક, તબીબી અને ક્લિનિકલ પ્રયોગશાળાઓમાં નમૂના તૈયાર કરવાના તેમના દૈનિક કાર્ય માટે Hielscher પ્રોબ-પ્રકારનાં અલ્ટ્રાસોનિકેટરો તેમજ બહુવિધ નમૂનાઓ માટેનાં સોનિકેશન એકમો VialTweeter અને UIP400MTP નો ઉપયોગ કરે છે. Hielscher પ્રોસેસરોના બુદ્ધિશાળી સોફ્ટવેર અને તાપમાન નિયંત્રણ દ્વારા તાપમાનનું વિશ્વસનીય રીતે નિયંત્રણ થાય છે અને ઉષ્માને કારણે થતું નમૂનાનું વિઘટન ટાળવામાં આવે છે. Hielscher અલ્ટ્રાસોનિક ઉકેલો વડે નમૂના તૈયાર કરવાથી અત્યંત વિશ્વસનીય અને પુનરુત્પાદનીય પરિણામો મળે છે!
પરીક્ષણો માટે બહુવિધ કૂવાવાળા પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP નો ઉપયોગ કરીને ઊંચી નમૂના પ્રક્રિયાક્ષમતા સાથે કરવામાં આવતા સોનિકેશન વિશે વધુ વાંચો!