Drosophila Melanogaster ના નમૂનાઓનું અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ

પ્રયોગશાળાઓમાં Drosophila melanogaster નો આદર્શ જીવ તરીકે વ્યાપક ઉપયોગ થાય છે. તેથી, Drosophila melanogaster ના નમૂનાઓનું લાયસિસ, કોષ વિઘટન, પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ અને DNA નું શિયરિંગ જેવા વિશ્લેષણપૂર્વ તૈયારીનાં પગલાં વારંવાર હાથ ધરવા પડે છે. અલ્ટ્રાસોનિક ડિસમેમ્બ્રેટર્સ વિશ્વસનીય અને કાર્યક્ષમ હોય છે અને માત્ર અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયાના પરિમાણો સમાયોજિત કરીને લાયસિસ, પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ અથવા DNA નું ખંડન જેવાં વિવિધ કાર્યો સરળતાથી કરવા માટે તેનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. આમ, અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર્સ વ્યાપક ઉપયોગક્ષેત્ર ધરાવતાં અનુકૂલનક્ષમ સાધનો છે.

અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ

જૈવિક પ્રયોગશાળાઓમાં લાયસિસ, કોષોનું દ્રાવ્યીકરણ, પેશીઓનું સમાનાંગીકરણ અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ એ અલ્ટ્રાસોનિક ડિસમેમ્બ્રેટર્સનાં સામાન્ય કાર્યો છે. અલ્ટ્રાસોનિક ડિસમેમ્બ્રેટર્સ અને કોષ વિઘટકો પ્રાણીઓની પેશીઓ, કીટકો (દા.ત., Drosophila melanogaster, C. elegans) અથવા વનસ્પતિના નમૂનાઓનું સમાનાંગીકરણ કરવા માટે ખૂબ યોગ્ય છે. અલ્ટ્રાસોનિકેશનના ત્યારબાદના ઉપયોગોમાં કોષીય નિલંબનો અને પેલેટ્સનું લાયસિસ તેમજ અંતઃકોષીય પ્રોટીનોનું નિષ્કર્ષણ સામેલ છે.
અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ અત્યંત વિશ્વસનીય અને પુનરુત્પાદનક્ષમ પ્રક્રિયાઓ છે, જે સ્થાપિત પ્રોટોકોલના આધારે કરી શકાય છે. કંપવિસ્તાર, ચક્ર / પલ્સ મોડ, તાપમાન અને નમૂનાના આયતન જેવા સોનિકેશન પરિમાણો દ્વારા અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયાની તીવ્રતા ચોક્કસ રીતે સમાયોજિત કરી શકાય છે, તેથી એક વાર પ્રમાણિત થયેલા પ્રોટોકોલને વારંવાર સમાન પરિણામ સાથે પુનરાવર્તિત કરી શકાય છે.

અલ્ટ્રાસોનિક DNA અને RNA ખંડન

કોષ લાયસિસ અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ પછી, નમૂનાની તૈયારીમાં સામાન્ય રીતે જરૂરી એક પગલું DNA, RNA અને ક્રોમેટિનનું શિયરિંગ અને ખંડન છે, દા.ત. ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (ChIP) પહેલાં. ભૌતિક બળો દ્વારા DNA ને એકસાથે જકડી રાખતા સહસંયોજક બંધો તોડીને DNA અને RNA નું ખંડન વિશ્વસનીય રીતે કરી શકાય છે. સોનિકેશન જેવા ભૌતિક શિયરિંગનો ઉપયોગ કરતાં પહેલાં DNA ના તંતુઓ તૂટે છે, પછી DNA નું નાના ટુકડાઓમાં ખંડન થાય છે.
અલ્ટ્રાસોનિક DNA ખંડન DNA ને લક્ષિત લંબાઈ સુધી, દા.ત. 500bp (બેઝ પેર), શિયર કરવામાં વિશ્વસનીય અને કાર્યક્ષમ છે. અલ્ટ્રાસોનિક DNA ખંડનના મુખ્ય ફાયદાઓમાં અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયાનાં પરિમાણો અને તીવ્રતાનું ચોક્કસ નિયંત્રણ સામેલ છે. સોનિકેશનની તીવ્રતા, ચક્રો અને સમયનું ચોક્કસ સમાયોજન કરીને અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયાનાં પરિમાણો સમાયોજિત કરી શકાય છે. આનાથી ઇચ્છિત કદના DNA બનાવવાનું શક્ય બને છે અને લક્ષિત લંબાઈના DNA વિશ્વસનીય રીતે ઉત્પન્ન કરી શકાય છે તેમજ ફરીથી પણ ઉત્પન્ન કરી શકાય છે. ઉચ્ચ આણ્વિક વજનવાળા DNA ખંડો બનાવવા માટે પણ અલ્ટ્રાસોનિક DNA શિયરિંગ આદર્શ છે.

Drosophila melanogaster ના અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ માટેના પ્રોટોકોલ

નીચે તમને Drosophila ના નમૂનાઓના અલ્ટ્રાસોનિક સહાયિત લાયસિસ, પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ અને DNA અથવા ક્રોમેટિનના ખંડન માટેના વિવિધ પ્રોટોકોલ મળી શકે છે.

ક્રોસ-લિંકિંગ ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (CLIP) પરીક્ષણ માટે અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ

CLIP પરીક્ષણ અગાઉ જણાવ્યા મુજબ કેટલાક ફેરફારો સાથે કરવામાં આવ્યું હતું. 0 થી 1 દિવસની ઉંમરની વન્ય પ્રકારની માદાઓમાંથી લીધેલા આશરે 20 mg અંડાશયોનું UV ક્રોસલિંકિંગ (3 × 2000 μJ/cm2) કરવામાં આવ્યું હતું, 300 U RNAseOUT ઉમેરેલા 1 mL RCB બફર (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM સુક્રોઝ, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) માં બરફ પર સમાનાંગીકરણ કરવામાં આવ્યું હતું અને 30 min માટે બરફ પર રાખવામાં આવ્યાં હતાં. હોમોજિનેટનું બરફ પર, 80% શક્તિએ, વચ્ચે 60 s ના વિરામ સાથે 20 s ના પાંચ બર્સ્ટમાં સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું હતું, જેમાં વપરાયેલું સાધન હતું Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) . હોમોજિનેટને સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવ્યું (4°C પર 5 min માટે 16,000 × g). દ્રાવ્ય અર્કને 20 μl Protein-G dynabeads સાથે 4°C પર 20 min રાખીને પૂર્વશુદ્ધ કરવામાં આવ્યો. ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ અને ઇનપુટ RNAના પરિમાણન (1%) માટે નમૂનાઓ દૂર કર્યા પછી, 450 μl પૂર્વશુદ્ધ અર્કમાંથી anti-HP1 9A9 એન્ટિબોડી વડે, 50 μl Protein-G dynabeads સાથે 4 h ઇન્ક્યુબેશન કરીને HP1નું ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન કરવામાં આવ્યું. ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેટ્સને RCB વડે 4 વખત ધોવામાં આવ્યાં. ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેટ થયેલા RNAને એલ્યુટ કરવા માટે, પેલેટ સ્વરૂપે એકત્ર કરેલા બીડ્સને 100 μL UltraPure DEPC-ઉપચારિત પાણીમાં 5 min ઉકાળવામાં આવ્યા. RNAની તૈયારી માટે મેળવેલા ઉપરના પ્રવાહીમાં 900 μL Qiazol Reagent ઉમેરવામાં આવ્યું. શુદ્ધ કરાયેલા RNAનો નમૂના તરીકે ઉપયોગ કરીને, ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર oligo dT, રૅન્ડમ હેક્સામર્સ અને SuperScript reverse transcriptase III વડે cDNAનું સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું.
(Cassale et al. 2019)

ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન પરીક્ષણ માટે અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ

ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન Menet દ્વારા વર્ણવેલી પદ્ધતિ અનુસાર નાના ફેરફારો સાથે કરવામાં આવ્યું. 0–1 દિવસની વન્ય-પ્રકારની માદાઓમાંથી લીધેલા આશરે 20 mg અંડાશયોને 1 mL NEB બફર (pH 8.0 પર 10 mM HEPES-Na, 10 mM NaCl, pH 8 પર 0.1 mM EGTA-Na, pH 8 પર 0.5 mM EDTA-Na, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM સ્પર્મિડિન, 0.15 mM સ્પર્મિન, 1× EDTA-મુક્ત Complete Protease Inhibitors)માં હોમોજેનાઇઝર / નિમજ્જિત ડિસ્પર્સર વડે 1 min માટે (3000 rpm પર) સમાનાંગીકૃત કરવામાં આવ્યા. સમાનાંગીકૃત મિશ્રણને અગાઉથી ઠંડા કરેલા કાચના ડાઉન્સ હોમોજેનાઇઝરમાં ખસેડવામાં આવ્યું અને ચુસ્ત પેસ્ટલ વડે 15 સંપૂર્ણ સ્ટ્રોક આપવામાં આવ્યા. ત્યારબાદ મુક્ત કેન્દ્રકોને 4°C પર 10 min માટે 6000xg પર સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવ્યા. કેન્દ્રકો ધરાવતા પેલેટ્સને 1 mL NEBમાં ફરી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા અને સુક્રોઝ ગ્રેડિયન્ટ (NEBમાં 1.6 M સુક્રોઝના 0.65 mL, NEBમાં 0.8 M સુક્રોઝના 0.35 mL) પર 20,000 × g પર 20 min માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવ્યા. પેલેટને 1 mL NEBમાં ફરી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું અને અંતિમ સાંદ્રતા 1% થાય તે રીતે ફોર્માલ્ડિહાઇડ ઉમેરવામાં આવ્યું. કેન્દ્રકોને ઓરડાના તાપમાને 10 min માટે ક્રોસ-લિંક કરવામાં આવ્યા અને 1.375 M ગ્લાયસિનનું 1/10 vol ઉમેરીને પ્રતિક્રિયા અટકાવવામાં આવી. 6000 × g પર 5 min સેન્ટ્રિફ્યુજ કરીને કેન્દ્રકોને એકત્ર કરવામાં આવ્યા. કેન્દ્રકોને 1 mL NEBમાં બે વખત ધોવામાં આવ્યા અને 1 mL લાયસિસ બફર (pH 7.6 પર 15 mM HEPES-Na, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, pH 8 પર 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% Na ડિઓક્સિકોલેટ, 0.1% SDS, 0.5% N-લૌરોઇલસાર્કોસિન અને 1× EDTA-મુક્ત Complete Protease Inhibitors)માં ફરી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા. કેન્દ્રકોનું સોનિકેશન Hielscher અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર UP100H (100 W, 30 kHz) નો ઉપયોગ કરીને છ વખત, દરેક વખતે 20 s સોનિકેશન ચાલુ રાખીને અને 1 min બરફ પર રાખીને કરવામાં આવ્યું. સોનિકેશન કરેલા કેન્દ્રકોને 4°C પર 4 min માટે 13,000 × g પર સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવ્યા. સોનિકેશન કરેલા ક્રોમેટિનનો મોટાભાગનો હિસ્સો 500 થી 1000 બેઝ પેર (bp) લંબાઈનો હતો. દરેક ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન માટે, 15 μg ક્રોમેટિનને 10 μg HP1 9A9 મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીની હાજરીમાં ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું (ફરતા ચક્રમાં 4°C પર 3 h). ત્યારબાદ, 50 μl dynabeads protein G ઉમેરવામાં આવ્યું અને 4°C પર આખી રાત ઇન્ક્યુબેશન ચાલુ રાખવામાં આવ્યું. ઉપરના પ્રવાહીઓને કાઢી નાખવામાં આવ્યા અને નમૂનાઓને લાયસિસ બફરમાં બે વખત (દરેક ધોવાણ 4 °C પર 15 min) અને TE બફરમાં બે વખત (1 mM EDTA, pH 8 પર 10 mM TrisHCl) ધોવામાં આવ્યા. બીડ્સમાંથી ક્રોમેટિનને બે તબક્કામાં એલ્યુટ કરવામાં આવ્યું; પહેલાં 100 μl એલ્યુશન બફર 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, pH 8 પર 50 mM TrisHCl)માં 65°C પર 15 min રાખવામાં આવ્યું, ત્યારબાદ સેન્ટ્રિફ્યુજેશન કરીને ઉપરનું પ્રવાહી મેળવવામાં આવ્યું. બીડ્સની સામગ્રીમાંથી 100 μl TE + 0.67% SDSમાં ફરી નિષ્કર્ષણ કરવામાં આવ્યું. સંયુક્ત એલ્યુએટ (200 μl)ને ક્રોસ-લિંક્સ ઉલટાવવા માટે 65°C પર આખી રાત ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું અને 50 μg/ml RNaseA વડે 65°C પર 15 min તથા 500 μg/ml Proteinase K વડે 65°C પર 3 h ઉપચાર કરવામાં આવ્યો. નમૂનાઓનું ફિનોલ–ક્લોરોફોર્મ વડે નિષ્કર્ષણ અને ઇથેનોલ વડે અવક્ષેપણ કરવામાં આવ્યું. DNAને 25 μl પાણીમાં ફરી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું. ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેટ કરેલા DNA વડે થતા આણ્વિક વિશ્લેષણોને મહત્તમ કરવા માટે, એક જ પ્રતિક્રિયામાં સમાન ગલન તાપમાન ધરાવતા પ્રાઇમર્સના બે જુદા સમૂહોનો ઉપયોગ કરીને અનુકૂલિત ડુપ્લેક્સ-PCR પ્રોટોકોલ દ્વારા સંભવિત જનીનોનું જોડીમાં એમ્પ્લિફિકેશન કરવામાં આવ્યું.
(Casale et al. 2019)
 

જૈવિક નમૂનાઓ માટે ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટકો

કોષ વિઘટન, લાઇસિસ, પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ, DNA, RNA અને ક્રોમેટિનના ખંડન તેમજ વિશ્લેષણ પહેલાંના નમૂના તૈયારીનાં અન્ય પગલાં માટે ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા અલ્ટ્રાસોનિકેટરની વાત આવે ત્યારે Hielscher Ultrasonics તમારા દીર્ઘ અનુભવ ધરાવતા ભાગીદાર છે. અલ્ટ્રાસોનિક લેબ હોમોજેનાઇઝર અને નમૂના તૈયારી એકમોની વ્યાપક શ્રેણી પ્રદાન કરતી Hielscher પાસે તમારા જૈવિક ઉપયોગ અને જરૂરિયાતો માટે આદર્શ અલ્ટ્રાસોનિક ઉપકરણ છે.
માઇક્રો-ટિપ ધરાવતું પરંપરાગત પ્રોબ-પ્રકારનું અલ્ટ્રાસોનિકેટર, જેમ કે UP200St (200W; ડાબી બાજુનું ચિત્ર જુઓ), અથવા અલ્ટ્રાસોનિક નમૂના તૈયારી એકમોમાંથી VialTweeter અથવા VialHolder ધરાવતું UP200ST_TD_CupHorn સંશોધન અને વિશ્લેષણાત્મક પ્રયોગશાળાઓમાં લોકપ્રિય મોડેલો છે. જ્યારે ઓછી સંખ્યામાં નમૂનાઓનું લાઇસિસ, નિષ્કર્ષણ અથવા ખંડન કરવાનું હોય ત્યારે પરંપરાગત અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ આદર્શ છે. નમૂના તૈયારી એકમો VialTweeter અને UP200St_TD_CupHorn અનુક્રમે 10 અથવા 5 વાયલ સુધીનું એકસાથે સોનિકેશન કરવાની સુવિધા આપે છે.
જો મોટી સંખ્યામાં નમૂનાઓ (દા.ત. 96-વેલ પ્લેટો, માઇક્રોટાઇટર પ્લેટો વગેરે) પર પ્રક્રિયા કરવાની હોય, તો UIP400MTP આદર્શ સોનિકેશન સેટઅપ છે. UIP400MTP મોટા કપહોર્નની જેમ કાર્ય કરે છે, જેમાં પાણી ભરવામાં આવે છે અને માઇક્રો-વેલ પ્લેટો રાખવા માટે પૂરતી જગ્યા હોય છે. 400 વૉટના શક્તિશાળી અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસરથી સંચાલિત UIP400MTP કોષોનું વિઘટન કરવા, નમૂનાઓનું લાઇસિસ કરવા, પેલેટોને દ્રાવ્ય બનાવવા, પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ કરવા અથવા DNAનું શીયરિંગ કરવા માટે મલ્ટિ-વેલ પ્લેટોનું અત્યંત સમાન અને તીવ્ર સોનિકેશન કરે છે.

સ્માર્ટ સોફ્ટવેર દ્વારા સચોટ નિયંત્રણ

200 વૉટ અને તેનાથી વધુ શક્તિવાળી Hielscher ની તમામ સોનિકેશન પ્રણાલીઓ ડિજિટલ રંગીન ટચ-સ્ક્રીન અને બુદ્ધિશાળી સોફ્ટવેરથી સજ્જ છે. સ્માર્ટ ડેટા નોંધણી દ્વારા, અલ્ટ્રાસોનિકેટર શરૂ થતાં જ અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયાનાં તમામ પરિમાણો આપમેળે બિલ્ટ-ઇન SD-કાર્ડ પર CSV ફાઇલ તરીકે સાચવવામાં આવે છે. આથી સંશોધન અને નોંધણી ઘણી વધુ સુવિધાજનક બને છે. સોનિકેશનના પ્રયોગો અથવા નમૂના તૈયારી પછી, તમે દરેક સોનિકેશન પ્રક્રિયાનાં સોનિકેશન પરિમાણો સરળતાથી સમીક્ષી શકો છો અને તેમની સરખામણી કરી શકો છો.
સહજ મેનુ દ્વારા સોનિકેશન પહેલાં અનેક પરિમાણો અગાઉથી સેટ કરી શકાય છે: ઉદાહરણ તરીકે, નમૂનાનું તાપમાન નિયંત્રિત કરવા અને તેનું ઉષ્મીય વિઘટન અટકાવવા માટે નમૂનાના તાપમાનની ઉપરની મર્યાદા સેટ કરી શકાય છે. અલ્ટ્રાસોનિક એકમ સાથે આવતું, પ્લગ દ્વારા જોડી શકાય એવું તાપમાન સેન્સર અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસરને સોનિકેશનના વાસ્તવિક તાપમાન વિશે પ્રતિસાદ આપે છે. જ્યારે તાપમાનની ઉપરની મર્યાદા પહોંચી જાય છે, ત્યારે અલ્ટ્રાસોનિક ઉપકરણ સેટ કરેલા ∆Tની નીચલી મર્યાદા સુધી તાપમાન પહોંચે ત્યાં સુધી થોભે છે અને ત્યારબાદ આપમેળે ફરીથી સોનિકેશન શરૂ કરે છે.
જો ચોક્કસ ઊર્જા ઇનપુટ સાથે સોનિકેશન જરૂરી હોય, તો તમે સોનિકેશન પ્રક્રિયાની અંતિમ અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા અગાઉથી સેટ કરી શકો છો. અલબત્ત, અલ્ટ્રાસોનિક પલ્સેશન અને ચક્ર મોડ પણ અલગથી સેટ કરી શકાય છે.
તમારાં સૌથી સફળ સોનિકેશન પરિમાણોનો ફરીથી ઉપયોગ કરવા માટે તમે વિવિધ સોનિકેશન મોડ (દા.ત. સોનિકેશન સમય, તીવ્રતા, ચક્ર મોડ વગેરે) અગાઉથી સેટ કરેલા મોડ તરીકે સાચવી શકો છો, જેથી તેમને સરળતાથી અને ઝડપથી ફરી શરૂ કરી શકાય.
સંચાલનમાં વધુ સુવિધા માટે, તમામ ડિજિટલ અલ્ટ્રાસોનિક એકમો કોઈપણ સામાન્ય બ્રાઉઝર (દા.ત. InternetExplorer, Safari, Chrome વગેરે)માં બ્રાઉઝર રિમોટ કંટ્રોલ દ્વારા ચલાવી શકાય છે. LAN જોડાણ એક સરળ પ્લગ-એન-પ્લે સેટઅપ છે અને તેના માટે વધારાના સોફ્ટવેર ઇન્સ્ટોલેશનની જરૂર નથી.
અમે Hielscher માં જાણીએ છીએ કે જૈવિક નમૂનાઓના સફળ સોનિકેશન માટે ચોકસાઈ અને પુનરાવર્તનીયતા જરૂરી છે. તેથી, અમે અમારાં અલ્ટ્રાસોનિકેટરને એવી તમામ સુવિધાઓ ધરાવતાં સ્માર્ટ ઉપકરણો તરીકે ડિઝાઇન કર્યાં છે, જે કાર્યક્ષમ, વિશ્વસનીય, પુનરુત્પાદનીય અને સુવિધાજનક નમૂના તૈયારી શક્ય બનાવે છે.

નીચેનું કોષ્ટક અનેક નમૂનાઓની સુવિધાજનક, વિશ્વસનીય તૈયારી માટેની અમારી અલ્ટ્રાસોનિક પ્રણાલીઓની અંદાજિત પ્રક્રિયા ક્ષમતાનો ખ્યાલ આપે છે, જેમાં અલ્ટ્રાસોનિક માઇક્રો-ટિપ અને પરંપરાગત અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝરથી લઈને MultiSample અલ્ટ્રાસોનિકેટર સુધીનો સમાવેશ થાય છે: