C. Elegans નમૂનાઓની અલ્ટ્રાસોનિક તૈયારી

નેમાટોડ કૃમિ C. elegans જીવવિજ્ઞાનમાં વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાતો મોડેલ સજીવ છે. વિશ્લેષણ પહેલાં નમૂનાઓની તૈયારી માટે લાયસિસ, પ્રોટીન અને લિપિડનું નિષ્કર્ષણ તેમજ RNAનું ખંડન જરૂરી છે, જે સોનિકેશન દ્વારા વિશ્વસનીય રીતે કરી શકાય છે. અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટકો C. elegans નમૂનાઓની ઝડપી તૈયારી માટે વિશ્વસનીય, અદ્યતન અને ઉપયોગમાં સરળ ઉપકરણો છે.

C. elegans નમૂનાઓની અલ્ટ્રાસોનિક તૈયારી

Caenorhabditis elegans ગોળકૃમિઓ છે, જેનો જીનોમિક્સ, વિકાસલક્ષી જીવવિજ્ઞાન અને રોગોનો અભ્યાસ કરવા માટે સંશોધન પ્રયોગશાળાઓમાં વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે. C. elegansના જીનોમમાં રહેલા ઘણા જનીનોના કાર્યાત્મક સમકક્ષો મનુષ્યોમાં જોવા મળે છે. તેથી, આ નેમાટોડ કૃમિ માનવ રોગો માટે અત્યંત ઉપયોગી મોડેલ છે. C. elegansના વ્યાપક ઉપયોગનાં અન્ય લાભોમાં બેક્ટેરિયા (દા.ત., E. coli) ધરાવતી પ્લેટો પર તેનું સરળ અને સસ્તું સંવર્ધન, તેની પારદર્શિતા, અનુકૂળ સંભાળ તેમજ કૃમિઓને હિમિત કરીને લાંબા સમય સુધી સંગ્રહિત કરવાની શક્યતાનો સમાવેશ થાય છે.
પ્રોટીન અને લિપિડનું વિશ્લેષણ પ્રયોગશાળાઓમાં નિયમિત પ્રક્રિયાઓ છે અને દરેક વિકાસ તબક્કે (એટલે કે ભ્રૂણ, લાર્વા L1-L4, પુખ્ત) C. elegans નેમાટોડનું લાયસિસ કરવા માટે અલ્ટ્રાસોનિક નમૂના તૈયારી એક સ્થાપિત પદ્ધતિ છે. લક્ષિત પ્રોટીનની અતિઅભિવ્યક્તિ માટે C. elegansનો પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ પ્રણાલી તરીકે પણ ઉપયોગ થતો હોવાથી, પ્રોટીનની ઊંચી ઉપજ આપતી વિશ્વસનીય અને પુનરુત્પાદનીય લાયસિસ તથા પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ પદ્ધતિ જરૂરી છે. અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટન અને નિષ્કર્ષણ પ્રણાલીઓ પ્રોબ પ્રકારના હોમોજેનાઇઝર અને બહુનમૂના અલ્ટ્રાસોનિકેટર તરીકે ઉપલબ્ધ છે. નમૂનાઓની અનુકૂળ તૈયારી તથા તમામ પ્રકારનાં નમૂના કદ અને સંખ્યાઓની જરૂરિયાતો પૂરી કરવા માટે Hielscher Ultrasonics પાસે તમારી પ્રયોગશાળાની પ્રક્રિયા માટે આદર્શ અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટક છે.

C. Elegansના વિઘટન અને લાયસિસ માટેના અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોટોકોલ

અલગ અલગ હોમોજેનાઇઝેશન અને લાયસિસ બફર વગેરે સાથે વિવિધ પ્રક્રિયાઓનો ઉપયોગ કરીને C. elegansનું અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝેશન અને લાયસિસ તથા ત્યારબાદ પ્રોટીન અને લિપિડનું નિષ્કર્ષણ કરી શકાય છે. તમામ લાયસિસ પ્રોટોકોલમાં એક બાબત સમાન છે કે પ્રોટીનનું અવક્ષય અટકાવવા માટે નમૂનાઓને સતત બરફ પર રાખવા જરૂરી છે. નીચે, અમે ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા પ્રોટીન અથવા લિપિડ ધરાવતા C. elegans નમૂનાઓની તૈયારી માટે કેટલાક વિશ્વસનીય અને ઝડપી અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ તથા નિષ્કર્ષણ પ્રોટોકોલ રજૂ કરીએ છીએ.

C. elegansના અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસના લાભો

• વિશ્વસનીય
• પુનરુત્પાદનીય
• ચોકસાઈપૂર્વક તાપમાન નિયંત્રિત
• વિશ્વસનીય પ્રક્રિયા નિયંત્રણ
• સૌમ્ય પદ્ધતિ
• અમલમાં મૂકવા સરળ
• સલામત

C. elegans નમૂનાઓમાંથી પ્રોટીનનું અલ્ટ્રાસોનિક નિષ્કર્ષણ

વિવિધ પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરીને C. elegans કૃમિઓનું અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ અને પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ કરી શકાય છે. નીચે અમે પ્રોટીન નિષ્કર્ષણનાં પુનરુત્પાદનીય પરિણામો માટે કેટલાક વિશ્વસનીય અને ઝડપી લાયસિસ પ્રોટોકોલ રજૂ કરીએ છીએ.

સોનિકેશન દ્વારા C. elegans કૃમિઓમાંથી સાયટોસોલિક નિષ્કર્ષની ઝડપી તૈયારી

નીચેના પ્રોટોકોલ વડે તમે 30 મિનિટથી ઓછા સમયમાં C. elegans લાયસેટ તૈયાર કરી શકો છો.
C. elegansનું એકત્રીકરણ
ઇચ્છિત C. elegans કૃમિઓને ફોસ્ફેટ બફર્ડ સેલાઇન (PBS) ધરાવતી 1.5ml નળીમાં પસંદ કરીને મૂકો અથવા 1.5ml PBS વડે પ્લેટ પરથી ધોઈને એકત્ર કરો. પેલેટ બનાવવા માટે 2000rpm પર 1min સુધી સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો. નમૂનાઓને હંમેશાં બરફ પર રાખો.
પછી, કૃમિઓને PBS વડે બે વાર ધુઓ.
ત્યારબાદ, કૃમિઓને બે વાર ધોવા માટે ddH₂Oનો ઉપયોગ કરો.
કૃમિઓને ઓછામાં ઓછા 500ul હોમોજેનાઇઝેશન બફર (HB)માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો. કૃમિના નમૂનાઓ હવે અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ માટે તૈયાર છે.
વધુ સારી ગુણવત્તાવાળા પ્રોટીન નિષ્કર્ષ માટે, તમે કૃમિઓને દરેકમાં 5min સુધી ધોવા માટે PBS અને જંતુરહિત, અતિશુદ્ધ પાણી (ddH₂O)નો ઉપયોગ કરીને બેક્ટેરિયલ દૂષણ ઘટાડવાનું વિચારી શકો છો અથવા સુક્રોઝ ફ્લોટેશન કરી શકો છો. કૃમિના નમૂનાઓને સતત બરફ પર રાખો.

C. elegansના અલ્ટ્રાસોનિક લાયસિસ માટેનો પ્રોટોકોલ

• ખાતરી કરો કે તમે અલ્ટ્રાસોનિકેટરને અગાઉથી તૈયાર કરો જેથી અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર ઉપયોગ માટે તૈયાર હોય (પ્રોબ લગાવેલો હોય અને સોનિકેશન પ્રોગ્રામ અગાઉથી સેટ કરેલો હોય). 

જો તમારું અલ્ટ્રાસોનિકેટર સ્ટૅન્ડ પર ગોઠવેલું હોય, તો નમૂનાની ટ્યુબો ધરાવતું બરફનું સ્નાન અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબની નીચે મૂકો અને અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબને 1.5ml ટ્યુબમાં દાખલ કરો.

• UP200St અથવા UP200Ht વડે C. elegansના લાઇસિસ માટે, માઇક્રોટિપનો ઉપયોગ કરીને (દા.ત., 2mm પ્રોબ S26d2; ડાબી બાજુનું ચિત્ર જુઓ) 40% કંપનવિસ્તાર પર 1sec માટે અલ્ટ્રાસોનિકેશન કરવું જોઈએ, અને વચ્ચે 30secના વિરામ રાખવા જોઈએ. દરેક 1 સેકન્ડના અને વચ્ચે 30secના વિરામ ધરાવતા 5 સોનિકેશન ચક્રો C. elegansના લાઇસિસ માટે આદર્શ છે. જો તમે પ્રથમ વખત લાઇસિસ કરતા હો, તો દરેક પલ્સ પછી નમૂનાના નાના અંશોમાં માઇક્રોસ્કોપ વડે લાઇસિસની પ્રગતિ તપાસી શકો છો.
• કૃમિઓ વિઘટિત થાય ત્યારે લાઇસિસ સફળતાપૂર્વક પૂર્ણ થાય છે. અતિશય સોનિકેશનથી કોષકેન્દ્રો તૂટી જાય છે, અને નમૂનો શ્યાન બને અથવા તેમાં ફીણ થાય ત્યારે આ અસર દેખાય છે. નમૂનાનું વિઘટન અટકાવવા માટે, જરૂર પડે તો વધુ પલ્સનો ઉપયોગ કરો. ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા પ્રોટીન અર્ક મેળવવા માટે દરેક અલ્ટ્રાસોનિક પલ્સ ચક્રનો સમય વધારશો નહીં.
• અલ્ટ્રાસોનિક રીતે લાઇસિસ કરેલા કૃમિઓને 4ºC પર 14,000rpmની ઝડપે 10min માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરીને કોષ લાઇસેટને સ્પષ્ટ કરો.
• ત્યારબાદ, ઉપરના પ્રવાહીને નવી ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરો અને ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન અથવા અન્ય પરીક્ષણો માટે તૈયાર કરો.

સમરસીકરણ બફર માટે નોંધ: ઉપરના અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ પ્રોટોકોલ માટે સમરસીકરણ બફર નીચે મુજબ તૈયાર કરો:

UIP400MTP પ્લેટ સોનિકેટરનો ઉપયોગ કરીને 96-વેલ પ્લેટોમાં C. elegansનું ઉચ્ચ નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતાવાળું લાઇસિસ

C. elegansનું લાઇસિસ (પુખ્ત નેમાટોડ)
UIP400MTP 80% કંપનવિસ્તાર, 20 ચક્રો (દરેક સોનિકેશન ચક્ર: 30 sec ચાલુ, 30 sec બંધ)
લાઇસિસ બફર:

• વિકલ્પ 1) 4% SDS, 0.1 M Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA
• વિકલ્પ 2) સહ-ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન (co-IP) માટે: 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 % NP-40 (સંપૂર્ણ પ્રોટીનેઝ અવરોધક મિશ્રણ)

ઉચ્ચ નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતાવાળું DNA ખંડન
C. elegans (પુખ્ત નેમાટોડ) DNA 200–300bp: UIP400MTP પ્લેટ સોનિકેટર – 80% કંપનવિસ્તાર સેટ કરો, 30 પલ્સ – દરેકમાં 30sec ચાલુ, 30sec બંધ

ઉચ્ચ નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતાવાળી નમૂના તૈયારી માટેનું UIP400MTP પ્લેટ સોનિકેટર મલ્ટિ-વેલ, માઇક્રોટાઇટર પ્લેટો અને 96-વેલ પ્લેટોમાં નમૂનાઓનું સમાનરૂપે સોનિકેશન કરે છે

માત્રાત્મક અફિનિટી શુદ્ધીકરણ પરીક્ષણો માટે C. elegansનું અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ

યુવાન ગર્ભવતી ઉભયલિંગી કૃમિઓનું બ્લીચિંગ કરીને C. elegansના ભ્રૂણો (દરેક પુનરાવર્તન દીઠ ∼2 મિલિયન) ત્રણ જૈવિક પુનરાવર્તનોમાં તાજા એકત્ર કરવામાં આવ્યા અને બરફ પર (ચક્ર: 0.5 s, કંપનવિસ્તાર: 40–45%, 5 પલ્સ/સત્ર, 5 સત્રો, સત્રો વચ્ચેનો વિરામ: 30 s; UP200S અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર સાથેની માઇક્રો-ટિપ S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) વડે લાઇસિસ બફરમાં (કુલ ઘનફળ: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% ગ્લિસરોલ, પ્રોટીએઝ અવરોધક મિશ્રણ, 0.1% Nonidet P-40 Substitute) સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું. સોનિકેશન પછી, Nonidet P-40 Substitute 1% સુધી ઉમેરવામાં આવ્યું અને લાઇસેટને 4°C પર 30 min માટે છેડેથી છેડે ફેરવતા રહીને ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા, ત્યારબાદ 4°C પર 20,000 × g પર 20 min માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવ્યા. ત્યારબાદ ઉપરના લિપિડ સ્તરને ખલેલ પહોંચાડ્યા વિના સ્પષ્ટ કરેલા લાઇસેટને ચૂસીને લેવામાં આવ્યું અને અડધા ભાગોમાં વહેંચીને એન્ટિ-GFP એગરોઝ બીડ્સ અથવા બ્લૉક કરેલા નિયંત્રણ બીડ્સ (40–50 μl)માં ઉમેરવામાં આવ્યું. 4°C પર 60–90 min માટે છેડેથી છેડે ફેરવ્યા પછી, બીડ્સને 0.1% Nonidet P-40 Substitute ધરાવતા લાઇસિસ બફરથી એક વખત ધોવામાં આવ્યા, ત્યારબાદ બફર I (25 mm Tris-HCl, pH 7.4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) અથવા બફર II (1 mm Tris-HCl, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) અથવા બંનેમાં બે વખત ધોવામાં આવ્યા. GFP:MBK-2 પુલ-ડાઉન માટે, ધોવાની જુદી જુદી પરિસ્થિતિઓનો ઉપયોગ કરીને બે અલગ પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા. ઓરડાના તાપમાને 6 m યુરિયા/2 M થાયોયુરિયાના 50 μlમાં કક્ષીય હલન દ્વારા પ્રોટીનનું ઇલ્યુશન કરવામાં આવ્યું. MBK-1::GFP પુલ-ડાઉન પ્રયોગો માટે, 90°C પર 8 m ગ્વાનિડિનિયમ ક્લોરાઇડના 50μlમાં હલાવીને પ્રોટીનનું બે વખત ઇલ્યુશન કરવામાં આવ્યું, ત્યારબાદ ઇથેનોલ અવક્ષેપન કરવામાં આવ્યું. ત્યારબાદ ઇલ્યુશન દ્વારા મેળવેલા પ્રોટીન નમૂનાઓનું દ્રાવણમાં પાચન કરવામાં આવ્યું.
(જુઓ Chen et al., 2016)

કૃમિઓનું અલ્ટ્રાસોનિક સમાનાંગીકરણ અને લાઇસિસ

C.elegans ના લાઇસિસ અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણની પ્રક્રિયા માટે, દરેક નમૂના દીઠ સંબંધિત તબક્કાના 30,000 નેમાટોડ એકત્રિત કરવામાં આવ્યા અને બરફ જેવા ઠંડા S-basal વડે ધોવામાં આવ્યા, 1500 rpm પર 2 min. માટે સેન્ટ્રિફ્યુગેશન કરીને સાંદ્રિત કરવામાં આવ્યા, અવશેષ બેક્ટેરિયા દૂર કરવા માટે બરફ જેવા ઠંડા S-basal વડે છ વખત ધોવામાં આવ્યા અને પછી ઉપયોગ માટે તૈયાર થાય ત્યાં સુધી બરફ પર રાખવામાં આવ્યા. પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ માટે, છેલ્લી S-basal ધોવણ પછી ઇંડાં ધરાવતા પુખ્ત કૃમિઓને સઘન પેલેટ બનાવવા દેવામાં આવ્યા. ત્યારબાદ કૃમિઓના પેલેટને બરફ જેવા ઠંડા નિષ્કર્ષણ બફર [20 mM પોટેશિયમ ફોસ્ફેટ, pH 7.4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, પ્રોટીએઝ અવરોધકો (Sigma P2714)] ના 1 ml માં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવ્યા અને તરત જ પ્રક્રિયા કરવામાં આવી.
∼30,000 ઇંડાં ધરાવતા પુખ્ત કૃમિઓ (∼100 mg ભીના વજનને અનુરૂપ) ને બરફ જેવા ઠંડા નિષ્કર્ષણ બફરના 1 ml માં, પ્રોબ પ્રકારના અલ્ટ્રાસોનિકેટર (દા.ત. માઇક્રોટિપ MS2 સાથેનું UP50H) નો ઉપયોગ કરીને બરફ પર 40% કંપનવિસ્તારે, 3 sec ચાલુ અને 30 sec બંધના 10 ચક્રો માટે સોનિકેટ કરવામાં આવ્યા. (cf. Baskharan et al. 2012)

C. elegans માંથી અલ્ટ્રાસોનિક લિપિડ નિષ્કર્ષણ

મેટાબોલોમિક્સની એક શાખા લિપિડોમિક્સમાં, જૈવિક પ્રણાલીઓના સમગ્ર લિપિડ સમૂહનું લક્ષણનિર્ધારણ અને વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. ચયાપચયી લિપિડોની પરસ્પરક્રિયા અને આરોગ્ય તથા આયુષ્ય પર તેમની અસરોની તપાસ કરવા માટે લિપિડોમિક્સમાં C. elegans નો વ્યાપક ઉપયોગ થાય છે.
C. elegans ના ભ્રૂણો, લાર્વા અને પુખ્ત કૃમિઓમાંથી સ્ફિંગોલિપિડ જેવા લિપિડ મુક્ત કરવા માટે અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ અને નિષ્કર્ષણનો ઉપયોગ થાય છે. કૃમિઓના સમાનાંગી મિશ્રણો તૈયાર કરવા અને ત્યારબાદ નમૂનામાંથી લિપિડનું નિષ્કર્ષણ કરવા માટે અલ્ટ્રાસોનિકેશનનો ઉપયોગ થાય છે.
C. elegans માંથી અલ્ટ્રાસોનિક લિપિડ નિષ્કર્ષણ માટેનો પ્રોટોકોલ
C. elegans ના પેલેટને બરફ પર પીગળવા દો અને 0.5 ml ultrawater વડે ફરીથી નિલંબિત કરો. નમૂનાઓને સતત બરફ પર રાખીને, C. elegans ના નમૂનાઓને 1.5mL ટેસ્ટ ટ્યુબોમાં સોનિકેટ કરો.
સોનિકેશન માટે પ્રોબ પ્રકારનું અલ્ટ્રાસોનિકેટર જેમ કે UP200Ht, અલ્ટ્રાસોનિક નમૂના તૈયારી એકમ VialTweeter (10 નમૂનાઓનું એકસાથે સોનિકેશન) અથવા UIP400MTP (96-વેલ પ્લેટો જેવી મલ્ટિ-વેલ પ્લેટોના સોનિકેશન માટે) વાપરી શકાય છે. UP200Ht વડે અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ માટે માઇક્રોટિપ S26d2 નો ઉપયોગ કરો. ડિજિટલ મેનુમાં અલ્ટ્રાસોનિક ચક્ર મોડ અગાઉથી સેટ કરો. કંપનવિસ્તાર 10% પર સેટ કરો અને સોનિકેશન ચક્ર મોડમાં 2 sec ના પલ્સના 20 ચક્રો સેટ કરો, જેમાં દરેક અલ્ટ્રાસોનિક પલ્સ સમૂહ વચ્ચે 30 sec. નો વિરામ હોય.
સુપરનેટન્ટ પ્રવાહીઓને સ્ક્રૂ ઢાંકણવાળી કાચની ટ્યુબોમાં સ્થાનાંતરિત કરો. દરેક કાચની ટ્યુબમાં 1 ml ultrawater ઉમેર્યા પછી ક્લોરોફોર્મ/મિથેનોલ (ગુણોત્તર = 2:1) મિશ્રણના 6 ml ઉમેરીને Folch નિષ્કર્ષણ કરો.
દરેક કાચની ટ્યુબને 30 sec માટે 4 વખત વોર્ટેક્સ કરો. પ્રાવસ્થા વિભાજનને વધુ સુધારવા માટે ટ્યુબોને 1,258 x g પર 15 min માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરો (Eppendorf, 5810 R). કાચની પાશ્ચર પિપેટ વડે નીચલા જલવિરાગી અંશને સ્વચ્છ કાચની ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરો. નાઇટ્રોજન બાષ્પીકારકમાં નાઇટ્રોજનના પ્રવાહ હેઠળ નીચલા જલવિરાગી અંશને સૂકવો. સૂકવેલા પેલેટને ઉપયોગ સુધી -80 °C ફ્રીઝરમાં સંગ્રહિત કરો. 


કૃમિઓના લાઇસેટની અલ્ટ્રાસોનિક તૈયારી

કૃમિ લાઇસેટ: L4 તબક્કાના કૃમિઓ એકત્રિત કરવામાં આવ્યા અને તેમને ત્રણ વખત M9 બફર (42.26 mM Na₂HPO₄, 22.04 mM KH₂PO₄, 85.56 mM NaCl અને 0.87 mM MgSO₄) વડે બધા બેક્ટેરિયા દૂર કરવા માટે ધોવામાં આવ્યા હતા. શક્ય તેટલું M9 બફર દૂર કર્યા પછી, કૃમિઓને લાઇસિસ બફરમાં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવ્યા હતા: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM ફોસ્ફેટ β-ગ્લિસરોલ, 0.1% (v/v) Triton X-100, 50 mM સોડિયમ ફ્લોરાઇડ, 1 mM સોડિયમ ઓર્થોવેનેડેટ, 5 mM સોડિયમ પાયરોફોસ્ફેટ, 0.2 mM ફેનાઇલમિથેનસલ્ફોનાઇલફ્લોરાઇડ અને પ્રોટીએઝ અવરોધક. કૃમિઓને પ્રવાહી નાઇટ્રોજનમાં જમાવીને 37°C પર પીગળાવવાની પ્રક્રિયા ત્રણ વખત કરવામાં આવી હતી, ત્યારબાદ 10 નમૂના ટ્યુબની એકસાથે તૈયારી માટેના અલ્ટ્રાસોનિક VialTweeter એકમ વડે કૃમિઓને સૂકા બરફ પર સોનિકેટ કરવામાં આવ્યા હતા. સોનિકેશન 50% કંપવિસ્તાર પર 2 sec.નાં 10 ચક્રમાં કરવામાં આવ્યું હતું, જેમાં સોનિકેશનના આવેગો વચ્ચે 30 secનો વિરામ રાખવામાં આવ્યો હતો. ત્યારબાદ, નમૂનાઓને 12,000 rpm પર 4°C તાપમાને 15 min માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા. ઉપરનું પ્રવાહી એકત્રિત કરીને -70°C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું. બ્રેડફોર્ડ પરીક્ષણ વડે પ્રોટીનનું માત્રાત્મક નિર્ધારણ કરવા માટે એક અંશનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
કુલ ગ્લુટાથાયોન, GSH અને GSSGનું નિર્ધારણ: ગ્લુટાથાયોનના માત્રાત્મક નિર્ધારણ માટે, લાઇસેટ તૈયાર કરવાનું અને નિર્ધારણ કરવાનું કામ એક જ દિવસે કરવામાં આવ્યું હતું. ગ્લુકોઝ ખવડાવેલા અને નિયંત્રણ સમૂહના L4 લાર્વાને એકત્રિત કરીને M9 બફર વડે ત્રણ વખત ધોવામાં આવ્યા હતા. શક્ય તેટલું M9 બફર દૂર કર્યા પછી, કૃમિઓને બરફ જેવા ઠંડા મેટાફોસ્ફોરિક એસિડ (5% w/v)માં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ અલ્ટ્રાસોનિક VialTweeter વડે 50% કંપવિસ્તાર પર 2 sec.નાં દસ સોનિકેશન ચક્રમાં બરફમાં સોનિકેટ કરવામાં આવ્યા હતા, જેમાં દરેક ચક્ર વચ્ચે 30 sec.નો વિરામ રાખવામાં આવ્યો હતો. ત્યારબાદ, 12,000 rpm પર 4 ̊C તાપમાને 15 min માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન અને વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ પહેલાં C. elegansના નમૂનાઓની તૈયારી

સંક્ષેપમાં, ભ્રૂણીય અર્ક માટે, C. elegansના L1 લાર્વાને મોટા પાયે પ્રવાહી S-મીડિયમ કલ્ચરમાં પુખ્ત અવસ્થા સુધી ઉછેરવામાં આવ્યા હતા. પ્રમાણભૂત બ્લીચ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને ભ્રૂણ એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને લાઇસિસ બફર (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8.7% ગ્લિસરોલ, 0.05% NP-40, 1􏰅 પ્રોટીએઝ અવરોધક કોકટેલ અને 1􏰅 ફોસ્ફેટેઝ અવરોધક કોકટેલ I અને II)માં નિલંબિત કરવામાં આવ્યા હતા, પ્રવાહી નાઇટ્રોજનમાં ઝડપથી જમાવવામાં આવ્યા હતા અને માઇક્રોટિપ ધરાવતા અલ્ટ્રાસોનિકેટર (ઉદાહરણ તરીકે UP200Ht સાથે S26d2 માઇક્રોટિપ) વડે 30% કંપવિસ્તાર પર 10 s દરમિયાન 10 પલ્સ આપીને અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટન દ્વારા તેમનું લાઇસિસ કરવામાં આવ્યું હતું. જો વધુ સંખ્યામાં નમૂનાઓ તૈયાર કરવાના હોય, તો અલ્ટ્રાસોનિક VialTweeter અથવા વેલ-પ્લેટો માટેના MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP ની ભલામણ કરવામાં આવે છે. સોનિકેશન પછી, અર્કને 4°C પર 30,000g પર 20 min માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરીને પ્રાથમિક રીતે સ્પષ્ટ કરવામાં આવ્યા હતા. પ્રાથમિક રીતે સ્પષ્ટ કરેલા અર્કને (કુલ પ્રોટીનના 300µg) પ્રોટીન A-એગરોઝ સાથે ક્રોસ-લિંક કરેલા અફિનિટી દ્વારા શુદ્ધ કરાયેલા anti-CDC-25.1 પ્રતિદ્રવ્યના (આ અભ્યાસ) 40µ􏰂g સાથે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યો હતો, અથવા નિયંત્રણ તરીકે, પ્રોટીન A-એગરોઝ સાથે ક્રોસ-લિંક કરેલા સસલાના ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન (Ig)Gની સમાન માત્રાનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. આ પ્રક્રિયા 1% NP-40 ધરાવતા લાઇસિસ બફરના કુલ 200µl આયતનમાં કરવામાં આવી હતી; તેના સમાવેશથી મેટ્રિક્સ સાથે પ્રોટીનનું બિનવિશિષ્ટ બંધન ઘટ્યું હતું. નમૂનાઓને 4°C પર 1 h સુધી ફેરવવામાં આવ્યા હતા, બીડ્સને લાઇસિસ બફર વડે ત્રણ વખત ધોવામાં આવ્યા હતા અને ગ્લાયસિન/HClના 30µl તથા 200 mM NaCl, pH 2.2 વડે ઇલ્યુશન કરવામાં આવ્યું હતું. ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન પછી, ઇલ્યુએટને SDS નમૂના બફરના 30µ􏰂lમાં મંદ કરવામાં આવ્યા હતા, 95°C સુધી ગરમ કરીને 4 min રાખવામાં આવ્યા હતા અને સામાન્ય રીતે ઇનપુટ માટે કુલના 3% અને ઇલ્યુએટ માટે 30% SDS-PAGE પર લાગુ કરવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) અથવા anti-􏰁β-actin (1:2000) પ્રતિદ્રવ્યો વડે વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ કરવામાં આવ્યું હતું. જ્યાં અર્કનું ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન કરવામાં આવ્યું ન હતું, ત્યાં તે અર્કમાંથી મેળવેલા કુલ પ્રોટીનની સમાન માત્રાને SDS નમૂના બફરમાં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવી હતી, 95°C સુધી ગરમ કરવામાં આવી હતી અને પછી સીધી SDS-PAGE પર લાગુ કરીને વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ દ્વારા તેનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. (cf. Segref et al. 2020)

ચોક્કસ તાપમાન નિયંત્રણ હેઠળ અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ

જૈવિક નમૂનાઓ સંભાળતી વખતે સચોટ અને વિશ્વસનીય તાપમાન નિયંત્રણ નિર્ણાયક હોય છે. ઊંચા તાપમાને નમૂનાઓમાં ઉષ્માપ્રેરિત પ્રોટીન વિઘટન શરૂ થાય છે.
નમૂના તૈયાર કરવાની તમામ યાંત્રિક તકનીકોની જેમ, સોનિકેશન પણ ગરમી ઉત્પન્ન કરે છે. જોકે, VialTweeter નો ઉપયોગ કરતી વખતે નમૂનાઓનું તાપમાન સારી રીતે નિયંત્રિત કરી શકાય છે. વિશ્લેષણ માટે VialTweeter અને VialPress વડે તમારા નમૂનાઓ તૈયાર કરતી વખતે તેમનું તાપમાન નિરીક્ષવા અને નિયંત્રિત કરવા માટે અમે તમને વિવિધ વિકલ્પો રજૂ કરીએ છીએ.

1. નમૂનાના તાપમાનનું નિરીક્ષણ: VialTweeter ને ચલાવતું અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર UP200St બુદ્ધિશાળી સોફ્ટવેર અને જોડાણ કરી શકાય તેવા તાપમાન સેન્સરથી સજ્જ છે. તાપમાન સેન્સરને UP200St સાથે જોડો અને તાપમાન સેન્સરની ટોચને નમૂનાની કોઈ એક ટ્યુબમાં દાખલ કરો. ડિજિટલ રંગીન ટચ-ડિસ્પ્લે દ્વારા તમે UP200St ના મેનુમાં તમારા નમૂનાના સોનિકેશન માટે ચોક્કસ તાપમાન શ્રેણી સેટ કરી શકો છો. મહત્તમ તાપમાને પહોંચતાં અલ્ટ્રાસોનિકેટર આપમેળે બંધ થઈ જશે અને નમૂનાનું તાપમાન સેટ કરેલા તાપમાન ∆ ના નીચલા મૂલ્ય સુધી ઘટે ત્યાં સુધી વિરામ લેશે. ત્યારબાદ સોનિકેશન આપમેળે ફરી શરૂ થશે. આ બુદ્ધિશાળી સુવિધા ઉષ્માપ્રેરિત વિઘટનને અટકાવે છે.
2. VialTweeter બ્લોકને અગાઉથી ઠંડો કરી શકાય છે. ટાઇટેનિયમ બ્લોકને અગાઉથી ઠંડો કરવા માટે VialTweeter બ્લોકને (ટ્રાન્સડ્યુસર વિના માત્ર સોનોટ્રોડને!) ફ્રિજ અથવા ફ્રીઝરમાં મૂકો; આમ કરવાથી નમૂનામાં તાપમાનનો વધારો વિલંબિત કરવામાં મદદ મળે છે. શક્ય હોય તો નમૂનાને પણ અગાઉથી ઠંડો કરી શકાય છે.
3. સોનિકેશન દરમિયાન ઠંડક માટે સૂકા બરફનો ઉપયોગ કરો. સૂકા બરફથી ભરેલી છીછરી ટ્રેનો ઉપયોગ કરો અને VialTweeter ને સૂકા બરફ પર મૂકો, જેથી ગરમી ઝડપથી વિખેરાઈ શકે.

તમારા લાયસિસના ઉપયોગ માટે શ્રેષ્ઠ અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટક શોધો

Hielscher Ultrasonics પ્રયોગશાળાઓ, બેન્ચ-ટોપ અને ઔદ્યોગિક સ્તરની પ્રણાલીઓ માટે ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટકો અને હોમોજેનાઇઝર્સનું ઉત્પાદન કરવામાં લાંબા સમયનો અનુભવ ધરાવે છે. તમારા બેક્ટેરિયલ કોષ સંવર્ધનનું કદ, તમારું સંશોધન અથવા ઉત્પાદન લક્ષ્ય અને પ્રતિ કલાક અથવા પ્રતિ દિવસ પ્રક્રિયા કરવાના કોષોનું આયતન એ તમારા ઉપયોગ માટે યોગ્ય અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટક શોધવા માટેનાં આવશ્યક પરિબળો છે.
Hielscher Ultrasonics એકસાથે બહુવિધ નમૂનાઓના (10 વાયલ સુધી) તેમજ મોટી સંખ્યામાં નમૂનાઓના (એટલે કે, માઇક્રોટાઇટર પ્લેટો / 96-કૂવાવાળી પ્લેટો) સોનિકેશન માટે વિવિધ ઉકેલો પ્રદાન કરે છે. આમાં 50 થી 400 watts સુધીનાં વિવિધ પાવર સ્તરો ધરાવતા પરંપરાગત પ્રોબ-પ્રકારના પ્રયોગશાળાના અલ્ટ્રાસોનિકેટરથી માંડીને મોટા પાયે ઉત્પાદનમાં વ્યાવસાયિક કોષ વિઘટન અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ માટે પ્રતિ એકમ 16,000watts સુધીના સંપૂર્ણ ઔદ્યોગિક અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસરોનો સમાવેશ થાય છે. તમામ Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટરો સંપૂર્ણ ભાર હેઠળ 24/7/365 કાર્ય કરવા માટે બનાવવામાં આવે છે. મજબૂતાઈ અને વિશ્વસનીયતા એ અમારા અલ્ટ્રાસોનિક ઉપકરણોની મુખ્ય વિશેષતાઓ છે.
તમામ ડિજિટલ અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર્સ બુદ્ધિશાળી સોફ્ટવેર, રંગીન ટચ ડિસ્પ્લે અને આપમેળે ડેટા નોંધવાની સુવિધાથી સજ્જ છે, જે અલ્ટ્રાસોનિક ઉપકરણને પ્રયોગશાળા અને ઉત્પાદન સુવિધાઓમાં કામ કરવા માટેનું અનુકૂળ સાધન બનાવે છે.
તમારા જૈવિક નમૂનાઓમાં કયા પ્રકારના કોષો પર, કેટલા આયતનમાં, કેટલી વાર અને કયા લક્ષ્ય સાથે પ્રક્રિયા કરવાની છે તે અમને જણાવો. અમે તમારી પ્રક્રિયાની જરૂરિયાતો માટે સૌથી યોગ્ય અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટકની ભલામણ કરીશું.

નીચેનું કોષ્ટક તમને નાના, હાથમાં પકડી શકાય તેવા હોમોજેનાઇઝર્સ અને બહુ-નમૂના અલ્ટ્રાસોનિકેટરોથી માંડીને વ્યાવસાયિક ઉપયોગો માટેના ઔદ્યોગિક અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસરો સુધીની અમારી અલ્ટ્રાસોનિક પ્રણાલીઓની અંદાજિત પ્રક્રિયા ક્ષમતાનો ખ્યાલ આપે છે: