સી. એલિગન્સ નમૂનાઓની અલ્ટ્રાસોનિક તૈયારી

સી. એલિગન્સ, નેમાટોડ કૃમિ, બાયોલોજીમાં વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાતું મોડેલ સજીવ છે. વિશ્લેષણ પહેલાં નમૂનાની તૈયારી માટે લિસિસ, પ્રોટીન અને લિપિડ નિષ્કર્ષણ તેમજ આરએનએ ફ્રેગમેન્ટેશનની જરૂર છે, જે સોનિકેશન દ્વારા વિશ્વસનીય રીતે કરી શકાય છે. અલ્ટ્રાસોનિક સેલ ડિસપ્ટર્સ એ C. એલિગન્સ નમૂનાઓની ઝડપી તૈયારી માટે વિશ્વસનીય, અત્યાધુનિક અને ઉપયોગમાં સરળ ઉપકરણો છે.

સી. એલિગન્સ નમૂનાઓની અલ્ટ્રાસોનિક તૈયારી

સી. એલિગન્સ રાઉન્ડવોર્મ્સ છે, જેનો વ્યાપકપણે જીનોમિક્સ, વિકાસલક્ષી જીવવિજ્ઞાન અને રોગોની તપાસ માટે સંશોધન પ્રયોગશાળાઓમાં ઉપયોગ થાય છે. સી. એલિગન્સના જીનોમમાં ઘણા જનીનો માનવોમાં કાર્યાત્મક સમકક્ષો ધરાવે છે. આમ, નેમાટોડ કૃમિ માનવ રોગો માટે અત્યંત ઉપયોગી મોડેલ છે. સી. એલિગન્સના બહોળા ઉપયોગ માટેના અન્ય ફાયદાઓ બેક્ટેરિયા (દા.ત., ઇ. કોલી) ધરાવતી પ્લેટો પર તેની સરળ અને સસ્તી ખેતી, તેની પારદર્શિતા, અનુકૂળ હેન્ડલિંગ, તેમજ લાંબા સમય સુધી કીડાને સ્થિર અને સંગ્રહિત કરવાની શક્યતા છે.
પ્રોટીન અને લિપિડ પૃથ્થકરણ એ પ્રયોગશાળાઓમાં નિયમિત પ્રક્રિયાઓ છે અને અલ્ટ્રાસોનિક નમૂનાની તૈયારી એ દરેક વિકાસના તબક્કામાં (એટલે કે એમ્બ્રોયો, લાર્વા L1-L4, પુખ્ત વયના લોકો) સી. એલિગન્સ નેમાટોડ્સને લિઝ કરવાની સ્થાપિત પદ્ધતિ છે. સી. એલિગન્સનો ઉપયોગ લક્ષિત પ્રોટીનને વધુ પડતો વ્યક્ત કરવા માટે પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ પ્રણાલી તરીકે પણ થતો હોવાથી, એક વિશ્વસનીય, પુનઃઉત્પાદનક્ષમ લિસિસ અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ પદ્ધતિ, જે ઉચ્ચ પ્રોટીન ઉપજ આપે છે, જરૂરી છે. અલ્ટ્રાસોનિક સેલ વિક્ષેપ અને નિષ્કર્ષણ સિસ્ટમ્સ પ્રોબ-ટાઇપ હોમોજેનાઇઝર્સ અને મલ્ટિ-સેમ્પલ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ તરીકે ઉપલબ્ધ છે. અનુકૂળ નમૂનાની તૈયારી અને તમામ પ્રકારના સેમ્પલ સાઈઝ નંબરોને પૂરા પાડવા, Hielscher Ultrasonics પાસે તમારી લેબ પ્રક્રિયા માટે આદર્શ અલ્ટ્રાસોનિક સેલ ડિસપ્ટર છે.

C. Elegans વિક્ષેપ અને Lysis માટે અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોટોકોલ્સ

સી. એલિગન્સનું અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજનાઇઝેશન અને લિસિસ અને ત્યારપછીના પ્રોટીન અને લિપિડ એક્સટ્રક્શન અલગ-અલગ હોમોજેનાઇઝેશન અને લિસિસ બફર્સ વગેરેનો ઉપયોગ કરીને વિવિધ પ્રક્રિયાઓનો ઉપયોગ કરીને કરી શકાય છે. બધા લિસિસ પ્રોટોકોલ્સમાં સમાનતા છે કે પ્રોટીન ડિગ્રેડેશનને રોકવા માટે સેમ્પલને સતત બરફ પર રાખવા જોઈએ. નીચે, અમે તમને ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા પ્રોટીન- અથવા લિપિડ ધરાવતા C. એલિગન્સ નમૂનાઓ તૈયાર કરવા માટે કેટલાક વિશ્વસનીય અને ઝડપી અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ અને નિષ્કર્ષણ પ્રોટોકોલ રજૂ કરીએ છીએ.

અલ્ટ્રાસોનિક સી. એલિગન્સ લિસિસના ફાયદા

• વિશ્વસનીય
• પ્રજનનક્ષમ
• ચોક્કસ તાપમાન-નિયંત્રિત
• વિશ્વસનીય પ્રક્રિયા નિયંત્રણ
• નમ્ર પદ્ધતિ
• લાગુ કરવા માટે સરળ
• સલામત

C. elegans નમૂનાઓમાંથી અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ

સી. એલિગન્સ વોર્મ્સનું અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ અને પ્રોટીન એક્સ્ટ્રક્શન વિવિધ પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરીને કરી શકાય છે. નીચે અમે તમને પ્રજનનક્ષમ પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ પરિણામો માટે કેટલાક વિશ્વસનીય અને ઝડપી લિસિસ પ્રોટોકોલ રજૂ કરીએ છીએ.

સોનિકેશન દ્વારા સી. એલિગન્સ વોર્મ્સમાંથી સાયટોસોલિક અર્કની ઝડપી તૈયારી

નીચેના પ્રોટોકોલ સાથે તમે 30 મિનિટથી ઓછા સમયમાં C. elegans lysates તૈયાર કરી શકો છો.
સી. એલિગન્સનો સંગ્રહ
1.5ml ટ્યુબ ફોસ્ફેટ બફર સલાઈન (PBS) માં જોઈતા C. એલિગન્સ વોર્મ્સને ચૂંટો અથવા 1.5ml PBS સાથે પ્લેટમાંથી ધોઈ લો. પેલેટ માટે 2000rpm પર 1min માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો. નમૂનાઓને હંમેશા બરફ પર રાખો.
પછી, પીબીએસ સાથે વોર્મ્સને બે વાર ધોવા.
તે પછી, કૃમિને ddH વડે બે વાર ધોઈ લો₂ઓ.
ઓછામાં ઓછા 500ul હોમોજેનાઇઝેશન બફર (HB) માં વોર્મ્સને ફરીથી ચાલુ કરો. કૃમિના નમૂના હવે અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ માટે તૈયાર છે.
ઉચ્ચ પ્રોટીન અર્ક ગુણવત્તા માટે, તમે પીબીએસ અને જંતુરહિત, અતિ શુદ્ધ પાણી (ddH₂ઓ) અથવા સુક્રોઝ ફ્લોટેશન કરો. કૃમિના નમૂનાઓને સતત બરફ પર રાખો.

અલ્ટ્રાસોનિક સી. એલિગન્સ લિસિસ પ્રોટોકોલ

• ખાતરી કરો કે તમે અલ્ટ્રાસોનિકેટરને અગાઉથી તૈયાર કરો જેથી અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર ઉપયોગ માટે તૈયાર હોય (પ્રોબ માઉન્ટ થયેલ, સોનિકેશન પ્રોગ્રામ પ્રી-સેટ).

જો તમારું અલ્ટ્રાસોનિકેટર સ્ટેન્ડ-માઉન્ટ થયેલ હોય, તો તમારી સેમ્પલ ટ્યુબ સાથે આઇસ-બાથને અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબની નીચે મૂકો અને અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબને 1.5ml ટ્યુબમાં દાખલ કરો.

• UP200St અથવા UP200Ht સાથે C. એલિગન્સ લિસિસ માટે, અલ્ટ્રાસોનિકેશન માઇક્રોટીપ (દા.ત., 2mm પ્રોબ S26d2; ડાબી બાજુએ ચિત્ર જુઓ) 40% કંપનવિસ્તાર પર 1sec માટે 30sec થોભો સાથે કરવું જોઈએ. 30 સેકન્ડના વિરામ સાથે દરેક 1 સેકન્ડ માટે 5 સોનિકેશન ચક્ર C. એલિગન્સ લિસિસ માટે આદર્શ છે. જો તમે પ્રથમ વખત લિસિસ કરો છો, તો તમે માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને દરેક પલ્સ પછી નમૂનાના નાના અલિકોટ્સમાં લિસિસની પ્રગતિ તપાસી શકો છો.
• જ્યારે વોર્મ્સ વિક્ષેપિત થાય છે ત્યારે લિસિસ સફળતાપૂર્વક પૂર્ણ થાય છે. ઓવર-સોનિકેશન ન્યુક્લિયસના તૂટફૂટમાં પરિણમે છે અને જ્યારે નમૂનામાં ચીકણું અથવા ફીણ આવે છે ત્યારે તે દૃશ્યમાન બને છે. નમૂનાના બગાડને રોકવા માટે, જો જરૂરી હોય તો વધુ કઠોળનો ઉપયોગ કરો. ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા પ્રોટીન અર્ક મેળવવા માટે દરેક અલ્ટ્રાસોનિક પલ્સ ચક્રનો સમય વધારશો નહીં.
• અલ્ટ્રાસોનિકલી લાઇસ્ડ વોર્મ્સને 14,000rpm પર 4ºC પર 10 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજીંગ કરીને સેલ લિસેટ સાફ કરો.
• પછી, સુપરનેટન્ટને તાજી નળીમાં સ્થાનાંતરિત કરો અને રોગપ્રતિકારક શક્તિ અથવા અન્ય પરીક્ષણો માટે તૈયાર કરો.

હોમોજેનાઇઝેશન બફર માટે નોંધ: નીચે પ્રમાણે ઉપરના અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ પ્રોટોકોલ માટે હોમોજનાઇઝેશન બફર તૈયાર કરો:

UIP400MTP પ્લેટ સોનીકેટરનો ઉપયોગ કરીને 96-વેલ પ્લેટ્સમાં સી. એલિગન્સનું હાઇ-થ્રુપુટ લિસિસ

સી. એલિગન્સ લિસિસ (પુખ્ત નેમાટોડ્સ)
UIP400MTP 80% કંપનવિસ્તાર, 20 ચક્ર (દરેક સોનિકેશન ચક્ર: 30 સેકન્ડ ચાલુ, 30 સેકન્ડ બંધ)
લિસિસ બફર:

• વિકલ્પ 1) 4% SDS, 0.1 M Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA
• વિકલ્પ 2) કો-ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (કો-આઇપી) માટે: 10 એમએમ ટ્રિસ એચસીએલ (પીએચ 7.5), 150 એમએમ નાસીએલ, 0.5 એમએમ ઇડીટીએ, 0.5 % એનપી-40 (સંપૂર્ણ પ્રોટીનનેઝ અવરોધક કોકટેલ)

ઉચ્ચ-થ્રુપુટ ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટેશન
C. એલિગન્સ (પુખ્ત નેમાટોડ્સ) DNA 200-300bp: UIP400MTP પ્લેટ સોનિકેટર – 80% કંપનવિસ્તાર, 30 પલ્સ સેટ કરો – દરેક 30 સેકન્ડ ચાલુ, 30 સેકન્ડ બંધ

ઉચ્ચ-થ્રુપુટ નમૂનાની તૈયારી માટે UIP400MTP પ્લેટ સોનીકેટર મલ્ટિ-વેલ, માઇક્રોટાઇટર પ્લેટ્સ અને 96-વેલ પ્લેટ્સમાં સમાનરૂપે નમૂનાઓને સોનીકેટ કરે છે

ક્વોન્ટિટેટિવ એફિનિટી પ્યુરિફિકેશન એસેસ માટે સી. એલિગન્સનું અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ

સી. એલિગન્સ એમ્બ્રોયો (પ્રતિ પ્રતિકૃતિ ∼2 મિલિયન) યુવાન ગ્રેવિડ હર્મેફ્રોડાઇટ્સને બ્લીચ કરીને અને બરફ પર સોનિકેટ કરીને જૈવિક ત્રિપુટીમાં તાજી લણણી કરવામાં આવી હતી (ચક્ર: 0.5 સે, કંપનવિસ્તાર: 40-45%, 5 સ્ટ્રોક/સત્ર, 5 સત્રો વચ્ચે, 5 સત્રો વચ્ચે, : 30 સે; UP200S અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર લિસિસ બફરમાં માઇક્રો-ટીપ S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) સાથે (કુલ વોલ્યુમ: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 11mm DTT, 110% , પ્રોટીઝ અવરોધક મિશ્રણ, 0.1% નોનિડેટ પી-40 અવેજી). સોનિકેશન પછી, નોનિડેટ P-40 સબસ્ટિટ્યુટ 1% સુધી ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને લિસેટ્સને 30 મિનિટ માટે 4°C પર પૂંછડીના પરિભ્રમણ સાથે માથા પર ઉકાળવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ 4°C પર 20 મિનિટ માટે 20,000 × g પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન કરવામાં આવ્યું હતું. પછી ક્લીયર કરેલ લાયસેટને ઉપલા લિપિડ સ્તરને ખલેલ પહોંચાડ્યા વિના એસ્પિરેટ કરવામાં આવ્યું હતું અને એન્ટિ-GFP એગેરોઝ મણકા અથવા અવરોધિત નિયંત્રણ માળખા (40-50 μl) માં અડધાથી વિભાજિત કરવામાં આવ્યું હતું. 60-90 મિનિટ માટે 4°C પર પૂંછડીના માથા પર પરિભ્રમણ કર્યા પછી, 0.1% નોનિડેટ P-40 સબસ્ટિટ્યુટ ધરાવતા લિસિસ બફર વડે મણકાને એકવાર ધોવામાં આવ્યા હતા, ત્યારપછી બફર I (25 mm Tris-HCl, pH) માં બે વખત ધોવામાં આવ્યા હતા. 7.4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) અથવા બફર II (1 mm Tris-HCl, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) અથવા બંને. GFP:MBK-2 પુલ-ડાઉન માટે, વિવિધ ધોવાની સ્થિતિનો ઉપયોગ કરીને બે અલગ-અલગ પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા હતા. ઓરડાના તાપમાને 50 μl 6 m યુરિયા/2 M થિયોરિયામાં ભ્રમણકક્ષાના ધ્રુજારી દ્વારા પ્રોટીનને દૂર કરવામાં આવ્યું હતું. MBK-1::GFP પુલ-ડાઉન પ્રયોગો માટે, પ્રોટીનને 50μl 8 m guanidinium ક્લોરાઇડમાં 90°C પર ધ્રુજારી દ્વારા બે વખત દૂર કરવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ ઇથેનોલ અવક્ષેપ દ્વારા. એલ્યુટેડ પ્રોટીનના નમૂનાઓ પછી દ્રાવણમાં પાચન કરવામાં આવ્યા હતા.
(cf. ચેન એટ અલ., 2016)

અલ્ટ્રાસોનિક વોર્મ હોમોજેનાઇઝેશન અને લિસિસ

C.elegans lysis અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ પ્રક્રિયા માટે, નમૂના દીઠ સંબંધિત તબક્કાના 30,000 નેમોટોડ્સ એકત્ર કરવામાં આવ્યા હતા અને બરફ-ઠંડા S-basal માં ધોવામાં આવ્યા હતા, 2 મિનિટ માટે 1500 rpm પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા કેન્દ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા, બરફ-ઠંડા S- સાથે છ વખત ધોવાયા હતા. શેષ બેક્ટેરિયાને દૂર કરવા માટે બેઝલ, અને પછી ઉપયોગ માટે તૈયાર ન થાય ત્યાં સુધી બરફ પર સંગ્રહિત કરો. પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ માટે, ગ્રેવિડ-પુખ્ત વોર્મ્સને છેલ્લા એસ-બેઝલ ધોવા પછી કોમ્પેક્ટ પેલેટ બનાવવાની મંજૂરી આપવામાં આવી હતી. કૃમિની ગોળીઓને પછી 1 મિલી બરફ-ઠંડા નિષ્કર્ષણ બફર [20 એમએમ પોટેશિયમ ફોસ્ફેટ, પીએચ 7.4, 2 એમએમ ઇડીટીએ, 1% ટ્રાઇટોન-એક્સ-100, પ્રોટીઝ ઇન્હિબિટર્સ (સિગ્મા P2714)] માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવી હતી અને તરત જ પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી.
∼30,000 ગ્રેવિડ-પુખ્ત વોર્મ્સ (∼100 મિલિગ્રામ વેટ વેઇટને અનુરૂપ), 3 સેકન્ડના 10 ચક્ર માટે 40% કંપનવિસ્તાર પર AA પ્રોબ-ટાઇપ અલ્ટ્રાસોનિકેટર (દા.ત. UP50H સાથે માઇક્રોટીપ MS2) નો ઉપયોગ કરીને બરફ પર સોનિક કરવામાં આવ્યા હતા, બરફ-ઠંડા નિષ્કર્ષણ બફરનું 1 મિલી. (cf. Baskharan et al. 2012)

C. elegans માંથી અલ્ટ્રાસોનિક લિપિડ નિષ્કર્ષણ

લિપિડોમિક્સમાં, મેટાબોલિક્સની શાખા, જૈવિક પ્રણાલીઓના લિપિડ પૂરકની લાક્ષણિકતા અને વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. મેટાબોલિક લિપિડ્સની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા અને આરોગ્ય અને જીવનકાળ પર તેમની અસરોની તપાસ કરવા માટે સી. એલિગન્સનો વ્યાપકપણે લિપિડોમિક્સમાં ઉપયોગ થાય છે.
અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ અને નિષ્કર્ષણનો ઉપયોગ સી. એલિગન્સ એમ્બ્રોયો, લાર્વા અને પુખ્ત વોર્મ્સમાંથી સ્ફિન્ગોલિપિડ્સ જેવા લિપિડ્સને મુક્ત કરવા માટે થાય છે. અલ્ટ્રાસોનિકેશનનો ઉપયોગ કૃમિ હોમોજેનેટ્સ તૈયાર કરવા અને ત્યારબાદ નમૂનામાંથી લિપિડ્સ કાઢવા માટે થાય છે.
સી. એલિગન્સમાંથી અલ્ટ્રાસોનિક લિપિડ એક્સટ્રેક્શન માટે પ્રોટોકોલ
સી. એલિગન્સ પેલેટને બરફ પર પીગળીને 0.5 મિલી અલ્ટ્રાવોટર વડે ફરી લો. સી. એલિગન્સના નમૂનાઓને 1,5mL ટેસ્ટ ટ્યુબમાં સોનિકેટ કરો, જ્યારે નમૂનાઓને સતત બરફ પર રાખો.
સોનિકેશન પ્રોબ-અલ્ટ્રાસોનિકસ્ટરનો ઉપયોગ કરીને કરી શકાય છે જેમ કે UP200Ht, અલ્ટ્રાસોનિક સેમ્પલ પ્રેપ યુનિટ VialTweeter (10 નમૂનાઓનું એક સાથે સોનિકેશન) અથવા UIP400MTP (મલ્ટી-વેલ પ્લેટ્સ જેમ કે 96-વેલ પ્લેટ્સના સોનિકેશન માટે). UP200Ht સાથે અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ માટે માઇક્રો-ટીપ S26d2 નો ઉપયોગ કરો. ડિજિટલ મેનૂમાં અલ્ટ્રાસોનિક સાયકલ મોડને પ્રી-સેટ કરો. કંપનવિસ્તાર 10% પર સેટ કરો અને 30 સેકન્ડના વિરામ સાથે 20 ચક્રના 2 સેકન્ડ પલ્સનો સોનિકેશન સાયકલ મોડ. દરેક અલ્ટ્રાસોનિક પલ્સેશન વિસ્ફોટ વચ્ચે.
સુપરનેટન્ટ્સને સ્ક્રુ કેપ સાથે કાચની નળીઓમાં સ્થાનાંતરિત કરો. દરેક ગ્લાસ ટ્યુબમાં 1 મિલી અલ્ટ્રાવોટર ઉમેરીને ફોલ્ચ એક્સટ્રક્શન કરો, ત્યારબાદ દરેક ગ્લાસ ટ્યુબમાં 6 મિલી ક્લોરોફોર્મ/મિથેનોલ (ગુણોત્તર = 2:1) મિશ્રણ ઉમેરીને કરો.
દરેક ગ્લાસ ટ્યુબને 4 વખત 30 સેકન્ડ માટે વમળ કરો. તબક્કાના વિભાજનને વધુ વધારવા માટે 15 મિનિટ (એપેનડોર્ફ, 5810 R) માટે 1,258 xg પર નળીઓને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો. ગ્લાસ પાશ્ચર પીપેટ દ્વારા નીચલા હાઇડ્રોફોબિક અપૂર્ણાંકને સ્વચ્છ કાચની નળીમાં સ્થાનાંતરિત કરો. નાઇટ્રોજન બાષ્પીભવકમાં નાઇટ્રોજન પ્રવાહ હેઠળ નીચલા હાઇડ્રોફોબિક અપૂર્ણાંકને સૂકવો. ઉપયોગ ન થાય ત્યાં સુધી સૂકા ગોળાને -80 °C ફ્રીઝરમાં સ્ટોર કરો.

વોર્મ લિસેટ્સની અલ્ટ્રાસોનિક તૈયારી

વોર્મ લાયસેટ: L4 સ્ટેજના વોર્મ્સની લણણી કરવામાં આવી હતી અને M9 બફર (42.26 mM Na) વડે ત્રણ વખત ધોવાઇ હતી₂HPO₄, 22.04 એમએમ કેએચ₂પો₄, 85.56 mM NaCl, અને 0.87 mM MgSO₄) બધા બેક્ટેરિયા દૂર કરવા માટે. M9 બફરને શક્ય તેટલું દૂર કર્યા પછી, lysis બફરમાં કૃમિ ફરી વળ્યાં: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM ફોસ્ફેટ β-glycerol, 0.1% (v/v) Triton X-10, X-10 50 એમએમ સોડિયમ ફ્લોરાઈડ, 1 એમએમ સોડિયમ ઓર્થોવેનાડેટ, 5 એમએમ સોડિયમ પાયરોફોસ્ફેટ, 0.2 એમએમ ફિનાઇલમેથેનેસલ્ફોનીલફ્લોરાઇડ અને પ્રોટીઝ અવરોધક. વોર્મ્સને પ્રવાહી નાઇટ્રોજનમાં સ્થિર કરવામાં આવ્યા હતા અને 37°C તાપમાને ત્રણ વખત ઓગળવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ 10 નમૂનાની નળીઓની એક સાથે તૈયારી માટે અલ્ટ્રાસોનિક વાયલટ્વીટર યુનિટ વડે વોર્મ્સને સૂકા બરફ પર સોનિક કરવામાં આવ્યા હતા. સોનિકેશન 2 સેકન્ડના 10 ચક્રમાં 50% કંપનવિસ્તાર પર હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું. sonication વિસ્ફોટો વચ્ચે 30 સેકન્ડ વિરામ સાથે. પછીથી, નમૂનાઓને 12000 rpm પર 15 મિનિટ માટે 4°C પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા. સુપરનેટન્ટ એકત્ર કરવામાં આવ્યું હતું અને -70 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું. બ્રેડફોર્ડ એસે દ્વારા પ્રોટીનની માત્રા નક્કી કરવા માટે અલીકોટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
કુલ ગ્લુટાથિઓન, જીએસએચ અને જીએસએસજીનું નિર્ધારણ: ગ્લુટાથિઓન જથ્થાબંધી માટે, લિસેટ્સ અને નિર્ધારણ તે જ દિવસે કરવામાં આવ્યા હતા. ગ્લુકોઝ-ફીડ અને નિયંત્રણ L4 લાર્વા લણણી કરવામાં આવી હતી અને M9 બફર સાથે ત્રણ વખત ધોવાઇ હતી. M9 બફરને શક્ય તેટલું દૂર કર્યા પછી, વોર્મ્સને બરફ-ઠંડા મેટાફોસ્ફોરિક એસિડ (5% w/v) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા, પછી 2 સેકન્ડના દસ સોનિકેશન ચક્રમાં 50% કંપનવિસ્તારમાં અલ્ટ્રાસોનિક વાયલટ્વીટર સાથે વોર્મ્સને બરફમાં સોનિક કરવામાં આવ્યા હતા. 30 સેકન્ડ સાથે. દરેક ચક્ર વચ્ચે વિરામ. પછીથી, 15 મિનિટ માટે 12000 rpm પર 4 ̊C પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવે છે.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

સી. એલિગન્સ ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન અને વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ પહેલાં સેમ્પલ પ્રેપ

સંક્ષિપ્તમાં, ગર્ભના અર્ક માટે, C. એલિગન્સ L1 લાર્વા મોટા પાયે પ્રવાહી S-મધ્યમ સંસ્કૃતિઓમાં પુખ્તાવસ્થા સુધી ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. સ્ટાન્ડર્ડ બ્લીચ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને ભ્રૂણ એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને લિસિસ બફર (50 એમએમ ટ્રિસ, પીએચ 7.5, 100 એમએમ કેસીએલ, 1 એમએમ ઇડીટીએ, 1 એમએમ એમજીસીએલ2, 8.7% ગ્લિસરોલ, 0.05% એનપી-40, 1 ઇનહેકિટ, અને પ્રોટેઇલબિટ, 1 એમએમ) માં સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા. 1 ફોસ્ફેટેઝ ઇન્હિબિટર કોકટેલ I અને II), પ્રવાહી નાઇટ્રોજનમાં ઝડપથી થીજી જાય છે, અને અલ્ટ્રાસોનિક સેલ વિક્ષેપ દ્વારા માઇક્રોટીપ જેવા અલ્ટ્રાસોનિકેટરનો ઉપયોગ કરીને લિઝ્ડ થાય છે. UP200Ht 30% કંપનવિસ્તારમાં 10 સેકન્ડથી વધુ 10 કઠોળ માટે S26d2 સાથે. જો મોટી સંખ્યામાં નમૂનાઓ અલ્ટ્રાસોનિક તૈયાર કરવા જોઈએ VialTweeter અથવા વેલ-પ્લેટ માટે મલ્ટી સેમ્પલ-અલ્ટ્રાસોનિકેટર UIP400MTP ની ભલામણ કરવામાં આવે છે. સોનિકેશન પછી, અર્ક 4°C પર 20 મિનિટ માટે 30,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા પૂર્વ-સાફ કરવામાં આવ્યા હતા. પૂર્વ-સાફ કરાયેલ અર્ક (કુલ પ્રોટીનનો 300µg) 40µďg એન્ટિ-CDC-25.1 એફિનિટી-પ્યુરિફાઇડ એન્ટિબોડી (આ અભ્યાસ) પ્રોટીન A-agarose સાથે ક્રોસ-લિંક્ડ અથવા નિયંત્રણ તરીકે, રેબિટ ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિનની સમાન રકમ સાથે ઉકાળવામાં આવ્યો હતો. (Ig)G પ્રોટીન A-agarose સાથે ક્રોસ-લિંક્ડ 1% NP-40 ધરાવતા લિસિસ બફરના 200µl ના કુલ જથ્થામાં ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, જેમાંના સમાવેશથી મેટ્રિક્સમાં પ્રોટીનનું બિન-વિશિષ્ટ બંધન ઘટ્યું હતું. નમૂનાઓને 1 કલાક માટે 4°C પર ફેરવવામાં આવ્યા હતા, મણકાને લિસિસ બફર વડે ત્રણ વખત ધોવામાં આવ્યા હતા, અને 30µl ગ્લાયસીન/HCl અને 200 mM NaCl, pH 2.2 વડે એલ્યુટ કરવામાં આવ્યા હતા. ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન પછી, ઇલ્યુએટ્સને SDS સેમ્પલ બફરના 30µ³ માં પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું, તેને 4 મિનિટ માટે 95°C પર ગરમ કરવામાં આવ્યું હતું, અને સામાન્ય રીતે ઇનપુટ માટે કુલ 3% અને ઇલ્યુએટ્સ માટે 30% SDS-PAGE પર લાગુ કરવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ સાથે એન્ટિ -CDC-25.1 (1:400), એન્ટિ-લિન-23 (1:750), એન્ટિ-યુબિક્વિટિન (1:1000), એન્ટિ-GSK3 π (1:500), અથવા એન્ટિ-ďβ-એક્ટિન (1: 2000) એન્ટિબોડીઝ. જ્યાં અર્ક ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશનને આધિન ન હતા, ત્યાં તે અર્કમાંથી મેળવેલા કુલ પ્રોટીનની સમાન માત્રાને SDS સેમ્પલ બફરમાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવી હતી, 95°C સુધી ગરમ કરવામાં આવી હતી, અને પછી સીધા SDS-PAGE પર લાગુ કરવામાં આવી હતી અને વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. (cf. Segref et al. 2020)

ચોક્કસ તાપમાન નિયંત્રણ હેઠળ અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ

જૈવિક નમૂનાઓનું સંચાલન કરતી વખતે ચોક્કસ અને વિશ્વસનીય તાપમાન નિયંત્રણ નિર્ણાયક છે. ઉચ્ચ તાપમાન નમૂનાઓમાં થર્મલી-પ્રેરિત પ્રોટીન અધોગતિ શરૂ કરે છે.
તમામ યાંત્રિક નમૂના તૈયારી તકનીકો તરીકે, sonication ગરમી બનાવે છે. જો કે, VialTweeter નો ઉપયોગ કરતી વખતે નમૂનાઓનું તાપમાન સારી રીતે નિયંત્રિત કરી શકાય છે. વિશ્લેષણ માટે VialTweeter અને VialPress સાથે તૈયાર કરતી વખતે અમે તમને તમારા નમૂનાઓના તાપમાનનું નિરીક્ષણ કરવા અને નિયંત્રિત કરવા માટે વિવિધ વિકલ્પો રજૂ કરીએ છીએ.

1. નમૂનાના તાપમાનનું નિરીક્ષણ કરવું: અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર UP200St, જે VialTweeter ચલાવે છે, તે એક બુદ્ધિશાળી સોફ્ટવેર અને પ્લગેબલ તાપમાન સેન્સરથી સજ્જ છે. તાપમાન સેન્સરને UP200St માં પ્લગ કરો અને સેમ્પલ ટ્યુબમાંથી એકમાં તાપમાન સેન્સરની ટોચ દાખલ કરો. ડિજિટલ રંગીન ટચ-ડિસ્પ્લે દ્વારા, તમે UP200St ના મેનૂમાં તમારા નમૂના સોનિકેશન માટે ચોક્કસ તાપમાન શ્રેણી સેટ કરી શકો છો. જ્યારે મહત્તમ તાપમાન પહોંચી જાય ત્યારે અલ્ટ્રાસોનિકેટર આપમેળે બંધ થઈ જશે અને જ્યાં સુધી નમૂનાનું તાપમાન સેટ તાપમાન ∆ ના નીચા મૂલ્ય સુધી ન આવે ત્યાં સુધી થોભો. પછી sonication આપોઆપ ફરીથી શરૂ થાય છે. આ સ્માર્ટ ફીચર ગરમી-પ્રેરિત અધોગતિને અટકાવે છે.
2. VialTweeter બ્લોકને પ્રી-કૂલ્ડ કરી શકાય છે. ટાઇટેનિયમ બ્લોકને પ્રી-કૂલ કરવા માટે VialTweeter બ્લોક (માત્ર ટ્રાન્સડ્યુસર વગરનો સોનોટ્રોડ!) ફ્રીજ અથવા ફ્રીઝરમાં મૂકો, નમૂનામાં તાપમાનમાં વધારો સ્થગિત કરવામાં મદદ કરે છે. જો શક્ય હોય તો, નમૂના પોતે પણ પ્રી-કૂલ્ડ કરી શકાય છે.
3. સોનિકેશન દરમિયાન ઠંડું કરવા માટે સૂકા બરફનો ઉપયોગ કરો. સૂકા બરફથી ભરેલી છીછરી ટ્રેનો ઉપયોગ કરો અને સૂકા બરફ પર VialTweeter મૂકો જેથી ગરમી ઝડપથી ઓસરી શકે.

તમારી લિસિસ એપ્લિકેશન માટે શ્રેષ્ઠ અલ્ટ્રાસોનિક સેલ ડિસપ્ટર શોધો

Hielscher Ultrasonics એ પ્રયોગશાળાઓ, બેન્ચ-ટોપ અને ઔદ્યોગિક સ્કેલ સિસ્ટમ્સ માટે ઉચ્ચ-પ્રદર્શન અલ્ટ્રાસોનિક સેલ ડિસપ્ટર્સ અને હોમોજેનાઇઝર્સના લાંબા સમયથી અનુભવી ઉત્પાદક છે. તમારી એપ્લિકેશન માટે યોગ્ય અલ્ટ્રાસોનિક સેલ ડિસપ્ટર શોધવા માટે તમારા બેક્ટેરિયલ સેલ કલ્ચરનું કદ, તમારું સંશોધન અથવા ઉત્પાદન ધ્યેય અને પ્રતિ કલાક કે દિવસની પ્રક્રિયા માટે સેલનું પ્રમાણ એ આવશ્યક પરિબળો છે.
Hielscher Ultrasonics મલ્ટિ-સેમ્પલ્સ (10 શીશીઓ સુધી) તેમજ સામૂહિક નમૂનાઓ (એટલે કે, માઇક્રોટાઇટર પ્લેટ્સ / 96-વેલ પ્લેટ્સ) ના એક સાથે સોનિકેશન માટે વિવિધ ઉકેલો પ્રદાન કરે છે, ક્લાસિક પ્રોબ-ટાઇપ લેબ અલ્ટ્રાસોનિકેટર 50 થી વિવિધ પાવર સ્તરો સાથે. વાણિજ્યિક સેલ વિક્ષેપ અને મોટા ઉત્પાદનમાં પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ માટે 16,000 વોટ પ્રતિ યુનિટ સાથે સંપૂર્ણ ઔદ્યોગિક અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર્સ માટે 400 વોટ. બધા Hielscher ultrasonicators સંપૂર્ણ લોડ હેઠળ 24/7/365 કામગીરી માટે બાંધવામાં આવે છે. મજબૂતાઈ અને વિશ્વસનીયતા એ અમારા અલ્ટ્રાસોનિક ઉપકરણોની મુખ્ય લાક્ષણિકતાઓ છે.
તમામ ડિજિટલ અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર્સ સ્માર્ટ સોફ્ટવેર, રંગીન ટચ ડિસ્પ્લે અને ઓટોમેટિક ડેટા પ્રોટોકોલિંગથી સજ્જ છે, જે અલ્ટ્રાસોનિક ઉપકરણને લેબ અને ઉત્પાદન સુવિધાઓમાં અનુકૂળ કાર્ય સાધન બનાવે છે.
ચાલો જાણીએ, કયા પ્રકારના કોષો, કયા વોલ્યુમ, કઈ ફ્રીક્વન્સી સાથે અને કયા લક્ષ્ય સાથે તમારે તમારા જૈવિક નમૂનાઓ પર પ્રક્રિયા કરવાની છે. અમે તમને તમારી પ્રક્રિયાની આવશ્યકતાઓ માટે સૌથી યોગ્ય અલ્ટ્રાસોનિક સેલ વિક્ષેપકર્તાની ભલામણ કરીશું.

નીચે આપેલ કોષ્ટક તમને કોમર્શિયલ એપ્લિકેશન્સ માટે કોમ્પેક્ટ હેન્ડ-હેલ્ડ હોમોજેનાઇઝર્સ અને મલ્ટી સેમ્પલ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સથી ઔદ્યોગિક અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર્સ સુધીની અમારી અલ્ટ્રાસોનિક સિસ્ટમ્સની અંદાજિત પ્રોસેસિંગ ક્ષમતાનો સંકેત આપે છે: