પાશ્ચાત્ય બ્લોટિંગ માટે અલ્ટ્રાસોનિક લિસેસ

• પશ્ચિમ બ્લોટ પેશી homogenate અથવા સેલ અર્ક એક નમૂનો ચોક્કસ પ્રોટીન શોધ માટે વિશ્લેષણાત્મક પ્રક્રિયા છે.
• પશ્ચિમી બ્લોટ ચલાવવા માટે અથવા એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિ માપવા, ઘણા એસે સામગ્રી (દા.ત. પ્રોટીન, ડીએનએ, subcellular ટુકડાઓ) કોષમાં entrapped વપરાશ જરૂરી છે.
• Sonication નિયંત્રિત સેલ ભંગાણ અને lysis માટે વિશ્વસનીય અને સરળ-થી-હેન્ડલ પદ્ધતિ છે.

અલ્ટ્રાસોનિક સેલ વિક્ષેપ

પેશીઓ અને સંસ્કારી કોશિકાઓમાંથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ ઘણા જૈવિક બાયોકેમિકલ અને વિશ્લેષણાત્મક તકનીકો (પાનું, પશ્ચિમી શાહીચૂસ એલિસા, સામૂહિક spectrometry, વગેરે) અથવા પ્રોટીન શુદ્ધિકરણ માટે પ્રથમ પગલું છે. એક ઉચ્ચ પ્રોટીન ઉપજ મેળવવા માટે, સેલ સામગ્રી અને પેશીને અસરકારક ખોરવાયો હોવું જ જોઈએ / lysed. છોડ કોષ અથવા પ્રાણીઓની પેશીઓમાં હોય, sonication તમારા સેલ lysate સરળ અને ઝડપી તૈયાર કરવા માટે પદ્ધતિ છે.

Sonication લાભો

• ફાસ્ટ & કાર્યક્ષમ
• સરળ કામગીરી
• ઉચ્ચ પ્રોટીન ઉપજ
• પ્રજનન / પુનરાવર્તિત
• ચોક્કસપણે નિયંત્રિત
• સ્કેલેબલ

Immunoprecipitation પ્રોટોકૉલ પશ્ચિમી Immunoblotting માટે

એ reagents

ઉકેલો તૈયાર કરવા માટે, જેમ કે મિલી-ક્યૂ શુદ્ધ પાણી વાપરો.

• 1x ફોસ્ફેટ બફર સેલાઇન (PBS)
• 1x સેલ lysis બફર: 20 મીમી Tris (પીએચ 7.5), 150 એમએમ NaCl, 1 મિમી EDTA, 1 મિમી EGTA 1% ટ્રાઇટોન એક્સ 100, 2.5 mM સોડિયમ pyrophosphate, 1 મિમી β-glycerophosphate, 1 મિમી Na3VO4 1 યુજી / મિલી Leupeptin
  મહત્વપૂર્ણ: ઉમેરો 1 મિમી PMSF તરત ઉપયોગ કરતા પહેલા.
• 15 એમએલ પ્રોટીન A + 15 એમએલ પ્રોટીન જી IP માટે પૂરતી છે, પરંતુ તે તમારા પ્રાથમિક એન્ટીબોડી અને નમૂના વોલ્યુમ પર આધાર રાખે છે શકે છે. તમે પણ પહેલેથી મિશ્ર પ્રોટીન એ / જી agarose ઉપયોગ કરી શકો છો (દા.ત. પ્રોટીન એક સસલું માટે આઇજીજી નીચે ખેંચી અને માઉસ આઇજીજી માટે પ્રોટીન જી નીચે પુલ)
• 3X એસડીએસ નમૂના બફર: 187,5 mM Tris-HCl (25 ° C પર પીએચ 6.8), 6% W / વી એસડીએસ, 30% glycerol, 150 એમએમ DTT, ડબલ્યુ 0.03% / વી bromophenol વાદળી

સેલ Lysates ના બી તૈયારી

• કોષો લણણી. nondenaturing શરતો હેઠળ કોષો લણણી કરવા માટે, મીડિયા દૂર કરો અને બરફ ઠંડા પીબીએસ સાથે એક વખત કોષો કોગળા.
• પીબીએસ દૂર કરો અને દરેક પ્લેટ (10 સે.મી.) 0.5 મિલી બરફ ઠંડા 1x સેલ lysis બફર ઉમેરો અને 5 મિનિટ માટે બરફ પર પ્લેટો સેવન.
• પ્લેટો કોષો ઉઝરડા અને microcentrifuge ટ્યુબ પરિવહન કરે છે. બરફ પર રાખો.
• Sonicate બે વાર બરફ ઠંડા immunoprecipitation બફર 10 સેકન્ડ માટે (IP બફર: 50 એમએમ Tris-HCl [7.4 પીએચ], 150 એમએમ NaCl, 5 એમએમ EDTA 0.1% એનપી 40 અને બાધક મિશ્રણ). sonication માટે, વીયલટેવેટર અથવા ચકાસણી ultrasonicator જેમ UP100H અથવા Uf200 ः ટી સૌથી યોગ્ય છે.
• 4 ° C તાપમાને 10 મિનિટ માટે 15,000 ગ્રામ પર lysates સેન્ટ્રિફ્યુજ.
• નવી ટ્યુબ supernatant સ્થાનાંતરિત કરો. (જરૂરી હોય તો, lysate -80 ° C પર સંગ્રહિત કરી શકાય છે.)
• supernatant પ્રાથમિક એન્ટીબોડી ઉમેરો. પ્રાથમિક એન્ટીબોડી સાથે supernatant પ્રકાશ ચળવળ હેઠળ 4 ° C તાપમાને 1 એચ માટે સેવવામાંઆવે છે. પ્રાથમિક એન્ટીબોડી સામાન્ય રીતે એક રકમ 10x કરતાં પશ્ચિમ શાહીચૂસ માટે વપરાય છે વધારે એકાગ્રતાવાળી માં ઉમેરવામાં આવે છે. (તમે 100μL દીઠ 1μg સાથે શરૂ કરી શકો છો.)
• supernatant પછી પ્રોટીન એ agarose (Invitrogen) અને અન્ય 1 એચ માટે પ્રોટીન જી agarose સમાન માત્રામાં મિશ્રણ સાથે વધુ સેવવામાંઆવે છે.
• agarose ગોળો આઇપી બફર સાથે ત્રણ વખત ધોવા. પછીથી, 5 મિનિટ માટે 95 ° C તાપમાને ગરમી આપીને એસડીએસ-પૃષ્ઠ લોડ બફર સાથે બંધાયેલા પ્રોટીન કાઢવા.

સી Immunoprecipitation

• 200 એમએલ સેલ lysate લો અને પ્રાથમિક એન્ટીબોડી ઉમેરો. સૌમ્ય 4 ° C તાપમાને રાતોરાત રોકિંગ સાથે સેવન.
• ક્યાં પ્રોટીન એક અથવા G agarose માળા (50% મણકો સ્લરી 20 એમએલ) ઉમેરો. સૌમ્ય 4 ° C તાપમાને 1-3 કલાક માટે રોકિંગ સાથે સેવન.
• 4 ° C તાપમાને 30 સેકન્ડ માટે Microcentrifuge. વૉશ 1x સેલ lysis બફર 500 એમએલ સાથે પાંચ વખત પેલેટ. washes દરમિયાન બરફ પર રાખો.
• 20 એમએલ 3X એસડીએસ નમૂના બફર સાથે પેલેટ Resuspend. વોર્ટેક્સ, પછી 30 સેકન્ડ માટે microcentrifuge.
• ખાતે 14,000 એક્સ ગ્રામ 1 મિનિટ માટે 2-5 મિનિટ માટે 95-100 ° સે અને microcentrifuge નમૂનાની ગરમી.
• SDS પાનાની જેલ (12-15%) પર નમૂનો (15-30 એમએલ) લોડ કરો.
• પશ્ચિમી શાહીચૂસ દ્વારા નમૂના પૃથ્થકરણ.

ultrasonicator UP50H સાથે પશ્ચિમી બ્લોટ વિશ્લેષણ

નીચેના પ્રોટોકોલ Kriebisch એટ અલ અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો હતો. (2011):
કુલ પ્રોટીન 1,25 સાથે સારવાર MC3T3-E1 કોષો અલગ કરવામાં આવી હતી (OH)₂ડી₃ (10^-8 એમ) અથવા વાહન. કોષ એક બફર 50 એમએમ Tris HCl, પીએચ 8 (સિગ્મા-Aldrich) ધરાવતી સાથે lysed હતા; 150 એમએમ NaCl (ફિશર વૈજ્ઞાનિક); 0.1% સોડિયમ dodecyl સલ્ફેટ (એસડીએસ) (ફિશર વૈજ્ઞાનિક); 1% IGEPAL સીએ-630 (સિગ્મા-Aldrich) અને 0.5% સોડિયમ deoxycholate (મર્ક). સેલ lysate ચક્ર 1 2 × 10 s માટે sonicated અને 80 કંપવિસ્તારના આવી હતી UP50H અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર (હાઈલેસ્ચર, અલ્ટ્રાસાઉન્ડ ટેકનોલોજી, ટેલ્ટો, જર્મની). ત્યારબાદ સામગ્રીને 10 મિનિટથી 14,000 આરપીએમ માટે કેન્દ્રિત કરવામાં આવી હતી અને પશ્ચિમ બ્લોટિંગ માટે સુપરનોટંટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. નમૂના બફરમાં પચ્ચીસ μg પ્રોટીન ઉકાળીને અને ઘટતા એજન્ટ (ઇન્વિટેરજન) અને ત્યારબાદ 4-12% પોલીક્રીલામાઇડ ગેલ્સ (ઇન્વિટ્રૉજન) નો ઉપયોગ કરીને એસડીએસ-PAGE દ્વારા અલગ પાડવામાં આવે છે અને નેટ્રોસેએલ્લોઝ મેમ્બ્રેન (જીઇ હેલ્થ કેર) માં તબદીલ કરવામાં આવે છે. ટીબીએસ (10 એમએમ ટ્રિસ-એચસીએલ; પીએચ 7.6; 150 એમએમ નાઇકલ) માં 1% કેસિન (સીગ્મા-એલ્ડ્રિચ) અને 1% ટ્રીસ (1 એમ) સમાવિષ્ટ 1 એચ માટે પટ્ટા અવરોધિત કરવામાં આવ્યો હતો. અવરોધિત કર્યા પછી, કલાપ્રેમી એન્ટીબોડી (સસલા વિરોધી માનવ સીબીએસ 1/500, પ્રો. આર. બેનરજી, એન આર્બર, એમઆઇ, યુએસએના પ્રયોગશાળામાં વિકસિત) સાથે 4 થી ° સે પર થોડો આંદોલન સાથે રાતોરાત હતા. હોર્બરડિશ પેરોક્સિડાઝ (એચપીઆર) સાથેના સેક્સ્યુગેશન- કોનજ્યુગેટેડ ગૌણ એન્ટિબોડી (ડાકો) ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે કરવામાં આવ્યો હતો. બધા blots ઉન્નત chemiluminescence (Perkin Elmer) દ્વારા વિકસાવવામાં આવ્યા હતા.

સાહિત્ય / સંદર્ભો