વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ માટે અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ

• વેસ્ટર્ન બ્લોટ એ પેશીના હોમોજેનેટ અથવા કોષના અર્કના નમૂનામાં વિશિષ્ટ પ્રોટીન શોધવા માટેની વિશ્લેષણાત્મક પ્રક્રિયા છે.
• વેસ્ટર્ન બ્લોટ કરવા અથવા ઉત્સેચકની સક્રિયતા માપવા માટે, ઘણી પરીક્ષણ પદ્ધતિઓમાં કોષની અંદર બંધાયેલા પદાર્થો (દા.ત. પ્રોટીન, DNA, ઉપકોષીય ખંડો) સુધી પહોંચવું જરૂરી હોય છે.
• નિયંત્રિત કોષ વિઘટન અને લાઇસિસ માટે સોનિકેશન એક વિશ્વસનીય અને સરળતાથી ઉપયોગ કરી શકાય તેવી પદ્ધતિ છે.

અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટન

પેશીઓ અને સંવર્ધિત કોષોમાંથી પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ એ ઘણી જૈવિક, જૈવરાસાયણિક અને વિશ્લેષણાત્મક પદ્ધતિઓ (PAGE, વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ, ELISA, માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી વગેરે) અથવા પ્રોટીન શુદ્ધીકરણનું પ્રથમ પગલું છે. પ્રોટીનની ઊંચી ઉપજ મેળવવા માટે, કોષીય સામગ્રી અને પેશીનું કાર્યક્ષમ રીતે વિઘટન/લાઇસિસ કરવું આવશ્યક છે. વનસ્પતિનો કોષ હોય કે પ્રાણીની પેશી, તમારા કોષ લાઇસેટને સરળતાથી અને ઝડપથી તૈયાર કરવાની પદ્ધતિ સોનિકેશન છે.

સોનિકેશનના ફાયદા

• ઝડપી અને કાર્યક્ષમ
• સરળ સંચાલન
• પ્રોટીનની ઊંચી ઉપજ
• પુનઃપ્રાપ્ય/પુનરાવર્તનીય પરિણામો
• ચોકસાઈપૂર્વક નિયંત્રિત
• પ્રક્રિયાનું પ્રમાણ વધારી શકાય તેવું

વેસ્ટર્ન ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ માટે ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન પ્રોટોકોલ

A. અભિકર્મકો

દ્રાવણો તૈયાર કરવા માટે Milli-Q જેવા શુદ્ધ કરેલા પાણીનો ઉપયોગ કરો.

• 1X ફોસ્ફેટ બફર્ડ સેલાઇન (PBS)
• 1X કોષ લાઇસિસ બફર: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM સોડિયમ પાયરોફોસ્ફેટ, 1 mM β-ગ્લિસેરોફોસ્ફેટ, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml લ્યુપેપ્ટિન
  મહત્ત્વપૂર્ણ: ઉપયોગ કરતાં તરત પહેલાં 1 mM PMSF ઉમેરો.
• 15 μl પ્રોટીન A+15 μl પ્રોટીન G એ IP માટે પૂરતું છે, પરંતુ તે તમારા પ્રાથમિક પ્રતિદ્રવ્ય અને નમૂનાના આયતન પર આધાર રાખી શકે છે. તમે અગાઉથી મિશ્રિત પ્રોટીન A/ G એગરોઝનો પણ ઉપયોગ કરી શકો છો (દા.ત. સસલાના IgG પુલ-ડાઉન માટે પ્રોટીન A અને ઉંદરના IgG પુલ-ડાઉન માટે પ્રોટીન G).
• 3X SDS નમૂના બફર: 187.5 mM Tris-HCl (25°C પર pH 6.8), 6% w/v SDS, 30% ગ્લિસેરોલ, 150 mM DTT, 0.03% w/v બ્રોમોફિનોલ બ્લૂ

B. કોષ લાઇસેટની તૈયારી

• કોષો એકત્રિત કરો. વિકૃતીકરણ ન થાય તેવી પરિસ્થિતિઓમાં કોષો એકત્રિત કરવા માટે, સંવર્ધન માધ્યમ દૂર કરો અને બરફ જેટલા ઠંડા PBS વડે કોષોને એક વાર ધુઓ.
• PBS દૂર કરો અને દરેક પ્લેટ (10 cm)માં 0.5 ml બરફ જેટલું ઠંડું 1X કોષ લાઇસિસ બફર ઉમેરો અને પ્લેટોને બરફ પર 5 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો.
• પ્લેટો પરથી કોષોને ખોતરીને માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યૂબોમાં સ્થાનાંતરિત કરો. બરફ પર રાખો.
• બરફ જેટલા ઠંડા ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન બફરમાં બે વાર 10 સેકન્ડ માટે સોનિકેશન કરો (IP બફર: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 અને પ્રોટીએઝ અવરોધક મિશ્રણ). સોનિકેશન માટે, VialTweeter અથવા પ્રોબ અલ્ટ્રાસોનિકેટર, જેમ કે UP100H અથવા UP200Ht સૌથી યોગ્ય છે.
• લાઇસેટને 4°C પર 15,000 g પર 10 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.
• ઉપરના પ્રવાહી સ્તરને નવી ટ્યૂબમાં સ્થાનાંતરિત કરો. (જરૂર હોય તો, લાઇસેટને –80°C પર સંગ્રહિત કરી શકાય છે.)
• ઉપરના પ્રવાહી સ્તરમાં પ્રાથમિક પ્રતિદ્રવ્ય ઉમેરો. પ્રાથમિક પ્રતિદ્રવ્ય ધરાવતા ઉપરના પ્રવાહી સ્તરને હળવા હલનચલન સાથે 4°C પર 1 h માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવે છે. પ્રાથમિક પ્રતિદ્રવ્ય સામાન્ય રીતે વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ માટે વપરાતી સાંદ્રતા કરતાં 10x વધુ સાંદ્ર માત્રામાં ઉમેરવામાં આવે છે. (તમે દર 100μL દીઠ 1μgથી શરૂઆત કરી શકો છો.)
• ત્યારબાદ ઉપરના પ્રવાહી સ્તરને પ્રોટીન A-એગરોઝ (Invitrogen) અને પ્રોટીન G એગરોઝની સમાન માત્રાઓના મિશ્રણ સાથે વધુ 1 h માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવે છે.
• એગરોઝ પેલેટને IP બફર વડે ત્રણ વાર ધુઓ. ત્યારબાદ, SDS-PAGE લોડિંગ બફર સાથે 95°C પર 5 મિનિટ ગરમ કરીને બંધાયેલા પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ કરો.

C. ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન

• 200 μl કોષ લાઇસેટ લો અને પ્રાથમિક પ્રતિદ્રવ્ય ઉમેરો. હળવેથી આગળ-પાછળ હલાવતા 4°C પર આખી રાત ઇન્ક્યુબેટ કરો.
• પ્રોટીન A અથવા G એગરોઝ બીડ્સ (50% બીડ સ્લરીના 20 μl) ઉમેરો. હળવેથી આગળ-પાછળ હલાવતા 4°C પર 1–3 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો.
• 4°C પર 30 સેકન્ડ માટે માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ કરો. પેલેટને 500 µl 1X કોષ લાઇસિસ બફર વડે પાંચ વાર ધુઓ. ધોવા દરમિયાન બરફ પર રાખો.
• પેલેટને 20 μl 3X SDS નમૂના બફર સાથે ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો. વોર્ટેક્સ કરો, પછી 30 સેકન્ડ માટે માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.
• નમૂનાને 95–100°C સુધી 2–5 મિનિટ માટે ગરમ કરો અને 14,000 X g પર 1 મિનિટ માટે માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.
• નમૂનો (15–30 μl) SDS-PAGE જેલ (12–15%) પર લોડ કરો.
• વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ દ્વારા નમૂનાનું વિશ્લેષણ કરો.

Sonicator UP50H વડે વેસ્ટર્ન બ્લોટ વિશ્લેષણ

Kriebisch et al. (2011) દ્વારા કરવામાં આવેલા અભ્યાસમાં પ્રોબ પ્રકારના સોનિકેટર UP50H સાથેનો નીચેનો પ્રોટોકોલ ઉપયોગમાં લેવાયો હતો:
કુલ પ્રોટીન MC3T3-E1 કોષોમાંથી અલગ કરવામાં આવ્યું હતું, જેમની સારવાર 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) અથવા વાહક સાથે કરવામાં આવી હતી. 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1% સોડિયમ ડોડેસિલ સલ્ફેટ (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) અને 0.5% સોડિયમ ડિઓક્સીકોલેટ (Merck) ધરાવતા બફર વડે કોષોનું લાઇસિસ કરવામાં આવ્યું હતું. કોષ લાઇસેટનું સોનિકેશન ચક્ર 1 અને કંપવિસ્તાર 80 પર 2 × 10 s માટે કરવામાં આવ્યું હતું, જેમાં UP50H Ultrasonic Processor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germany)નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ત્યારબાદ સામગ્રીને 14,000 rpm પર 10 min માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવી હતી અને ઉપરના પ્રવાહી સ્તરનો ઉપયોગ વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ માટે કરવામાં આવ્યો હતો. પચીસ μg પ્રોટીનને નમૂના બફર અને અપચાયક અભિકર્મક (Invitrogen)માં ઉકાળવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ 4–12% પોલિએક્રિલામાઇડ જેલ (Invitrogen)નો ઉપયોગ કરીને SDS-PAGE દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યું હતું અને નાઇટ્રોસેલ્યુલોઝ પટલ (GE health care) પર સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું. પટલને 1% કેસિન (Sigma-Aldrich) અને 1% Tris (1 M) ધરાવતા TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) વડે 1 h માટે બ્લોક કરવામાં આવ્યું હતું. બ્લોકિંગ પછી, પટલને પ્રાથમિક પ્રતિદ્રવ્ય (સસલામાં ઉત્પન્ન માનવ CBS સામેનું પ્રતિદ્રવ્ય 1/500, Prof. R. Banerjeeની પ્રયોગશાળા, Ann Arbor, MI, USAમાં વિકસાવવામાં આવેલું) સાથે 4°C પર આખી રાત સહેજ હલનચલન સાથે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું. હોર્સરેડિશ પેરોક્સિડેઝ (HPR) સાથે સંયુગ્મિત ગૌણ પ્રતિદ્રવ્ય (Dako) સાથેનું ઇન્ક્યુબેશન ઓરડાના તાપમાને 1 h માટે કરવામાં આવ્યું હતું. બધા બ્લોટને વર્ધિત કેમિલ્યુમિનેસન્સ (Perkin Elmer) દ્વારા વિકસાવવામાં આવ્યા હતા.
 

અલ્ટ્રાસોનિક કોષ લાઇસિસ અને નિષ્કર્ષણ, લાઇસેટની તૈયારી તથા પ્રક્રિયામાં સુધારા માટેની ભલામણો અંગેની શ્રેષ્ઠ કાર્યપદ્ધતિઓ વિશે વધુ વાંચવા અહીં ક્લિક કરો!
 
નીચેનું કોષ્ટક અમારી પ્રયોગશાળાના કદની અલ્ટ્રાસોનિકેટર ઉપકરણોની અંદાજિત પ્રક્રિયા ક્ષમતાનો ખ્યાલ આપે છે:

સાહિત્ય / સંદર્ભો

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.