વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ માટે અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ

• વેસ્ટર્ન બ્લોટ એ ટીશ્યુ હોમોજેનેટ અથવા કોષના અર્કના નમૂનામાં વિશિષ્ટ પ્રોટીન શોધવા માટેની વિશ્લેષણાત્મક પ્રક્રિયા છે.
• વેસ્ટર્ન બ્લૉટ ચલાવવા અથવા એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિને માપવા માટે, ઘણા પરીક્ષણોને કોષમાં ફસાયેલી સામગ્રી (દા.ત. પ્રોટીન, ડીએનએ, સબસેલ્યુલર ટુકડાઓ) સુધી પહોંચવાની જરૂર છે.
• સોનિકેશન એ નિયંત્રિત સેલ વિક્ષેપ અને લિસિસ માટે વિશ્વસનીય અને હેન્ડલ-થી-હેન્ડલ પદ્ધતિ છે.

અલ્ટ્રાસોનિક સેલ વિક્ષેપ

પેશીઓ અને સંસ્કારી કોષોમાંથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ એ ઘણી જૈવિક, બાયોકેમિકલ અને વિશ્લેષણાત્મક તકનીકો (PAGE, પશ્ચિમી બ્લોટિંગ, ELISA, માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી, વગેરે) અથવા પ્રોટીન શુદ્ધિકરણ માટેનું પ્રથમ પગલું છે. ઉચ્ચ પ્રોટીન ઉપજ મેળવવા માટે, કોષની સામગ્રી અને પેશીઓને અસરકારક રીતે વિક્ષેપિત/લીઝ્ડ હોવા જોઈએ. છોડના કોષ હોય કે પ્રાણીની પેશી, સોનિકેશન એ તમારા સેલ લિસેટને સરળ અને ઝડપી તૈયાર કરવાની પદ્ધતિ છે.

Sonication ના ફાયદા

• ઝડપી & કાર્યક્ષમ
• સરળ કામગીરી
• ઉચ્ચ પ્રોટીન ઉપજ
• પુનઃઉત્પાદન / પુનરાવર્તિત
• ચોક્કસ નિયંત્રિત
• માપી શકાય તેવું

પશ્ચિમી ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ માટે ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન પ્રોટોકોલ

A. રીએજન્ટ્સ

ઉકેલોની તૈયારી માટે, મિલી-ક્યુ જેવા શુદ્ધ પાણીનો ઉપયોગ કરો.

• 1X ફોસ્ફેટ બફર્ડ ક્ષાર (PBS)
• 1X સેલ લિસિસ બફર: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% ટ્રાઇટોન X-100, 2.5 mM સોડિયમ પાયરોફોસ્ફેટ, 1 mM β-glycerophosphate, m4μM/NV13μg, મિલી લ્યુપેપ્ટિન
  મહત્વપૂર્ણ: ઉપયોગ કરતા પહેલા તરત જ 1 mM PMSF ઉમેરો.
• 15 μl પ્રોટીન A+15 μl પ્રોટીન G IP માટે પૂરતું છે, પરંતુ તે તમારા પ્રાથમિક એન્ટિબોડી અને નમૂનાની માત્રા પર આધાર રાખે છે. તમે પૂર્વ-મિશ્રિત પ્રોટીન A/ G એગરોઝનો પણ ઉપયોગ કરી શકો છો (દા.ત. સસલાના IgG પુલ ડાઉન માટે પ્રોટીન A અને માઉસ IgG પુલ ડાઉન માટે પ્રોટીન G)
• 3X SDS સેમ્પલ બફર: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 25°C પર), 6% w/v SDS, 30% ગ્લિસરોલ, 150 mM DTT, 0.03% w/v બ્રોમોફેનોલ બ્લુ

B. સેલ લિસેટ્સની તૈયારી

• કોષો લણણી. બિનજરૂરી પરિસ્થિતિઓમાં કોષોની લણણી કરવા માટે, મીડિયાને દૂર કરો અને બરફ-ઠંડા પીબીએસ સાથે એકવાર કોષોને કોગળા કરો.
• પીબીએસ દૂર કરો અને દરેક પ્લેટ (10 સે.મી.)માં 0.5 મિલી આઈસ-કોલ્ડ 1X સેલ લિસિસ બફર ઉમેરો અને પ્લેટોને 5 મિનિટ માટે બરફ પર ઉકાળો.
• પ્લેટોમાંથી કોષોને ઉઝરડા કરો અને માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરો. બરફ પર રાખો.
• બરફ-ઠંડા ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન બફરમાં 10 સેકન્ડ માટે બે વાર સોનિકેટ કરો (IP બફર: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 અને પ્રોટીઝ અવરોધક મિશ્રણ). sonication માટે, આ VialTweeter અથવા પ્રોબ અલ્ટ્રાસોનિકેટર જેમ કે UP100H અથવા UP200Ht સૌથી યોગ્ય છે.
• લિસેટ્સને 15,000 ગ્રામ પર 4°C પર 10 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.
• સુપરનેટન્ટને નવી નળીમાં સ્થાનાંતરિત કરો. (જો જરૂરી હોય તો, લિસેટને -80 ° સે પર સંગ્રહિત કરી શકાય છે.)
• સુપરનેટન્ટમાં પ્રાથમિક એન્ટિબોડી ઉમેરો. પ્રાથમિક એન્ટિબોડી ધરાવતું સુપરનેટન્ટ પ્રકાશ આંદોલન હેઠળ 4°C તાપમાને 1 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવે છે. પ્રાથમિક એન્ટિબોડી સામાન્ય રીતે વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ માટે વપરાય છે તેના કરતા 10 ગણી વધુ માત્રામાં ઉમેરવામાં આવે છે. (તમે 100μL દીઠ 1μg થી પ્રારંભ કરી શકો છો.)
• સુપરનેટન્ટને પછી સમાન માત્રામાં પ્રોટીન A-agarose (Invitrogen) અને Protein G agarose ના મિશ્રણ સાથે બીજા 1 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવે છે.
• આઈપી બફર વડે એગરોઝની ગોળીઓને ત્રણ વખત ધોઈ લો. પછીથી, SDS-PAGE લોડિંગ બફર વડે બાઉન્ડ પ્રોટીનને 5 મિનિટ માટે 95°C પર ગરમ કરીને બહાર કાઢો.

C. રોગપ્રતિકારક શક્તિ

• 200 μl સેલ લિસેટ લો અને પ્રાથમિક એન્ટિબોડી ઉમેરો. રાતોરાત 4°C પર હળવા રોકિંગ સાથે સેવન કરો.
• પ્રોટીન A અથવા G એગ્રોઝ મણકા (50% મણકા સ્લરીનું 20 μl) ઉમેરો. 4 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર 1-3 કલાક માટે હળવા રોકિંગ સાથે સેવન કરો.
• 4°C પર 30 સેકન્ડ માટે માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ. 1X સેલ લિસિસ બફરના 500 μl વડે પેલેટને પાંચ વખત ધોઈ લો. ધોતી વખતે બરફ પર રાખો.
• 20 μl 3X SDS સેમ્પલ બફર સાથે પેલેટને ફરીથી મોકલો. વોર્ટેક્સ, પછી 30 સેકન્ડ માટે માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ.
• નમૂનાને 2-5 મિનિટ માટે 95–100°C અને 14,000 X g પર 1 મિનિટ માટે માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ પર ગરમ કરો.
• SDS-PAGE જેલ (12–15%) પર નમૂના (15–30 μl) લોડ કરો.
• વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ દ્વારા નમૂનાનું વિશ્લેષણ કરો.

Sonicator UP50H સાથે વેસ્ટર્ન બ્લોટ વિશ્લેષણ

પ્રોબ-ટાઈપ સોનીકેટર UP50H નો ઉપયોગ કરીને નીચેના પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ ક્રિબિસ્ચ એટ અલના અભ્યાસમાં કરવામાં આવ્યો હતો. (2011):
કુલ પ્રોટીનને 1,25(OH) સાથે સારવાર કરાયેલા MC3T3-E1 કોષોમાંથી અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.₂ડી₃ (10⁻⁸ એમ) અથવા વાહન. કોષોને 50 એમએમ ટ્રિસ એચસીએલ, પીએચ 8 (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) ધરાવતા બફર સાથે લિઝ્ડ કરવામાં આવ્યા હતા; 150 એમએમ NaCl (ફિશર સાયન્ટિફિક); 0.1% સોડિયમ ડોડેસીલ સલ્ફેટ (SDS) (ફિશર સાયન્ટિફિક); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) અને 0.5% સોડિયમ ડીઓક્સીકોલેટ (મર્ક). સેલ lysate ચક્ર 1 અને કંપનવિસ્તાર 80 પર 2 × 10 s માટે sonicated હતી UP50H અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર (Hielscher, અલ્ટ્રાસાઉન્ડ ટેકનોલોજી, Teltow, Germany). ત્યારબાદ સામગ્રીને 14,000 rpm પર 10 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવી હતી અને વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ માટે સુપરનેટન્ટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. પચીસ μg પ્રોટીનને સેમ્પલ બફર અને રિડ્યુસિંગ એજન્ટ (ઇન્વિટ્રોજન)માં ઉકાળવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ SDS-PAGE દ્વારા 4-12% પોલિએક્રિલામાઇડ જેલ્સ (ઇન્વિટ્રોજન)નો ઉપયોગ કરીને અલગ કરવામાં આવ્યું હતું અને નાઇટ્રોસેલ્યુલોઝ મેમ્બ્રેન (જીઇ હેલ્થ કેર)માં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવ્યું હતું. પટલને TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) સાથે 1% કેસીન (સિગ્મા-એલ્ડ્રીચ) અને 1% ટ્રિસ (1 M) સાથે 1 કલાક માટે અવરોધિત કરવામાં આવી હતી. અવરોધિત કર્યા પછી, પટલને પ્રાથમિક એન્ટિબોડી (સસલું વિરોધી માનવ સીબીએસ 1/500, પ્રો. આર. બેનર્જી, એન આર્બર, MI, યુએસએની લેબમાં વિકસિત) સાથે 4°C પર રાતોરાત સહેજ આંદોલન સાથે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું. હોર્સરાડિશ પેરોક્સિડેઝ (HPR)-સંયોજિત ગૌણ એન્ટિબોડી (ડાકો) સાથેનું સેવન ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે કરવામાં આવ્યું હતું. બધા બ્લોટ્સ ઉન્નત કેમિલ્યુમિનેસેન્સ (પર્કિન એલ્મર) દ્વારા વિકસાવવામાં આવ્યા હતા.
 

અલ્ટ્રાસોનિક સેલ લિસિસ અને નિષ્કર્ષણ, લિસેટની તૈયારી અને પ્રક્રિયા સુધારણા માટેની ભલામણો માટેની શ્રેષ્ઠ પદ્ધતિઓ વિશે વધુ વાંચવા માટે અહીં ક્લિક કરો!
 
નીચે આપેલ કોષ્ટક તમને અમારા લેબ-સાઇઝ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સની અંદાજિત પ્રોસેસિંગ ક્ષમતાનો સંકેત આપે છે:

સાહિત્ય / સંદર્ભો