E. Coli નું અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ
- E. coli બેક્ટેરિયા સૂક્ષ્મજીવવિજ્ઞાન અને જૈવપ્રૌદ્યોગિકીમાં સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતા બેક્ટેરિયા છે.
- અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટકો E. coli ના લાઇસિસ માટે વિશ્વસનીય અને પુનરુત્પાદનીય પરિણામો આપે છે.
- તીવ્ર છતાં ચોકસાઈથી નિયંત્રિત કરી શકાય તેવા કેવિટેશન અને શિયર બળોના પરિણામે સંપૂર્ણ વિઘટન થાય છે અને નિષ્કર્ષણની ઊંચી ઉપજ મળે છે (દા.ત. પ્રોટીન, DNA).
E. coli ના અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટનને પ્રાધાન્ય કેમ આપવામાં આવે છે?
અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર અથવા પ્રોબ પ્રકારના અલ્ટ્રાસોનિકેટર E. coli ના લાઇસિસ માટે અનેક લાભો આપે છે, કારણ કે તીવ્ર અલ્ટ્રાસાઉન્ડ કોષભિત્તિઓ અને કોષપટલોનું કાર્યક્ષમ રીતે વિઘટન કરે છે. નીચેના કારણોસર E. coli ના લાઇસિસ માટે પ્રોબ પ્રકારના અલ્ટ્રાસોનિકેટરનો વ્યાપક ઉપયોગ થાય છે:
E.coli કોષોમાંથી પ્રોટીનનું નિષ્કર્ષણ અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ UP200St વડે કાર્યક્ષમ રીતે કરવામાં આવે છે
પ્રોબ પ્રકારનું અલ્ટ્રાસોનિકેટર E. coli ના લાઇસિસ માટે ઘણા લાભો આપે છે. અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયાના પરિમાણો પરનું વિશ્વસનીય અને ચોક્કસ નિયંત્રણ ઇચ્છિત પરિણામો મેળવવા માટે શક્તિ, અવધિ અને નમૂનાની હેરફેર જેવા સંચાલન પરિમાણોને શ્રેષ્ઠ રીતે ગોઠવવાની સુવિધા આપે છે.
0 – 15 min અલ્ટ્રાસોનિકેશનને આધિન કરાયેલા E. coli EDL933 ના જીનોમિક DNA નું ઇલેક્ટ્રોફોરેટિક વિશ્લેષણ. L એ DNA લેડર દર્શાવે છે.
(અભ્યાસ અને છબી: ©Basselet et al. 2008)
અલ્ટ્રાસોનિક કેવિટેશનનો ઉપયોગ કરીને કોષ વિઘટન
અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ-પ્રકારના હોમોજેનાઇઝર પ્રતિ સેકન્ડ આશરે 20,000 ચક્રો (20kHz પર) સાથે કાર્ય કરે છે અને પ્રવાહી અથવા સસ્પેન્શનમાં કેવિટેશન પેદા કરે છે. ધ્વનિક કેવિટેશન શૂન્યાવકાશ જેવા દબાણ અને ઊંચા તાપમાન ધરાવતા સૂક્ષ્મ વિસ્તારો બનાવે છે, જે કોષોને તોડી નાખે છે. તાપમાન કેટલાક હજાર ડિગ્રી સેલ્સિયસ સુધી પહોંચી શકે છે, છતાં કેવિટેશનના વિસ્તારોનું કદ એટલું નાનું હોય છે કે તે પ્રક્રિયાને નોંધપાત્ર રીતે ગરમ કરતા નથી. અલ્ટ્રાસાઉન્ડથી ઉત્પન્ન થતું ધ્વનિક કેવિટેશન અને શિયર બળો E.coli જેવા બેક્ટેરિયાના કોષોની કોષપટલમાં છિદ્રો પાડે છે અથવા તેને તોડી નાખે છે. Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર અલ્ટ્રાસોનિક તીવ્રતા, કંપવિસ્તાર, ઊર્જા ઇનપુટ અને તાપમાન જેવા પ્રક્રિયા પરિમાણો પર ચોક્કસ નિયંત્રણની સુવિધા આપે છે. આથી, અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ પ્રક્રિયાને કોષના પ્રકાર, કોષ સંવર્ધન અને પ્રક્રિયાના ધ્યેયને અનુરૂપ શ્રેષ્ઠ રીતે ગોઠવી શકાય છે.
- લાઇસિસનું ચોક્કસ નિયંત્રણ (તીવ્રતા, કંપવિસ્તાર, તાપમાન)
- વિશ્વસનીય, પુનરુત્પાદનક્ષમ પરિણામો
- ચોક્કસ નમૂનાઓને અનુરૂપ શ્રેષ્ઠ અનુકૂલન
- તાપમાન નિયંત્રણ
- અત્યંત નાના નમૂનાઓથી લઈને અત્યંત મોટા નમૂનાઓ માટે (µL થી લિટર સુધી)
- સંપૂર્ણપણે યાંત્રિક ઉપચાર
- વપરાશકર્તા માટે સરળ, સલામત સંચાલન
- પ્રયોગશાળાથી ઉત્પાદન સુધી રેખીય સ્કેલ-અપ
VialTweeter અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ માટે
અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર વિરુદ્ધ અન્ય લાઇસિસ તકનીકો
રાસાયણિક અને એન્ઝાઇમેટિક લાઇસિસ સમસ્યારૂપ બની શકે છે – કારણ કે રાસાયણિક લાઇસિસ પ્રોટીનની સંરચનાઓને બદલી શકે છે અને શુદ્ધિકરણમાં સમસ્યાઓ ઊભી કરી શકે છે, જ્યારે એન્ઝાઇમેટિક લાઇસિસ માટે લાંબા ઇન્ક્યુબેશન સમયની જરૂર પડે છે અને તે પુનરુત્પાદનક્ષમ નથી – ત્યારે અલ્ટ્રાસોનિક વિઘટન એક અત્યાધુનિક, ઝડપી કોષ વિઘટન પદ્ધતિ છે.
અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ માત્ર યાંત્રિક બળો પર આધારિત છે. કોઈ રસાયણો ઉમેરવામાં આવતા નથી; સોનિકેશન શિયર બળો દ્વારા કોષભિત્તિને તોડે છે. રાસાયણિક લાઇસિસ પ્રોટીનની સંરચનાને બદલી શકે છે અને શુદ્ધિકરણમાં સમસ્યાઓ ઊભી કરી શકે છે. એન્ઝાઇમેટિક વિઘટન માટે લાંબા ઇન્ક્યુબેશન સમયની જરૂર પડે છે અને તે પુનરુત્પાદનક્ષમ નથી. E.coli બેક્ટેરિયાના કોષોનું અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટન ઝડપી, સરળ, વિશ્વસનીય અને પુનરુત્પાદનક્ષમ છે. તેથી જ વિશ્વભરની જૈવિક અને જૈવરાસાયણિક પ્રયોગશાળાઓમાં નમૂનાની તૈયારી, વિશ્લેષણપૂર્વ કામગીરી, ઇન-વિટ્રો નિદાન અને વિવિધ પરીક્ષણો માટે Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટરનો ઉપયોગ થાય છે.
અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ માટે સામાન્ય ભલામણો
કોષ સસ્પેન્શનના અત્યંત નાના, મધ્યમ અને મોટા જથ્થાના લાઇસિસ માટે સોનિકેશન સૌથી લોકપ્રિય તકનીક છે – પિકોલિટરથી લઈને 100L/hr સુધી (અલ્ટ્રાસોનિક ફ્લો સેલનો ઉપયોગ કરીને). પ્રવાહીના શિયર અને કેવિટેશન દ્વારા કોષોનું લાઇસિસ થાય છે. સોનિકેશન દરમિયાન DNA પણ શિયરથી ખંડિત થાય છે, તેથી કોષ સસ્પેન્શનમાં DNase ઉમેરવાની જરૂર નથી.
અલ્ટ્રાસોનિક E.coli લાઇસિસ દરમિયાન તાપમાન નિયંત્રણ
નમૂનાને અગાઉથી ઠંડો કરીને અને સોનિકેશન દરમિયાન તેને બરફ પર રાખીને, નમૂનાનું ઉષ્માથી થતું વિઘટન સરળતાથી અટકાવી શકાય છે.
આદર્શ રીતે, લાઇસિસ દરમિયાન નમૂનાઓને બરફ જેવા ઠંડા રાખવા જોઈએ, પરંતુ મોટાભાગના નમૂનાઓ માટે તાપમાન સંવર્ધન અથવા પેશીના સ્ત્રોતના તાપમાનથી ઉપર ન જાય તે પૂરતું છે. તેથી સસ્પેન્શનને બરફ પર રાખવાની અને 5–10 sec ના અનેક ટૂંકા અલ્ટ્રાસોનિક પલ્સ તથા 10–30 sec ના વિરામ સાથે સોનિકેશન કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે. વિરામ દરમિયાન ઉષ્મા વિખેરાઈ શકે છે, જેથી ફરી નીચું તાપમાન સ્થાપિત થાય. મોટા કોષ નમૂનાઓ માટે ઠંડક માટેનાં જેકેટ ધરાવતા વિવિધ ફ્લો સેલ રિએક્ટર ઉપલબ્ધ છે.
સફળ અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ માટે વિગતવાર સૂચનો અને ભલામણો અહીં વાંચો!
E. Coli લાઇસેટની અલ્ટ્રાસોનિક તૈયારી માટેના પ્રોટોકોલ
સંશોધકો E.coli ના કોષ વિઘટન માટે Hielscher અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝરનો ઉપયોગ કરે છે. નીચે તમને E. coli સંબંધિત વિવિધ ઉપયોગો માટે Hielscher અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝરનો ઉપયોગ કરીને E.coli લાઇસિસ કરવાના વિવિધ પરીક્ષણ કરાયેલા અને સાબિત થયેલા પ્રોટોકોલ મળશે.
અલ્ટ્રાસોનિક્સનો ઉપયોગ કરીને કોષ વૃદ્ધિ, ક્રોસલિંકિંગ અને E. coli કોષ અર્કની તૈયારી
SeqA અને RNA પોલિમરેઝ ChIP-Chip માટે E. coli MG1655 અથવા MG1655 ΔseqA ને 37°C પર OD600 લગભગ 0.15 થાય ત્યાં સુધી 50 ml LB (+ 0.2% ગ્લુકોઝ)માં ઉછેરવામાં આવ્યું, ત્યારબાદ માધ્યમના પ્રત્યેક ml દીઠ 27 μl ફોર્માલ્ડિહાઇડ (37%) ઉમેરવામાં આવ્યું (અંતિમ સાંદ્રતા 1%). ઓરડાના તાપમાને 20 min સુધી ધીમે હલાવીને (100 rpm) ક્રોસલિંકિંગ કરવામાં આવ્યું, ત્યારબાદ 2.5 M ગ્લાયસીનના 10 ml વડે પ્રતિક્રિયા અટકાવવામાં આવી (અંતિમ સાંદ્રતા 0.5 M). હીટ-શોક પ્રયોગો માટે, E. coli MG1655ને 65 ml LB માધ્યમમાં 30°C પર ઉછેરવામાં આવ્યા, જ્યાં સુધી OD600 લગભગ 0.3 ન થયું. ત્યારબાદ કલ્ચરના 30 mlને 43°C પર અગાઉથી ગરમ કરેલા ફ્લાસ્કમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યા અને બાકીનું કલ્ચર 30°C પર રાખવામાં આવ્યું. ક્રોસલિંકિંગ અને પ્રતિક્રિયા અટકાવવાની પ્રક્રિયા ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે કરવામાં આવી, માત્ર એટલો ફેરફાર હતો કે ઓરડાના તાપમાને વધુ ધીમે હલાવતા પહેલાં કોષોને 30 અથવા 43°C પર 5 min માટે રાખવામાં આવ્યા. સેન્ટ્રિફ્યુગેશન દ્વારા કોષો એકત્રિત કરવામાં આવ્યા અને ઠંડા TBS (pH7.5)થી બે વાર ધોવામાં આવ્યા. 1 ml લાયસિસ બફર (10 mM Tris (pH 8.0), 20% સુક્રોઝ, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml લાઇસોઝાઇમ)માં ફરી નિલંબિત કર્યા અને 37°C પર 30 min માટે ઇન્ક્યુબેટ કર્યા બાદ 4 ml IP બફર ઉમેરવામાં આવ્યું, ત્યારબાદ Hielscher અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર UP400Stનો 100% પાવર સેટિંગ પર ઉપયોગ કરીને કોષોનું બરફ પર 12 વાર સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું, જેમાં પ્રત્યેક સોનિકેશન 30 secનું અને વિરામ 30 secનો હતો. 9000 g પર 10 min માટે સેન્ટ્રિફ્યુગેશન કર્યા બાદ ઉપરના પ્રવાહીના 800 μlના અંશો -20°C પર સંગ્રહવામાં આવ્યા. (Waldminghaus 2010)
અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ વડે ઉત્સેચકોનું અતિઉત્પાદન અને શુદ્ધિકરણ
ડેકાહિસ્ટિડિન (His10)-ટૅગ ધરાવતા પ્રોટીનના અતિઉત્પાદન માટે, E. coli BL21(DE3)નું pET19b કન્સ્ટ્રક્ટ્સ વડે ટ્રાન્સફોર્મેશન કરવામાં આવ્યું. રાતભર ઉછેરેલા પૂર્વકલ્ચરને સેન્ટ્રિફ્યુગેશન દ્વારા એકત્રિત કરવામાં આવ્યું, અને તેના 1%નો ઉપયોગ અભિવ્યક્તિ કલ્ચરમાં ઇનોક્યુલેશન કરવા માટે કરવામાં આવ્યો. pET19mgtB ધરાવતા કોષોને 22°C પર ઉછેરવામાં આવ્યા, જ્યાં સુધી 600 nm પરની પ્રકાશીય ઘનતા (OD600) 0.7 ન થઈ. કલ્ચરને 17°C પર સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યું અને 100 μM IPTG વડે અભિવ્યક્તિ પ્રેરિત કરવામાં આવી. 16 h બાદ, 4°C પર 7,500 × g પર સેન્ટ્રિફ્યુગેશન દ્વારા કલ્ચર એકત્રિત કરવામાં આવ્યું. કોષોને pH 7.4 પર 0.3 M NaCl ધરાવતા 50 mM ફોસ્ફેટ-બફર્ડ સેલાઇન (PBS)માં ફરી નિલંબિત કરવામાં આવ્યા અને Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર UP200St પર S2 માઇક્રો-ટિપ સોનોટ્રોડ વડે 0.5ના સાઇકલ અને 75%ના કંપનવિસ્તાર પર અલ્ટ્રાસોનિકેશન કરીને તેમનું વિઘટન કરવામાં આવ્યું.
ડેકાહિસ્ટિડિન-ટૅગ ધરાવતા GtfCનું અતિઉત્પાદન 37°C પર પ્રેરિત કરવામાં આવ્યું, જ્યારે OD600 0.6 હતું, અને આ માટે 100 μM IPTGનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો. ત્યારબાદ કોષોને 4 h માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા, એકત્રિત કરવામાં આવ્યા અને MgtB માટે ઉપર જણાવ્યા પ્રમાણે તેમનું લાયસિસ કરવામાં આવ્યું.
કોષીય અવશેષોને તળિયે બેસાડવા માટે અશુદ્ધ કોષીય અર્કનું 15,000 × g અને 4°C પર સેન્ટ્રિફ્યુગેશન કરવામાં આવ્યું. ÄKTAprime Plus સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને અવશેષોથી અલગ કરેલા અર્કને 1-ml HisTrap FF Crude કૉલમ પર લોડ કરવામાં આવ્યા. His-ટૅગ ધરાવતા પ્રોટીનના ગ્રેડિયન્ટ ઇલ્યુશન માટે ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર ઉત્સેચકોનું શુદ્ધિકરણ કરવામાં આવ્યું. ઇલ્યુશનથી મેળવેલા પ્રોટીન દ્રાવણોનું 4°C પર 0.3 M NaCl ધરાવતા 50 mM PBS, pH 7.4ના 1,000 ગણા કદના દ્રાવણ સામે બે વાર ડાયાલિસિસ કરવામાં આવ્યું. શુદ્ધિકરણનું 12% SDS-PAGE દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. Roti-Quantનો ઉપયોગ કરીને બ્રેડફોર્ડ પદ્ધતિ દ્વારા પ્રોટીનની સાંદ્રતા નિર્ધારિત કરવામાં આવી. (Rabausch et al. 2013)
E. coli બેક્ટેરિયામાંથી પ્રોટીનનું અલ્ટ્રાસોનિક નિષ્કર્ષણ
અભ્યાસ માટે પસંદ કરેલા બેઇટ પ્રોટીનને (આ કિસ્સામાં, Arabidopsis thalianaનું MTV1) GST ટૅગ સાથે જોડવામાં આવે છે અને BL21 Escherichia coli (E. coli) કોષોમાં તેની અભિવ્યક્તિ કરાવવામાં આવે છે.
- GST-MTV1 અને GSTની એક-એક પેલેટ લો (50 ml બેક્ટેરિયલ કલ્ચરને અનુરૂપ) અને પ્રત્યેકને 2.5 mL બરફ જેવા ઠંડા નિષ્કર્ષણ બફરમાં ફરી નિલંબિત કરો.
- બેક્ટેરિયલ કોષોનું લાયસિસ થાય ત્યાં સુધી તેમનું વિઘટન કરવા માટે અલ્ટ્રાસોનિકેટર UP100Hનો ઉપયોગ કરો (આશરે 2–5mL જેટલા નાના કદના નમૂનાઓ માટે MS3 માઇક્રોટિપ-સોનોટ્રોડથી સજ્જ). ઘટેલી અપારદર્શકતા અને વધેલી શ્યાનતા લાયસિસ થયું હોવાનું સૂચવે છે. આ પ્રક્રિયા બરફ પર કરવી આવશ્યક છે, અને અંતરાલોમાં સોનિકેશન કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે (દા.ત. 10 sec સોનિકેશન કર્યા બાદ બરફ પર 10 sec વિરામ, અને આ રીતે આગળ). અતિશય ઊંચી તીવ્રતાએ સોનિકેશન ન થાય તેની કાળજી લેવી આવશ્યક છે. જો ફીણ બનતું અથવા સફેદ અવક્ષેપ રચાતો જોવા મળે, તો તીવ્રતા ઘટાડવી જરૂરી છે.
- લાયસિસ કરેલા બેક્ટેરિયાના દ્રાવણને 1.5 mL માઇક્રોસેન્ટ્રિફ્યુજ ટ્યુબોમાં સ્થાનાંતરિત કરો અને 4°C પર 16,000 x g પર 20 min માટે સેન્ટ્રિફ્યુગેશન કરો.
UP400St જેવા પ્રોબ-પ્રકારના અલ્ટ્રાસોનિકેટરો E.coliના કાર્યક્ષમ લાયસિસ માટે ધ્વનિજન્ય કેવિટેશનના કાર્યસિદ્ધાંતનો ઉપયોગ કરે છે.
સોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને રિકૉમ્બિનન્ટ પ્રોટીનની અભિવ્યક્તિનું વિશ્લેષણ અને શુદ્ધિકરણ
E. coli ના પેલેટનું Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર UP100H વડે સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું. આ હેતુ માટે, કોષ પેલેટને ઠંડા કરેલા લાયસિસ બફર (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું અને બરફ પર 10 min સુધી ઠંડું કરવામાં આવ્યું. ત્યારબાદ, કોષ સસ્પેન્શનનું 10 s ના 10 ટૂંકા સ્પંદનો વડે સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું, અને દરેક સ્પંદન પછી ઠંડું કરવા માટે 30 s નો વિરામ રાખવામાં આવ્યો. અંતે, 4°C પર 15 min સુધી 14,000 rpm પર અલ્ટ્રાસેન્ટ્રિફ્યુગેશન કરીને કોષ અવશેષો દૂર કરવામાં આવ્યા. rPR ની અભિવ્યક્તિની પુષ્ટિ કરવા માટે, ઉપરના પ્રવાહીને 12% પોલિએક્રિલામાઇડ જેલ પર ચલાવવામાં આવ્યું અને SDS-PAGE તથા વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ વડે વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. ઉત્પાદકની માર્ગદર્શિકા અનુસાર Ni2+-NTA રેઝિન (Invitrogen, USA) નો ઉપયોગ કરીને rPR નું શુદ્ધિકરણ કરવામાં આવ્યું. આ તબક્કે, નેટિવ શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો. શુદ્ધ કરેલા પ્રોટીનની શુદ્ધતાનું મૂલ્યાંકન 12% પોલિએક્રિલામાઇડ જેલ પર ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ અને ત્યારબાદ કૂમાસી બ્લૂ સ્ટેઇનિંગ વડે કરવામાં આવ્યું. શુદ્ધ કરેલા પ્રોટીનની સાંદ્રતા Micro BCA પ્રોટીન એસે કિટ (PIERCE, USA) વડે માપવામાં આવી. (Azarnezhad et al. 2016)
E. coli ના લાયસિસ માટે અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર
Hielscher Ultrasonics, E. coli બેક્ટેરિયા અને અન્ય પ્રકારના કોષો, પેશીઓ તથા કોષ સંવર્ધનોના વિશ્વસનીય અને કાર્યક્ષમ લાયસિસ માટે ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝરની ડિઝાઇન, ઉત્પાદન અને પુરવઠો કરે છે.
અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ તેમજ પરોક્ષ સોનિકેશન પ્રણાલીઓની વિશાળ શ્રેણી અમને તમારા કોષ વિઘટન અને નિષ્કર્ષણના ઉપયોગ માટે આદર્શ અલ્ટ્રાસોનિક પેશી હોમોજેનાઇઝર પ્રદાન કરવા સક્ષમ બનાવે છે.
ડિઝાઇન, ઉત્પાદન અને પરામર્શ – જર્મનીમાં નિર્મિત ગુણવત્તા
Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર તેમની સર્વોચ્ચ ગુણવત્તા અને ડિઝાઇનનાં ધોરણો માટે જાણીતા છે. સ્માર્ટ સોફ્ટવેર, સહજ રીતે સમજી શકાય તેવું મેનુ, પ્રોગ્રામ કરી શકાય તેવાં સેટિંગ્સ અને સ્વચાલિત ડેટા નોંધણી એ Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટરની કેટલીક જ વિશેષતાઓ છે. મજબૂતાઈ અને સરળ સંચાલનને કારણે અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટરને સંશોધન અને બાયોટેક સુવિધાઓમાં સરળતાથી સામેલ કરી શકાય છે. કઠિન પરિસ્થિતિઓ અને પડકારજનક વાતાવરણમાં પણ Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર સરળતાથી કાર્ય કરે છે.
Hielscher Ultrasonics એક ISO પ્રમાણિત કંપની છે અને અત્યાધુનિક ટેકનોલોજી તથા વપરાશની સરળતા ધરાવતા ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા અલ્ટ્રાસોનિકેટર પર વિશેષ ભાર મૂકે છે. અલબત્ત, Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર CE અનુરૂપ છે અને UL, CSA તથા RoHs ની આવશ્યકતાઓ પૂર્ણ કરે છે.
નીચેનું કોષ્ટક અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટરની અંદાજિત પ્રક્રિયા ક્ષમતાનો ખ્યાલ આપે છે:
| બેચનું ઘનફળ | પ્રવાહ દર | ભલામણ કરેલાં ઉપકરણો |
|---|---|---|
| મલ્ટિ-વેલ / માઇક્રોટાઇટર પ્લેટો | n.a. | UIP400MTP |
| વાયલ અથવા બીકર માટે CupHorn | n.a. | અલ્ટ્રાસોનિક CupHorn |
| અલ્ટ્રાસોનિક માઇક્રો-ફ્લો રિએક્ટર | n.a. | GDmini2 |
| 0.5 થી 1.5mL ધરાવતી વધુમાં વધુ 10 વાયલ | n.a. | VialTweeter |
| 0.5 થી 1.5mL | n.a. | VialTweeter |
| 1 થી 500mL | 10 થી 200mL/min | UP100H |
| 10 થી 2000mL | 20 થી 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 થી 20L | 0.2 થી 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 થી 100L | 2 થી 10L/min | UIP4000 |
| n.a. | 10 થી 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | વધુ | ક્લસ્ટર જેમાં UIP16000 છે |
અમારો સંપર્ક કરો! / અમને પૂછો!
અલ્ટ્રાસોનિક E. coli લાયસિસ માટે વધારાના પ્રોટોકોલ
અલ્ટ્રાસોનિક VialTweeter નો ઉપયોગ કરીને E. coli માં એલિસિનથી સંશોધિત પ્રોટીન
5,5′-ડાઇથાયોબિસ(2-નાઇટ્રોબેન્ઝોઇક એસિડ) (DTNB) એસે વડે સલ્ફહાઇડ્રિલની માત્રાનું નિર્ધારણ
E. coli MG1655 ના રાતભરના સંવર્ધનનો ઉપયોગ MOPS લઘુતમ માધ્યમમાં ઇનોક્યુલેશન કરવા માટે કરવામાં આવ્યો (1:100). A600 નું મૂલ્ય 0.4 થાય ત્યાં સુધી સંવર્ધનને વાયુજીવી પરિસ્થિતિઓમાં ઉછેરવામાં આવ્યું. તાણની સારવાર માટે સંવર્ધનને 15-ml ના ત્રણ સંવર્ધનોમાં વહેંચવામાં આવ્યું. સારવાર ન કરેલું એક સંવર્ધન નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાયું. બાકીનાં બે સંવર્ધનોમાંથી એકમાં 0.79 mM એલિસિન (128 μg ml-1) અને બીજામાં 1 mM ડાયમાઇડ ઉમેરવામાં આવ્યું. સંવર્ધનોને 15 min સુધી ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યાં. દરેક સંવર્ધનમાંથી 5 ml સેન્ટ્રિફ્યુગેશન (8,525 × g, 4°C, 10 min) વડે એકત્ર કરવામાં આવ્યાં. કોષોને 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, ઉપયોગ પહેલાં અવાયુજીવી પરિસ્થિતિઓમાં સંગ્રહિત) વડે બે વાર ધોવામાં આવ્યા અને સેન્ટ્રિફ્યુગ કરવામાં આવ્યા (13,000 × g, 4°C, 10 min). 4°C પર અલ્ટ્રાસોનિકેશન વડે વિઘટન કરતાં પહેલાં કોષોને લાયસિસ બફર (6 mM ગ્વાનિડિનિયમ HCl ધરાવતું PBS, pH 7.4) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા (VialTweeter અલ્ટ્રાસોનિકેટર, Hielscher GmbH, જર્મની) (3 × 1 min). સેન્ટ્રિફ્યુગેશન (13,000 × g, 4 °C, 15 min) દ્વારા કોષીય અવશેષોની પેલેટ બનાવવામાં આવી. ઉપરના સ્વચ્છ પ્રવાહીને ચુંબકીય સ્ટિર બાર ધરાવતી 3.5-ml QS-macro ક્યુવેટ (10 mm)માં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યું અને 1 ml લાઇસિસ બફર સાથે મિશ્રિત કરવામાં આવ્યું. ઓરડાના તાપમાને PSC-718 તાપમાન-નિયંત્રિત સેલ હોલ્ડરથી સજ્જ Jasco V-650 સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર વડે 412 nm પર નમૂનાઓની શોષકતાનું નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું. 3 mM ડાઇથિઓબિસ(2-નાઇટ્રોબેન્ઝોઇક એસિડ) દ્રાવણના 100μl ઉમેરવામાં આવ્યા. શોષકતા સંતૃપ્તિ સુધી પહોંચે ત્યાં સુધી તેનું નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું. થાયોલની સાંદ્રતાની ગણતરી વિલોપન ગુણાંક ϵ412 = 13,700 M-1 cm-1 નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી, જે થિઓ-2-નાઇટ્રોબેન્ઝોઇક એસિડ (TNB) માટેનો છે. કોષીય થાયોલની સાંદ્રતાઓ E. coli કોષોના 6.7 × 10-15 લિટર આયતન અને A600 = 0.5 જેટલી કોષ ઘનતા (1 × 108 કોષો ml-1 કલ્ચરની સમકક્ષ)ના આધારે ગણવામાં આવી. (Müller et al. 2016)
અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટકનો ઉપયોગ કરીને ઇન વિવો ગ્લુટાથાયોનનું નિર્ધારણ
E.coli MG1655 ને MOPS લઘુત્તમ માધ્યમમાં કુલ 200ml આયતનમાં A600 નું મૂલ્ય 0.5 થાય ત્યાં સુધી ઉછેરવામાં આવ્યું. તાણની સારવાર માટે કલ્ચરને 50-ml કલ્ચરોમાં વહેંચવામાં આવ્યું. 0.79 mM એલિસિન, 1 mM ડાયમાઇડ અથવા ડાઇમિથાઇલ સલ્ફોક્સાઇડ (નિયંત્રણ) સાથે 15 min ઇન્ક્યુબેશન પછી, કોષોને 4°C પર 4,000g એ 10 min સેન્ટ્રિફ્યુગ કરીને એકત્રિત કરવામાં આવ્યા. પેલેટોને 700µl KPE બફરમાં ફરીથી નિલંબિત કરતાં પહેલાં કોષોને KPE બફરથી બે વાર ધોવામાં આવ્યા. પ્રોટીન દૂર કરવા માટે, અલ્ટ્રાસોનિકેશન દ્વારા કોષ વિઘટન કરતાં પહેલાં 10% (w/v) સલ્ફોસેલિસિલિક એસિડના 300l ઉમેરવામાં આવ્યા (3 x 1 min; VialTweeter અલ્ટ્રાસોનિકેટર). સેન્ટ્રિફ્યુગેશન (30 min, 13,000g, 4°C) પછી ઉપરનાં સ્વચ્છ પ્રવાહીઓ એકત્રિત કરવામાં આવ્યાં. KPE બફરના 3 આયતન ઉમેરવાથી સલ્ફોસેલિસિલિક એસિડની સાંદ્રતાઓ ઘટાડીને 1% કરવામાં આવી. કુલ ગ્લુટાથાયોન અને GSSG નું માપન ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે કરવામાં આવ્યું. કોષીય ગ્લુટાથાયોનની સાંદ્રતાઓ E. coli કોષોના 6.7×10-15 લિટર આયતન અને A600 0.5 જેટલી કોષ ઘનતા (1×108 કોષો ml-1 કલ્ચરની સમકક્ષ)ના આધારે ગણવામાં આવી. GSH ની સાંદ્રતાઓ કુલ ગ્લુટાથાયોનમાંથી 2[GSSG] બાદ કરીને ગણવામાં આવી. (Müller et al. 2016)
અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝરનો ઉપયોગ કરીને E. coli માં માનવ mAspAT ની અભિવ્યક્તિ
અભિવ્યક્તિ વેક્ટર ધરાવતી E. coli BL21 (DE3) ની એક કોલોનીને 100μg/mL એમ્પિસિલિન ધરાવતા 30 mL Luria-Bertani (LB) માધ્યમમાં મૂકવામાં આવી અને પછી 37ºC પર ઉછેરવામાં આવી, જ્યાં સુધી પ્રકાશીય ઘનતા (OD600) 0.6 સુધી ન પહોંચી. કોષોને 4,000 × g પર 10 min સેન્ટ્રિફ્યુગ કરીને એકત્રિત કરવામાં આવ્યા અને 100μg/mL એમ્પિસિલિન ધરાવતા 3L તાજા LB માધ્યમમાં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવ્યા.
ત્યારબાદ, 1 mM આઇસોપ્રોપાઇલ β-ᴅ-1-થિયોગેલેક્ટોપાયરાનોસાઇડ (IPTG) વડે 16ºC પર 20 h માટે પ્રોટીનની અભિવ્યક્તિ પ્રેરિત કરવામાં આવી. કોષોને 8,000 × g પર 15 min સેન્ટ્રિફ્યુગ કરીને એકત્રિત કરવામાં આવ્યા અને બફર A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4) વડે ધોવામાં આવ્યા. 3 L કલ્ચરમાંથી આશરે 45g (ભીનું વજન) કોષો મેળવવામાં આવ્યા. સેન્ટ્રિફ્યુગેશન પછી, કોષોની પેલેટોને 40 mL (1 L કલ્ચર માટે) બરફ જેવા ઠંડા નિષ્કર્ષણ બફર A માં ફરીથી નિલંબિત કરવામાં આવી અને Hielscher અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિઘટક UP400St નો ઉપયોગ કરીને બરફ જેવા ઠંડા તાપમાને અલ્ટ્રાસોનિકેશન દ્વારા લાઇસિસ કરવામાં આવ્યું. દ્રાવ્ય (ઉપરનું સ્વચ્છ પ્રવાહી) અને અવક્ષેપિત (પેલેટ) અંશોને અલગ કરવા માટે કોષ લાઇસેટને 12,000 rpm પર 15 min સેન્ટ્રિફ્યુગ કરવામાં આવ્યું. (Jiang et al. 2015)
જાણવા યોગ્ય તથ્યો
E.coli
Escherichia coli (E. coli) એ Escherichia વંશનું ગ્રામ-નેગેટિવ, વૈકલ્પિક રીતે અવાયુજીવી, દંડાકાર, કોલિફોર્મ બેક્ટેરિયમ છે, જે સામાન્ય રીતે ઉષ્ણરક્તી સજીવોના (એન્ડોથર્મ્સના) આંતરડાના નીચલા ભાગમાં જોવા મળે છે. વિવિધ લાક્ષણિકતાઓ ધરાવતી E. coli ની અસંખ્ય જાતો (અથવા પેટાપ્રકારો) છે. E. coli ની મોટાભાગની જાતો મનુષ્યો માટે હાનિરહિત છે, ઉદાહરણ તરીકે B અને K-12 જાતો, જેનો પ્રયોગશાળાઓમાં સંશોધન માટે સામાન્ય રીતે ઉપયોગ થાય છે. જોકે, કેટલીક જાતો હાનિકારક છે અને ગંભીર બીમારી પેદા કરી શકે છે.
E. coli આધુનિક જૈવિક ઇજનેરી અને ઔદ્યોગિક સૂક્ષ્મજીવવિજ્ઞાનમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે, કારણ કે આ બેક્ટેરિયામાં ફેરફાર કરવો સરળ છે. પ્રયોગશાળાના સામાન્ય ઉપયોગોમાં વારંવાર E. coli નો ઉપયોગ થાય છે, ઉદાહરણ તરીકે રિકોમ્બિનન્ટ ડિઓક્સિરાઇબોન્યુક્લિક એસિડ (DNA) બનાવવા માટે અથવા મોડેલ સજીવ તરીકે.
વિજાતીય પ્રોટીનના ઉત્પાદન માટે E. coli અત્યંત બહુમુખી યજમાન છે, અને E. coli માં રિકોમ્બિનન્ટ પ્રોટીન બનાવવા માટે અનેક પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ પ્રણાલીઓ ઉપલબ્ધ છે. પ્રોટીનની ઉચ્ચ સ્તરની અભિવ્યક્તિને મંજૂરી આપતા પ્લાઝ્મિડનો ઉપયોગ કરીને બેક્ટેરિયામાં જનીનો દાખલ કરી શકાય છે, જે ઔદ્યોગિક આથવણ પ્રક્રિયાઓમાં આવા પ્રોટીનનું મોટા જથ્થામાં ઉત્પાદન શક્ય બનાવે છે.
ઇન્સ્યુલિન બનાવવા માટે E.coli નો કોષ ફેક્ટરીઓ તરીકે ઉપયોગ થાય છે. અન્ય ઉપયોગોમાં રસીઓ અને સ્થિરીકૃત ઉત્સેચકો વિકસાવવા અને બનાવવા, જૈવઇંધણ બનાવવા તેમજ જૈવ ઉપચારણ માટે સંશોધિત E. coli કોષોનો ઉપયોગ સામેલ છે.
K-12 જાત એ E. coli નું એક ઉત્પરિવર્તિત સ્વરૂપ છે, જે આલ્કલાઇન ફોસ્ફેટેઝ (ALP) ઉત્સેચકની અતિઅભિવ્યક્તિ કરે છે. આ ઉત્પરિવર્તન એ જનીનમાં રહેલી ખામીને કારણે થાય છે, જે સતત આ ઉત્સેચક માટે કોડ કરે છે. જો કોઈ જનીન કોઈપણ અવરોધ વિના ઉત્પાદન બનાવે, તો તેને સતત સક્રિયતા કહેવામાં આવે છે. આ વિશિષ્ટ ઉત્પરિવર્તિત સ્વરૂપનો ઉપયોગ ALP ઉત્સેચકના અલગીકરણ અને શુદ્ધિકરણ માટે થાય છે.
E. coli બેક્ટેરિયાનો કોષ ફેક્ટરીઓ તરીકે પણ વ્યાપક ઉપયોગ થાય છે. ઇજનેરી દ્વારા સંશોધિત સૂક્ષ્મજીવો (દા.ત., બેક્ટેરિયા) અને વનસ્પતિ કોષોનો કહેવાતી કોષ ફેક્ટરીઓ તરીકે ઉપયોગ કરી શકાય છે. આ આનુવંશિક રીતે સંશોધિત કોષો અણુઓ, રસાયણો, પોલિમર, પ્રોટીન અને અન્ય પદાર્થો બનાવે છે, જેનો ઉપયોગ, ઉદાહરણ તરીકે, ઔષધ, ખાદ્ય અને રાસાયણિક ઉદ્યોગોમાં થાય છે. આવા જૈવ ઇજનેરી દ્વારા સંશોધિત કોષોની અંદર બનેલા અણુઓને મુક્ત કરવા માટે, અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસિસ એ કોષદીવાલોનું વિઘટન કરવાની અને લક્ષિત પદાર્થોને આસપાસના પ્રવાહીમાં સ્થાનાંતરિત કરવાની એક સામાન્ય પદ્ધતિ છે. જૈવ ઇજનેરી દ્વારા સંશોધિત કોષોના લાઇસિસ વિશે વધુ વાંચો!
અલ્ટ્રાસોનિક DNA શિયરિંગ
અલ્ટ્રાસોનિક શિયર બળોનો ઉપયોગ કોષની અંદરથી અણુઓ, કોષાંગો અને પ્રોટીન મુક્ત કરવા તેમજ DNA તંતુઓને ટુકડાઓમાં તોડવા માટે સામાન્ય પદ્ધતિ તરીકે થાય છે. ધ્વનિક કેવિટેશન કોષોમાંથી DNA નિષ્કર્ષિત કરવા માટે કોષદીવાલો અને પટલોને તોડે છે અને લગભગ 600 – 800 bp લંબાઈના ખંડો બનાવે છે, જે વિશ્લેષણ માટે આદર્શ છે.
DNA ખંડીકરણ માટેના અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર વિશે વધુ જાણવા અહીં ક્લિક કરો!
સાહિત્ય / સંદર્ભો
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર પ્રયોગશાળાના કદ થી ઔદ્યોગિક કદ સુધી બનાવે છે.