ઇ. કોલીના અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ

• કોલાઇ બેક્ટેરિયા માઇક્રોબાયોલોજી અને બાયોટેકનોલોજી સૌથી સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં બેક્ટેરિયા છે.
• અલ્ટ્રાસોનિક સેલ disruptors ઇ કોલી lysis માટે વિશ્વસનીય અને પ્રજનન પરિણામો વિતરિત.
• તીવ્ર હજુ સુધી ચોક્કસપણે નિયંત્રણક્ષમ પોલાણ અને દબાણમાં દળો સંપૂર્ણ વિક્ષેપ અને ઉચ્ચ નિષ્કર્ષણ ઉપજ (દા.ત. પ્રોટીન, ડીએનએ) માં પરિણમે છે.

પોલાણ દ્વારા સેલ વિક્ષેપ

અલ્ટ્રાસોનિક ચકાસણી પ્રકારના homogenizers આશરે સાથે કામ કરે છે. (20kHz ખાતે) પ્રતિ સેકન્ડ 20,000 ચક્ર અને પ્રવાહી અથવા supsensions માં પોલાણ કારણ બને છે. વેક્યૂમ જેવા દબાણ અને ઊંચા તાપમાને કે જેમાં શરીરના કોશિકાઓ સિવાય તોડીને એકોસ્ટિક પોલાણ માઇક્રોસ્કોપિક વિસ્તારોમાં. જોકે તાપમાન કેટલાક હજાર ડિગ્રી સેલ્સિયસ સુધી પહોંચી શકે છે, પોલાણ વોલ્યુમો જેથી નાના તેઓ પ્રક્રિયા નોંધપાત્ર ગરમી નથી. અલ્ટ્રાસાઉન્ડ એકોસ્ટિક પોલાણ પેદા થાય છે અને દબાણમાં દળો છિદ્ર વાટે અથવા E.coli ના કોષ પટલ તૂટી – અવાજ homogenizer ઉપકરણ સેટિંગ પર આધાર રાખે છે.

અલ્ટ્રાસોનિક lysis લાભો

• lysis ચોક્કસ નિયંત્રણ (તીવ્રતા, કંપનવિસ્તાર, તાપમાન)
• ચોક્કસ નમૂનાઓ શ્રેષ્ઠ અનુકૂલન
• તાપમાન નિયંત્રણ
• ખૂબ જ નાના માટે ખૂબ જ મોટી નમૂનાઓ માટે (એમએલ લિટર)
• શુદ્ધ યાંત્રિક સારવાર
• રેખીય ઉત્પાદન માટે લેબ માંથી સ્કેલ અપ

જ્યારે રાસાયણિક અને enzymtic lysis સમસ્યારૂપ બની શકે – ત્યારથી રાસાયણિક lysis પ્રોટીન માળખા બદલવા અને શુદ્ધિકરણ સમસ્યાઓ અને એન્જીમેટિક lysis દાખલ કરી શકો છો લાંબા સમય સુધી સેવન વખત જરૂરી છે અને પ્રજનન નથી – અવાજ ભંગાણ એક વ્યવહારદક્ષ, ઝડપી સેલ ભંગાણ પદ્ધતિ છે.
અલ્ટ્રાસોનિક લિસીસ ફક્ત યાંત્રિક દળો પર આધારિત છે. કોઈ રસાયણો ઉમેરવામાં આવતા નથી, સોનીકેશન શિયર દળો દ્વારા કોષની દિવાલ તોડી નાખે છે. રાસાયણિક લિસીસ પ્રોટીન રચનામાં ફેરફાર કરી શકે છે અને શુદ્ધિકરણની સમસ્યાઓ રજૂ કરી શકે છે. એન્ઝાઇમેટિક વિક્ષેપ માટે લાંબા ગાળાના સમયની જરૂર પડે છે અને તે પુનrodઉત્પાદનક્ષમ નથી. ઇકોલી બેક્ટેરિયાના કોષોનું અલ્ટ્રાસોનિક કોષ વિક્ષેપ ઝડપી, સરળ, વિશ્વસનીય અને પ્રજનનક્ષમ છે. તેથી જ હિલ્સચર અલ્ટ્રાસોનિસેટર્સનો ઉપયોગ વિશ્વભરની જૈવિક અને બાયોકેમિકલ પ્રયોગશાળાઓમાં નમૂનાની તૈયારી, પ્રી-એનાલિટીક્સ, ઇન-વિટ્રો ડાયગ્નોસ્ટિક્સ અને મેનીફોલ્ડ એસેઝ માટે થાય છે.

જનરલ ભલામણો

Sonication સેલ સસ્પેન્શન ખૂબ નાના, મધ્યમ અને મોટા જથ્થામાં lysing માટે સૌથી વધુ લોકપ્રિય ટેકનિક છે – 100L / કલાક સુધી Pico-લિટર માંથી (એક અવાજ પ્રવાહ સેલ મદદથી). કોષ પ્રવાહી દબાણમાં અને પોલાણ દ્વારા lysed આવે છે. ડીએનએ પણ sonication દરમિયાન sheared છે, તેથી તેને સેલ સસ્પેન્શન તરફ DNase ઉમેરવા જરૂરી નથી.
તાપમાન નિયંત્રણ:
નમૂના પૂર્વ ઠંડક અને બરફ પર sonication દરમિયાન નમૂના રાખીને, નમૂના થર્મલ અધઃપતન સરળતાથી અટકાવી શકાય છે.
આદર્શ રીતે, લિસિસ દરમિયાન નમૂનાને બરફ-ઠંડુ રાખવું જોઇએ, પરંતુ મોટાભાગના નમૂનાઓ માટે જો તાપમાન તાપમાન અથવા પેશીઓના સ્રોતના તાપમાનથી ઉપર ન વધે તો તે પૂરતું છે. તેથી બરફની સસ્પેન્શન રાખવા અને 5-10 સેકંડના કેટલાક ટૂંકા અલ્ટ્રાસોનિકલ્સના કઠોળ અને 10-30 સેકન્ડના વિરામ સાથે સૉકેટ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે. વિરામ દરમિયાન, ઉષ્ણતામાન નીચા તાપમાનને ફરીથી સ્થાપિત કરવા માટે ઓગાળી શકે છે. મોટા સેલ નમૂનાઓ માટે, કૂલિંગ જેકેટ સાથે વિવિધ ફ્લો સેલ રિએક્ટર ઉપલબ્ધ છે.

કોલાઇ Lysates તૈયાર કરવા માટે શિષ્ટાચાર

અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ અને રિકોમ્બિનન્ટ પ્રોટીનના શુદ્ધિકરણ

કોલાઇ પેલેટ એક અવાજ સિસ્ટમ સાથે sonicated કરવામાં આવી હતી UP100H (Hielscher). આ હેતુ માટે, સેલ પેલેટને ઠંડું લિસિસ બફર (50 એમએમ ટ્રિસ-એચસીએલ પીએચ = 7.5, 100 એમએમ નાકેલ, 5 એમએમ ડીટીટી, 1 એમએમ પીએમએસએફ) માં રિસુસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું અને 10 મિનિટ માટે બરફ પર ઠંડુ કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ, સેલ સસ્પેન્શનને 10 સેકંડના 10 ટૂંકા વિસ્ફોટ સાથે કોન્ટ્રેકશન કરવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ ઠંડક માટે 30 સે. છેલ્લે, સેલ કચરો 4 ડિગ્રી સેલ્સિયસ દ્વારા 14000 આરપીએમ પર 15 મિનિટ માટે અલ્ટ્રાસેન્ટ્રિફ્યુગેશન દ્વારા દૂર કરવામાં આવ્યો હતો. આરઆરપીઆર અભિવ્યક્તિની પુષ્ટિ માટે, સપાટી પરની સપાટી પર 12% પોલીક્રીલામાઇડ જેલ પર ચાલતો હતો અને SDS-PAGE અને પશ્ચિમી બ્લોટિંગ દ્વારા તેનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. આરપીઆરની શુદ્ધિકરણ ની મદદથી કરવામાં આવી હતી²⁺-NTA રેઝિન (Invitrogen, યુએસએ) ઉત્પાદકની માર્ગદર્શિકા અનુસાર. આ તબક્કે, મૂળ શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિ ઉપયોગ થતો હતો. શુદ્ધ પ્રોટીન શુદ્ધતા 12% polyacrylamide જેલ અને અનુગામી Coomassie વાદળી સ્ટેનિંગ પર ઇલેક્ટ્રો મદદથી આકારણી કરવામાં આવી હતી. શુદ્ધ પ્રોટીન એકાગ્રતા સૂક્ષ્મ BCA પ્રોટીન નિબંધ કિટ (પીયર્સ, યુએસએ) દ્વારા માપવામાં આવ્યો હતો. (Azarnezhad એટ અલ. 2016)

સેલ ગ્રોથ, Crosslinking અને ઇ કોલી સેલ અર્ક ની તૈયારી

SeqA અને આરએનએ પોલિમરેઝ ચિપ-ચિપ કોલાઇ MG1655 અથવા MG1655 ΔseqA માટે OD 37 ° C પર મોટો થયો₆₀₀ ફોર્મલડિહાઈડ (37%) પ્રતિ મિલી માધ્યમ (અંતિમ એકાગ્રતા 1%) ના 27 μl પહેલાં 50 મિલિગ્રામ એલબી (+ 0.2% ગ્લુકોઝ) માં 0.15 વિશે. ક્રોસલીન્કિંગ 20 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને ધીમી ઝાંખા (100 આરપીએમ) પર કરવામાં આવ્યું હતું અને તે પછી 10 મિલીલીટર 2.5 એમ ગ્લાયસીન (અંતિમ એકાગ્રતા 0.5 એમ) સાથે શ્વસન કરવામાં આવ્યું હતું. ઉષ્ણ આંચકા પ્રયોગો માટે, ઇ. કોલી એમજી1655 ઉદર 30 મીટર સેલ્સિયસના ઉમરથી 65 મીલી એલબી માધ્યમમાં ઉગાડવામાં આવ્યો હતો.₆₀₀ લગભગ 0.3. ત્યારબાદ 30 મીલીયન સંસ્કૃતિ પૂર્વ-ગરમ ફ્લાસ્કને 43 ડીગ્રી સેલ્સિયસમાં તબદિલ કરવામાં આવી હતી અને બાકીના 30 ડિગ્રી સેલ્સિયસ રાખવામાં આવ્યા હતા. ઓરડાના તાપમાને વધુ ધુમાડો થતાં પહેલાં કોશિકાઓએ 30 અથવા 43 ડિગ્રી સેલ્સિયસ રાખ્યા બાદ ક્રોસલીંકિંગ અને ક્વીનિંગને ઉપર વર્ણવ્યા અનુસાર કરવામાં આવી હતી. કોષોને સેન્ટ્રિફ્યુગેશન દ્વારા એકત્રિત કરવામાં આવ્યાં અને ઠંડા ટીબીએસ (પીએચ 7.5) સાથે બે વખત ધોવાઇ. 1 મિલિલેશન બફર (10 એમએમ ટ્રીસ (પીએચ 8.0), 20% સુક્રોઝ, 50 એમએમ નાવિક, 10 એમએમ EDTA, 10 એમજી / એમએલ લાઇસોઝીમે) અને સેક્સ્યુલેશન પછી 30 મીટર માટે 37 ડિગ્રી સેલ્સિયસમાં રિસુસ્પેન કર્યા પછી 4 એમએલ આઈપી બફર, કોશિકાઓ બરફ પર 12 વખત 30 સેકંડ અને 30 સેકંડના બ્રેક સાથેનું એકીકરણ કરવામાં આવતું હતું UP400St અવાજ પ્રોસેસર 100% શક્તિ સાથે (Hielscher Ultrasonics જીએમબીએચ). 9000 ગ્રામ 10 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી, 800 supernatant ના એમએલ aliquotes -20 ° C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવી હતી. (Waldminghaus 2010)

ઉત્પાદન અને ઉત્સેચકો શુદ્ધિકરણ.

decahistidine (His10) -tagged પ્રોટીન ઉત્પાદન માટે, કોલાઇ BL21 (DE3) pET19b સર્જન સાથે રૂપાંતરિત કરવામાં આવી હતી. રાતોરાત preculture સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા ખેતી કરવામાં આવી હતી, અને 1% અભિવ્યક્તિ સંસ્કૃતિ રોગપ્રતિબંધક રસી મૂકવી માટે થતો હતો. pET19mgtB વહન કોશિકાઓ (OD 600 nm ના સ્તરે ઓપ્ટિકલ ઘનતા સુધી 22 ° C તાપમાને ઉગાડવામાં આવતા હતા₆₀₀) 0.7 છે. સંસ્કૃતિ 17 ° સે બદલી કરવામાં આવી અને 100 μM IPTG દ્વારા પ્રેરિત કરવામાં આવી હતી. 16 એચ પછી, સંસ્કૃતિ 4 ° C ખાતે 7500 × ગ્રામ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા ખેતી કરવામાં આવી હતી. કોષ એક S2 સૂક્ષ્મ-ટિપ Sonotrode સાથે પીએચ 7.4 ખાતે 50 એમએમ ફોસ્ફેટ બફર ખારા (PBS) 0.3 m NaCl સાથે resuspended અને અલ્ટ્રાસાઉન્ડ દ્વારા વિક્ષેપ પાડ્યો હતા UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, જર્મની) 0.5 એક ચક્ર અને 75% ની કંપનવિસ્તાર છે.
decahistidine-ટેગ કર્યાં GtfC જરૂરિયાતથી ઘણું વધારે ઉત્પાદન એક OD ખાતે 37 ° C તાપમાને પ્રેરિત કરવામાં આવી હતી₆₀₀ 100 μM IPTG સાથે 0.6 છે. કોષ પછી, 4 કલાક માટે સેવવામાંઆવે ખેતી, અને MgtB માટે ઉપર જણાવ્યું lysed કરવામાં આવી હતી.
ક્રૂડ સેલ અર્ક 15,000 × ગ્રામ અને 4 ° C તાપમાને સેન્ટ્રિફ્યુજ હતા સેલ ભંગાર કાંપ છે. સ્પષ્ટતા અર્ક 1 મિલી HisTrap એફએફ ક્રૂડ કૉલમ એક ÄKTAprime પ્લસ સિસ્ટમ (જીઈ હેલ્થકેર) ના ઉપયોગ પર લોડ કરવામાં આવી હતી. ઉત્સેચકો તેમના-ટેગ કર્યાં પ્રોટીન ઢોળાવ elution માટે ઉત્પાદકની પ્રોટોકોલ અનુસાર શુદ્ધ કરવામાં આવી હતી. Eluted પ્રોટીન ઉકેલો 4 ° C તાપમાને 50 એમએમ પીબીએસ, પીએચ 7.4, 0.3 એમ NaCl સાથે 1,000 વોલ્યુમો સામે તેણે બે વાર dialyzed કરવામાં આવી હતી. શુદ્ધિકરણ 12% એસડીએસ પાનાની દ્વારા પૃથક્કરણ કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રોટીન એકાગ્રતા રોટી-કોન્ટના (કાર્લ રોથ જીએમબીએચ, કાર્લસ્રૂ, જર્મની) ની મદદથી બ્રેડફોર્ડ પદ્ધતિ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવ્યું છે. (Rabausch એટ અલ. 2013)

કોલાઇ બેક્ટેરિયા પ્રોટીન ના નિષ્કર્ષણ
રસ એક બાઈટ પ્રોટીન (આ કિસ્સામાં, આર્બિડોપ્સિસ થલિયાના ના MTV1) એક જીએસટી ટેગ કરવા એકીકૃત અને BL21 એસ્કેરિકીયા કોલી (ઇ કોલી) કોષો વ્યક્ત કરવામાં આવે છે.
1. જીએસટી-MTV1 અને જીએસટી એક પેલેટ લો (50 મિલી અનુરૂપ બેક્ટેરીયલ સંસ્કૃતિ) અને 2.5 એમએલ બરફ ઠંડા નિષ્કર્ષણ બફર દરેક resuspend.
2. એક ultrasonicator વાપરો UP100H ત્યાં સુધી તેઓ lysed આવે છે ઘટાડો અસ્પષ્ટ અને વધતા સ્નિગ્ધતા દ્વારા સૂચવવામાં આવે છે બેક્ટેરીયલ કોશિકાઓનો પણ વિધ્વંસ ((2-5mL) નાના વોલ્યુમો માટે MS3 microtip-Sonotrode સજ્જ). આ બરફ પર હાથ ધરવામાં કરી શકાય છે, અને તે (દા.ત. 10 સેકન્ડ sonicating બરફ પર 10 સેકન્ડ અને તેથી અનુસરતા) અંતરાલો માં sonicate ભલામણ કરવામાં આવે છે. કેર ખૂબ ઊંચો તીવ્રતા સાથે sonicate નથી લેવામાં આવશે ધરાવે છે. જો foaming અથવા સફેદ અવક્ષેપ રચના શોધ્યું છે, તીવ્રતા ઘટાડો કરવાની જરૂર છે.
3. 4 ° C 16,000 x 20 મિનિટ માટે જી 1.5 એમએલ microcentrifuge ટ્યુબ માટે lysed બેક્ટેરિયા ઉકેલ અને સેન્ટ્રિફ્યુજ સ્થાનાંતરિત કરો.

કોલાઇ માં Allicin સુધારેલા પ્રોટીન્સ

5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic એસિડ) (DTNB) ટચ દ્વારા Sulfhydryl કન્ટેન્ટ્સ નિર્ધારણ
એક કોલાઇ MG1655 રાતોરાત સંસ્કૃતિ Mops ન્યૂનતમ મધ્યમ (: 100 1) રોગપ્રતિબંધક રસી મૂકવી માટે થતો હતો. સંસ્કૃતિ aerobically મોટો થયો ત્યાં સુધી 0.4 એક A600 પર પહોંચી હતી. સંસ્કૃતિ તણાવ સારવાર માટે ત્રણ 15 મિલી સંસ્કૃતિઓ વિભાજિત કરવામાં આવી હતી. એક સારવાર ન સંસ્કૃતિ નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે સેવા આપી હતી. 0.79 mM allicin (128 યુજી મિલી^-1) અથવા 1 મિમી diamide બાકીના બે સંસ્કૃતિઓ દરેક એક ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. કલ્ચર્સ 15 મિનિટ માટે સેવવામાંઆવે આવી હતી. દરેક સંસ્કૃતિ 5 મિલી સેન્ટ્રીફ્યુગેશન (8,525 × જી, 4 ° C, 10 મિનિટ) દ્વારા ખેતી કરવામાં આવી હતી. કોષ પીબીએસ (137 mM NaCl, 2.7 mM કેસીએલ, 10 mm ના 1 મિલી સાથે બે વાર ધોવાઇ કરવામાં આવી હતી₂એચપીઓ₄, 2 મીમી કેએચ₂પોસ્ટ₄, પીએચ 7.4, ઍનોરોબિકલી ઉપયોગ પહેલાં) અને સેન્ટ્રીફ્યુડ (13,000 × જી, 4 ° સે, 10 મિનિટ). સેલ્સને લિસિસ બફર (પીબીએસ સાથે 6 એમએમ ગ્યુનેડીનિયમ એચસીએલ, પીએચ 7.4) માં રિસુસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું.વીયલટેવેટર ultrasonicator, Hielscher જીએમબીએચ, જર્મની) (3 × 1 મિનિટ). સેલ ભંગાર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન (13,000 × જી, 4 ° C થી 15 મિનિટ) દ્વારા pelleted હતી. supernatant ચુંબકીય હલચલ બાર સાથે 3.5 મિલી ક્યુએસ સ્થૂળ Cuvette (10 મિમી) બદલી કરવામાં આવી અને lysis બફર 1 મિલી સાથે મિશ્ર કરવામાં આવી હતી. નમૂનાઓની લુપ્તતા એક Jasco વી 650 PSC-718 તાપમાન નિયંત્રિત સેલ ધારક (Jasco) ઓરડાના તાપમાને સજ્જ Spectrophotometer સાથે 412 nm ના સ્તરે મોનીટર કરવામાં આવી હતી. એક 3 મીમી dithiobis (2-nitrobenzoic એસિડ) ઉકેલ 100μl ઉમેરવામાં આવ્યા હતા. લુપ્તતા મોનીટર કરવામાં આવી હતી ત્યાં સુધી તે સંતૃપ્તિ સુધી પહોંચી હતી. thiol એકાગ્રતા ગણતરી લુપ્ત ગુણાંક ε ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો₄₁₂ = 13.700 એમ^-1 સે.મી.^-1 thio-2-nitrobenzoic એસિડ (TNB માટે). સેલ્યુલર thiol સાંદ્રતા 6.7 × 10 કોલાઇ કોશિકાઓ વોલ્યુમ પર આધારિત ગણતરી કરવામાં આવી હતી^-15 લિટર અને એ સેલ ઘનતા₆₀₀ = 0.5 (સમકક્ષ 1 × 10⁸ કોષો મિલી^-1 સંસ્કૃતિ). (મુલર એટ અલ. 2016)

Vivo Glutathione નિર્ધારણમાં

E.coli MG1655 એ સુધી 200ml કુલ વોલ્યુમ Mops ન્યૂનતમ મધ્યમ ઉગાડવામાં આવી હતી₆₀₀ 0.5 ની અંદર પહોંચી હતી. તણાવની સારવાર માટે સંસ્કૃતિને 50-એમએલ સંસ્કૃતિઓમાં વિભાજિત કરવામાં આવી હતી. 0.79 એમએમ એરિકિન, 1 એમએમ હીરાડ, અથવા ડાઇમેથાઇલ સલ્ફોક્સાઈડ (નિયંત્રણ) સાથેના સેવનના 15 મિનિટ પછી, કોશિકાઓ 4,000 ગ્રામ 4 ડિગ્રી સે કેપીએ બફરના 700μl માં ગોળીઓના રિસુપેન્શન પહેલાં કેપ્સ બફર સાથે બે વખત કોષો ધોવાઇ ગયા હતા. Deprotination માટે, 10% ની 300l (w / v) sulfosalicylic એસિડ ultrasonication દ્વારા કોષો વિક્ષેપ પહેલાં ઉમેરવામાં આવ્યા હતા (3 x 1 મિનિટ; વીયલટેવેટર ultrasonicator). Supernatants (30 મિ, 13,000g, 4 ° સે) સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. Sulfosalicylic એસિડ સાંદ્રતા KPE બફર 3 વોલ્યુમો ઉમેરાથી 1% ઘટાડો કરવામાં આવ્યો હતો. કુલ glutathione અને GSSG માપદંડ ઉપર વર્ણવ્યા કરવામાં આવી હતી. સેલ્યુલર glutathione સાંદ્રતા ઇ એક વોલ્યુમ પર આધારિત ગણતરી કરવામાં આવી હતી 6.7 કોશિકાઓ કોલી×10^-15 લિટર અને એ સેલ ઘનતા₆₀₀ 0.5 (1 સમકક્ષ×10⁸ કોષો મિલી^-1 સંસ્કૃતિ). GSH સાંદ્રતા 2 [GSSG] કુલ glutathione થી બાદબાકી દ્વારા ગણતરી કરવામાં આવી હતી. (મુલર એટ અલ. 2016)