ઇ. કોલીનું અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ
- ઇ. કોલી બેક્ટેરિયા એ માઇક્રોબાયોલોજી અને બાયોટેકનોલોજીમાં સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતા બેક્ટેરિયા છે.
- અલ્ટ્રાસોનિક સેલ વિક્ષેપકો E. coli ના lysis માટે વિશ્વસનીય અને પુનઃઉત્પાદન કરી શકાય તેવા પરિણામો આપે છે.
- તીવ્ર છતાં ચોક્કસપણે નિયંત્રિત કરી શકાય તેવું પોલાણ અને શીયર ફોર્સ સંપૂર્ણ વિક્ષેપ અને ઉચ્ચ નિષ્કર્ષણ ઉપજમાં પરિણમે છે (દા.ત. પ્રોટીન, ડીએનએ).
E. coli ના અલ્ટ્રાસોનિક સેલ વિક્ષેપ શા માટે પસંદીદા પદ્ધતિ છે?
અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર્સ અથવા પ્રોબ-ટાઇપ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ ઇ. કોલી લિસિસ માટે ઘણા ફાયદા પ્રદાન કરે છે કારણ કે તીવ્ર અલ્ટ્રાસાઉન્ડ કોષની દિવાલો અને પટલને અસરકારક રીતે વિક્ષેપિત કરે છે. નીચેના કારણોસર પ્રોબ-ટાઈપ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સનો ઉપયોગ E. coli lysis માટે વ્યાપકપણે થાય છે:
E.coli કોશિકાઓમાંથી પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ અસરકારક રીતે સાથે કરવામાં આવે છે અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ UP200St
પ્રોબ-ટાઇપ અલ્ટ્રાસોનિકેટર ઇ. કોલી લિસિસ માટે ઘણા ફાયદા આપે છે. અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયા પરિમાણો પર વિશ્વસનીય અને ચોક્કસ નિયંત્રણ ઇચ્છિત પરિણામો પ્રાપ્ત કરવા માટે પાવર, અવધિ અને નમૂના હેન્ડલિંગ જેવા ઓપરેટિંગ પરિમાણોને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવાની મંજૂરી આપે છે.
E. coli EDL933 ના જીનોમિક ડીએનએના ઇલેક્ટ્રોફોરેટિક વિશ્લેષણો 0 - 15 મિનિટ અલ્ટ્રાસોનિકેશનને આધિન છે. L DNA લેડર સૂચવે છે.
(અભ્યાસ અને છબી: ©બેસેલેટ એટ અલ. 2008)
અલ્ટ્રાસોનિક પોલાણનો ઉપયોગ કરીને સેલ વિક્ષેપ
અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ-ટાઇપ હોમોજેનાઇઝર્સ આશરે કામ કરે છે. 20,000 ચક્ર પ્રતિ સેકન્ડ (20kHz પર) અને પ્રવાહી અથવા સસ્પેન્શનમાં પોલાણનું કારણ બને છે. શૂન્યાવકાશ જેવા દબાણ અને ઉચ્ચ તાપમાનના એકોસ્ટિક પોલાણ માઇક્રોસ્કોપિક વિસ્તારો જે કોષોને તોડી નાખે છે. જોકે તાપમાન હજારો ડિગ્રી સેલ્સિયસ સુધી પહોંચી શકે છે, પોલાણનું પ્રમાણ એટલું નાનું છે કે તે પ્રક્રિયાને નોંધપાત્ર રીતે ગરમ કરતું નથી. અલ્ટ્રાસાઉન્ડ જનરેટ કરે છે એકોસ્ટિક કેવિટેશન અને શીયર ફોર્સ ઇ.કોલી જેવા બેક્ટેરિયલ કોષોના કોષ પટલને છિદ્રિત કરે છે અથવા તોડે છે. Hielscher ultrasonicators પ્રક્રિયા પરિમાણો જેમ કે અલ્ટ્રાસોનિક તીવ્રતા, કંપનવિસ્તાર, ઊર્જા ઇનપુટ અને તાપમાન પર ચોક્કસ નિયંત્રણની મંજૂરી આપે છે. આ રીતે, અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ પ્રક્રિયાને કોષના પ્રકાર, સેલ કલ્ચર અને પ્રક્રિયાના ધ્યેયમાં શ્રેષ્ઠ રીતે ગોઠવી શકાય છે.
- લિસિસનું ચોક્કસ નિયંત્રણ (તીવ્રતા, કંપનવિસ્તાર, તાપમાન)
- વિશ્વસનીય, પુનઃઉત્પાદન પરિણામો
- ચોક્કસ નમૂનાઓ માટે શ્રેષ્ઠ અનુકૂલન
- તાપમાન નિયંત્રણ
- ખૂબ નાનાથી ખૂબ મોટા નમૂનાઓ માટે (µL થી લિટર)
- સંપૂર્ણપણે યાંત્રિક સારવાર
- વપરાશકર્તા મૈત્રીપૂર્ણ, સલામત કામગીરી
- લેબથી ઉત્પાદન સુધી રેખીય સ્કેલ-અપ
VialTweeter અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ માટે
અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર વિ અન્ય લિસિસ તકનીકો
જ્યારે રાસાયણિક અને એન્ઝાઈમેટિક લિસિસ સમસ્યારૂપ હોઈ શકે છે – કેમ કે રાસાયણિક લિસિસ પ્રોટીનની રચનામાં ફેરફાર કરી શકે છે અને શુદ્ધિકરણની સમસ્યાઓનો પરિચય કરી શકે છે અને એન્ઝાઈમેટિક લિસિસ માટે લાંબા સેવન સમયની જરૂર પડે છે અને તે પુનઃઉત્પાદન કરી શકાતું નથી. – અલ્ટ્રાસોનિક વિક્ષેપ એ એક અત્યાધુનિક, ઝડપી સેલ વિક્ષેપ પદ્ધતિ છે.
અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ ફક્ત યાંત્રિક દળો પર આધારિત છે. કોઈ રસાયણો ઉમેરવામાં આવતાં નથી, સોનિકેશન શીયર ફોર્સ દ્વારા સેલ દિવાલ તોડે છે. રાસાયણિક લિસિસ પ્રોટીનનું માળખું બદલી શકે છે અને શુદ્ધિકરણ સમસ્યાઓનો પરિચય કરી શકે છે. એન્ઝાઇમેટિક વિક્ષેપને લાંબા સેવન સમયની જરૂર છે અને તે પુનઃઉત્પાદન કરી શકાતું નથી. E.coli બેક્ટેરિયા કોશિકાઓના અલ્ટ્રાસોનિક સેલ વિક્ષેપ ઝડપી, સરળ, વિશ્વસનીય અને પુનઃઉત્પાદનક્ષમ છે. એટલા માટે હિલ્સચર અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સનો ઉપયોગ વિશ્વભરની જૈવિક અને બાયોકેમિકલ પ્રયોગશાળાઓમાં નમૂનાની તૈયારી, પ્રી-એનાલિટિક્સ, ઇન-વિટ્રો ડાયગ્નોસ્ટિક્સ અને મેનીફોલ્ડ એસેસ માટે થાય છે.
અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ માટે સામાન્ય ભલામણો
સોનિકેશન એ ખૂબ જ નાની, મધ્યમ અને મોટી માત્રામાં સેલ સસ્પેન્શન નાખવા માટેની સૌથી લોકપ્રિય તકનીક છે. – પિકો-લિટરથી 100L/hr સુધી (એક અલ્ટ્રાસોનિક ફ્લો સેલનો ઉપયોગ કરીને). કોષો પ્રવાહી શીયર અને પોલાણ દ્વારા લિઝ્ડ હોય છે. સોનિકેશન દરમિયાન ડીએનએ પણ કાપવામાં આવે છે, તેથી સેલ સસ્પેન્શનમાં ડીએનએઝ ઉમેરવું જરૂરી નથી.
અલ્ટ્રાસોનિક E.coli lysis દરમિયાન તાપમાન નિયંત્રણ
નમૂનાને પૂર્વ-ઠંડક કરીને અને બરફ પર સોનિકેશન દરમિયાન નમૂનાને રાખવાથી, નમૂનાના થર્મલ ડિગ્રેડેશનને સરળતાથી અટકાવી શકાય છે.
આદર્શરીતે, લિસિસ દરમિયાન નમૂનાઓને બરફ-ઠંડા રાખવા જોઈએ, પરંતુ મોટાભાગના નમૂનાઓ માટે તે પૂરતું છે જો તાપમાન સંસ્કૃતિ અથવા પેશીઓના સ્ત્રોતના તાપમાનથી ઉપર ન વધે. તેથી, બરફ પર સસ્પેન્શન રાખવા અને 5-10 સેકન્ડના કેટલાક ટૂંકા અલ્ટ્રાસોનિક કઠોળ અને 10-30 સેકંડના વિરામ સાથે સોનિકેટ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે. વિરામ દરમિયાન, નીચા તાપમાનને પુનઃસ્થાપિત કરવા માટે ગરમી ઓસરી શકે છે. મોટા સેલ સેમ્પલ માટે, કુલિંગ જેકેટ્સ સાથે વિવિધ ફ્લો સેલ રિએક્ટર ઉપલબ્ધ છે.
સફળ અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ માટે અહીં વિગતવાર ટીપ્સ અને ભલામણો વાંચો!
ઇ. કોલી લિસેટ્સની અલ્ટ્રાસોનિક તૈયારી માટેના પ્રોટોકોલ્સ
સંશોધકો E.coli સેલ વિક્ષેપ માટે Hielscher ultrasonic homogenizers નો ઉપયોગ કરે છે. નીચે તમે વિવિધ E. coli-સંબંધિત એપ્લિકેશનો માટે Hielscher ultrasonic homogenizers નો ઉપયોગ કરીને E.coli lysis માટે વિવિધ પરીક્ષણ કરેલ અને સાબિત પ્રોટોકોલ શોધી શકો છો.
અલ્ટ્રાસોનિક્સનો ઉપયોગ કરીને કોષની વૃદ્ધિ, ક્રોસલિંકિંગ અને ઇ. કોલી સેલ અર્કની તૈયારી
SeqA અને RNA પોલિમરેઝ ChIP-Chip E. coli MG1655 અથવા MG1655 માટે ΔseqA 37°C પર OD સુધી ઉગાડવામાં આવ્યો હતો.600 50 ml LB (+ 0.2% ગ્લુકોઝ) માં લગભગ 0.15 ની પહેલાં 27 μl ફોર્માલ્ડિહાઇડ (37%) પ્રતિ મિલી માધ્યમ ઉમેરવામાં આવ્યા હતા (અંતિમ સાંદ્રતા 1%). 20 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને ધીમા ધ્રુજારી (100 આરપીએમ) પર ક્રોસલિંકિંગ કરવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ 10 મિલી 2.5 એમ ગ્લાયસીન (અંતિમ સાંદ્રતા 0.5 એમ) વડે શમન કરવામાં આવ્યું હતું. હીટ-શોક પ્રયોગો માટે, E. coli MG1655 65 ml LB માધ્યમમાં 30°C થી OD માં ઉગાડવામાં આવ્યું હતું600 લગભગ 0.3 નું. ત્યારબાદ 30 મિલી કલ્ચર 43 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર પ્રી વોર્મ્ડ ફ્લાસ્કમાં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવ્યું અને બાકીનું 30 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર રાખવામાં આવ્યું. ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે ક્રોસલિંકિંગ અને ક્વેન્ચિંગ હતા સિવાય કે ઓરડાના તાપમાને વધુ ધીમા ધ્રુજારી પહેલા કોષોને 5 મિનિટ માટે 30 અથવા 43°C પર રાખવામાં આવ્યા હતા. સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા કોષો એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને કોલ્ડ ટીબીએસ (pH7.5) સાથે બે વાર ધોવાયા હતા. 1 મિલી લિસિસ બફર (10 એમએમ ટ્રિસ (પીએચ 8.0), 20% સુક્રોઝ, 50 એમએમ NaCl, 10 એમએમ ઇડીટીએ, 10 એમજી/એમએલ લાઇસોઝાઇમ) માં પુનઃસસ્પેન્શન અને 30 મિનિટ માટે 37 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર ઇન્ક્યુબેશન પછી 4 મિલી આઇપીનો ઉમેરો બફર, કોષોને 100% પાવર સેટિંગ પર Hielscher અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર UP400St નો ઉપયોગ કરીને 12 વખત 30 સેકન્ડ અને 30 સેકન્ડના વિરામ સાથે બરફ પર સોનિક કરવામાં આવ્યા હતા. 9000 ગ્રામ પર 10 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી, સુપરનેટન્ટના 800 μl એલીકોટ્સ -20 ° સે પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા. (વોલ્ડમિંગહોસ 2010)
અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ સાથે ઉત્સેચકોનું વધુ ઉત્પાદન અને શુદ્ધિકરણ
ડેકાહિસ્ટીડાઇન (His10)-ટેગ કરેલા પ્રોટીનના વધુ ઉત્પાદન માટે, E. coli BL21(DE3) ને pET19b રચનાઓ સાથે રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું. સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા રાતોરાત પ્રીકલચરની લણણી કરવામાં આવી હતી, અને 1% નો ઉપયોગ અભિવ્યક્તિ સંસ્કૃતિને ઇનોક્યુલેટ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. pET19mgtB વહન કરતા કોષો 0.7 ના 600 nm (OD600) પર ઓપ્ટિકલ ઘનતા સુધી 22°C પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. સંસ્કૃતિને 17°C પર સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવી હતી અને 100 μM IPTG દ્વારા પ્રેરિત કરવામાં આવી હતી. 16 કલાક પછી, 4°C પર 7,500 × g પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા સંસ્કૃતિની લણણી કરવામાં આવી હતી. કોષોને pH 7.4 પર 0.3 M NaCl સાથે 50 mM ફોસ્ફેટ-બફર્ડ સલાઈન (PBS) માં પુનઃસ્થાપિત કરવામાં આવ્યા હતા અને Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર UP200St ખાતે S2 માઈક્રો-ટીપ સોનોટ્રોડ સાથે અલ્ટ્રાસોનિકેશન દ્વારા 0.57% અને aamplitude ના ચક્ર પર વિક્ષેપ પાડ્યો હતો.
ડેકાહિસ્ટીડાઇન-ટેગવાળા GtfC નું વધુ ઉત્પાદન OD પર 37°C પર પ્રેરિત કરવામાં આવ્યું હતું600 100 μM IPTG સાથે 0.6 નું. ત્યારબાદ MgtB માટે ઉપર જણાવ્યા મુજબ કોષોને 4 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા, કાપણી કરવામાં આવી હતી અને તેને લીસ કરવામાં આવી હતી.
ક્રૂડ સેલ અર્કને 15,000 × g અને 4°C પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું જેથી કોષના કાટમાળને નિકાલ કરવામાં આવે. ÄKTAprime Plus સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને સ્પષ્ટતા અર્ક 1-ml HisTrap FF ક્રૂડ કૉલમ પર લોડ કરવામાં આવ્યા હતા. ઉત્સેચકો હિઝ-ટૅગ કરેલા પ્રોટીનના ગ્રેડિયન્ટ ઉત્સર્જન માટે ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા. 4°C પર 0.3 M NaCl સાથે 50 એમએમ પીબીએસ, પીએચ 7.4 ના 1,000 વોલ્યુમની સામે એલ્યુટેડ પ્રોટીન સોલ્યુશનનું બે વાર ડાયલાઇઝેશન કરવામાં આવ્યું હતું. શુદ્ધિકરણનું 12% SDS-PAGE દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રોટીનની સાંદ્રતા રોટી-ક્વોન્ટનો ઉપયોગ કરીને બ્રેડફોર્ડ પદ્ધતિ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવી હતી. (Rabausch et al. 2013)
ઇ. કોલી બેક્ટેરિયામાંથી પ્રોટીનનું અલ્ટ્રાસોનિક નિષ્કર્ષણ
રસનું બાઈટ પ્રોટીન (આ કિસ્સામાં, અરેબિડોપ્સિસ થલિયાનાનું MTV1) GST ટેગ સાથે જોડવામાં આવે છે અને BL21 એસ્ચેરીચિયા કોલી (ઇ. કોલી) કોષોમાં વ્યક્ત થાય છે.
- GST-MTV1 અને GST (50 મિલી બેક્ટેરિયલ કલ્ચરને અનુરૂપ) ની એક પેલેટ લો અને દરેકને 2.5 મિલી આઈસ કોલ્ડ એક્સટ્રેક્શન બફરમાં રિસસ્પેન્ડ કરો.
- બેક્ટેરિયલ કોશિકાઓ લિસ્ડ ન થાય ત્યાં સુધી વિક્ષેપિત કરવા માટે અલ્ટ્રાસોનિકેટર UP100H (અંદાજે 2-5mL ના નાના વોલ્યુમો માટે MS3 માઇક્રોટિપ-સોનોટ્રોડથી સજ્જ) નો ઉપયોગ કરો, જે ઓછી અસ્પષ્ટતા અને વધેલી સ્નિગ્ધતા દ્વારા સૂચવવામાં આવે છે. આ બરફ પર હાથ ધરવામાં આવે છે, અને તે અંતરાલો માં sonicate ભલામણ કરવામાં આવે છે (દા.ત. 10 સેકન્ડ sonicating અને બરફ પર 10 સેકન્ડ વિરામ અને તેથી વધુ). ખૂબ ઊંચી તીવ્રતા સાથે સોનિકેટ ન થાય તેની કાળજી લેવી પડશે. જો ફોમિંગ અથવા સફેદ અવક્ષેપની રચના મળી આવે, તો તેની તીવ્રતા ઘટાડવી જરૂરી છે.
- લિસ્ડ બેક્ટેરિયા સોલ્યુશનને 1.5 એમએલ માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરો અને 20 મિનિટ માટે 4°C, 16,000 xg પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.
પ્રોબ-પ્રકાર અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ જેમ કે UP400St E.coli ના કાર્યક્ષમ લિસિસ માટે એકોસ્ટિક પોલાણના કાર્યકારી સિદ્ધાંતનો ઉપયોગ કરો.
સોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને રીકોમ્બિનન્ટ પ્રોટીનનું અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ અને શુદ્ધિકરણ
E. કોલી પેલેટ Hielscher ultrasonicator UP100H સાથે sonicated હતી. આ હેતુ માટે, સેલ પેલેટને ચિલ્ડ લિસિસ બફર (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવી હતી અને 10 મિનિટ માટે બરફ પર ઠંડુ કરવામાં આવ્યું હતું. પછી, સેલ સસ્પેન્શનને 10 સેકન્ડના 10 ટૂંકા વિસ્ફોટો સાથે સોનિકેટ કરવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ ઠંડક માટે 30 સે.ના અંતરાલ સાથે. છેલ્લે, 14000 rpm પર 15 મિનિટ માટે 4°C પર અલ્ટ્રાસેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા કોષનો ભંગાર દૂર કરવામાં આવ્યો હતો. rPR અભિવ્યક્તિની પુષ્ટિ માટે, સુપરનેટન્ટ 12% પોલિએક્રાયલામાઇડ જેલ પર ચલાવવામાં આવ્યું હતું અને SDS-PAGE અને પશ્ચિમી બ્લોટિંગ દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ઉત્પાદક માર્ગદર્શિકા અનુસાર rPR નું શુદ્ધિકરણ Ni2+-NTA રેઝિન (Invitrogen, USA) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. આ તબક્કામાં, મૂળ શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. શુદ્ધ થયેલ પ્રોટીનની શુદ્ધતાનું મૂલ્યાંકન 12% પોલિએક્રીલામાઇડ જેલ અને ત્યારબાદ કુમસી બ્લુ સ્ટેનિંગ પર ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. શુદ્ધ પ્રોટીન સાંદ્રતા માઇક્રો BCA પ્રોટીન એસે કીટ (PIERCE, USA) દ્વારા માપવામાં આવી હતી. (Azarnezhad et al. 2016)
ઇ. કોલી લિસિસ માટે અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર્સ
Hielscher Ultrasonics E. coli બેક્ટેરિયા અને અન્ય કોષના પ્રકારો, પેશીઓ અને કોષ સંસ્કૃતિઓના વિશ્વસનીય અને કાર્યક્ષમ લિસિસ માટે ઉચ્ચ-પ્રદર્શન અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર્સ ડિઝાઇન, ઉત્પાદન અને સપ્લાય કરે છે.
અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ્સ તેમજ પરોક્ષ સોનિકેશન સિસ્ટમ્સનો વ્યાપક પોર્ટફોલિયો અમને તમારા સેલ વિક્ષેપ અને નિષ્કર્ષણ એપ્લિકેશન માટે તમને આદર્શ અલ્ટ્રાસોનિક ટિશ્યુ હોમોજેનાઇઝર ઑફર કરવાની મંજૂરી આપે છે.
ડિઝાઇન, ઉત્પાદન અને કન્સલ્ટિંગ – જર્મનીમાં બનાવેલ ગુણવત્તા
Hielscher ultrasonicators તેમના ઉચ્ચતમ ગુણવત્તા અને ડિઝાઇન ધોરણો માટે જાણીતા છે. સ્માર્ટ સોફ્ટવેર, સાહજિક મેનૂ, પ્રોગ્રામેબલ સેટિંગ્સ અને ઓટોમેટિક ડેટા પ્રોટોકોલિંગ એ Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સની માત્ર થોડી વિશેષતાઓ છે. મજબૂતાઈ અને સરળ કામગીરી સંશોધન અને બાયોટેક સુવિધાઓમાં અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સના સરળ એકીકરણને મંજૂરી આપે છે. ખરબચડી પરિસ્થિતિઓ અને માંગવાળા વાતાવરણને પણ Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ દ્વારા સરળતાથી નિયંત્રિત કરવામાં આવે છે.
Hielscher Ultrasonics એ ISO પ્રમાણિત કંપની છે અને ઉચ્ચ-પ્રદર્શન અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ પર વિશેષ ભાર મૂકે છે જેમાં અત્યાધુનિક ટેકનોલોજી અને વપરાશકર્તા-મિત્રતા દર્શાવવામાં આવે છે. અલબત્ત, Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ CE અનુરૂપ છે અને UL, CSA અને RoHs ની જરૂરિયાતોને પૂર્ણ કરે છે.
નીચે આપેલ કોષ્ટક તમને અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સની અંદાજિત પ્રોસેસિંગ ક્ષમતાનો સંકેત આપે છે:
| બેચ વોલ્યુમ | પ્રવાહ દર | ભલામણ કરેલ ઉપકરણો |
|---|---|---|
| મલ્ટી-વેલ / માઇક્રોટાઇટર પ્લેટો | na | UIP400MTP |
| શીશીઓ અથવા બીકર માટે કપહોર્ન | na | અલ્ટ્રાસોનિક કપહોર્ન |
| અલ્ટ્રાસોનિક માઇક્રો-ફ્લો રિએક્ટર | na | GDmini2 |
| 0.5 થી 1.5 એમએલ સાથે 10 શીશીઓ સુધી | na | VialTweeter |
| 05 થી 1.5 એમએલ | na | VialTweeter |
| 1 થી 500 મિલી | 10 થી 200 એમએલ/મિનિટ | UP100H |
| 10 થી 2000 એમએલ | 20 થી 400 એમએલ/મિનિટ | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 થી 20L | 0.2 થી 4L/મિનિટ | UIP2000hdT |
| 10 થી 100 લિ | 2 થી 10L/મિનિટ | UIP4000 |
| na | 10 થી 100L/મિનિટ | UIP16000 |
| na | મોટા | નું ક્લસ્ટર UIP16000 |
અમારો સંપર્ક કરો! / અમને પૂછો!
અલ્ટ્રાસોનિક ઇ. કોલી લિસિસ માટે વધારાના પ્રોટોકોલ
અલ્ટ્રાસોનિક VialTweeter નો ઉપયોગ કરીને E. coli માં એલિસિન-સંશોધિત પ્રોટીન
5.5′-ડિથિઓબિસ(2-નાઇટ્રોબેન્ઝોઇક એસિડ) (DTNB) પરીક્ષા દ્વારા સલ્ફાઇડ્રિલ સામગ્રીનું નિર્ધારણ
MOPS ન્યૂનતમ માધ્યમ (1:100)ને ઇનોક્યુલેટ કરવા માટે E. coli MG1655 રાતોરાત સંસ્કૃતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. 0.4 ના A600 સુધી પહોંચે ત્યાં સુધી સંસ્કૃતિ એરોબિક રીતે ઉગાડવામાં આવી હતી. તણાવની સારવાર માટે સંસ્કૃતિને ત્રણ 15-ml સંસ્કૃતિઓમાં વિભાજિત કરવામાં આવી હતી. સારવાર ન કરાયેલ સંસ્કૃતિ નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે સેવા આપે છે. 0.79 એમએમ એલિસિન (128 μg એમએલ-1) અથવા 1 એમએમ ડાયમાઇડ બાકીની બે સંસ્કૃતિઓમાંની એકમાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. સંસ્કૃતિઓ 15 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવી હતી. સેન્ટ્રીફ્યુગેશન (8,525 × g, 4°C, 10 મિનિટ) દ્વારા દરેક સંસ્કૃતિમાંથી 5 મિલી લણણી કરવામાં આવી હતી. કોષોને 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, ઉપયોગ કરતા પહેલા એનારોબિક રીતે સંગ્રહિત) અને સેન્ટ્રીફ્યુજ (13,000 °C, 14 મિનિટ) વડે બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા. અલ્ટ્રાસોનિકેશન દ્વારા 4°C પર વિક્ષેપ પહેલા કોષોને લિસિસ બફર (6 mM guanidinium HCl, pH 7.4 સાથે PBS) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા (VialTweeter અલ્ટ્રાસોનિકેટર, Hielscher GmbH, જર્મની) (3 × 1 મિનિટ). સેન્ટ્રીફ્યુગેશન (13,000 × g, 4 °C, 15 મિનિટ) દ્વારા સેલ કચરો પેલેટ કરવામાં આવ્યો હતો. સુપરનેટન્ટને 3.5-ml QS-macro ક્યુવેટ (10 mm) માં ચુંબકીય જગાડવો બાર સાથે સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યો હતો અને 1 ml lysis બફર સાથે મિશ્ર કરવામાં આવ્યો હતો. ઓરડાના તાપમાને PSC-718 તાપમાન-નિયંત્રિત સેલ ધારકથી સજ્જ Jasco V-650 સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર વડે નમૂનાઓના લુપ્તતાનું 412 nm પર નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. 3 એમએમ ડિથિઓબીસ (2-નાઇટ્રોબેન્ઝોઇક એસિડ) સોલ્યુશનનું 100μl ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. જ્યાં સુધી તે સંતૃપ્તિ સુધી પહોંચે ત્યાં સુધી લુપ્તતાનું નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. થિયોલ સાંદ્રતાની ગણતરી લુપ્તતા ગુણાંક ϵ નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી412 = 13,700 એમ-1 સેમી-1 થિયો-2-નાઇટ્રોબેન્ઝોઇક એસિડ (TNB) માટે. સેલ્યુલર થિઓલ સાંદ્રતાની ગણતરી 6.7 × 10 ના ઇ. કોલી કોષોના વોલ્યુમના આધારે કરવામાં આવી હતી.-15 લિટર અને A600 = 0.5 ની સેલ ઘનતા (1 × 10 ની સમકક્ષ8 કોષો મિલી-1 સંસ્કૃતિ). (Müller et al. 2016)
અલ્ટ્રાસોનિક સેલ ક્રશરનો ઉપયોગ કરીને વિવો ગ્લુટાથિઓન નિર્ધારણમાં
E.coli MG1655 એ 0.5 ના A600 સુધી પહોંચે ત્યાં સુધી 200ml ના કુલ વોલ્યુમમાં MOPS ન્યૂનતમ માધ્યમમાં ઉગાડવામાં આવ્યું હતું. તણાવની સારવાર માટે સંસ્કૃતિને 50-ml સંસ્કૃતિઓમાં વિભાજિત કરવામાં આવી હતી. 0.79 એમએમ એલિસિન, 1 એમએમ ડાયામાઇડ અથવા ડાયમિથાઈલ સલ્ફોક્સાઇડ (નિયંત્રણ) સાથે 15 મિનિટના સેવન પછી, કોષોને 10 મિનિટ માટે 4°C પર 4,000 ગ્રામ પર કાપવામાં આવ્યા હતા. KPE બફરના 700µl માં ગોળીઓના પુનઃસસ્પેન્શન પહેલાં કોષોને KPE બફરથી બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા. ડિપ્રોટીનેશન માટે, અલ્ટ્રાસોનિકેશન (3 x 1 મિનિટ; VialTweeter અલ્ટ્રાસોનિકેટર). સેન્ટ્રીફ્યુગેશન (30 મિનિટ, 13,000 ગ્રામ, 4° સે) પછી સુપરનેટન્ટ્સ એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. KPE બફરના 3 વોલ્યુમોના ઉમેરા દ્વારા સલ્ફોસાલિસિલિક એસિડની સાંદ્રતા ઘટીને 1% થઈ હતી. કુલ ગ્લુટાથિઓન અને GSSG ના માપ ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે કરવામાં આવ્યા હતા. સેલ્યુલર ગ્લુટાથિઓન સાંદ્રતાની ગણતરી 6.7 ના ઇ. કોલી કોશિકાઓના વોલ્યુમના આધારે કરવામાં આવી હતી.×10-15 લિટર અને A600 0.5 ની સેલ ઘનતા (1 ની સમકક્ષ×108 કોષો મિલી-1 સંસ્કૃતિ). કુલ ગ્લુટાથિઓનમાંથી 2[GSSG] ની બાદબાકી દ્વારા GSH સાંદ્રતાની ગણતરી કરવામાં આવી હતી. (Müller et al. 2016)
અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝરનો ઉપયોગ કરીને ઇ. કોલીમાં માનવ mAspAT ની અભિવ્યક્તિ
E. coli BL21 (DE3) ની સિંગલ વસાહત જે 100μg/mL એમ્પીસિલિન ધરાવતા લુરિયા-બર્ટાની (LB) માધ્યમના 30 mL માં અભિવ્યક્તિ વેક્ટરને આશ્રય આપે છે, અને પછી ઓપ્ટિકલ ઘનતા (OD) સુધી 37ºC પર ઉગાડવામાં આવે છે.600) 0.6 પર પહોંચી. 10 મિનિટ માટે 4,000 × g પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા કોષોની લણણી કરવામાં આવી હતી, અને 100μg/mL એમ્પીસિલિન ધરાવતા 3L તાજા LB માધ્યમમાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવી હતી.
ત્યારબાદ, પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) સાથે 16ºC પર 20 કલાક માટે પ્રેરિત કરવામાં આવી હતી. 15 મિનિટ માટે 8,000 × g પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા કોષોની લણણી કરવામાં આવી હતી અને બફર A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4) વડે ધોવાઇ હતી. આશરે 45 ગ્રામ (ભીનું વજન) કોષો 3 એલ સંસ્કૃતિમાંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા. સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી, સેલ પેલેટ્સને 40 એમએલ (1 એલ કલ્ચર માટે) બરફ-ઠંડા નિષ્કર્ષણ બફર A માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા, અને Hielscher અલ્ટ્રાસોનિક સેલ ક્રશર UP400St નો ઉપયોગ કરીને બરફ-ઠંડા તાપમાન પર અલ્ટ્રાસોનિકેશન દ્વારા lysed કરવામાં આવ્યા હતા. સેલ લિસિસ 15 મિનિટ માટે 12,000 rpm પર દ્રાવ્ય (સુપરનેટન્ટ) અને અવક્ષેપિત (પેલેટ) અપૂર્ણાંકને અલગ કરવા માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. (જિઆંગ એટ અલ. 2015)
જાણવા લાયક હકીકતો
ઇ.કોલી
એસ્ચેરીચીયા કોલી (ઇ. કોલી) એ એસ્ચેરીચીયા જીનસનું ગ્રામ-નેગેટિવ, ફેક્ટીલી એનારોબિક, સળિયા આકારનું, કોલિફોર્મ બેક્ટેરિયમ છે જે સામાન્ય રીતે ગરમ લોહીવાળા સજીવો (એન્ડોથર્મ્સ) ના નીચેના આંતરડામાં જોવા મળે છે. વિવિધ લાક્ષણિકતાઓ સાથે મોટી સંખ્યામાં ઇ. કોલાઈ સ્ટ્રેઈન (અથવા પેટાપ્રકારો) છે. મોટાભાગના ઇ. કોલી સ્ટ્રેન્સ મનુષ્યો માટે હાનિકારક છે, દા.ત. B અને K-12 સ્ટ્રેન્સ જેનો ઉપયોગ સામાન્ય રીતે પ્રયોગશાળાઓમાં સંશોધન કાર્યક્રમો માટે થાય છે. જો કે, કેટલીક જાતો હાનિકારક હોય છે અને ગંભીર બીમારીનું કારણ બની શકે છે.
ઇ. કોલી આધુનિક જૈવિક ઇજનેરી અને ઔદ્યોગિક માઇક્રોબાયોલોજીમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે કારણ કે બેક્ટેરિયાની હેરફેર કરવી સરળ છે. સામાન્ય લેબ એપ્લીકેશન જેમાં વારંવાર E. coli નો ઉપયોગ સામેલ હોય છે, દા.ત. રિકોમ્બિનન્ટ ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લીક એસિડ (DNA) બનાવવા અથવા એક મોડેલ ઓર્ગેનિઝમ તરીકે કામ કરવા માટે.
ઇ. કોલી એ હેટરોલોગસ પ્રોટીનના ઉત્પાદન માટે ખૂબ જ સર્વતોમુખી યજમાન છે, અને મેનીફોલ્ડ પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ પ્રણાલીઓ ઇ. કોલીમાં રિકોમ્બિનન્ટ પ્રોટીનના ઉત્પાદન માટે ઉપલબ્ધ છે. પ્લાઝમિડ્સનો ઉપયોગ કરીને જે પ્રોટીનની ઉચ્ચ સ્તરની અભિવ્યક્તિને મંજૂરી આપે છે, જનીનોને બેક્ટેરિયામાં દાખલ કરી શકાય છે, જે ઔદ્યોગિક આથોની પ્રક્રિયાઓમાં આવા પ્રોટીનને ઉચ્ચ માત્રામાં ઉત્પન્ન કરવામાં સક્ષમ બનાવે છે.
ઇ.કોલીનો ઉપયોગ ઇન્સ્યુલિન બનાવવા માટે સેલ ફેક્ટરીઓ તરીકે થાય છે. આગળના કાર્યક્રમોમાં રસીઓ અને સ્થાવર ઉત્સેચકો વિકસાવવા અને ઉત્પન્ન કરવા, જૈવ ઇંધણ ઉત્પન્ન કરવા તેમજ બાયોરેમીડિયેશન માટે સંશોધિત ઇ. કોલી કોષોનો ઉપયોગ શામેલ છે.
તાણ K-12 એ E. coli નું મ્યુટન્ટ સ્વરૂપ છે જે એન્ઝાઇમ આલ્કલાઇન ફોસ્ફેટેઝ (ALP) ને વધારે પડતું વ્યક્ત કરે છે. આ પરિવર્તન જનીનમાં ખામીને કારણે થાય છે જે એન્ઝાઇમ માટે સતત કોડ કરે છે. જો કોઈ જનીન કોઈપણ અવરોધ વિના ઉત્પાદનનું ઉત્પાદન કરે તો તેને રચનાત્મક પ્રવૃત્તિ તરીકે ઓળખવામાં આવે છે. આ વિશિષ્ટ મ્યુટન્ટ સ્વરૂપનો ઉપયોગ ALP એન્ઝાઇમને અલગ કરવા અને શુદ્ધિકરણ માટે થાય છે.
ઇ. કોલી બેક્ટેરિયાનો સેલ ફેક્ટરીઓ તરીકે પણ વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે. એન્જિનિયર્ડ સૂક્ષ્મજીવાણુઓ (દા.ત., બેક્ટેરિયા) અને છોડના કોષો કહેવાતા સેલ ફેક્ટરીઓ તરીકે વાપરી શકાય છે. આ આનુવંશિક રીતે સંશોધિત કોષો પરમાણુઓ, રસાયણો, પોલિમર, પ્રોટીન અને અન્ય પદાર્થો ઉત્પન્ન કરે છે, જેનો ઉપયોગ ફાર્માસ્યુટિકલ, ખોરાક અને રાસાયણિક ઉદ્યોગમાં થાય છે. આવા બાયોએન્જિનિયર કોશિકાઓના આંતરિક ભાગમાં ઉત્પાદિત પરમાણુઓને મુક્ત કરવા માટે, અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ એ કોષની દિવાલોને વિક્ષેપિત કરવાની અને લક્ષ્ય પદાર્થોને આસપાસના પ્રવાહીમાં સ્થાનાંતરિત કરવાની એક સામાન્ય પદ્ધતિ છે. બાયોએન્જિનિયર કોષોના લિસિસ વિશે વધુ વાંચો!
અલ્ટ્રાસોનિક ડીએનએ શીયરિંગ
અલ્ટ્રાસોનિક શીયર ફોર્સ એ કોષના આંતરિક ભાગમાંથી અણુઓ, ઓર્ગેનેલ્સ અને પ્રોટીનને મુક્ત કરવા તેમજ ડીએનએ સેરને ટુકડાઓમાં તોડવા માટે સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ છે. એકોસ્ટિક પોલાણ કોશિકાઓમાંથી ડીએનએ કાઢવા અને લગભગ 600 ટુકડાઓ પેદા કરવા માટે કોષની દિવાલો અને પટલને તોડે છે. – લંબાઈમાં 800 bp, જે વિશ્લેષણ માટે આદર્શ છે.
DNA ફ્રેગમેન્ટેશન માટે અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર્સ વિશે વધુ જાણવા માટે અહીં ક્લિક કરો!
સાહિત્ય / સંદર્ભો
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics થી ઉચ્ચ-પ્રદર્શન અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર્સનું ઉત્પાદન કરે છે પ્રયોગશાળા પ્રતિ ઔદ્યોગિક કદ.