અલ્ટ્રાસોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને પ્લાઝમિડ તૈયારી

અલ્ટ્રાસોનિકેશન એ પ્લાઝમિડ ડીએનએના ટુકડા કરવા માટે વિશ્વસનીય તકનીક છે. ચોક્કસ રીતે નિયંત્રિત કરી શકાય તેવું કંપનવિસ્તાર, પલ્સેશન મોડ અને તાપમાન નિયંત્રણ એ બિન-નુકસાનકર્તા પ્લાઝમિડ ફ્રેગમેન્ટેશન માટે અલ્ટ્રાસોનિકેટરની સૌથી મહત્વપૂર્ણ લાક્ષણિકતાઓ છે. વધુમાં, અમુક એજન્ટોનો ઉપયોગ પ્લાઝમિડના અધોગતિ સામે રક્ષણ કરવામાં મદદ કરે છે. Hielscher Ultrasonics સિંગલ શીશીઓમાંથી નિયંત્રિત પ્લાઝમિડ ફ્રેગમેન્ટેશન માટે વિવિધ સોલ્યુશન્સ ઓફર કરે છે, એક સાથે અસંખ્ય નમૂનાઓ તેમજ મલ્ટી-વેલ પ્લેટ્સનું સોનિકેશન. સફળ અલ્ટ્રાસોનિક પ્લાઝમિડ ફ્રેગમેન્ટેશન વિશે વધુ જાણો!

અલ્ટ્રાસોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને પ્લાઝમિડ શીયરિંગ

જ્યારે ડીએનએ નમૂનાઓ અલ્ટ્રાસોનિક તરંગોને આધિન હોય છે, ત્યારે અલ્ટ્રાસોનિકલી જનરેટેડ સ્પંદનો પ્રવાહીમાં એકોસ્ટિક પોલાણ બનાવે છે જે યાંત્રિક દળો દ્વારા ઉચ્ચ પરમાણુ વજનના ડીએનએ પરમાણુઓને કાતર અથવા તોડે છે. સોનિકેશન એ ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (ChIP) જેવી એપ્લિકેશનો સહિત બલ્ક ડીએનએ શીયરિંગ પ્રયોગો માટે સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ છે, જેના માટે ઉચ્ચ રીઝોલ્યુશન મેળવવા માટે નાના ટુકડાના કદ એકદમ નિર્ણાયક છે. (cf. Tseng et al., 2012)
પ્લાઝમિડ ડીએનએ (પીડીએનએ) એ ડીએનએનું વિશિષ્ટ સ્વરૂપ છે, જે તેના રિંગ આકાર દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે અને તે બેક્ટેરિયા અને કેટલાક યુકેરીયોટ્સમાં જોવા મળે છે.
સુપરકોઇલ્ડ પીડીએનએ એ પ્લાઝમિડ ડીએનએનું ઇચ્છિત સ્વરૂપ છે કારણ કે તે ડાઉન-સ્ટ્રીમ પ્રક્રિયાઓમાં શ્રેષ્ઠ પરિણામો દર્શાવે છે જેમ કે સ્વયંસંચાલિત સિક્વન્સિંગ અને ટ્રાન્સફેક્શન. અલ્ટ્રાસોનિકેશન પીડીએનએ, સુપરકોઇલ્ડ પીડીએનએ સહિત સફળતાપૂર્વક ટુકડા કરવા માટે યોગ્ય છે.
થોમ્પસન એટ અલ. (2008) એ દર્શાવ્યું છે કે પ્લાઝમિડ સોનિકેશન, જે સુપરકોઇલ્ડ ડીએનએને ફ્રેગમેન્ટ કરવા માટે જાણીતું છે, તે ક્રમ ફ્રેડ20 રીડ લંબાઈને એ બિંદુ સુધી સુધારવા માટે એક અસરકારક રીત છે કે તે બેકમેન કુલ્ટરના કંટ્રોલ ટેમ્પ્લેટ અથવા એન્ઝાઇમેટિકલી લીનિયરાઇઝ્ડ પ્લાઝમિડ્સથી નોંધપાત્ર રીતે અલગ નથી.

પ્લાઝમિડ વેક્ટરનો ઉપયોગ

પ્લાઝમિડ્સનો ઉપયોગ ઘણીવાર જનીનોને ક્લોન કરવા, ટ્રાન્સફર કરવા અને ચાલાકી કરવા માટેના સાધનો તરીકે થાય છે. જ્યારે પ્લાઝમિડનો ઉપયોગ આ હેતુઓ માટે પ્રાયોગિક રીતે કરવામાં આવે છે, ત્યારે તેને વેક્ટર કહેવામાં આવે છે. DNA ટુકડાઓ અથવા જનીનોને પ્લાઝમિડ વેક્ટરમાં દાખલ કરી શકાય છે, જે કહેવાતા રિકોમ્બિનન્ટ પ્લાઝમિડ બનાવે છે. પ્લાઝમિડ વેક્ટરનો ઉપયોગ રિકોમ્બિનન્ટ ડીએનએને યજમાન કોષમાં ચલાવવા માટે વાહનો તરીકે થાય છે અને તે મોલેક્યુલર ક્લોનિંગનો મુખ્ય ઘટક છે.
“વિવિધ જટિલ રોગોની સારવાર માટે જીન થેરાપીમાં તેમના સંભવિત ઉપયોગ માટે બિન-વાયરલ વેક્ટર્સનો વ્યાપકપણે અભ્યાસ કરવામાં આવી રહ્યો છે. બિન-વાયરલ વેક્ટર્સ પ્લાઝમિડ ડીએનએને ભૌતિક, રાસાયણિક અને એન્ઝાઈમેટિક અધોગતિ સામે રક્ષણ આપે છે અને ડીએનએ પરમાણુને લક્ષ્ય સાઇટ પર પહોંચાડે છે. ઉદાહરણ તરીકે, cationic liposomes, chitosan અને અન્ય હકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલ નેનોપાર્ટિકલ્સ ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા પ્લાઝમિડ DNA સાથે સંકુલ બનાવે છે. જો કે, સહેલાઈથી બનેલા કેશનીક લિપોસોમ્સ/પ્લાઝમિડ ડીએનએ સંકુલ પ્રમાણમાં મોટા (એટલે કે, 300–400 એનએમ) અને વિજાતીય પ્રકૃતિના હોય છે જે ફાર્માસ્યુટિકલ એપ્લિકેશન્સમાં તેનો ઉપયોગ મુશ્કેલ બનાવે છે. મોટા અને વિજાતીય પ્લાઝમિડ ડીએનએ/લિપોસોમ્સ, પ્લાઝમિડ ડીએનએ/એરોસોલ્સ અને પ્લાઝમિડ ડીએનએ/પેપ્ટાઈડ્સ સંકુલને અલ્ટ્રાસોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને નાના અને સજાતીય કણોમાં ઘટાડી શકાય છે.” (સરકર એટ અલ., 2019)
પ્લાઝમિડ વેક્ટરના ઉપયોગ માટેનું એક અગ્રણી ઉદાહરણ CRISPR-Cas9 છે. CRISPR-Cas9 સિસ્ટમ સામાન્ય રીતે કોષોને એક મોટા પ્લાઝમિડ અથવા બહુવિધ નાના પ્લાઝમિડ તરીકે પહોંચાડવામાં આવે છે જે લક્ષ્ય ક્રમ, CRISPR માર્ગદર્શિકા અને Cas9ને એન્કોડ કરે છે.

નેનોપ્રિસિપિટેશન દ્વારા ડીએનએ-લોડેડ PLGA નેનોપાર્ટિકલ્સની અલ્ટ્રાસોનિક તૈયારી

જો એટ અલ. (2020) એ મોડેલ CRISPR-Cas9 પ્લાઝમિડને પ્રાથમિક અસ્થિ મજ્જામાંથી મેળવેલા મેક્રોફેજમાં પહોંચાડવા માટે નેનોપાર્ટિકલ કેરિયર બનાવવા માટે પોલી(લેક્ટિક-કો-ગ્લાયકોલિક એસિડ) (PLGA) નો ઉપયોગ કર્યો. PLGA નેનોપાર્ટિકલ્સના નેનોપ્રિસિપિટેશન માટે, બે અલગ-અલગ અંતિમ જૂથો (એસ્ટર અને એમાઈન જૂથો) સાથેના PLGAનો ઉપયોગ એ હેતુ સાથે કરવામાં આવ્યો હતો કે હકારાત્મક રીતે ચાર્જ કરાયેલ એમાઈન એન્ડ કેપ્સ તેની વચ્ચેના ચાર્જની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને કારણે એન્કેપ્સ્યુલેશન કાર્યક્ષમતા અને લોડિંગમાં વધારો કરે છે. ડીએનએ. 50 એમએલ પોલીપ્રોપીલીન કોનિકલ સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં, 100 એમજી પ્લુરોનિક એફ 127 20 એમએલ ઓટોક્લેવ્ડ ડીઆઈ પાણીમાં વમળ મિશ્રણ દ્વારા ઓગળવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ અલ્ટ્રાસોનિક બાથનો ઉપયોગ કરીને 30 મિનિટ હળવા સોનિકેશન (કપહોર્ન જુઓ). એક ઓટોક્લેવ્ડ મેગ્નેટિક સ્ટિરિંગ બાર ઉમેરવામાં આવ્યો હતો અને સોલ્યુશનને 600 RPM પર 30 મિનિટ માટે મિશ્ર કરવામાં આવ્યું હતું જ્યારે અન્ય સોલ્યુશન બનાવવામાં આવ્યા હતા. ડીએનએના બિન-વિશિષ્ટ શોષણને ઘટાડવા માટે કાચના વાસણોને બદલે પ્લાસ્ટિક લેબવેરનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. DMF (44.48 mg/ml) માં ઓગળેલા PLGA ના ઉકેલો અને THF (0.667 mg/ml) માં ઓગળેલા TIPS પેન્ટાસીન અલગથી બનાવવામાં આવ્યા હતા. PLGA ને 30 મિનિટ માટે sonicated પહેલાં 30 મિનિટ માટે DMF માં ભીનું કરવા માટે શાંતિથી છોડી દેવામાં આવ્યું હતું. (સંપૂર્ણ પ્રોટોકોલ માટે જુઓ જો એટ અલ., 2020)

સોનિકેશન દરમિયાન પ્લાઝમિડ ડીએનએ પ્રોટેક્શન

પ્લાઝમિડ્સ અને સુપરકોઈલ્ડ પ્લાઝમિડ્સ સહિત ડીએનએ અત્યંત સંવેદનશીલ ડિગ્રેડેશન છે. ઉપલબ્ધ તમામ ફ્રેગમેન્ટેશન પદ્ધતિઓ ચોક્કસ ગેરફાયદા માટે જાણીતી છે. અલ્ટ્રાસોનિક ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટેશન એ પસંદગીની પદ્ધતિઓમાંની એક છે કારણ કે રક્ષણાત્મક પગલાં સાથે સંયોજનમાં નિયંત્રિત સોનિકેશન ડીએનએ સેરની શીયર- અને હીટ-પ્રેરિત નુકસાનને ઘટાડવાની મંજૂરી આપે છે.
અલ્ટ્રાસોનિક ડીએનએ શીયરિંગ દરમિયાન નીચા કંપનવિસ્તાર સેટિંગ્સ, પલ્સેશન મોડ અને તાપમાન નિયંત્રણ ઉપરાંત, અમુક એજન્ટોના ઉપયોગથી ડીએનએ ડિગ્રેડેશન સામે નોંધપાત્ર રક્ષણાત્મક અસર જોવા મળી હતી. દાખલા તરીકે, અલ્ટ્રાસોનિકેશન દરમિયાન વિવિધ પોલિમર, પેપ્ટાઈડ્સ અને લિપિડ્સ પ્લાઝમિડ ડીએનએનું રક્ષણ કરે છે.

અલ્ટ્રાસોનિક શીયર સ્ટ્રેસ સામે પ્લાઝમિડ ડીએનએ અને પ્લાઝમિડ ડીએનએ/આઈએલ નેનોકોમ્પ્લેક્સની સ્થિરતા એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ એસેનો ઉપયોગ કરીને તપાસ કરવામાં આવી હતી. પ્લાઝમિડ ડીએનએ અને પ્લાઝમિડ ડીએનએ/આઈએલ નેનોકોમ્પ્લેક્સ બંને અલગ અલગ સમય બિંદુઓ માટે અલ્ટ્રાસોનિક શીયર સ્ટ્રેસને આધિન હતા. પ્લાઝમિડ ડીએનએ 0, 10, 20, 30 અને 40 મિનિટ માટે અલ્ટ્રાસોનિક શીયર સ્ટ્રેસના સંપર્કમાં આવ્યું હતું. જો કે, પ્લાઝમિડ DNA/IL નેનોકોમ્પ્લેક્સ 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 અને 120 મિનિટ માટે અલ્ટ્રાસોનિક શીયર સ્ટ્રેસના સંપર્કમાં આવ્યા હતા.
(અભ્યાસ અને ચિત્ર: ©સરકર એટ અલ., 2019)

સરકાર એટ અલ. (2019) એ દર્શાવ્યું કે જ્યારે પ્લાઝમિડ ડીએનએ / આયનીય પ્રવાહી (pDNA/IL) નેનોસ્ટ્રક્ચર્સ 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 અને 120 મિનિટ માટે અલ્ટ્રાસોનિક શીયર સ્ટ્રેસને આધિન હતા અને વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ કેટેનિક જેન સાથે જટિલ હતા. ડિલિવરી એજન્ટ લિપોફેક્ટેમાઇન, ફ્લોરોસન્ટ પોઝિટિવ કોષોની ટકાવારી અનુક્રમે 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% અને 50% હતી (નીચેનો ચાર્ટ જુઓ). જ્યારે નેનોસ્ટ્રક્ચરને 10 અને 20 મિનિટ માટે અલ્ટ્રાસોનિક શીયર સ્ટ્રેસ આપવામાં આવ્યું ત્યારે ફ્લોરોસન્ટ પોઝિટિવ કોશિકાઓની ટકાવારીમાં વધારો થયો અને તે પછી ધીમે ધીમે ઘટાડો થયો.

COS7 કોષોને પ્લાઝમિડ ડીએનએ પહોંચાડવા પર આયનીય પ્રવાહી [Bmim][PF6] નો પ્રભાવ. પ્લાઝમિડ ડીએનએ/આઈએલ (આયોનિક લિક્વિડ) નેનોકોમ્પ્લેક્સ 120 મિનિટ સુધી અલ્ટ્રાસોનિક શીયર સ્ટ્રેસને આધિન હતા અને COS7 કોષોમાં પહોંચાડતા પહેલા LA સાથે જટિલ હતા. ડેટા દર્શાવે છે કે GFP પોઝિટિવ HeLa કોષોની સરેરાશ સંખ્યા (%) 10 વિવિધ માઇક્રોસ્કોપિક ફીલ્ડમાં ગણવામાં આવે છે અને પ્રયોગ ત્રણ અલગ-અલગ દિવસોમાં ઘણી વખત કરવામાં આવ્યો હતો. (અભ્યાસ અને ચાર્ટ: ©સરકર એટ અલ., 2019)

અલ્ટ્રાસોનિક Lysate તૈયારી

અલ્ટ્રાસોનિક સેલ લિસિસ પ્રોટોકોલ
કોષોના સમૃદ્ધ નમૂના સાથે પ્રારંભ કરો જે કોષ વિભાજન પદ્ધતિ દ્વારા તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા (દા.ત., ઇમ્યુનોમેગ્નેટિક સેલ સેપરેશન, ફ્લોરોસેન્સ-એક્ટિવેટેડ સેલ સોર્ટિંગ (FACS), ડેન્સિટી ગ્રેડિયન્ટ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન, ઇમ્યુનોડેન્સિટી સેલ આઇસોલેશન).
કોષના નમૂનાઓએ લિસિસ બફરનું પ્રમાણ દર્શાવવું જોઈએ જે પ્રાયોગિક ધ્યેય અને પ્રોબ-પ્રકાર અલ્ટ્રાસોનિકેટર માટે યોગ્ય છે.
હાયપોટોનિક બફર્સ પસંદ કરવામાં આવે છે કારણ કે તેઓ અલ્ટ્રાસોનિક સેલ લિસિસને વધારે છે. તે મહત્વનું છે કે ઉમેરણો અને મીઠાની સાંદ્રતાનો યોગ્ય રીતે ઉપયોગ કરવામાં આવે.
તમારું અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ ઉપકરણ પસંદ કરો: શીશીઓના પરોક્ષ સોનિકેશન માટે, VialTweeter અથવા CupHorn ની ભલામણ કરવામાં આવે છે. મલ્ટિવેલ-પ્લેટ માટે, UIP400MTP આદર્શ અલ્ટ્રાસોનિકેટર છે. અને ક્લાસિકલ પ્રોબ-ટાઇપ સોનિકેશન, માઇક્રો-ટીપ સાથે UP100H અથવા UP200Ht તરીકે અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજેનાઇઝર સૌથી યોગ્ય છે.
પ્રોબ-ટાઈપ સોનિકેશન માટે પ્રોટોકોલ: અલ્ટ્રાસોનિકેટર પ્રોબને નમૂનાના જથ્થામાં માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં મૂકો અને આશરે માટે સોનીકેટ કરો. 10 સેકન્ડ. ડીએનએ નમૂનાના આધારે, સોનિકેશન એક કે બે વધુ વખત પુનરાવર્તિત થઈ શકે છે. જરૂરી અલ્ટ્રાસોનિક એનર્જી ઇનપુટ (Ws/mL) નમૂનાની સ્નિગ્ધતા અને DNA પ્રકાર પર આધાર રાખે છે. અલ્ટ્રાસોનિકેટરના આઇસ બાથ અને પલ્સેશન મોડ દ્વારા ઠંડક એ સેમ્પલને થર્મલી ડિગ્રેજ થવાથી રોકવામાં મદદ કરે છે.
અલ્ટ્રાસોનિક લિસિસ પછી, સેમ્પલને પેલેટ કચરાને અલગ કરવા માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવે છે (જેમાં અનલિસ્ડ કોષો, ન્યુક્લી અને અનલિસ્ડ ઓર્ગેનેલ્સ હોય છે)
જો નમૂના પર તરત જ આગળ પ્રક્રિયા કરવામાં ન આવે, તો તેની સધ્ધરતા જાળવવા માટે તેને યોગ્ય તાપમાને સંગ્રહિત કરી શકાય છે.

ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટેશન માટે અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ

Hielscher Ultrasonics DNA, RNA અને ક્રોમેટિન ફ્રેગમેન્ટેશન માટે વિવિધ અલ્ટ્રાસાઉન્ડ-આધારિત પ્લેટફોર્મ ઓફર કરે છે. આ વિવિધ પ્લેટફોર્મ્સમાં અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ્સ (સોનોટ્રોડ્સ), બહુવિધ ટ્યુબ અથવા બહુ-વેલ પ્લેટ્સ (દા.ત., 96-વેલ પ્લેટ્સ, માઇક્રોટાઇટર પ્લેટ્સ), સોનોરેક્ટર્સ અને અલ્ટ્રાસોનિક કપહોર્ન્સના એકસાથે નમૂના તૈયાર કરવા માટે પરોક્ષ સોનિકેશન સોલ્યુશન્સનો સમાવેશ થાય છે. ડીએનએ શીયરિંગ માટેના તમામ પ્લેટફોર્મ ફ્રિક્વન્સી-ટ્યુન, ઉચ્ચ-પ્રદર્શન અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર્સ દ્વારા સંચાલિત છે, જે ચોક્કસપણે નિયંત્રણક્ષમ છે અને પુનઃઉત્પાદન કરી શકાય તેવા પરિણામો આપે છે.

કોઈપણ નમૂના નંબર અને કદ માટે અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર્સ

Hielscher ના મલ્ટિ-સેમ્પલ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ VialTweeter (10 ટેસ્ટ ટ્યુબ સુધી) અને UIP400MTP (માઇક્રોપ્લેટ્સ/મલ્ટીવેલ પ્લેટ્સ માટે) સાથે ઇચ્છિત ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટ કદ પ્રાપ્ત કરતી વખતે તીવ્ર અને ચોક્કસ નિયંત્રણ કરી શકાય તેવા અલ્ટ્રાસોનિકેશનને કારણે સેમ્પલ પ્રોસેસિંગનો સમય ઘટાડવો સહેલાઈથી શક્ય બને છે. . અલ્ટ્રાસોનિક ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટેશન પ્લાઝમિડ તૈયારીના પગલાંને કાર્યક્ષમ, વિશ્વસનીય અને માપી શકાય તેવું બનાવે છે. સતત અલ્ટ્રાસાઉન્ડ પેરામીટર્સ લાગુ કરીને પ્રોટોકોલ્સને એકથી અસંખ્ય નમૂના સુધી રેખીય રીતે માપી શકાય છે.
એકથી પાંચ આંગળીઓવાળા પ્રોબ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ નાના નમૂના નંબરો તૈયાર કરવા માટે આદર્શ છે. Hielscher ના લેબ અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ વિવિધ પાવર લેવલ સાથે ઉપલબ્ધ છે જેથી કરીને તમે તમારા DNA-સંબંધિત એપ્લિકેશન માટે આદર્શ અલ્ટ્રાસોનિક ડિસપ્ટર પસંદ કરી શકો.