અલ્ટ્રાસોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને પ્લાઝ્મિડની તૈયારી

પ્લાઝ્મિડ DNAનું ખંડન કરવા માટે અલ્ટ્રાસોનિકેશન એક વિશ્વસનીય તકનીક છે. નુકસાન પહોંચાડ્યા વિના પ્લાઝ્મિડનું ખંડન કરવા માટે ચોકસાઈપૂર્વક નિયંત્રિત કરી શકાય તેવો કંપવિસ્તાર, સ્પંદન મોડ અને તાપમાન નિયંત્રણ એ અલ્ટ્રાસોનિકેટરની સૌથી મહત્વપૂર્ણ વિશેષતાઓ છે. વધુમાં, અમુક પદાર્થોનો ઉપયોગ પ્લાઝ્મિડના વિઘટન સામે રક્ષણ આપવામાં મદદ કરે છે. Hielscher Ultrasonics એકલ વાયલથી લઈને અનેક નમૂનાઓના એકસાથે સોનિકેશન તેમજ મલ્ટિ-વેલ પ્લેટો સુધી પ્લાઝ્મિડના નિયંત્રિત ખંડન માટે વિવિધ ઉકેલો પ્રદાન કરે છે. અલ્ટ્રાસાઉન્ડ દ્વારા પ્લાઝ્મિડના સફળ ખંડન વિશે વધુ જાણો!

અલ્ટ્રાસોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને પ્લાઝ્મિડનું શિયરિંગ

જ્યારે DNAના નમૂનાઓને અલ્ટ્રાસોનિક તરંગોના સંપર્કમાં લાવવામાં આવે છે, ત્યારે અલ્ટ્રાસાઉન્ડથી ઉત્પન્ન થતાં કંપનો પ્રવાહીમાં ધ્વનિક કેવિટેશન ઉત્પન્ન કરે છે, જે યાંત્રિક બળો દ્વારા ઊંચા અણુભારવાળા DNA અણુઓનું શિયરિંગ કરે છે અથવા તેમને તોડે છે. મોટા જથ્થામાં DNAના શિયરિંગના પ્રયોગો માટે સોનિકેશન સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ છે. તેમાં ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (ChIP) જેવા ઉપયોગોનો સમાવેશ થાય છે, જેમાં ઉચ્ચ વિભેદન મેળવવા માટે નાના કદના ખંડો અત્યંત અનિવાર્ય છે. (જુઓ Tseng et al., 2012)
પ્લાઝ્મિડ DNA (pDNA) એ DNAનું એક વિશિષ્ટ સ્વરૂપ છે, જે તેના વલયાકાર આકારથી ઓળખાય છે અને બેક્ટેરિયા તથા કેટલાક યુકેરિયોટ્સમાં જોવા મળે છે.
સુપરકોઇલ્ડ pDNA એ પ્લાઝ્મિડ DNAનું ઇચ્છિત સ્વરૂપ છે, કારણ કે તે સ્વચાલિત સિક્વેન્સિંગ અને ટ્રાન્સફેક્શન જેવી અનુવર્તી પ્રક્રિયાઓમાં શ્રેષ્ઠ પરિણામો આપે છે. સુપરકોઇલ્ડ pDNA સહિતના pDNAનું સફળતાપૂર્વક ખંડન કરવા માટે અલ્ટ્રાસોનિકેશન યોગ્ય છે.
Thompson et al. (2008)એ દર્શાવ્યું હતું કે પ્લાઝ્મિડ સોનિકેશન, જે સુપરકોઇલ્ડ DNAનું ખંડન કરવા માટે જાણીતું છે, તે સિક્વેન્સની phred20 રીડ લંબાઈઓને એટલી હદ સુધી સુધારવાની અસરકારક રીત છે કે તે Beckman Coulterના નિયંત્રણ ટેમ્પલેટ અથવા ઉત્સેચક દ્વારા રેખીય બનાવેલા પ્લાઝ્મિડ્સથી નોંધપાત્ર રીતે અલગ રહેતી નથી.

પ્લાઝ્મિડ વેક્ટર્સનો ઉપયોગ

જનીનોનું ક્લોનિંગ કરવા, તેમનું સ્થાનાંતરણ કરવા અને તેમનામાં ફેરફાર કરવા માટે પ્લાઝ્મિડ્સનો ઘણીવાર સાધનો તરીકે ઉપયોગ થાય છે. જ્યારે આ હેતુઓ માટે પ્રાયોગિક રીતે પ્લાઝ્મિડ્સનો ઉપયોગ થાય છે, ત્યારે તેમને વેક્ટર્સ કહેવામાં આવે છે. DNAના ખંડો અથવા જનીનોને પ્લાઝ્મિડ વેક્ટરમાં દાખલ કરી શકાય છે, જેનાથી કહેવાતા રિકોમ્બિનન્ટ પ્લાઝ્મિડની રચના થાય છે. યજમાન કોષમાં રિકોમ્બિનન્ટ DNA પહોંચાડવા માટે પ્લાઝ્મિડ વેક્ટર્સનો વાહક તરીકે ઉપયોગ થાય છે અને તે મોલેક્યુલર ક્લોનિંગનો મુખ્ય ઘટક છે.
“વિવિધ જટિલ રોગોની સારવાર માટે જનીન ચિકિત્સામાં તેમના સંભવિત ઉપયોગ અંગે બિન-વાયરલ વેક્ટર્સનો વ્યાપક અભ્યાસ થઈ રહ્યો છે. બિન-વાયરલ વેક્ટર્સ પ્લાઝ્મિડ DNAને ભૌતિક, રાસાયણિક અને ઉત્સેચકીય વિઘટન સામે રક્ષણ આપે છે અને DNA અણુને લક્ષ્ય સ્થાને પહોંચાડે છે. ઉદાહરણ તરીકે, ધનાયનિક લિપોસોમ્સ, કાઇટોસાન અને અન્ય ધનભારિત નેનોકણો સ્થિરવિદ્યુતીય આંતરક્રિયાઓ દ્વારા પ્લાઝ્મિડ DNA સાથે સંકુલો બનાવે છે. જોકે, સહેલાઈથી રચાતાં ધનાયનિક લિપોસોમ્સ/પ્લાઝ્મિડ DNA સંકુલો પ્રમાણમાં મોટાં (એટલે કે, 300–400 nm) અને સ્વભાવે વિષમ હોય છે, જેના કારણે ઔષધીય ઉપયોગોમાં તેમનો ઉપયોગ કરવો મુશ્કેલ બને છે. મોટાં અને વિષમ પ્લાઝ્મિડ DNA/લિપોસોમ્સ, પ્લાઝ્મિડ DNA/એરોસોલ્સ અને પ્લાઝ્મિડ DNA/પેપ્ટાઇડ્સ સંકુલોને અલ્ટ્રાસોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને નાના અને સમાનરૂપ કણોમાં ઘટાડી શકાય છે.” (Sarker et al., 2019)
પ્લાઝ્મિડ વેક્ટર્સના ઉપયોગનું એક અગ્રણી ઉદાહરણ CRISPR–Cas9 છે. CRISPR–Cas9 પ્રણાલી સામાન્ય રીતે એક મોટા પ્લાઝ્મિડ અથવા અનેક નાના પ્લાઝ્મિડ્સના સ્વરૂપમાં કોષોમાં પહોંચાડવામાં આવે છે, જે લક્ષ્ય અનુક્રમ, CRISPR માર્ગદર્શક અને Cas9ને એન્કોડ કરે છે.

નેનોપ્રિસિપિટેશન દ્વારા DNA ધરાવતા PLGA નેનોકણોની અલ્ટ્રાસોનિક તૈયારી

Jo et al. (2020)એ પ્રાથમિક અસ્થિમજ્જામાંથી મેળવેલા મેક્રોફેજોમાં મોડેલ CRISPR–Cas9 પ્લાઝ્મિડ પહોંચાડવા માટે નેનોકણ વાહક બનાવવા પોલી(લેક્ટિક-કો-ગ્લાયકોલિક એસિડ) (PLGA)નો ઉપયોગ કર્યો હતો. PLGA નેનોકણોના નેનોપ્રિસિપિટેશન માટે, બે અલગ અંતિમ સમૂહો (એસ્ટર અને એમાઇન સમૂહો) ધરાવતા PLGAનો ઉપયોગ એ હેતુથી કરવામાં આવ્યો હતો કે ધનભારિત એમાઇન અંતિમ સમૂહો અને DNAના ઋણભારિત મુખ્ય માળખા વચ્ચેની વિદ્યુતભારની આંતરક્રિયાઓને કારણે સંપુટન કાર્યક્ષમતા અને લોડિંગ વધે. 50 mLની પોલીપ્રોપિલીન શંકુઆકારની સેન્ટ્રિફ્યુજ ટ્યૂબમાં, વોર્ટેક્સ મિશ્રણ દ્વારા 20 mL ઓટોક્લેવ કરેલા વિઆયનીકૃત (DI) પાણીમાં 100 mg Pluronic F127 ઓગાળવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ અલ્ટ્રાસોનિક બાથનો ઉપયોગ કરીને 30 min સુધી હળવું સોનિકેશન કરવામાં આવ્યું હતું (CupHorn જુઓ). ઓટોક્લેવ કરેલો ચુંબકીય સ્ટિરિંગ બાર ઉમેરવામાં આવ્યો હતો અને અન્ય દ્રાવણો તૈયાર કરવામાં આવતાં હતાં તે દરમિયાન આ દ્રાવણને 600 RPM પર 30 min સુધી મિશ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. DNAનું અવિશિષ્ટ અધિશોષણ ઓછું કરવા માટે સમગ્ર પ્રક્રિયામાં કાચનાં સાધનોને બદલે પ્લાસ્ટિકનાં પ્રયોગશાળા સાધનોનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. DMFમાં ઓગાળેલા PLGA (44.48 mg/ ml) અને THFમાં ઓગાળેલા TIPS pentacene (0.667 mg/ml)નાં દ્રાવણો અલગથી તૈયાર કરવામાં આવ્યાં હતાં. PLGAનું 30 min સુધી સોનિકેશન કરતાં પહેલાં તેને DMFમાં ભીંજાવા માટે 30 min સુધી સ્થિર અવસ્થામાં રાખવામાં આવ્યું હતું. (સંપૂર્ણ પ્રોટોકોલ માટે Jo et al., 2020 જુઓ)

સોનિકેશન દરમિયાન પ્લાઝ્મિડ DNAનું રક્ષણ

પ્લાઝ્મિડ અને સુપરકોઇલ્ડ પ્લાઝ્મિડ સહિતનું DNA વિઘટન પ્રત્યે અત્યંત સંવેદનશીલ હોય છે. ઉપલબ્ધ તમામ ખંડન પદ્ધતિઓ ચોક્કસ ગેરફાયદા ધરાવતી હોવાનું જાણીતું છે. અલ્ટ્રાસોનિક DNA ખંડન પસંદગીની પદ્ધતિઓમાંની એક છે, કારણ કે રક્ષણાત્મક ઉપાયો સાથે નિયંત્રિત સોનિકેશનનો ઉપયોગ કરવાથી DNAના તંતુઓને કર્તન અને ગરમીને કારણે થતું નુકસાન ઘટાડી શકાય છે.
અલ્ટ્રાસોનિક DNA કર્તન દરમિયાન નીચા કંપવિસ્તારની સેટિંગ્સ, સ્પંદન મોડ અને તાપમાન નિયંત્રણ ઉપરાંત, અમુક પદાર્થોના ઉપયોગે DNAના વિઘટન સામે નોંધપાત્ર રક્ષણાત્મક અસર દર્શાવી હતી. ઉદાહરણ તરીકે, વિવિધ પોલિમર, પેપ્ટાઇડ અને લિપિડ અલ્ટ્રાસોનિકેશન દરમિયાન પ્લાઝ્મિડ DNAનું રક્ષણ કરે છે.

અલ્ટ્રાસોનિક કર્તન તણાવ સામે પ્લાઝ્મિડ DNA અને પ્લાઝ્મિડ DNA/IL નેનોસંકુલોની સ્થિરતાની તપાસ એગારોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી. પ્લાઝ્મિડ DNA અને પ્લાઝ્મિડ DNA/IL નેનોસંકુલો બંનેને અલગ અલગ સમયગાળા માટે અલ્ટ્રાસોનિક કર્તન તણાવને આધીન કરવામાં આવ્યાં હતાં. પ્લાઝ્મિડ DNAને 0, 10, 20, 30 અને 40 મિનિટ સુધી અલ્ટ્રાસોનિક કર્તન તણાવને આધીન કરવામાં આવ્યું હતું. જોકે, પ્લાઝ્મિડ DNA/IL નેનોસંકુલોને 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 અને 120 મિનિટ સુધી અલ્ટ્રાસોનિક કર્તન તણાવને આધીન કરવામાં આવ્યાં હતાં.
(અભ્યાસ અને ચિત્ર: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019)એ દર્શાવ્યું હતું કે જ્યારે પ્લાઝ્મિડ DNA / આયનિક પ્રવાહી (pDNA/IL) નેનોસંરચનાઓને 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 અને 120 min સુધી અલ્ટ્રાસોનિક કર્તન તણાવને આધીન કરવામાં આવી અને વ્યાવસાયિક રીતે ઉપલબ્ધ ધનભારિત જનીન પહોંચાડતા પદાર્થ લિપોફેક્ટામાઇન સાથે સંકુલિત કરવામાં આવી, ત્યારે ફ્લોરેસન્સ માટે પોઝિટિવ કોષોની ટકાવારી અનુક્રમે 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% અને 50% હતી (નીચેનો આલેખ જુઓ). જ્યારે નેનોસંરચનાઓને 10 અને 20 min સુધી અલ્ટ્રાસોનિક કર્તન તણાવને આધીન કરવામાં આવી, ત્યારે ફ્લોરેસન્સ માટે પોઝિટિવ કોષોની ટકાવારી વધી હતી અને ત્યારબાદ ધીમે ધીમે ઘટી હતી.

આયનિક પ્રવાહી [Bmim][PF6] ની COS7 કોષોમાં પ્લાઝ્મિડ DNA પહોંચાડવા પર અસર. પ્લાઝ્મિડ DNA/IL (આયનિક પ્રવાહી) નેનોસંકુલોને 120 મિનિટ સુધીના સમયગાળા માટે અલ્ટ્રાસોનિક કર્તન તણાવને આધીન કરવામાં આવ્યાં હતાં અને COS7 કોષોમાં પહોંચાડતાં પહેલાં LA સાથે સંકુલિત કરવામાં આવ્યાં હતાં. આ માહિતી 10 અલગ સૂક્ષ્મદર્શકીય દૃશ્યક્ષેત્રોમાં ગણવામાં આવેલા GFP પોઝિટિવ HeLa કોષોની સરેરાશ સંખ્યા (%) દર્શાવે છે અને આ પ્રયોગ ત્રણ અલગ દિવસોએ અનેક વખત કરવામાં આવ્યો હતો. (અભ્યાસ અને આલેખ: ©Sarker et al., 2019)

અલ્ટ્રાસોનિક લાઇસેટ તૈયારી

અલ્ટ્રાસોનિક કોષલયન પ્રોટોકોલ
કોષોને અલગ કરવાની પદ્ધતિ (દા.ત., ઇમ્યુનોમેગ્નેટિક કોષ વિભાજન, ફ્લુઓરેસન્સ-સક્રિય કોષ વર્ગીકરણ (FACS), ઘનતા પ્રવણતા સેન્ટ્રિફ્યુગેશન, ઇમ્યુનોડેન્સિટી કોષ અલગીકરણ) દ્વારા તૈયાર કરાયેલા કોષોના સમૃદ્ધ નમૂનાથી શરૂઆત કરો.
કોષના નમૂનાઓમાં પ્રયોગના ઉદ્દેશ્ય અને પ્રોબ-પ્રકારના અલ્ટ્રાસોનિકેટર માટે યોગ્ય આયતનમાં લયન બફર હોવું આવશ્યક છે.
હાઇપોટોનિક બફરને પ્રાધાન્ય આપવામાં આવે છે, કારણ કે તે અલ્ટ્રાસોનિક કોષલયન વધારે છે. ઉમેરણો અને ક્ષારની સાંદ્રતાનો યોગ્ય રીતે ઉપયોગ કરવામાં આવે તે જરૂરી છે.
તમારું અલ્ટ્રાસોનિક લયન ઉપકરણ પસંદ કરો: વાયલના પરોક્ષ સોનિકેશન માટે VialTweeter અથવા CupHorn ની ભલામણ કરવામાં આવે છે. મલ્ટીવેલ પ્લેટ માટે UIP400MTP આદર્શ અલ્ટ્રાસોનિકેટર છે. પરંપરાગત પ્રોબ-પ્રકારના સોનિકેશન માટે, માઇક્રો-ટિપ ધરાવતું UP100H અથવા UP200Ht જેવું અલ્ટ્રાસોનિક હોમોજનાઇઝર સૌથી યોગ્ય છે.
પ્રોબ-પ્રકારના સોનિકેશન માટેનો પ્રોટોકોલ: માઇક્રોસેન્ટ્રિફ્યુજ ટ્યુબમાં રહેલા નમૂનાના પ્રવાહીમાં અલ્ટ્રાસોનિકેટરનો પ્રોબ મૂકો અને આશરે 10 સેકન્ડ સુધી સોનિકેશન કરો. DNAના નમૂનાના આધારે, સોનિકેશન વધુ એક કે બે વખત પુનરાવર્તિત કરવું પડી શકે છે. જરૂરી અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા ઇનપુટ (Ws/mL) નમૂનાની શ્યાનતા અને DNAના પ્રકાર પર આધાર રાખે છે. બરફના સ્નાન દ્વારા ઠંડક અને અલ્ટ્રાસોનિકેટરનો પલ્સેશન મોડ નમૂનાનું ઉષ્માને કારણે વિઘટન થતું અટકાવવામાં મદદ કરે છે.
અલ્ટ્રાસોનિક લયન પછી, પેલેટના અવશેષો (જેમાં લયન ન થયેલા કોષો, કોષકેન્દ્રો અને લયન ન થયેલી કોષાંગિકાઓ હોય છે) અલગ કરવા માટે નમૂનાનું સેન્ટ્રિફ્યુગેશન કરવામાં આવે છે.
જો નમૂના પર તાત્કાલિક આગળની પ્રક્રિયા કરવામાં ન આવે, તો તેની જીવક્ષમતા જાળવવા માટે તેને યોગ્ય તાપમાને સંગ્રહિત કરી શકાય છે.

DNA વિખંડન માટેનાં અલ્ટ્રાસોનિકેટર

Hielscher Ultrasonics DNA, RNA અને ક્રોમેટિનના વિખંડન માટે વિવિધ અલ્ટ્રાસાઉન્ડ-આધારિત પ્લેટફોર્મ પ્રદાન કરે છે. આ વિવિધ પ્લેટફોર્મમાં અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોબ (સોનોટ્રોડ), અનેક ટ્યુબ અથવા મલ્ટી-વેલ પ્લેટ (દા.ત., 96-વેલ પ્લેટ, માઇક્રોટાઇટર પ્લેટ)ના નમૂનાઓની એકસાથે તૈયારી માટેનાં પરોક્ષ સોનિકેશન ઉકેલો, સોનોરિએક્ટર અને અલ્ટ્રાસોનિક કપહોર્નનો સમાવેશ થાય છે. DNAના શિયરિંગ માટેનાં તમામ પ્લેટફોર્મ આવૃત્તિ પ્રમાણે ટ્યુન કરાયેલા, ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસરથી સંચાલિત થાય છે, જેને ચોકસાઈપૂર્વક નિયંત્રિત કરી શકાય છે અને જે પુનરુત્પાદનક્ષમ પરિણામો આપે છે.

કોઈપણ સંખ્યાના અને કદના નમૂનાઓ માટે અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોસેસર

Hielscher ના બહુ-નમૂના અલ્ટ્રાસોનિકેટર VialTweeter (10 ટેસ્ટ ટ્યુબ સુધી માટે) અને UIP400MTP (માઇક્રોપ્લેટ/મલ્ટીવેલ પ્લેટ માટે) વડે તીવ્ર અને ચોકસાઈપૂર્વક નિયંત્રિત કરી શકાય તેવા અલ્ટ્રાસોનિકેશનને કારણે નમૂનાની પ્રક્રિયાનો સમય ઘટાડવો સરળ બને છે, સાથે જ DNA ના ખંડોના કદનું ઇચ્છિત વિતરણ અને ઉપજ પ્રાપ્ત થાય છે. અલ્ટ્રાસોનિક DNA ખંડન પ્લાઝ્મિડ તૈયારીનાં પગલાંને કાર્યક્ષમ, વિશ્વસનીય અને વ્યાપ વધારી શકાય તેવાં બનાવે છે. અલ્ટ્રાસાઉન્ડનાં પરિમાણો સ્થિર રાખીને પ્રોટોકોલને એક નમૂનાથી અનેક નમૂનાઓ સુધી રેખીય રીતે વિસ્તારી શકાય છે.
એકથી પાંચ આંગળીઓ ધરાવતા પ્રોબ અલ્ટ્રાસોનિકેટર ઓછી સંખ્યામાં નમૂનાઓની તૈયારી માટે આદર્શ છે. Hielscher નાં પ્રયોગશાળા અલ્ટ્રાસોનિકેટર વિવિધ શક્તિ સ્તરો સાથે ઉપલબ્ધ છે, જેથી તમે DNA સંબંધિત તમારા ઉપયોગ માટે આદર્શ અલ્ટ્રાસોનિક ડિસરપ્ટર પસંદ કરી શકો.