અલ્ટ્રાસોનિક ફિલ્ટર-એડેડ સેમ્પલ પ્રિપેરેશન (FASP): એડવાન્સ્ડ સોનિકેશન સાથે પ્રોટીઓમિક્સ વર્કફ્લોને વધારવું

આધુનિક પ્રોટીઓમિક્સમાં અલ્ટ્રાસોનિક ફિલ્ટર-એઇડેડ સેમ્પલ પ્રિપેરેશન (FASP) એક અત્યંત કાર્યક્ષમ અને પ્રજનનક્ષમ પદ્ધતિ તરીકે ઉભરી રહી છે. સ્થાપિત FASP વર્કફ્લોમાં નિયંત્રિત સોનિકેશનને એકીકૃત કરીને, સંશોધકો પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ, પાચન કાર્યક્ષમતા અને એકંદર ડેટા ગુણવત્તામાં નોંધપાત્ર સુધારો કરી શકે છે. ઉચ્ચ-થ્રુપુટ અને પ્રજનનક્ષમ સેમ્પલ પ્રિપેરેશનની વધતી માંગ સાથે, માઇક્રોપ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP જેવા કેન્દ્રિત સોનિકેટર વૈજ્ઞાનિક અને વ્યવહારુ સુસંગતતા મેળવી રહ્યા છે.

વૈજ્ઞાનિક સંદર્ભ: પ્રોટીઓમિક્સમાં FASP શા માટે મહત્વપૂર્ણ છે

ફિલ્ટર-એઇડેડ સેમ્પલ પ્રિપેરેશન (FASP) એ બોટમ-અપ પ્રોટીઓમિક્સમાં ગોલ્ડ સ્ટાન્ડર્ડ બની ગયું છે કારણ કે તે ડિટર્જન્ટ, ક્ષાર અને અન્ય દૂષકોને દૂર કરવાની ક્ષમતા ધરાવે છે અને કાર્યક્ષમ એન્ઝાઇમેટિક પાચનને સક્ષમ બનાવે છે. જો કે, ક્લાસિકલ FASP પ્રોટોકોલ ઘણીવાર અપૂર્ણ લિસિસ, અસંગત પાચન અને નમૂના પરિવર્તનશીલતા સંબંધિત મર્યાદાઓનો સામનો કરે છે. – ખાસ કરીને જ્યારે જટિલ અથવા સ્થિતિસ્થાપક જૈવિક કોષો અથવા પેશીઓ સાથે વ્યવહાર કરવામાં આવે છે.
આ તે જગ્યા છે જ્યાં કેન્દ્રિત અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા (સોનિકેશન) નિર્ણાયક ફાયદો પૂરો પાડે છે. યાંત્રિક શીયર ફોર્સ અને પોલાણનો પરિચય આપીને, સોનિકેશન પ્રોટીન અખંડિતતા સાથે સમાધાન કર્યા વિના FASP વર્કફ્લોમાં બહુવિધ મહત્વપૂર્ણ પગલાંઓને વધારે છે.

અલ્ટ્રાસોનિક FASP માં સોનિકેશનની સકારાત્મક અસરો

સોનિકેશન નિયંત્રિત એકોસ્ટિક પોલાણ રજૂ કરે છે – સૂક્ષ્મ પરપોટાની રચના અને પતન – જે સ્થાનિક શીયર ફોર્સ અને માઇક્રોસ્ટ્રીમિંગ ઉત્પન્ન કરે છે.
સોનિકેશન, માસ ટ્રાન્સફરમાં સુધારો કરીને અને પ્રતિક્રિયા ગતિશાસ્ત્રને વેગ આપીને અલ્ટ્રાસોનિક FASP માં આલ્કિલેશન અને પાચન બંને પગલાંને વધારે છે. અલ્ટ્રાસોનિક ઉર્જાનો ઉપયોગ પોલાણ ઉત્પન્ન કરે છે, જેનાથી સ્થાનિક માઇક્રોસ્ટ્રીમિંગ અને ક્ષણિક શીયર ફોર્સ થાય છે જે પ્રોટીન મેટ્રિક્સ અથવા ફિલ્ટર વાતાવરણમાં રીએજન્ટ્સના ઝડપી મિશ્રણ અને કાર્યક્ષમ પ્રવેશને પ્રોત્સાહન આપે છે. આલ્કિલેશન દરમિયાન, આયોડોએસેટામાઇડ દ્વારા સિસ્ટીન અવશેષોમાં વધુ સમાન અને ઝડપી ફેરફાર થાય છે. પાચનના પગલામાં, સોનિકેશન પ્રોટીઓલિટીક ક્લીવેજ સાઇટ્સની સુલભતામાં વધારો કરે છે અને એન્ઝાઇમ-સબસ્ટ્રેટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓમાં સુધારો કરે છે, જેનાથી ટ્રિપ્સિન પ્રવૃત્તિને વેગ મળે છે અને પાચન કાર્યક્ષમતામાં વધારો થાય છે. એકંદરે, અલ્ટ્રાસોનિક સારવાર પ્રક્રિયા સમય ઘટાડે છે જ્યારે પ્રતિક્રિયા પૂર્ણતા અને પ્રજનનક્ષમતા જાળવી રાખે છે અથવા સુધારે છે.

પ્રોટીઓમિક્સ નમૂનાની તૈયારીમાં, અલ્ટ્રાસોનિક FASP નો અનુવાદ આમાં થાય છે:

• કઠિન પેશીઓ અથવા માઇક્રોબાયલ નમૂનાઓમાં પણ, વધુ કાર્યક્ષમ કોષ વિક્ષેપ અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ
• પ્રોટીનનું ઉન્નત દ્રાવ્યીકરણ
• પાચન દરમિયાન ઉત્સેચકોની સુલભતામાં સુધારો
• પ્રક્રિયા સમય ઓછો અને પ્રજનનક્ષમતામાં વધારો

પરંપરાગત યાંત્રિક અથવા રાસાયણિક લિસિસ પદ્ધતિઓથી વિપરીત, અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયા ખૂબ જ નિયંત્રિત અને સ્કેલેબલ છે, જે તેને પ્રમાણિત પ્રોટીઓમિક્સ વર્કફ્લો માટે ખાસ કરીને યોગ્ય બનાવે છે.

પરંપરાગત અભિગમો કરતાં અલ્ટ્રાસોનિક FASP ના ફાયદા

FASP પ્રોટોકોલમાં સોનિકેશનનું એકીકરણ માપી શકાય તેવા લાભો પૂરા પાડે છે જે ડાઉનસ્ટ્રીમ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી પરિણામોને સીધી અસર કરે છે.
અલ્ટ્રાસોનિક FASP વધુ સંપૂર્ણ પ્રોટીન પુનઃપ્રાપ્તિને સક્ષમ કરે છે, ખાસ કરીને તંતુમય પેશીઓ અથવા બાયોફિલ્મ્સ જેવા પડકારજનક નમૂનાઓમાંથી. સમાન ઊર્જા વિતરણ પ્રતિકૃતિઓમાં સુસંગત સારવાર સુનિશ્ચિત કરે છે, પરિવર્તનશીલતા ઘટાડે છે. – માત્રાત્મક પ્રોટીઓમિક્સ માટે એક આવશ્યક આવશ્યકતા.
વધુમાં, સોનિકેશન એન્ઝાઇમ-સબસ્ટ્રેટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં સુધારો કરીને પાચન ગતિશાસ્ત્રને વેગ આપે છે. આ ઘણીવાર ટૂંકા પાચન સમય અને ઉચ્ચ પેપ્ટાઇડ ઉપજમાં પરિણમે છે, જ્યારે ક્રમ કવરેજ જાળવી રાખે છે.
વર્કફ્લોના દૃષ્ટિકોણથી, અલ્ટ્રાસોનિક સિસ્ટમ્સ મેન્યુઅલ હસ્તક્ષેપ ઘટાડે છે અને આક્રમક રાસાયણિક સારવારની જરૂરિયાતને દૂર કરે છે, નમૂનાની અખંડિતતા જાળવી રાખે છે અને પ્રોટોકોલ માનકીકરણને સરળ બનાવે છે.

ઓવર-નાઈટ FASP ની સરખામણીમાં અલ્ટ્રાસોનિક FASP દ્વારા ઓળખાયેલ પ્રોટીનની વધેલી સંખ્યા દર્શાવતો વેન ડાયાગ્રામ
છબી અને અભ્યાસ: ©કાર્વાલ્હો એટ અલ., 2020

પ્રોટોકોલ: UIP400MTP સાથે હાઇ-થ્રુપુટ અલ્ટ્રાસોનિક FASP

મોટા નમૂના સમૂહોની પ્રક્રિયા કરતી પ્રયોગશાળાઓ માટે, UIP400MTP માઇક્રોપ્લેટ સોનિકેટર પ્રમાણભૂત મલ્ટી-વેલ પ્લેટ્સ (દા.ત., 96-વેલ પ્લેટ્સ) ના એક સાથે સોનિકેશનને સક્ષમ કરે છે, જે થ્રુપુટ અને પ્રજનનક્ષમતામાં નોંધપાત્ર વધારો કરે છે.
આ ફોર્મેટમાં, નમૂનાઓ (સામાન્ય રીતે 50-200 µL પ્રતિ કૂવા) સીધા અલ્ટ્રાફિલ્ટરેશન અથવા ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રોસેસિંગ સાથે સુસંગત માઇક્રોપ્લેટ્સમાં તૈયાર કરવામાં આવે છે. લિસિસ બફર્સ પ્રમાણભૂત FASP પ્રોટોકોલમાં ઉપયોગમાં લેવાતા જેવા જ છે.

UIP400MTP બધા કુવાઓમાં એકસમાન અલ્ટ્રાસોનિક ઉર્જા લાગુ કરે છે. નમૂનાના પ્રકાર પર આધાર રાખીને, સોનિકેશન સામાન્ય રીતે 2-4 મિનિટ માટે 60-80% કંપનવિસ્તાર પર કરવામાં આવે છે. પ્લગેબલ તાપમાન સેન્સરનો ઉપયોગ કરીને તાપમાનનું નિરીક્ષણ કરો. સ્પંદિત સોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને અને વૈકલ્પિક રીતે લેબ ચિલરનો ઉપયોગ કરીને.

ઉદાહરણરૂપ પ્રોટોકોલ:

1. આલ્કિલેશન સ્ટેપ માટે, નમૂનાઓને 7 ચક્ર માટે 40% કંપનવિસ્તાર પર માઇક્રોપ્લેટ સોનિકેટર (UIP400MTP) નો ઉપયોગ કરીને સોનિકેટ કરવામાં આવે છે (30 સેકન્ડ ચાલુ, 15 સેકન્ડ બંધ; કુલ સોનિકેટિંગ સમય: 5 મિનિટ 45 સેકન્ડ).
2. સોનિકેશન પછી, આયોડોએસેટામાઇડ (IAA) દ્રાવણ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા દૂર કરવામાં આવે છે. ટ્રિપ્સિન પાચન પહેલાં, નમૂનાઓને અવશેષ યુરિયા દૂર કરવા માટે ધોવા જોઈએ, જે એક મજબૂત કેઓટ્રોપિક એજન્ટ છે જે એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિને અટકાવે છે. તેથી, નમૂનાઓને 25 mM એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટ (AmBic) ના 200 μL સાથે બે વાર ધોવામાં આવે છે.
3. ત્યારબાદ, ૧૨.૫ એમએમ એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટમાં તૈયાર કરાયેલ ૧૦૦ μL ટ્રિપ્સિન દ્રાવણ (૧:૩૦ એન્ઝાઇમ-થી-પ્રોટીન ગુણોત્તર) ઉમેરવામાં આવે છે. ત્યારબાદ પ્રોટીનનું પાચન UIP400MTP નો ઉપયોગ કરીને સમાન સોનિકેશન પરિસ્થિતિઓ (૪૦% કંપનવિસ્તાર, ૭ ચક્ર, ૩૦ સેકન્ડ ચાલુ / ૧૫ સેકન્ડ બંધ; કુલ સમય: ૫ મિનિટ ૪૫ સેકન્ડ) હેઠળ કરવામાં આવે છે.
4. સોનિકેશન પછી, નમૂનાઓને ફિલ્ટર પ્લેટોમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવે છે અથવા પ્લેટ-આધારિત FASP સિસ્ટમ્સનો ઉપયોગ કરીને પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે. રિડક્શન અને આલ્કિલેશન પગલાં પ્લેટમાં કરવામાં આવે છે, જે સુવ્યવસ્થિત કાર્યપ્રવાહ જાળવી રાખે છે.
5. ટ્રિપ્સિનનું પાચન નિયંત્રિત પરિસ્થિતિઓમાં (દા.ત., 37°C, 4-16 કલાક) કરવામાં આવે છે, જેમાં એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિને વેગ આપવા અને પેપ્ટાઇડ ઉપજ સુધારવા માટે ટૂંકા અલ્ટ્રાસોનિક ઉત્તેજનાના વિકલ્પનો સમાવેશ થાય છે.
6. પેપ્ટાઇડ્સ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા પુનઃપ્રાપ્ત થાય છે અને LC-MS/MS વિશ્લેષણ માટે તૈયાર છે.

આ સિસ્ટમનો મુખ્ય ફાયદો એ છે કે તે બધા કુવાઓમાં સમાન પ્રક્રિયા પરિસ્થિતિઓ પહોંચાડવાની ક્ષમતા ધરાવે છે, બેચ અસરોને ઘટાડે છે અને મોટા પાયે પ્રોટીઓમિક્સ અભ્યાસોમાં મજબૂત માત્રાત્મક તુલનાને સક્ષમ બનાવે છે.

ડિઝાઇન, ઉત્પાદન અને કન્સલ્ટિંગ – જર્મનીમાં બનાવેલ ગુણવત્તા

Hielscher ultrasonicators તેમના ઉચ્ચતમ ગુણવત્તા અને ડિઝાઇન ધોરણો માટે જાણીતા છે. મજબૂતાઈ અને સરળ કામગીરી ઔદ્યોગિક સુવિધાઓમાં અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સના સરળ એકીકરણને મંજૂરી આપે છે. ખરબચડી પરિસ્થિતિઓ અને માંગવાળા વાતાવરણને Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ દ્વારા સરળતાથી નિયંત્રિત કરવામાં આવે છે.

Hielscher Ultrasonics એ ISO પ્રમાણિત કંપની છે અને ઉચ્ચ-પ્રદર્શન અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ પર વિશેષ ભાર મૂકે છે જેમાં અત્યાધુનિક ટેકનોલોજી અને વપરાશકર્તા-મિત્રતા દર્શાવવામાં આવે છે. અલબત્ત, Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ CE અનુરૂપ છે અને UL, CSA અને RoHs ની જરૂરિયાતોને પૂર્ણ કરે છે.

સાહિત્ય / સંદર્ભો