અલ્ટ્રાસોનિક ફિલ્ટર-સહાયિત નમૂના તૈયારી (FASP): અદ્યતન સોનિકેશનથી પ્રોટીઓમિક કાર્યપ્રવાહોમાં સુધારો

અલ્ટ્રાસોનિક ફિલ્ટર-સહાયિત નમૂના તૈયારી (FASP) આધુનિક પ્રોટીઓમિક્સમાં અત્યંત કાર્યક્ષમ અને પુનરુત્પાદનીય પદ્ધતિ તરીકે ઊભરી રહી છે. સ્થાપિત FASP કાર્યપ્રવાહોમાં નિયંત્રિત સોનિકેશનનો સમાવેશ કરીને સંશોધકો પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ, પાચનની કાર્યક્ષમતા અને ડેટાની એકંદર ગુણવત્તામાં નોંધપાત્ર સુધારો કરી શકે છે. એકસાથે મોટી સંખ્યામાં નમૂનાઓની પુનરુત્પાદનીય તૈયારીની વધતી માંગ સાથે, માઇક્રોપ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP જેવા કેન્દ્રિત સોનિકેશન આપતા સોનિકેટરોનું વૈજ્ઞાનિક અને વ્યવહારિક મહત્ત્વ વધી રહ્યું છે.

વૈજ્ઞાનિક સંદર્ભ: પ્રોટીઓમિક્સમાં FASP શા માટે મહત્ત્વનું છે

કાર્યક્ષમ એન્ઝાઇમેટિક પાચન શક્ય બનાવવાની સાથે ડિટર્જન્ટ, ક્ષાર અને અન્ય દૂષકો દૂર કરવાની ક્ષમતાને કારણે ફિલ્ટર-સહાયિત નમૂના તૈયારી (FASP) બોટમ-અપ પ્રોટીઓમિક્સમાં સુવર્ણ ધોરણ બની ગઈ છે. જોકે, પરંપરાગત FASP પ્રોટોકોલમાં ઘણીવાર અપૂર્ણ કોષલયન, અસંગત પાચન અને નમૂનાઓ વચ્ચેની પરિવર્તનશીલતા સંબંધિત મર્યાદાઓ જોવા મળે છે – ખાસ કરીને જટિલ અથવા વિઘટન સામે પ્રતિરોધક જૈવિક કોષો કે પેશીઓ સાથે કામ કરતી વખતે.
અહીં કેન્દ્રિત અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા (સોનિકેશન) નિર્ણાયક લાભ આપે છે. યાંત્રિક શિયર બળો અને કેવિટેશન ઉત્પન્ન કરીને સોનિકેશન પ્રોટીનની અખંડિતતા સાથે સમાધાન કર્યા વિના FASP કાર્યપ્રવાહનાં અનેક નિર્ણાયક પગલાંમાં સુધારો કરે છે.

અલ્ટ્રાસોનિક FASPમાં સોનિકેશનની સકારાત્મક અસરો

સોનિકેશન નિયંત્રિત ધ્વનિક કેવિટેશન – સૂક્ષ્મ પરપોટાઓની રચના અને તેમનું તૂટી પડવું – ઉત્પન્ન કરે છે, જે સ્થાનિક શિયર બળો અને સૂક્ષ્મ પ્રવાહો પેદા કરે છે.
સોનિકેશન દ્રવ્ય સ્થાનાંતરણ સુધારીને અને પ્રતિક્રિયાની ગતિ વધારીને અલ્ટ્રાસોનિક FASPમાં આલ્કિલેશન અને પાચન બંને તબક્કાઓને વધુ અસરકારક બનાવે છે. અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જાનો ઉપયોગ કેવિટેશન ઉત્પન્ન કરે છે, જેનાથી સ્થાનિક સૂક્ષ્મ પ્રવાહો અને ક્ષણિક શિયર બળો પેદા થાય છે. આ બળો ઝડપી મિશ્રણ અને પ્રોટીન મેટ્રિક્સ અથવા ફિલ્ટરના પર્યાવરણમાં અભિકર્મકોના કાર્યક્ષમ પ્રવેશને પ્રોત્સાહન આપે છે. આલ્કિલેશન દરમિયાન, આના પરિણામે આયોડોએસિટામાઇડ દ્વારા સિસ્ટીન અવશેષોનું વધુ એકસમાન અને ઝડપી રૂપાંતરણ થાય છે. પાચનના તબક્કામાં, સોનિકેશન પ્રોટિઓલિટિક વિચ્છેદન સ્થાનોની સુલભતા વધારે છે અને એન્ઝાઇમ–સબસ્ટ્રેટ આંતરક્રિયાઓ સુધારે છે, જેથી ટ્રિપ્સિનની ક્રિયા ઝડપી બને છે અને પાચનની કાર્યક્ષમતા વધે છે. એકંદરે, અલ્ટ્રાસોનિક ઉપચાર પ્રતિક્રિયાની પૂર્ણતા અને પુનરુત્પાદનીયતા જાળવીને અથવા સુધારીને પ્રક્રિયા માટેનો સમય ઘટાડે છે.

પ્રોટીઓમિક્સ માટે નમૂના તૈયારીમાં અલ્ટ્રાસોનિક FASPથી નીચેના લાભો મળે છે:

• કઠિન પેશીઓ અથવા સૂક્ષ્મજીવી નમૂનાઓમાં પણ વધુ કાર્યક્ષમ કોષ વિઘટન અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ
• પ્રોટીનનું વધુ અસરકારક દ્રાવ્યીકરણ
• પાચન દરમિયાન એન્ઝાઇમની વધુ સારી સુલભતા
• પ્રક્રિયા માટેના સમયમાં ઘટાડો અને પુનરુત્પાદનીયતામાં વધારો

પરંપરાગત યાંત્રિક અથવા રાસાયણિક કોષલયન પદ્ધતિઓથી વિપરીત, અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયાને ઉચ્ચ સ્તરે નિયંત્રિત કરી શકાય છે અને તેનું પ્રમાણ વધારી શકાય છે, જેથી તે પ્રમાણિત પ્રોટીઓમિક્સ કાર્યપ્રવાહો માટે ખાસ યોગ્ય બને છે.

પરંપરાગત અભિગમોની સરખામણીમાં અલ્ટ્રાસોનિક FASPના ફાયદા

FASP પ્રોટોકોલમાં સોનિકેશનનો સમાવેશ કરવાથી માપી શકાય તેવા લાભો મળે છે, જે ત્યારબાદના માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રીનાં પરિણામો પર સીધી અસર કરે છે.
અલ્ટ્રાસોનિક FASP પ્રોટીનની વધુ સંપૂર્ણ પુનઃપ્રાપ્તિ શક્ય બનાવે છે, ખાસ કરીને તંતુમય પેશીઓ અથવા બાયોફિલ્મ જેવા પડકારજનક નમૂનાઓમાંથી. ઊર્જાનું એકસમાન વિતરણ પુનરાવર્તિત નમૂનાઓમાં સુસંગત ઉપચાર સુનિશ્ચિત કરે છે અને પરિવર્તનશીલતા ઘટાડે છે – જે માત્રાત્મક પ્રોટીઓમિક્સ માટે આવશ્યક છે.
વધુમાં, સોનિકેશન એન્ઝાઇમ–સબસ્ટ્રેટ આંતરક્રિયા સુધારીને પાચનની ગતિ વધારે છે. આના પરિણામે ઘણીવાર પાચન માટે ઓછો સમય લાગે છે અને પેપ્ટાઇડની ઉપજ વધે છે, જ્યારે અનુક્રમનું આવરણ જળવાઈ રહે છે.
કાર્યપ્રવાહની દૃષ્ટિએ, અલ્ટ્રાસોનિક સિસ્ટમો હસ્તચાલિત હસ્તક્ષેપ ઘટાડે છે અને ઉગ્ર રાસાયણિક ઉપચારોની જરૂરિયાત દૂર કરે છે, જેથી નમૂનાની અખંડિતતા જળવાય છે અને પ્રોટોકોલનું માનકીકરણ સરળ બને છે.

રાતભર ચાલતા FASPની સરખામણીમાં અલ્ટ્રાસોનિક FASP દ્વારા ઓળખાયેલા પ્રોટીનની સંખ્યામાં થયેલો વધારો દર્શાવતો વેન આલેખ
ચિત્ર અને અભ્યાસ: ©Carvalho et al., 2020

પ્રોટોકોલ: UIP400MTP સાથે ઉચ્ચ નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતાવાળી અલ્ટ્રાસોનિક FASP

નમૂનાઓના મોટા સમૂહો પર પ્રક્રિયા કરતી પ્રયોગશાળાઓ માટે, UIP400MTP માઇક્રોપ્લેટ સોનિકેટર પ્રમાણભૂત મલ્ટી-વેલ પ્લેટો (દા.ત., 96-વેલ પ્લેટો)નું એકસાથે સોનિકેશન શક્ય બનાવે છે, જેનાથી નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતા અને પુનરુત્પાદકતામાં નોંધપાત્ર વધારો થાય છે.
આ વ્યવસ્થામાં, નમૂનાઓ (સામાન્ય રીતે દરેક વેલ દીઠ 50–200 µL) અલ્ટ્રાફિલ્ટ્રેશન અથવા અનુગામી પ્રક્રિયા સાથે સુસંગત માઇક્રોપ્લેટોમાં સીધા તૈયાર કરવામાં આવે છે. કોષલયન માટેનાં બફરો પ્રમાણભૂત FASP પ્રોટોકોલમાં વપરાતાં બફરો જેવાં હોય છે.

UIP400MTP તમામ વેલમાં સમાન અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા લાગુ કરે છે. નમૂનાના પ્રકારને આધારે, સામાન્ય રીતે 60–80% કંપનવિસ્તાર પર 2–4 મિનિટ સુધી સોનિકેશન કરવામાં આવે છે. જોડાણ કરી શકાય તેવા તાપમાન સેન્સરનો ઉપયોગ કરીને તાપમાનનું નિરીક્ષણ કરો. સ્પંદિત સોનિકેશનનો અને વૈકલ્પિક રીતે પ્રયોગશાળાના ચિલરનો ઉપયોગ કરો.

ઉદાહરણરૂપ પ્રોટોકોલ:

1. આલ્કિલેશનના તબક્કા માટે, માઇક્રોપ્લેટ સોનિકેટર (UIP400MTP)નો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓનું 40% કંપનવિસ્તાર પર 7 ચક્રો સુધી સોનિકેશન કરવામાં આવે છે (30 s ચાલુ, 15 s બંધ; સોનિકેશનનો કુલ સમય: 5 min 45 s).
2. સોનિકેશન પછી, આયોડોએસિટામાઇડ (IAA)નું દ્રાવણ અપકેન્દ્રણ દ્વારા દૂર કરવામાં આવે છે. ટ્રિપ્સિન દ્વારા પાચન પહેલાં, અવશેષ યુરિયાને દૂર કરવા માટે નમૂનાઓને ધોવા જરૂરી છે; યુરિયા એ એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિને અવરોધતો શક્તિશાળી કેઓટ્રોપિક પદાર્થ છે. તેથી, નમૂનાઓને 25 mM એમોનિયમ બાઇકાર્બોનેટ (AmBic)ના 200 μL વડે બે વાર ધોવામાં આવે છે.
3. ત્યારબાદ, 12.5 mM એમોનિયમ બાઇકાર્બોનેટમાં તૈયાર કરેલા ટ્રિપ્સિન દ્રાવણના 100 μL (એન્ઝાઇમ અને પ્રોટીનનો ગુણોત્તર 1:30) ઉમેરવામાં આવે છે. પછી UIP400MTP નો ઉપયોગ કરીને સોનિકેશનની સમાન પરિસ્થિતિઓ હેઠળ પ્રોટીનનું પાચન કરવામાં આવે છે (40% કંપનવિસ્તાર, 7 ચક્રો, 30 s ચાલુ / 15 s બંધ; કુલ સમય: 5 min 45 s).
4. સોનિકેશન પછી, નમૂનાઓને ફિલ્ટર પ્લેટોમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવે છે અથવા પ્લેટ-આધારિત FASP પ્રણાલીઓનો ઉપયોગ કરીને તેમની પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે. સુવ્યવસ્થિત કાર્યપ્રવાહ જાળવી રાખીને, અપચય અને આલ્કિલેશનના તબક્કાઓ પ્લેટની અંદર કરવામાં આવે છે.
5. ટ્રિપ્સિન દ્વારા પાચન નિયંત્રિત પરિસ્થિતિઓ હેઠળ (દા.ત., 37°C, 4–16 કલાક) કરવામાં આવે છે, જેમાં એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિને વેગ આપવા અને પેપ્ટાઇડની પ્રાપ્તિ વધારવા માટે ટૂંકા સમયના અલ્ટ્રાસોનિક ઉત્તેજનનો વિકલ્પ ઉપલબ્ધ હોય છે.
6. અપકેન્દ્રણ દ્વારા પેપ્ટાઇડ મેળવવામાં આવે છે અને તે LC-MS/MS વિશ્લેષણ માટે તૈયાર હોય છે.

આ પ્રણાલીનો મુખ્ય લાભ તમામ વેલમાં એકસરખી પ્રક્રિયા પરિસ્થિતિઓ પૂરી પાડવાની તેની ક્ષમતામાં રહેલો છે, જે બેચની અસરોને ન્યૂનતમ કરે છે અને મોટા પાયાના પ્રોટીઓમિક્સ અભ્યાસોમાં વિશ્વસનીય પરિમાણાત્મક તુલનાઓ શક્ય બનાવે છે.

ડિઝાઇન, ઉત્પાદન અને પરામર્શ – જર્મનીમાં નિર્મિત ગુણવત્તા

Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ તેમની સર્વોચ્ચ ગુણવત્તા અને ડિઝાઇનનાં ધોરણો માટે જાણીતા છે. મજબૂતાઈ અને સરળ સંચાલનને કારણે અમારા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સને ઔદ્યોગિક સુવિધાઓમાં સરળતાથી સંકલિત કરી શકાય છે. Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ કઠોર પરિસ્થિતિઓ અને પડકારજનક વાતાવરણનો સરળતાથી સામનો કરે છે.

Hielscher Ultrasonics એક ISO પ્રમાણિત કંપની છે અને અદ્યતન ટેક્નોલોજી તથા વપરાશકર્તા માટેની સરળતા ધરાવતા ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતાવાળા અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ પર વિશેષ ભાર મૂકે છે. અલબત્ત, Hielscher અલ્ટ્રાસોનિકેટર્સ CE અનુરૂપ છે અને UL, CSA તથા RoHs ની આવશ્યકતાઓ પૂરી કરે છે.

સાહિત્ય / સંદર્ભો

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).