ઉચ્ચ નમૂના પ્રક્રમણ ક્ષમતાવાળા પ્રોટીન પાચન સાથેની પ્રોટિઓમિક કાર્યપ્રવાહો

જૈવિક પ્રક્રિયાઓ અને તંત્રોને સમજવા માટે પ્રોટિઓમિક્સ એક આવશ્યક ક્ષેત્ર છે, અને તેના કાર્યપ્રવાહોમાં પ્રોટીન પાચન એક નિર્ણાયક પગલું છે. પરંપરાગત રીતે, પ્રોટીન પાચન દ્રાવણમાં ટ્રિપ્સિન જેવા પ્રોટીનવિઘટક ઉત્સેચકોનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે, જે ખાસ કરીને લાઇસિન અને આર્જિનિન અવશેષો પરના પેપ્ટાઇડ બંધોનું જલવિઘટન કરે છે. આ પ્રક્રિયાથી એવા પેપ્ટાઇડ બને છે જે માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS)ના ઉપયોગોમાં આયનીકરણ અને ખંડન માટે સારી રીતે અનુકૂળ હોય છે. જોકે, પરંપરાગત પાચન પદ્ધતિઓને પૂર્ણ થવામાં 12–24 કલાક લાગે છે, જેના કારણે પ્રોટિઓમિક કાર્યપ્રવાહોમાં નોંધપાત્ર અવરોધો ઊભા થાય છે.
અલ્ટ્રાસોનિકેશન એક શક્તિશાળી વિકલ્પ પૂરો પાડે છે, જે પાચનનો સમય કલાકોમાંથી ઘટાડીને માત્ર થોડી મિનિટો કરી દે છે. Hielscher CupHorn, VialTweeter અને 96-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP જેવા અદ્યતન બહુ-નમૂના સોનિકેટરો સાથે સંયોજિત કરવામાં આવે ત્યારે અલ્ટ્રાસોનિકેશન ઝડપી અને ઉચ્ચ નમૂના પ્રક્રમણ ક્ષમતાવાળું પ્રોટિઓમિક્સ શક્ય બનાવે છે. આ તકનીકો કાર્યપ્રવાહોને સુવ્યવસ્થિત કરે છે, પુનરુત્પાદકતા અથવા ડેટાની ગુણવત્તા સાથે સમાધાન કર્યા વિના નમૂના તૈયારીનો સમય ઘટાડે છે અને કાર્યક્ષમતા વધારે છે.

પ્રોટીન પાચનમાં અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જાની ભૂમિકા

અલ્ટ્રાસોનિકેશન કેન્દ્રિત અલ્ટ્રાસાઉન્ડ તરંગોનો ઉપયોગ કરીને કેવિટેશન સર્જે છે – સ્થાનિક સૂક્ષ્મ પરપોટા, જે ધસી પડવાથી તીવ્ર કર્તન બળો ઉત્પન્ન કરે છે. આ ઘટના દ્રવ્ય સ્થાનાંતરણ વધારે છે, ઉત્સેચકોનું સબસ્ટ્રેટો સાથે મિશ્રણ પ્રોત્સાહિત કરે છે અને પ્રોટીનની સંરચનાઓને ઉકેલે છે, જેથી વિચ્છેદન સ્થાનો ટ્રિપ્સિન જેવા પ્રોટીનવિઘટક ઉત્સેચકો માટે ખુલ્લાં પડે છે.
પરિણામ શું આવે છે? કાર્યક્ષમતા અથવા પુનરુત્પાદકતા સાથે સમાધાન કર્યા વિના પાચનના સમયમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થાય છે.

અલ્ટ્રાસોનિક્સથી ઉન્નત પ્રોટીનવિઘટક પાચન: પદ્ધતિ અને પરિણામો

ત્વરિત પાચન પ્રોટોકોલ

અલ્ટ્રાસોનિક-સહાયિત પાચન કાર્યપ્રવાહોને ઝડપી બનાવવા માટે પ્રોટીનવિઘટક ઉત્સેચકો અને અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જાનું સંયોજન કરે છે. ઉદાહરણ તરીકે, Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz)નો ઉપયોગ કરતી વખતે પાચનનો કાર્યપ્રવાહ નીચે મુજબ આગળ વધે છે:

1. અપચય: પ્રોટીન નમૂનાઓ (0.5 mg/mL, 20 µL)ને એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટ બફર (12.5 mM)માં DTT (2 µL, 110 mM) વડે ઉપચાર આપવામાં આવે છે. 50% કંપનવિસ્તાર પર 5 મિનિટ સુધી સોનિકેશન કરવામાં આવે છે.
2. આલ્કિલેશન: IAA (2 µL, 400 mM) ઉમેર્યા પછી, એ જ પરિસ્થિતિઓમાં સોનિકેશન ફરીથી કરવામાં આવે છે.
3. પાચન: નમૂનાઓને મંદ કરવામાં આવે છે અને સ્થિરીકૃત ટ્રિપ્સિન ધરાવતા નેનોકણો સાથે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવે છે. સોનિકેશનનો અંતિમ તબક્કો (5 મિનિટ) પાચન પૂર્ણ કરે છે. પેપ્ટાઇડને અલગ કરીને, સૂકવીને MS વિશ્લેષણ માટે સંગ્રહિત કરવામાં આવે છે.

આ અલ્ટ્રાસોનિક પદ્ધતિ તૈયારીનો કુલ સમય 12 કલાકથી ઘટાડીને 30 મિનિટ કરતાં ઓછો કરે છે. પ્રક્રિયા ઝડપી હોવા છતાં, પેપ્ટાઇડની ઊપજ અને ગુણવત્તા પરંપરાગત રાતભર ચાલતી પદ્ધતિઓને અનુરૂપ રહે છે.

અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોટીન પાચનની કાર્યક્ષમતા

E. coli પ્રોટિઓમનો ઉપયોગ કરીને કરાયેલા તુલનાત્મક અભ્યાસોમાં:

• પ્રોટીનની ઓળખ: અલ્ટ્રાસોનિક રીતે પાચિત નમૂનાઓમાં 5 મિનિટમાં 777 પ્રોટીન ઓળખાયા હતા, જ્યારે 12 કલાકમાં 817 પ્રોટીન ઓળખાયા હતા. બંને પદ્ધતિઓમાં સામાન્ય રીતે ઓળખાયેલા પ્રોટીનનું પ્રમાણ 70% કરતાં વધુ હતું.
• પુનરુત્પાદકતા: પુનરાવર્તિત વિશ્લેષણોએ દરેક પદ્ધતિની અંદર 98% કરતાં વધુ સહસંબંધ મૂલ્યો દર્શાવ્યાં હતાં, જે વિશ્વસનીયતા દર્શાવે છે.
• પસંદગીક્ષમતા: દરેક પદ્ધતિ દ્વારા અમુક પ્રોટીનનું પ્રાધાન્યપૂર્વક પાચન થયું હતું, જેમાં અલ્ટ્રાસોનિક પાચન 65 પ્રોટીન માટે અને રાતભરનું પાચન 54 પ્રોટીન માટે વધુ અનુકૂળ હતું. આવા સૂક્ષ્મ તફાવતો ચોક્કસ ઉપયોગો માટે અલ્ટ્રાસોનિકેશનની અનન્ય સંભાવનાને રેખાંકિત કરે છે.

E. coli નમૂનામાં ઉમેરાયેલા સાત પ્રોટીનના લેબલ-મુક્ત પરિમાણનનાં પરિણામો.
નીચેના પ્રોટીન બે અલગ સ્તરોએ ઉમેરવામાં આવ્યા હતા, જેમ કે
“Theo Ratio” નામના કૉલમમાં દર્શાવ્યું છે. Theo Ratio એ આ
પ્રયોગમાં વપરાયેલા બે સ્તરો વચ્ચેનો સૈદ્ધાંતિક ગુણોત્તર છે. બોવાઇન સીરમ આલ્બ્યુમિન (ALBU), β-લેક્ટોગ્લોબ્યુલિન (LACB), α-S1 કેસીન (CASA1),
α-S2 કેસીન (CASA2), સાયટોક્રોમ c (CYC), ઓવલ્બ્યુમિન (OVAL) અને કાર્બોનિક એનહાઇડ્રેઝ 2
(CAH2). ગુણોત્તરોની ગણતરી MaxQuant વિશ્લેષણમાંથી મેળવેલી LFQ પ્રોટીન તીવ્રતાઓનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.
દરેક પદ્ધતિથી મેળવેલાં મૂલ્યોની તુલના કરવા માટે સ્ટુડન્ટની t કસોટી લાગુ કરવામાં આવી હતી (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
અભ્યાસ અને આલેખ: © Martins et al., 2019)

નેનોકણો પર સ્થિરીકૃત ટ્રિપ્સિન

અલ્ટ્રાસોનિકેશન સાથે ટ્રિપ્સિન સ્થિરિત કરેલા નાનોકણો (દા.ત., T-FMNPs)નું સંયોજન પ્રોટિઓમિક્સની કાર્યપ્રવાહોને વધુ સુધારે છે. આ નાનોકણો ઉત્સેચક અને સબસ્ટ્રેટ વચ્ચેની ક્રિયાઓ માટે મોટું સપાટી ક્ષેત્ર પૂરું પાડે છે, જેનાથી કાર્યક્ષમતા વધે છે. E. coli જેવા જટિલ પ્રોટિઓમ પર લાગુ કરવામાં આવે ત્યારે આ સંયુક્ત પદ્ધતિ નીચેના પરિણામો આપે છે:

• ઝડપ: 5 મિનિટની અંદર સંપૂર્ણ પાચન.
• ચોકસાઈ: પરંપરાગત પદ્ધતિઓ સાથે તુલનાત્મક પ્રોટીનનું માત્રાત્મક નિર્ધારણ (p > 0.01, n=3).
• પ્રક્રિયાનું પ્રમાણ વધારવાની ક્ષમતા: UIP400MTP જેવા મલ્ટિ-વેલ પ્લેટફોર્મ માટે અનુકૂલન કરવાથી ઉચ્ચ નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતા સાથે પ્રક્રિયા કરી શકાય છે.

પગલાવાર સૂચનાઓ સાથેની વિગતવાર પ્રક્રિયાવિધિ માટે અહીં ક્લિક કરો!
(જુઓ Martins et al., 2019)

Hielscher સોનિકેટરો સાથે ઊંચી ઝડપે અને ઉચ્ચ નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતા સાથે પ્રોટીનવિઘટક પાચન

પ્રોટિઓમિક્સ માટેનાં શ્રેષ્ઠ સોનિકેટર મોડેલો

Hielscher Ultrasonics એકસાથે બહુવિધ નમૂનાઓની તૈયારી માટે વિવિધ સોનિકેટર મોડેલો પ્રદાન કરે છે, જે ઉચ્ચ નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતાવાળી કાર્યપ્રવાહોને સુગમ બનાવે છે. તમે વાયલ, ટેસ્ટ ટ્યુબ, મલ્ટિ-વેલ પ્લેટો (દા.ત., 6-, 24-, 96-વેલ પ્લેટો) કે પેટ્રી ડિશ સાથે કામ કરતા હોવ – અમે તમારા પ્રયોગો માટે આદર્શ સોનિકેટરો પ્રદાન કરીએ છીએ.

UIP400MTP મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર

સર્વોચ્ચ નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતા માટે UIP400MTP, 96-વેલ પ્લેટો પર અલ્ટ્રાસોનિક પ્રક્રિયા કરવાની ક્ષમતા પૂરી પાડે છે. કોઈપણ પ્રમાણભૂત માઇક્રોપ્લેટ સાથે સુસંગત UIP400MTP માટે મોંઘી માલિકીહકવાળી એકવાર વાપરીને નિકાલ કરવાની સામગ્રીની જરૂર પડતી નથી અને તે તમને તમારા સંશોધન માટે શ્રેષ્ઠ મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ પસંદ કરવાની સ્વતંત્રતા આપે છે. સમગ્ર પ્લેટ પર સમાન ઊર્જા પહોંચાડીને તે માત્ર 1 કલાકમાં 200 જેટલા જટિલ પ્રોટિઓમનું ઝડપી અપચય, આલ્કિલેશન અને પાચન શક્ય બનાવે છે. આ સ્તરનું સ્વચાલન અને કાર્યક્ષમતા ઉચ્ચ નમૂના પ્રક્રિયા ક્ષમતાવાળા પ્રોટિઓમિક્સ અને ક્લિનિકલ ઉપયોગો માટે અત્યંત મહત્ત્વનાં છે. મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર વિશે વધુ જાણો!

VialTweeter

VialTweeter એવી પ્રયોગશાળાઓ માટે વિશેષ રીતે તૈયાર કરવામાં આવ્યું છે, જ્યાં એકસાથે 10 જેટલી વાયલ અથવા ટેસ્ટ ટ્યુબનું સોનિકેશન કરવાની જરૂર હોય છે. તેનો બિન-આક્રમક અભિગમ પુનરુત્પાદનીય પ્રોટીન પાચન સુનિશ્ચિત કરવાની સાથે નમૂનાઓ વચ્ચેના પરસ્પર દૂષણના જોખમોને દૂર કરે છે. આ ઉપકરણ મર્યાદિત નમૂના આયતન અથવા વિવિધ પ્રકારના નમૂનાઓ સાથે કામ કરતા સંશોધકો માટે આદર્શ છે.
VialTweeter મલ્ટિ-ટ્યુબ સોનિકેટર વિશે વધુ જાણો!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn સોનિકેટર સીલબંધ પાત્રોમાં એકસાથે બહુવિધ નમૂનાઓની પ્રક્રિયા કરવા માટે રચાયેલું શક્તિશાળી ઉપકરણ છે. તે અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જાનું સમાન વિતરણ અને તાપમાનનું ચોક્કસ નિયંત્રણ સુનિશ્ચિત કરે છે. એકસાથે વધુમાં વધુ પાંચ નમૂનાઓની પ્રક્રિયા કરવાની તેની ક્ષમતા અને અપચય, આલ્કિલેશન તથા પાચનનો સમાવેશ કરતા કાર્યપ્રવાહો સાથે તેની સુસંગતતા, CupHorn ને MS પર આધારિત પ્રોટિઓમિક્સ માટે વિશ્વસનીય સાધન બનાવે છે.
CupHorn SonoReactor વિશે વધુ જાણો!

નાનોકણો પર સ્થિરિત ટ્રિપ્સિનનો ઉપયોગ કરીને અલ્ટ્રાસોનિકેશન-સહાયિત પ્રોટીનવિઘટક પાચન માટેની પગલાવાર પ્રક્રિયાવિધિ

Martins et al. (2019) દ્વારા રજૂ કરાયેલી આ પ્રક્રિયાવિધિ અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા અને નાનોકણો પર સ્થિરિત ટ્રિપ્સિન (T-FMNPs)નો ઉપયોગ કરીને ઝડપી પ્રોટીન પાચન માટે અનુકૂલિત કરવામાં આવી છે. દર્શાવેલાં પગલાં માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS)ના ઉપયોગો માટે યોગ્ય કાર્યક્ષમ અપચય, આલ્કિલેશન અને પ્રોટીનવિઘટન સુનિશ્ચિત કરે છે.
પ્રક્રિયાવિધિનાં પગલાં

1. ડાઇસલ્ફાઇડ બંધોનું અપચય
   • AmBic બફરમાં રહેલા 20 µL પ્રોટીન નમૂના (0.5 mg/mL)માં 2 µL DTT દ્રાવણ (110 mM) ઉમેરો.
   • નમૂનાની ટ્યુબને UP200St-CupHorn સોનોરિએક્ટરમાં મૂકો.
   • નમૂનાનું 50% કંપવિસ્તાર પર 2.5 મિનિટ સુધી સોનિકેશન કરો (200 W, 26 kHz).
   • ઠંડું થવા દેવા માટે થોડો સમય વિરામ આપો, પછી એ જ પરિસ્થિતિઓમાં વધુ 2.5 મિનિટ સુધી સોનિકેશન કરો.
2. અપચયિત સિસ્ટીન અવશેષોનું આલ્કિલેશન
   • અપચયિત પ્રોટીન નમૂનામાં 2 µL IAA દ્રાવણ (400 mM) ઉમેરો.
   • આલ્કિલેશનને સુગમ બનાવવા માટે 50% કંપવિસ્તાર પર 2.5 મિનિટ સુધી સોનિકેશન કરો.
   • ઠંડું થવા માટે વિરામ આપો, પછી વધુ 2.5 મિનિટ સુધી સોનિકેશન કરો.

   નોંધ: IAAનું વિઘટન અટકાવવા માટે આલ્કિલેશન કરેલા નમૂનાનો પ્રકાશ સાથેનો સંપર્ક શક્ય તેટલો ઓછો રાખો.

3. નમૂનાનું મંદન
   • 4% એસિટોનાઇટ્રાઇલ (v/v) ધરાવતા 25 mM AmBic બફરનો ઉપયોગ કરીને આલ્કિલેશન કરેલા પ્રોટીન નમૂનાને મંદ કરો, જેથી તેનું અંતિમ આયતન 100 µL થાય.
   • હળવેથી પિપેટિંગ કરીને સારી રીતે મિશ્રિત કરો.
4. નાનોકણો પર સ્થિરિત ટ્રિપ્સિન સાથે પ્રોટીનવિઘટક પાચન
   • મંદ કરેલા પ્રોટીન નમૂનામાં 20 µL T-FMNP દ્રાવણ (3 mg/mL) ઉમેરો.
   • સોનોરિએક્ટરમાં મિશ્રણને 50% કંપનવિસ્તાર પર 2.5 મિનિટ માટે સોનિકેટ કરો.
   • ઠંડું થવા માટે વિરામ આપો, પછી સમાન પરિસ્થિતિઓમાં વધુ 2.5 મિનિટ માટે સોનિકેટ કરો.
5. ટ્રિપ્સિન સ્થિરિત કરેલા નેનોકણોનું પૃથક્કરણ
   • પાચિત પેપ્ટાઇડ્સ ધરાવતા ઉપરિતર પ્રવાહીમાંથી T-FMNPs ને અલગ કરવા માટે ચુંબકનો ઉપયોગ કરો.
   • ઉપરિતર પ્રવાહીને નવી માઇક્રોસેન્ટ્રિફ્યુજ ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરો.
6. MS વિશ્લેષણ માટે પેપ્ટાઇડ્સની તૈયારી
   • પેપ્ટાઇડ્સ ધરાવતા ઉપરિતર પ્રવાહીને વેક્યૂમ સેન્ટ્રિફ્યુજમાં સૂકવો.
   • માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી દ્વારા આગળનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવે ત્યાં સુધી સૂકવેલા પેપ્ટાઇડ્સને -20°C પર સંગ્રહિત કરો.