ઉચ્ચ-થ્રુપુટ પ્રોટીન પાચન સાથે પ્રોટીઓમિક વર્કફ્લો

પ્રોટીઓમિક્સ એ જૈવિક પ્રક્રિયાઓ અને પ્રણાલીઓને સમજવા માટે એક આવશ્યક ક્ષેત્ર છે, જેમાં પ્રોટીન પાચન તેના કાર્યપ્રવાહમાં નિર્ણાયક પગલું બનાવે છે. પરંપરાગત રીતે, ટ્રિપ્સિન જેવા પ્રોટીઓલિટીક ઉત્સેચકોનો ઉપયોગ કરીને દ્રાવણમાં પ્રોટીનનું પાચન કરવામાં આવે છે, જે ખાસ કરીને લાયસિન અને આર્જિનિન અવશેષો પર પેપ્ટાઇડ બોન્ડનું હાઇડ્રોલાઇઝેશન કરે છે. આ પ્રક્રિયા માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS) એપ્લિકેશનમાં આયનીકરણ અને ફ્રેગમેન્ટેશન માટે સારી રીતે અનુકૂળ પેપ્ટાઈડ્સ પેદા કરે છે. જો કે, પરંપરાગત પાચન પદ્ધતિઓને પૂર્ણ કરવા માટે 12-24 કલાકની જરૂર પડે છે, જે પ્રોટીઓમિક વર્કફ્લોમાં નોંધપાત્ર અવરોધો બનાવે છે.
અલ્ટ્રાસોનિકેશન એક શક્તિશાળી વિકલ્પ પ્રદાન કરે છે, જે નાટ્યાત્મક રીતે પાચન સમયને કલાકોથી થોડી મિનિટો સુધી ઘટાડે છે. જ્યારે Hielscher CupHorn, VialTweeter અને 96-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર UIP400MTP જેવા અદ્યતન મલ્ટિ-સેમ્પલ સોનિકેટર્સ સાથે જોડવામાં આવે છે, ત્યારે અલ્ટ્રાસોનિકેશન એક્સિલરેટેડ, હાઇ-થ્રુપુટ પ્રોટીઓમિક્સને સક્ષમ કરે છે. આ તકનીકો વર્કફ્લોને સુવ્યવસ્થિત કરે છે, નમૂનાની તૈયારીનો સમય ઘટાડે છે અને પુનઃઉત્પાદનક્ષમતા અથવા ડેટા ગુણવત્તા સાથે સમાધાન કર્યા વિના કાર્યક્ષમતામાં વધારો કરે છે.

પ્રોટીન પાચનમાં અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જાની ભૂમિકા

અલ્ટ્રાસોનિકેશન પોલાણ બનાવવા માટે કેન્દ્રિત અલ્ટ્રાસાઉન્ડ તરંગોનો ઉપયોગ કરે છે-સ્થાનિક માઇક્રોબબલ્સ કે જે તીવ્ર શીયર ફોર્સ પેદા કરવા માટે તૂટી જાય છે. આ ઘટના સામૂહિક સ્થાનાંતરણને વધારે છે, સબસ્ટ્રેટ સાથે ઉત્સેચકોના મિશ્રણને પ્રોત્સાહન આપે છે, અને પ્રોટીન સ્ટ્રક્ચર્સ પ્રગટ કરે છે, ટ્રિપ્સિન જેવા પ્રોટીઓલિટીક એન્ઝાઇમ્સ માટે ક્લીવેજ સાઇટ્સને ખુલ્લા પાડે છે.
પરિણામ? કાર્યક્ષમતા અથવા પ્રજનનક્ષમતા સાથે સમાધાન કર્યા વિના પાચનના સમયમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો.

અલ્ટ્રાસોનિક-ઉન્નત પ્રોટીઓલિટીક પાચન: પદ્ધતિ અને પરિણામો

ઝડપી પાચન પ્રોટોકોલ

અલ્ટ્રાસોનિક-સહાયિત પાચન વર્કફ્લોને ઝડપી બનાવવા માટે પ્રોટીઓલિટીક એન્ઝાઇમ્સ અને અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જાને જોડે છે. ઉદાહરણ તરીકે, Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) નો ઉપયોગ કરીને, પાચન કાર્યપ્રવાહ નીચે પ્રમાણે આગળ વધે છે:

1. ઘટાડો: એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટ બફર (12.5 mM) માં પ્રોટીનના નમૂનાઓ (0.5 mg/mL, 20 µL) DTT (2 µL, 110 mM) વડે ગણવામાં આવે છે. સોનિકેશન 5 મિનિટ માટે 50% કંપનવિસ્તાર પર લાગુ કરવામાં આવે છે.
2. આલ્કિલેશન: IAA (2 µL, 400 mM) ઉમેર્યા પછી, સમાન શરતો હેઠળ સોનિકેશન પુનરાવર્તિત થાય છે.
3. પાચન: નમૂનાઓ સ્થિર ટ્રિપ્સિન નેનોપાર્ટિકલ્સ સાથે પાતળું અને ઉકાળવામાં આવે છે. સોનિકેશનનો અંતિમ રાઉન્ડ (5 મિનિટ) પાચન પૂર્ણ કરે છે. MS વિશ્લેષણ માટે પેપ્ટાઇડ્સને અલગ, સૂકવવા અને સંગ્રહિત કરવામાં આવે છે.

આ અલ્ટ્રાસોનિક પદ્ધતિ કુલ તૈયારીના સમયને 12 કલાકથી 30 મિનિટથી ઓછી કરે છે. ઝડપી પ્રક્રિયા હોવા છતાં, પેપ્ટાઇડ ઉપજ અને ગુણવત્તા પરંપરાગત રાતોરાત પદ્ધતિઓ સાથે સુસંગત રહે છે.

અલ્ટ્રાસોનિક પ્રોટીન પાચનની કાર્યક્ષમતા

ઇ. કોલી પ્રોટીઓમનો ઉપયોગ કરીને તુલનાત્મક અભ્યાસમાં:

• પ્રોટીન ઓળખ: અલ્ટ્રાસોનિકલી ડાયજેસ્ટેડ સેમ્પલ 12 કલાકમાં 817ની સરખામણીમાં 5 મિનિટમાં 777 પ્રોટીન ઓળખે છે. વહેંચાયેલ પ્રોટીન ઓળખ 70% થી વધી ગઈ છે.
• પ્રજનનક્ષમતા: પ્રતિકૃતિ વિશ્લેષણ દરેક પદ્ધતિમાં 98% થી ઉપરના સહસંબંધ મૂલ્યો દર્શાવે છે, જે વિશ્વસનીયતા દર્શાવે છે.
• પસંદગી: અલ્ટ્રાસોનિક પાચન 65 પ્રોટીન અને રાતોરાત પાચન 54 પ્રોટીન સાથે, દરેક પદ્ધતિ દ્વારા અમુક પ્રોટીનને પ્રાધાન્યપૂર્વક પચવામાં આવતું હતું. આવા સૂક્ષ્મ તફાવતો ચોક્કસ એપ્લિકેશનો માટે અલ્ટ્રાસોનિકેશનની અનન્ય સંભવિતતાને રેખાંકિત કરે છે.

ઇ. કોલી માં સાત સ્પાઇક્ડ પ્રોટીનના લેબલ-મુક્ત પ્રોટીન ક્વોન્ટિફિકેશન પરિણામો
નમૂના. કોલમમાં નોંધ્યા મુજબ નીચેના પ્રોટીન બે અલગ અલગ સ્તરે ઉમેરવામાં આવ્યા હતા
"થિયો રેશિયો" તરીકે ઓળખાય છે. થિયો રેશિયો એ આમાં ઉપયોગમાં લેવાતા બે સ્તરો વચ્ચેનો સૈદ્ધાંતિક ગુણોત્તર છે
પ્રયોગ બોવાઇન સીરમ આલ્બુમિન (ALBU), β-લેક્ટોગ્લોબ્યુલિન (LACB), α-S1 કેસીન (CASA1),
α-S2 કેસીન (CASA2), સાયટોક્રોમ c (CYC), ઓવલબ્યુમિન (OVAL) અને કાર્બોનિક એનહાઇડ્રેઝ 2
(CAH2). મેક્સક્વોન્ટમાંથી મેળવેલ LFQ પ્રોટીન તીવ્રતાનો ઉપયોગ કરીને ગુણોત્તરની ગણતરી કરવામાં આવી હતી.
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
અભ્યાસ અને ગ્રાફિક: © માર્ટિન્સ એટ અલ., 2019)

નેનોપાર્ટિકલ-ઇમોબિલાઇઝ્ડ ટ્રિપ્સિન

અલ્ટ્રાસોનિકેશન સાથે સ્થિર ટ્રિપ્સિન નેનોપાર્ટિકલ્સ (દા.ત., T-FMNPs) નું એકીકરણ પ્રોટીઓમિક્સ વર્કફ્લોને વધારે છે. આ નેનોપાર્ટિકલ્સ એન્ઝાઇમ-સબસ્ટ્રેટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ માટે ઉચ્ચ સપાટી વિસ્તાર પૂરો પાડે છે, કાર્યક્ષમતામાં વધારો કરે છે. જ્યારે જટિલ પ્રોટીઓમ પર લાગુ કરવામાં આવે છે, જેમ કે ઇ. કોલી, સંયુક્ત પદ્ધતિ પ્રાપ્ત કરે છે:

• ઝડપ: 5 મિનિટમાં પાચન પૂર્ણ કરો.
• ચોકસાઈ: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• માપનીયતા: UIP400MTP જેવા મલ્ટિ-વેલ પ્લેટફોર્મ પર અનુકૂલન ઉચ્ચ-થ્રુપુટ પ્રક્રિયાને સક્ષમ કરે છે.

પગલું-દર-પગલાં સૂચનો સાથે વિગતવાર પ્રોટોકોલ માટે અહીં ક્લિક કરો!
(cf. Martins et al., 2019)

Hielscher sonicators સાથે હાઇ-સ્પીડ અને હાઇ-થ્રુપુટ પર પ્રોટીઓલિટીક પાચન

પ્રોટીઓમિક્સ માટે શ્રેષ્ઠ સોનિકેટર મોડલ્સ

Hielscher Ultrasonics ઉચ્ચ-થ્રુપુટ વર્કફ્લોની સુવિધા માટે એક સાથે મલ્ટી-સેમ્પલ તૈયારી માટે વિવિધ સોનીકેટર મોડલ્સ ઓફર કરે છે. શું તમે શીશીઓ, ટેસ્ટ ટ્યુબ, બહુ-વેલ પ્લેટ્સ (દા.ત. 6-, 24-, 96-વેલ પ્લેટ) અથવા પેટ્રી ડીશ સાથે કામ કરો છો – અમે તમને તમારા પ્રયોગો માટે આદર્શ સોનિકેટર્સ ઓફર કરીએ છીએ.

UIP400MTP મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર

અંતિમ થ્રુપુટ માટે, UIP400MTP 96-વેલ પ્લેટોને અલ્ટ્રાસોનિકલી પ્રોસેસ કરવાની ક્ષમતા પૂરી પાડે છે. કોઈપણ પ્રમાણભૂત માઇક્રોપ્લેટ સાથે સુસંગત, UIP400MTP ને ખર્ચાળ માલિકીના નિકાલજોગની જરૂર નથી અને તે તમને તમારા સંશોધન માટે શ્રેષ્ઠ મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ પસંદ કરવાની સ્વતંત્રતા આપે છે. સમગ્ર પ્લેટમાં એકસમાન ઉર્જા પહોંચાડીને, તે માત્ર 1 કલાકમાં 200 જેટલા જટિલ પ્રોટીઓમના ઝડપી ઘટાડા, આલ્કિલેશન અને પાચનને સક્ષમ કરે છે. ઓટોમેશન અને કાર્યક્ષમતાનું આ સ્તર ઉચ્ચ-થ્રુપુટ પ્રોટીઓમિક્સ અને ક્લિનિકલ એપ્લિકેશન્સ માટે નિર્ણાયક છે. મલ્ટિ-વેલ પ્લેટ સોનિકેટર વિશે વધુ જાણો!

VialTweeter

VialTweeter એ પ્રયોગશાળાઓ માટે તૈયાર કરવામાં આવ્યું છે જેમાં 10 જેટલી શીશીઓ અથવા ટેસ્ટ ટ્યુબના એકસાથે સોનિકેશનની જરૂર હોય છે. તેનો બિન-આક્રમક અભિગમ પ્રજનનક્ષમ પ્રોટીન પાચનને સુનિશ્ચિત કરતી વખતે ક્રોસ-પ્રદૂષણના જોખમોને દૂર કરે છે. આ ઉપકરણ મર્યાદિત નમૂના વોલ્યુમો અથવા વિવિધ નમૂનાના પ્રકારો સાથે કામ કરતા સંશોધકો માટે આદર્શ છે.
VialTweeter મલ્ટી-ટ્યુબ સોનિકેટર વિશે વધુ જાણો!

Hielscher UP200St-CupHorn

કપહોર્ન સોનિકેટર એ એક શક્તિશાળી ઉપકરણ છે જે સીલબંધ કન્ટેનરમાં બહુવિધ નમૂનાઓની એકસાથે પ્રક્રિયા કરવા માટે રચાયેલ છે. તે એકસમાન અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા વિતરણ અને ચોક્કસ તાપમાન નિયંત્રણની ખાતરી કરે છે. એકસાથે પાંચ નમૂનાઓ પર પ્રક્રિયા કરવાની ક્ષમતા, ઘટાડેલા, અલ્કાયલેટેડ અને ડાયજેસ્ટેડ વર્કફ્લો સાથે તેની સુસંગતતા સાથે, કપહોર્નને એમએસ-આધારિત પ્રોટીઓમિક્સ માટે વિશ્વસનીય સાધન બનાવે છે.
કપહોર્ન સોનોરિએક્ટર વિશે વધુ જાણો!

નેનોપાર્ટિકલ-ઇમોબિલાઇઝ્ડ ટ્રિપ્સિનનો ઉપયોગ કરીને અલ્ટ્રાસોનિકેશન-આસિસ્ટેડ પ્રોટીઓલિટીક પાચન માટે સ્ટેપ-બાય-સ્ટેપ પ્રોટોકોલ

માર્ટિન્સ એટ અલ દ્વારા આ પ્રોટોકોલ. (2019) અલ્ટ્રાસોનિક ઊર્જા અને નેનોપાર્ટિકલ-ઇમોબિલાઇઝ્ડ ટ્રિપ્સિન (T-FMNPs) નો ઉપયોગ કરીને ઝડપી પ્રોટીન પાચન માટે ઑપ્ટિમાઇઝ કરવામાં આવ્યું છે. દર્શાવેલ પગલાં માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS) એપ્લીકેશન માટે યોગ્ય ઘટાડો, આલ્કિલેશન અને પ્રોટીઓલિસિસની ખાતરી કરે છે.
પ્રોટોકોલ પગલાં

1. ડિસલ્ફાઇડ બોન્ડમાં ઘટાડો
   • AmBic બફરમાં 20 μL પ્રોટીન નમૂના (0.5 mg/mL) માં 2 µL DTT સોલ્યુશન (110 mM) ઉમેરો.
   • સોનોરેએક્ટર UP200St-CupHorn માં સેમ્પલ ટ્યુબ મૂકો.
   • નમૂનાને 50% કંપનવિસ્તાર (200 W, 26 kHz) પર 2.5 મિનિટ માટે સોનિકેટ કરો.
   • ઠંડકને મંજૂરી આપવા માટે સંક્ષિપ્ત અંતરાલ માટે થોભો, પછી સમાન પરિસ્થિતિઓમાં અન્ય 2.5 મિનિટ માટે સોનિકેટ કરો.
2. ઘટાડેલા સિસ્ટીન અવશેષોનું આલ્કિલેશન
   • ઘટાડેલા પ્રોટીન નમૂનામાં 2 µL IAA સોલ્યુશન (400 mM) ઉમેરો.
   • આલ્કિલેશનની સુવિધા માટે 50% કંપનવિસ્તાર પર 2.5 મિનિટ માટે સોનિકેટ કરો.
   • ઠંડક માટે થોભો, પછી વધારાની 2.5 મિનિટ માટે સોનિકેટ કરો.

   નોંધ: IAA અધોગતિને રોકવા માટે આલ્કીલેટેડ નમૂનાના પ્રકાશમાં એક્સપોઝર ઓછું કરો.

3. નમૂના મંદન
   • 4% એસેટોનાઈટ્રાઈલ (v/v) ધરાવતા 25 એમએમ એમ્બીક બફરનો ઉપયોગ કરીને આલ્કીલેટેડ પ્રોટીન નમૂનાને 100 μL ના અંતિમ વોલ્યુમમાં પાતળું કરો.
   • હળવા પાઇપિંગ દ્વારા સારી રીતે મિક્સ કરો.
4. નેનોપાર્ટિકલ-ઇમોબિલાઇઝ્ડ ટ્રિપ્સિન સાથે પ્રોટીઓલિટીક પાચન
   • પાતળા પ્રોટીન નમૂનામાં 20 µL T-FMNP સોલ્યુશન (3 mg/mL) ઉમેરો.
   • સોનોરેએક્ટરમાં મિશ્રણને 50% કંપનવિસ્તારમાં 2.5 મિનિટ માટે સોનિકેટ કરો.
   • ઠંડક માટે થોભો, પછી સમાન શરતો હેઠળ અન્ય 2.5 મિનિટ માટે સોનિકેટ કરો.
5. ટ્રિપ્સિન નેનોપાર્ટિકલ્સનું વિભાજન
   • T-FMNP ને ડાયજેસ્ટેડ પેપ્ટાઈડ્સ ધરાવતા સુપરનેટન્ટથી અલગ કરવા માટે ચુંબકનો ઉપયોગ કરો.
   • સુપરનેટન્ટને નવી માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરો.
6. એમએસ વિશ્લેષણ માટે પેપ્ટાઇડ તૈયારી
   • વેક્યૂમ સેન્ટ્રીફ્યુજમાં પેપ્ટાઈડ્સ ધરાવતા સુપરનેટન્ટને સૂકવી દો.
   • માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી દ્વારા વધુ વિશ્લેષણ ન થાય ત્યાં સુધી સૂકા પેપ્ટાઈડ્સને -20°C પર સંગ્રહિત કરો.