Extraction de protéines à partir de tissus tumoraux assistée par sonication – Protocole

Ce protocole décrit une méthode d'extraction de protéines assistée par sonication pour les tissus tumoraux qui fait progresser le flux de travail de lyse d'urée CPTAC standard en ajoutant une étape de sonication de sonde contrôlée pendant la rupture du tissu. S'appuyant sur la stratégie de préparation du protéome et du phosphoprotéome CPTAC à grande échelle, cette modification améliore la rupture des structures cellulaires et subcellulaires, réduit la viscosité de l'échantillon et améliore la libération des protéines qui sont généralement plus difficiles à récupérer avec la lyse à l'urée seule, en particulier les protéines liées à la membrane et à l'ADN ou associées au noyau. Dans l'étude sous-jacente, le flux de travail assisté par sonication a amélioré la détection des protéines et des phosphopeptides tout en préservant la compatibilité avec la digestion de type CPTAC, le marquage TMT, le fractionnement, l'enrichissement en phosphopeptides et le pipeline d'analyse LC-MS/MS en aval.

Extraction de protéines assistée par sonication à partir de tissus tumoraux pour une analyse protéomique et phosphoprotéomique en profondeur

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Domaine d'application du protocole

Utilisez cette procédure pour :

• tissu tumoral fraîchement congelé et cryopulvérisé
• les culots cellulaires ou autres échantillons biologiques pour lesquels l'extraction à base d'urée est déjà établie
• flux de travail globaux en protéomique et phosphoprotéomique utilisant la digestion tryptique et le marquage TMT en option

L'étude de Li et al. (2025) indique que le flux de travail est également applicable à d'autres types d'échantillons tels que les lignées cellulaires, le sang et l'urine, mais qu'une optimisation peut s'avérer nécessaire en fonction du type d'échantillon.

Flux de travail optimisé pour la préparation des échantillons avec une étape de sonication. Le flux de travail optimisé et la conception expérimentale sont basés sur le protocole de préparation d'échantillons CPTAC pour l'analyse protéomique et phosphoprotéomique globale.
Étude et schéma : ©Li et al, 2025

Principe de fonctionnement

L'étude originale a ajouté la sonication au flux de travail standard de lyse à l'urée du CPTAC et a constaté une amélioration de la détection des protéines associées aux membranes et aux noyaux. Les auteurs précisent que les paramètres de sonication doivent être affinés en fonction de la taille et de la concentration de l'échantillon. – en choisissant la taille de la sonotrode, l'apport d'énergie et le moment de l'impulsion.

A titre d'exemple, pour les Hielscher UP200Ht et UP200St, cela signifie :

• utiliser l'amplitude et le mode d'impulsion comme principales variables de contrôle
• maintenir les échantillons au froid pendant toute la durée de l'opération (c'est-à-dire sur de la glace)
• commencer par des paramètres conservateurs
• optimiser en fonction de la clarté de l'échantillon, de la température, du rendement en protéines et de la qualité des peptides en aval

 
Les deux modèles de sonicateurs Hielscher 200 watts UP200Ht et UP200St sont conçus pour les petits et moyens volumes d'échantillons, avec des réglages d'amplitude et d'impulsion ajustables. Les deux homogénéisateurs ultrasoniques sont dotés d'un écran tactile numérique pour un ajustement précis des paramètres, d'un enregistrement automatique des données, d'un capteur de température enfichable, d'une télécommande et d'un éclairage de l'échantillon.
 

Réactifs pour l'extraction de protéines assistée par sonication

Tampon de lyse à l'urée

Préparer le produit frais immédiatement avant de l'utiliser :

• 8 M d'urée
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8.0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL d'aprotinine
• 10 µg/mL leupeptine
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Cocktail d'inhibiteurs de phosphatase 2, 1:100 (v/v)
• Cocktail d'inhibiteurs de phosphatase 3, 1:100 (v/v)

L'urée doit être complètement dissoute avant d'ajouter les additifs ; les inhibiteurs doivent être ajoutés immédiatement avant l'utilisation ; le tampon doit être conservé sur de la glace ; il est recommandé d'agiter plutôt que de vortexer vigoureusement après l'ajout des additifs.
 

Réactifs supplémentaires :

• Réactifs pour le dosage des protéines BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Iodoacétamide
• LysC
• trypsine
• Acide formique
• Réactifs TMT, en cas d'utilisation de la protéomique quantitative multiplexée
• Réactifs IMAC, en cas d'enrichissement en phosphopeptides

Équipement pour l'extraction de protéines assistée par sonication

Exigée

Sélection de la sonde recommandée

Pour les échantillons de 200 à 1000 µl, utilisez une sonotrode de petit diamètre adaptée au traitement direct à haute intensité de petits volumes. Hielscher propose plusieurs diamètres de sonotrode, et des diamètres de pointe plus petits permettent d'obtenir une intensité plus élevée à la pointe.

Note pratique : utiliser la plus petite sonde permettant un mélange efficace sans mousse excessive ni contact avec les parois du récipient.

Si vous travaillez avec plusieurs échantillons en même temps, vous pouvez envisager de le Multi-Tube Sonicator VialTweeter ou le sonicateur pour microplaques UIP400MTP !

Instructions pas à pas : Procédure d'extraction des protéines assistée par sonication

A. Prérefroidissement et préparation

1. Refroidir la centrifugeuse à 4°C.
2. Préparer un tampon de lyse à l'urée frais et le conserver sur de la glace.
3. Installez l'UP200Ht ou l'UP200St sur un support à l'intérieur d'une enceinte acoustique.
4. Préparer un bain de glace suffisamment grand pour que les tubes d'échantillon puissent être maintenus debout et stables.

La préparation de tampons frais et la manipulation à froid sont essentielles.

B. Extraction initiale de l'urée

1. Conserver les tissus cryopulvérisés sur de la glace.
2. Ajouter 200 µl de tampon de lyse à l'urée réfrigéré pour 50 mg de tissu humide.
3. Vortex 5-10 s à grande vitesse.
4. Incuber 15 minutes à 4°C.
5. Répéter l'étape du vortex et de l'incubation une fois de plus.
6. Centrifuger à 20 000g pendant 10 minutes à 4°C.
7. Transférer le lysat/supernatant dans un tube propre à faible liaison.

C. Sonication à l'aide de l'UP200Ht ou de l'UP200St

Conditions de départ pour la sonication

• Amplitude : commencer à 20-30%.
• Durée de l'impulsion : 5 s ON
• Refroidissement : 2 min sur glace entre les impulsions
• Nombre de cycles : 4 cycles
• Durée totale de la sonication active : 20 s
• Durée totale du processus, y compris le refroidissement : environ 8-10 min

Étapes de la sonication

1. Transférer le lysat dans un tube adapté à la sonication. Utiliser un tube étroit, à paroi fine, permettant un bon échange thermique et une immersion sûre de la sonde.
2. Placer le tube dans un bain de glace. L'article indique que le refroidissement pendant la sonication est essentiel pour éviter les dommages causés par la chaleur.
3. Immergez la pointe de la sonde dans l'échantillon. Maintenez la pointe suffisamment immergée pour que la cavitation soit stable, mais ne la laissez pas toucher la paroi ou le fond du tube.
4. Effectuer une impulsion de 5 s à l'amplitude de départ.
5. Remettre immédiatement l'échantillon entièrement dans la glace pendant 2 minutes.
6. Répéter jusqu'à ce que 4 cycles soient terminés.
7. Contrôler le lysat après le cycle.
8. Continuer seulement si nécessaire, en utilisant une impulsion supplémentaire de 5 s à la fois, toujours suivie d'un refroidissement complet.
9. Arrêter lorsque le lysat devient plus uniforme et moins filandreux/viscosique.
   Le résultat final est un lysat plus translucide qui forme des gouttes plutôt qu'un flux visqueux continu.
10. Centrifuger à environ 16 000g pendant 15 minutes à 4°C.
11. Transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube et mesurer la concentration en protéines.

Comparaison de la protéomique globale et de la phosphoprotéomique entre les échantillons sonifiés et non sonifiés.
a. Nombre de protéines identifiées (protéomique globale) dans tous les tissus tumoraux PDX avec ou sans sonication. b. Nombre de phosphopeptides identifiés (enrichissement IMAC) dans tous les tissus tumoraux PDX avec ou sans sonication. Seuls les protéines et les phosphopeptides dont le rapport d'abondance était supérieur ou égal au 25e percentile ont été comptés. Le rapport d'abondance a été calculé entre les mêmes types d'échantillons.
Étude et graphiques : ©Li et al, 2025

Digestion et analyse en aval

Après la sonication et la clarification, procéder comme décrit dans le flux de travail original du CPTAC :

1. Diluer le lysat 1:3 (v/v) avec 50 mM Tris-HCl pH 8.0 pour réduire l'urée à <2 M.
2. Ajouter du LysC à raison de 1 mAU par 50 µg de protéines et incuber 2 h à 25°C.
3. Ajouter de la trypsine à raison de 1:49 enzyme:substrat (p/p) et digérer pendant une nuit à 25°C.
4. Tremper dans l'acide formique jusqu'à 1 % final.
5. Poursuivre le dessalage, le marquage TMT, le fractionnement, l'enrichissement en phosphopeptides et la LC-MS/MS si nécessaire.

Expression différentielle des phosphopeptides à partir de MS marqués au TMT.
a. Le sous-type basal, mettant en évidence certains phosphopeptides humains (début et fin de la séquence protéique) régulés à la hausse dans les échantillons soniqués par rapport aux échantillons non soniqués. b. Le sous-type luminal, mettant en évidence certains phosphopeptides humains (début et fin de la séquence protéique) régulés à la hausse dans les échantillons soniqués par rapport aux échantillons non soniqués. c. Voies KEGG enrichies basées sur les protéines des phosphopeptides régulés dans le sous-type basal des tumeurs soniquées. d. Voies KEGG enrichies basées sur les protéines des phosphopeptides régulés dans le sous-type luminal des tumeurs soniquées.
Étude et graphiques : ©Li et al, 2025

Conception, fabrication et conseil – Qualité Made in Germany

Les ultrasons Hielscher sont réputés pour leur qualité et leurs normes de conception les plus élevées. La robustesse et la facilité d'utilisation permettent une intégration aisée de nos ultrasons dans les installations industrielles. Les conditions difficiles et les environnements exigeants sont facilement gérés par les ultrasons Hielscher.

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Littérature / Références