Extraction de protéines assistée par sonication à partir de tissu tumoral – Protocole

Ce protocole décrit une méthode d’extraction de protéines assistée par sonication pour le tissu tumoral, qui fait évoluer le flux de travail standard de lyse à l’urée du CPTAC en ajoutant une étape contrôlée de sonication par sonde pendant la désagrégation du tissu. S’appuyant sur la stratégie établie du CPTAC de préparation du protéome et du phosphoprotéome à grande profondeur, cette modification améliore la désagrégation des cellules et des structures subcellulaires, réduit la viscosité de l’échantillon et favorise la libération des protéines habituellement plus difficiles à récupérer par la seule lyse à l’urée, en particulier les protéines liées aux membranes et les protéines se liant à l’ADN ou associées au noyau. Dans l’étude sous-jacente, le flux de travail assisté par sonication a augmenté la détection des protéines comme des phosphopeptides, tout en préservant la compatibilité avec la chaîne d’analyse en aval de type CPTAC : digestion, marquage TMT, fractionnement, enrichissement en phosphopeptides et analyse LC-MS/MS.

Extraction de protéines assistée par sonication à partir de tissu tumoral pour une analyse protéomique et phosphoprotéomique approfondie

Le protocole suivant est optimisé pour l’extraction de protéines à partir de tissu tumoral cryopulvérisé dans un tampon de lyse à l’urée 8 M : une étape supplémentaire de sonication par sonde améliore la récupération des classes de protéines difficiles, en particulier les protéines associées aux membranes et à l’ADN/au noyau, avant la digestion et l’analyse LC-MS/MS en aval. Dans l’étude sous-jacente de Li et al. (2025), l’ajout de la sonication a augmenté la détection des protéines associées aux membranes et au noyau et a permis une couverture à grande profondeur de >12 000 protéines et >25 000 phosphopeptides dans le cadre de leur flux de travail.

Domaine d’application du protocole

Utilisez cette procédure pour :

• tissu tumoral frais congelé et cryopulvérisé
• culots cellulaires ou autres échantillons biologiques pour lesquels l’extraction à base d’urée est déjà établie
• flux de travail de protéomique et de phosphoprotéomique globales utilisant une digestion trypsique et un marquage TMT facultatif

L’étude de Li et al. (2025) indique que le flux de travail est également applicable à d’autres types d’échantillons tels que les lignées cellulaires, le sang et l’urine, mais qu’une optimisation peut être nécessaire selon le type d’échantillon.

Flux de travail optimisé de préparation des échantillons avec étape de sonication intégrée. Le flux de travail optimisé et le plan expérimental reposent sur le protocole de préparation des échantillons du CPTAC pour l’analyse protéomique et phosphoprotéomique globale.
Étude et schéma : ©Li et al., 2025

Principe de fonctionnement

L’étude originale a ajouté la sonication au flux de travail standard de lyse à l’urée du CPTAC et a constaté une meilleure détection des protéines associées aux membranes et aux noyaux. Les auteurs indiquent que les paramètres de sonication doivent être ajustés avec précision en fonction de la taille/concentration de l’échantillon – en choisissant la taille de la sonotrode, l’apport d’énergie et la durée des impulsions.

À titre d’exemple, pour les Hielscher UP200Ht et UP200St, cela signifie :

• utiliser l’amplitude et le mode pulsé comme principales variables de contrôle
• maintenir les échantillons au froid en permanence (c.-à-d. sur glace)
• commencer avec des réglages prudents
• optimiser en fonction de la limpidité de l’échantillon, de la température, du rendement en protéines et de la qualité des peptides en aval

Les deux modèles de sonicateurs Hielscher de 200 watts, UP200Ht et UP200St, sont conçus pour les petits et moyens volumes d’échantillons, avec des réglages d’amplitude et d’impulsions ajustables ; les deux homogénéisateurs à ultrasons offrent une commande numérique par écran tactile pour un réglage précis des paramètres, l’enregistrement automatique des données, un capteur de température enfichable, la commande à distance et l’éclairage de l’échantillon.

Réactifs pour l’extraction de protéines assistée par sonication

Tampon de lyse à l’urée

À préparer frais, immédiatement avant utilisation :

• urée 8 M
• NaCl 75 mM
• Tris 50 mM, pH 8,0
• EDTA 1 mM
• aprotinine 2 µg/mL
• leupeptine 10 µg/mL
• PMSF 1 mM
• NaF 10 mM
• PUGNAc 20 µM
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

L’urée doit être complètement dissoute avant l’ajout des additifs ; les inhibiteurs doivent être ajoutés immédiatement avant utilisation ; le tampon doit être conservé sur glace ; et il est recommandé de mélanger par rotation douce plutôt que par vortex vigoureux après l’ajout des additifs.

Réactifs supplémentaires :

• Réactifs de dosage des protéines BCA
• Tris-HCl 50 mM, pH 8,0
• DTT
• Iodoacétamide
• LysC
• Trypsine
• Acide formique
• Réactifs TMT, en cas de protéomique quantitative multiplexée
• Réactifs IMAC, en cas d’enrichissement en phosphopeptides

Équipement pour l’extraction de protéines assistée par sonication

Requis

Choix de sonde recommandé

Pour des échantillons d’environ 200–1000 µL, utilisez une sonotrode de petit diamètre adaptée au traitement direct à haute intensité de petits volumes. Hielscher propose plusieurs diamètres de sonotrodes, et les pointes de plus petit diamètre fournissent une intensité plus élevée à leur extrémité.

Remarque pratique : utilisez la plus petite sonde permettant un mélange efficace sans formation excessive de mousse ni contact avec la paroi du récipient.

Si vous travaillez avec plusieurs échantillons en même temps, vous pouvez envisager le sonicateur multi-tubes VialTweeter ou le sonicateur pour microplaques UIP400MTP !

Instructions étape par étape : procédure d’extraction de protéines assistée par sonication

A. Prérefroidissement et préparation

1. Refroidissez la centrifugeuse à 4°C.
2. Préparez du tampon de lyse à l’urée frais et conservez-le sur glace.
3. Installez l’UP200Ht ou l’UP200St sur un statif à l’intérieur d’une enceinte d’insonorisation.
4. Préparez un bain de glace suffisamment grand pour maintenir les tubes d’échantillons droits et stables.

La préparation de tampon frais et la manipulation au froid sont essentielles.

B. Extraction initiale à l’urée

1. Conservez le tissu cryopulvérisé sur glace.
2. Ajoutez 200 µL de tampon de lyse à l’urée refroidi pour 50 mg de tissu humide.
3. Vortexez 5–10 s à vitesse élevée.
4. Incubez 15 min à 4°C.
5. Répétez encore une fois l’étape vortex plus incubation.
6. Centrifugez à 20 000g pendant 10 min à 4°C.
7. Transférez le lysat/surnageant dans un tube propre à faible liaison.

C. Sonication avec l’UP200Ht ou l’UP200St

Conditions initiales de sonication

• Amplitude : commencer à 20–30%
• Durée d’impulsion : 5 s ON
• Refroidissement : 2 min sur glace entre les impulsions
• Nombre de cycles : 4 cycles
• Durée totale de sonication active : 20 s
• Durée totale du processus, refroidissement compris : environ 8–10 min

Étapes de sonication

1. Transférez le lysat dans un tube adapté à la sonication. Utilisez un tube étroit à paroi mince permettant un bon échange thermique et une immersion sûre de la sonde.
2. Placez le tube dans un bain de glace. L’article identifie le refroidissement pendant la sonication comme essentiel pour éviter les dommages thermiques.
3. Immergez l’extrémité de la sonde dans l’échantillon. Maintenez l’extrémité suffisamment immergée pour une cavitation stable, mais ne la laissez pas toucher la paroi ou le fond du tube.
4. Appliquez une impulsion de 5 s à l’amplitude initiale.
5. Replacez immédiatement l’échantillon entièrement sur glace pendant 2 min.
6. Répétez jusqu’à ce que 4 cycles soient effectués.
7. Inspectez le lysat après le cycle.
8. Ne poursuivez que si nécessaire, en appliquant une impulsion supplémentaire de 5 s à la fois, toujours suivie d’un refroidissement complet.
9. Arrêtez dès que le lysat devient plus homogène et moins filant/visqueux.
   Le point final est un lysat plus translucide qui forme des gouttes plutôt qu’un écoulement visqueux continu.
10. Centrifugez à environ 16 000g pendant 15 min à 4°C.
11. Transférez le surnageant clarifié dans un tube neuf et mesurez la concentration en protéines.

Comparaison de la protéomique et de la phosphoprotéomique globales entre échantillons soniqués et non soniqués.
a. Nombre de protéines identifiées (protéomique globale) dans l’ensemble des tissus tumoraux PDX avec ou sans sonication. b. Nombre de phosphopeptides identifiés (enrichissement IMAC) dans l’ensemble des tissus tumoraux PDX avec ou sans sonication. Seuls les protéines et phosphopeptides dont le rapport d’abondance était supérieur ou égal au 25e percentile ont été comptés. Le rapport d’abondance a été calculé entre échantillons du même type.
Étude et graphiques : ©Li et al., 2025

Digestion et analyse en aval

Après la sonication et la clarification, procédez comme décrit dans le flux de travail original de type CPTAC :

1. Diluez le lysat à 1:3 (v/v) avec du Tris-HCl 50 mM pH 8,0 afin de réduire l’urée à <2 M.
2. Ajoutez la LysC à raison de 1 mAU pour 50 µg de protéines et incubez 2 h à 25°C.
3. Ajoutez la trypsine selon un rapport enzyme:substrat de 1:49 (w/w) et digérez pendant la nuit à 25°C.
4. Arrêtez la réaction avec de l’acide formique à 1% final.
5. Poursuivez par le dessalage, le marquage TMT, le fractionnement, l’enrichissement en phosphopeptides et l’analyse LC-MS/MS selon les besoins.

Expression différentielle des phosphopeptides issus de la MS avec marquage TMT.
a. Sous-type basal, mettant en évidence certains phosphopeptides humains (protein-sequence début et fin) surexprimés dans les échantillons soniqués par rapport aux échantillons non soniqués. b. Sous-type luminal, mettant en évidence certains phosphopeptides humains (protein_sequence début et fin) surexprimés dans les échantillons soniqués par rapport aux échantillons non soniqués. c. Voies KEGG enrichies d’après les protéines des phosphopeptides surexprimés dans les tumeurs de sous-type basal soniquées. d. Voies KEGG enrichies d’après les protéines des phosphopeptides surexprimés dans les tumeurs de sous-type luminal soniquées.
Étude et graphiques : ©Li et al., 2025

Conception, fabrication et conseil – Qualité Made in Germany

Les ultrasonicateurs Hielscher sont réputés pour leurs normes de qualité et de conception les plus élevées. Leur robustesse et leur facilité d’utilisation permettent une intégration harmonieuse de nos ultrasonicateurs dans les installations industrielles. Les ultrasonicateurs Hielscher font facilement face aux conditions difficiles et aux environnements exigeants.

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Bibliographie / Références

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.