Fragmentation de l’ADN par ultrasons pour le séquençage de nouvelle génération

Le séquençage de nouvelle génération (NGS) nécessite un cisaillement et une fragmentation fiables de l’ADN génomique afin de séquencer les brins d’ADN génomique et de créer des banques génomiques. La fragmentation contrôlée de l’ADN en fragments d’ADN est une étape essentielle de préparation des échantillons, requise avant le séquençage de l’ADN. Le traitement par ultrasons est une technique éprouvée, efficace et fiable pour fragmenter l’ADN à une longueur donnée. Les protocoles de fragmentation de l’ADN par ultrasons permettent d’obtenir des résultats de fragmentation reproductibles. Les appareils à ultrasons Hielscher peuvent produire une large gamme de distributions de tailles des fragments d’ADN génomique, contrôlables avec précision au moyen des paramètres de fonctionnement. Les systèmes Hielscher de cisaillement de l’ADN par ultrasons étant disponibles pour un ou plusieurs flacons ainsi que pour les microplaques, la préparation des échantillons devient très efficace.

Séquençage de nouvelle génération : fragmentation de l’ADN par ultrasons pour la préparation des banques

Pour réaliser un séquençage de nouvelle génération, les trois étapes fondamentales suivantes doivent être effectuées : (1) préparation de la banque, (2) séquençage et (3) analyse des données. Lors de la préparation de la banque, l’ADN est fragmenté, puis les extrémités des fragments sont réparées (polies) par l’ajout d’une seule base d’adénine et les fragments cibles sont convertis en ADN double brin. Enfin, des éléments appelés adaptateurs sont fixés par ligation, PCR ou tagmentation afin que le produit final d’ADN de la banque puisse être quantifié pour le séquençage.
Fragmentation de l’ADN par sonication : En particulier lors de l’utilisation de technologies de séquençage à lectures courtes telles qu’Illumina, qui ne permettent pas de lire facilement les fragments d’ADN plus longs, les brins d’ADN doivent être fragmentés à une taille donnée, ce qui peut être réalisé de manière fiable par traitement aux ultrasons.
Le traitement par ultrasons peut être utilisé de manière fiable pour la fragmentation de l’ADN, de l’ARN et de la chromatine.

Séquençage de nouvelle génération – Préparation des banques

La fragmentation de l’ADN par ultrasons est couramment utilisée pour préparer les banques de séquençage d’ADN destinées aux plateformes de séquençage de nouvelle génération (NGS). Cette technique sert à rompre les molécules d’ADN en fragments plus petits appartenant à une plage de tailles souhaitée, ce qui facilite les étapes suivantes de préparation des banques. La fragmentation de l’ADN par ultrasons est généralement requise lors de l’étape de préparation des banques dans les flux de travail NGS pour fragmenter l’ADN génomique en morceaux plus petits, adaptés au traitement ultérieur et au séquençage. Elle joue un rôle crucial dans la réussite de l’expérience de séquençage en générant des fragments d’ADN dans la plage de tailles appropriée à la plateforme de séquençage utilisée.

Séquençage de nouvelle génération – Étapes du processus :

• Fragmentation de l’ADN par ultrasons : Avant la construction de la banque, l’ADN génomique est fragmenté en morceaux plus petits et plus faciles à manipuler. La fragmentation par ultrasons consiste à utiliser des ondes sonores à haute fréquence pour cisailler les molécules d’ADN en fragments appartenant à la plage de tailles souhaitée. Cette étape est cruciale, car elle contribue à garantir que les lectures de séquençage générées ultérieurement auront une longueur appropriée à la plateforme de séquençage utilisée. La plage de tailles des fragments peut être ajustée en fonction des exigences spécifiques de l’expérience de séquençage.
• Amplification clonale par PCR : Après la fragmentation par ultrasons, les fragments d’ADN subissent une réparation des extrémités, une ligation des adaptateurs et une amplification par PCR afin de générer les banques finales de séquençage d’ADN. Ces étapes préparent les molécules d’ADN fragmentées au processus de séquençage en ajoutant des séquences adaptatrices nécessaires à la liaison à la plateforme de séquençage et en fournissant des sites d’amorçage pour l’amplification par PCR.
• Séquençage de l’ADN par synthèse : Une fois les banques de séquençage préparées, le processus de séquençage de l’ADN par synthèse (SBS) commence. Pendant le SBS, la séquence d’ADN est déterminée par l’ajout séquentiel de nucléotides au brin complémentaire. Cette étape implique des réactions cycliques d’incorporation de nucléotides, d’imagerie et de clivage, permettant de déterminer la séquence d’ADN à partir des signaux fluorescents émis par les nucléotides incorporés.
• Séquençage massivement parallèle : Lors de l’étape finale, les matrices d’ADN amplifiées et séparées spatialement sont séquencées simultanément de manière massivement parallèle. Cette approche de séquençage à haut débit permet de générer des millions à des milliards de lectures de séquençage en une seule analyse, permettant une détermination efficace et rapide des séquences d’ADN.

Comment fonctionne la fragmentation de l’ADN par ultrasons ?

La sonication, également appelée traitement acoustique des échantillons, est une méthode largement utilisée pour fragmenter l’ADN. Pour le cisaillement de l’ADN par ultrasons, les échantillons sont exposés à des ondes ultrasonores dans des conditions contrôlées. Le principe de fonctionnement de la fragmentation de l’ADN par ultrasons repose sur les vibrations et la cavitation générées par les ondes ultrasonores. Les forces de cisaillement résultant de la cavitation ultrasonore (acoustique) rompent les molécules d’ADN de masse moléculaire élevée. Les réglages de sonication tels que l’intensité (amplitude, durée), le mode de pulsation et la température permettent de fragmenter précisément l’ADN en fragments d’une longueur souhaitée. Alors que l’ADN est souvent réduit à 100 à 600 bp par traitement aux ultrasons, des fragments d’ADN plus longs, allant jusqu’à 1300 bp, peuvent être obtenus lorsque des conditions ultrasonores plus douces sont appliquées.

Contrôle de la température pour prévenir la dégradation de l’ADN

La structure moléculaire double brin de l’ADN est très sensible aux températures élevées ; un contrôle précis de la température pendant les étapes de préparation des échantillons est donc un facteur crucial pour obtenir des résultats d’analyse fiables.
Que vous utilisiez les appareils à ultrasons à sonde Hielscher, le VialTweeter ou l’UIP400MTP, la surveillance et le contrôle continus de la température sont assurés par un capteur de température enfichable et le logiciel intelligent de l’appareil. Afin de maintenir la température dans une plage donnée, vous pouvez définir une limite de température supérieure et inférieure. L’appareil à ultrasons se met ainsi en pause dès que cette limite de température est dépassée et reprend automatiquement la sonication lorsque la température a diminué d’un ∆T prédéfini.
Le logiciel sophistiqué des appareils à ultrasons Hielscher assure le maintien fiable de conditions idéales de traitement des échantillons.

Fragmentation de l’ADN dans de nombreux échantillons avec l’appareil à ultrasons pour plaques multipuits UIP400MTP

Le nombre d’échantillons en sciences de la vie a considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. Cela signifie que de très grands nombres d’échantillons (p. ex., 384, 1536 ou 3456 puits par microplaque) doivent être traités pendant la préparation des échantillons et l’analyse dans des conditions constamment identiques afin d’obtenir des résultats comparables et valides. Avec l’UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics suit la tendance du traitement d’échantillons en masse. L’UIP400MTP est un appareil à ultrasons destiné à la préparation d’échantillons dans des microplaques. L’UIP400MTP peut traiter des plaques à 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ou 3456 puits. Selon le type de microplaque, chaque puits peut généralement contenir des volumes d’échantillons allant de dizaines de nanolitres à plusieurs millilitres. Largement utilisé dans la recherche en sciences de la vie, l’UIP400MTP est très couramment employé pour la préparation d’échantillons avant des essais tels que l’ELISA (dosage immuno-enzymatique) ou la PCR, avant l’analyse des protéines, ainsi que pour la préparation de la chromatine avant la CHiP et la CHiP-seq, l’identification des modifications des histones et d’autres traitements analytiques (p. ex., électrophorèse sur gel, spectrométrie de masse).
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Le VialTweeter pour la préparation d’échantillons dans jusqu’à 10 flacons

Le VialTweeter est un appareil à ultrasons de laboratoire VialTweeter largement utilisé, qui permet une sonication efficace et pratique de jusqu’à 10 flacons simultanément. Les flacons et les tubes à essai (p. ex., flacons Eppendorf, cryotubes, tubes à centrifuger) étant soumis à une sonication indirecte, toute contamination croisée est évitée. La même intensité ultrasonore étant transmise à chaque échantillon, tous les résultats de sonication sont homogènes et reproductibles. Le VialTweeter offre toutes les fonctionnalités intelligentes de nos autres appareils numériques (p. ex., menu intelligent, réglages programmables, contrôle de la température, commande à distance, etc.), garantissant ainsi un confort d’utilisation maximal.

Sondes à doigts multiples pour plaques à micropuits

Disponibles pour les homogénéisateurs à ultrasons à sonde UP200Ht et UP200St, les sondes à doigts multiples comportant 4 ou 8 doigts constituent une option pratique pour soumettre plusieurs échantillons à la sonication simultanément dans les mêmes conditions. Par exemple, la sonotrode MTP-24-8-96 est une sonde à huit doigts, idéale pour l’intégration dans des systèmes automatisés ou pour la préparation manuelle efficace des échantillons contenus dans les puits de plaques multipuits. La sonotrode à doigts multiples est idéale pour l’automatisation dans les laboratoires où l’on traite principalement des béchers et des tubes à essai à l’aide d’une sonotrode ultrasonore standard. Les sondes à doigts multiples et les sondes standard peuvent être interchangées rapidement, en quelques minutes, transformant l’appareil à ultrasons à sonde unique en un désintégrateur à ultrasons à sondes multiples.

Appareils à ultrasons Hielscher pour la fragmentation de l’ADN

Hielscher Ultrasonics propose diverses plateformes fondées sur les ultrasons pour la fragmentation de l’ADN, de l’ARN et de la chromatine. Ces différentes plateformes comprennent des sondes ultrasonores (sonotrodes), des solutions de sonication indirecte pour la préparation simultanée d’échantillons dans plusieurs tubes ou plaques multipuits (p. ex., plaques à 96 puits, plaques de microtitration), des sonoréacteurs et des dispositifs ultrasonores de type cuphorn. Toutes les plateformes de cisaillement de l’ADN sont alimentées par des processeurs à ultrasons haute performance à fréquence accordée, contrôlables avec précision et fournissant des résultats reproductibles.

Processeurs à ultrasons pour tous les nombres et toutes les tailles d’échantillons

Avec les appareils à ultrasons multi-échantillons Hielscher VialTweeter (pour jusqu’à 10 tubes à essai) et UIP400MTP (pour les microplaques / plaques multipuits), il est possible de réduire le temps de traitement des échantillons grâce à un traitement ultrasonore intense et contrôlable avec précision, tout en obtenant la distribution de tailles et le rendement souhaités des fragments d’ADN. La fragmentation de l’ADN par ultrasons rend la préparation des échantillons efficace, fiable et évolutive. Les protocoles peuvent être adaptés linéairement d’un seul échantillon à de nombreux échantillons en appliquant des ultrasons constamment contrôlés.
Les appareils à ultrasons à sonde comportant un à cinq doigts sont idéaux pour la préparation d’un plus petit nombre d’échantillons. Les appareils à ultrasons de laboratoire Hielscher sont disponibles en différentes tailles, ce qui nous permet de vous recommander l’appareil idéal pour votre application et vos exigences.

Contrôle précis du processus

Des réglages de sonication contrôlables avec précision sont cruciaux, car une sonification excessive peut détruire l’ADN, l’ARN et la chromatine, tandis qu’un cisaillement ultrasonore insuffisant produit des fragments d’ADN et de chromatine trop longs. Les appareils à ultrasons numériques Hielscher peuvent être facilement réglés sur des paramètres de sonication précis. Des réglages de sonication spécifiques peuvent également être enregistrés sous forme de réglages programmés pour répéter rapidement la même procédure.
Toutes les sonications sont automatiquement consignées et enregistrées sous forme de fichier CSV sur une carte SD intégrée. Cela permet de documenter précisément les essais réalisés et de réexaminer facilement les cycles de sonication.
Grâce à la commande à distance par navigateur, tous les appareils à ultrasons numériques peuvent être utilisés et surveillés au moyen de n’importe quel navigateur standard. L’installation de logiciels supplémentaires n’est pas nécessaire, car une connexion LAN permet une configuration plug-and-play très simple.


Une facilité d’utilisation maximale pour la préparation des échantillons par ultrasons

Tous les appareils à ultrasons Hielscher sont conçus pour fournir des ultrasons haute performance tout en restant toujours très conviviaux et faciles à utiliser. Tous les réglages sont bien structurés dans un menu clair, facilement accessible via un écran tactile couleur ou une commande à distance par navigateur. Le logiciel intelligent, avec ses réglages programmables et son enregistrement automatique des données, garantit des réglages de sonication optimaux pour des résultats fiables et reproductibles. L’interface de menu claire et facile à utiliser fait des appareils à ultrasons Hielscher des appareils conviviaux et efficaces.
Le tableau ci-dessous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos appareils à ultrasons de laboratoire, idéaux pour des tâches de préparation d’échantillons telles que la fragmentation de l’ADN et de l’ARN, la lyse cellulaire et l’extraction des protéines :