Fragmentation ultrasonique de l'ADN pour le séquençage de la prochaine génération
Le séquençage de nouvelle génération (NGS) nécessite le cisaillement et la fragmentation fiables de l'ADN génomique afin de séquencer les brins d'ADN génomique et de créer des bibliothèques de génomes. La fragmentation contrôlée de l'ADN en fragments d'ADN est une étape essentielle de la préparation de l'échantillon avant le séquençage de l'ADN. Les ultrasons se sont avérés être une technique efficace et fiable pour la fragmentation de l'ADN d'une certaine longueur. Les protocoles de fragmentation de l'ADN par ultrasons permettent d'obtenir des résultats reproductibles. Les appareils à ultrasons Hielscher sont capables de produire une large gamme de distributions de tailles de fragments d'ADN génomique, contrôlables avec précision par le biais des paramètres de fonctionnement. Les systèmes de cisaillement de l'ADN par ultrasons Hielscher étant disponibles pour des flacons simples ou multiples ainsi que pour des microplaques, la préparation des échantillons devient très efficace.
Le sonificateur à plaques UIP400MTP pour la préparation d'échantillons à haut débit sonifie uniformément les échantillons dans les plaques multi-puits, les plaques de microtitration et les plaques à 96 puits
- résultats répétables / reproductibles
- réglable avec précision pour obtenir une certaine longueur de fragment
- Traitement rapide
- résultats cohérents de la fragmentation de l'ADN
- dispositifs pour tous les volumes d'échantillons (par exemple, plusieurs flacons ou microplaques)
- haut débit
- contrôle précis de la température
- un fonctionnement simple et convivial
Séquençage de la prochaine génération : Fragmentation ultrasonique de l'ADN pour la préparation des bibliothèques
Pour effectuer un séquençage de nouvelle génération, les trois étapes fondamentales que sont (1) la préparation de la bibliothèque, (2) le séquençage et (3) l'analyse des données doivent être réalisées. Lors de la préparation de la bibliothèque, l'ADN est fragmenté, puis les extrémités des fragments sont réparées (polies) par l'ajout d'une seule base adénine et les fragments cibles sont convertis en ADN double brin. Enfin, des adaptateurs sont fixés par ligature, PCR ou étiquetage afin que le produit final de la bibliothèque d'ADN puisse être quantifié pour le séquençage.
Fragmentation de l'ADN par sonication : En particulier dans le cas des technologies de séquençage à lecture courte telles que Illumina, qui ne peuvent pas lire facilement des fragments d'ADN plus longs, les peuplements d'ADN doivent être fragmentés jusqu'à une certaine taille, ce qui peut être obtenu de manière fiable par ultrasonication.
L'ultrasonication peut être utilisée de manière fiable pour la fragmentation de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine.
Séquençage de la prochaine génération – préparation de la bibliothèque
La fragmentation ultrasonique de l'ADN est couramment employée dans la préparation des bibliothèques de séquençage de l'ADN pour les plateformes de séquençage de nouvelle génération (NGS). Cette technique est utilisée pour diviser les molécules d'ADN en fragments plus petits d'une taille souhaitée, ce qui facilite les étapes suivantes de la préparation des librairies. La fragmentation ultrasonique de l'ADN est généralement requise au cours de l'étape de préparation des librairies des flux de travail NGS pour fragmenter l'ADN génomique en fragments plus petits adaptés au traitement et au séquençage en aval. Elle joue un rôle crucial dans la réussite de l'expérience de séquençage en générant des fragments d'ADN de taille appropriée pour la plateforme de séquençage spécifique utilisée.
Analyses électrophorétiques de l'ADN génomique de E. coli EDL933 soumis à une ultrasonication de 0 à 15 minutes. L indique l'échelle d'ADN. (Basselet et al. 2008)
Séquençage de nouvelle génération – Étapes du processus :
- Fragmentation ultrasonique de l'ADN : Avant la construction de la bibliothèque, l'ADN génomique est fragmenté en morceaux plus petits et plus faciles à gérer. La fragmentation ultrasonique consiste à utiliser des ondes sonores à haute fréquence pour cisailler les molécules d'ADN en fragments de la taille souhaitée. Cette étape est cruciale car elle permet de s'assurer que les lectures de séquençage générées ultérieurement seront d'une longueur appropriée pour la plateforme de séquençage utilisée. La taille des fragments peut être ajustée en fonction des exigences spécifiques de l'expérience de séquençage.
- Amplification clonale par PCR : Après la fragmentation ultrasonique, les fragments d'ADN subissent une réparation des extrémités, une ligature d'adaptateur et une amplification PCR pour générer les bibliothèques de séquençage d'ADN finales. Ces étapes préparent les molécules d'ADN fragmentées au processus de séquençage en ajoutant les séquences d'adaptateurs nécessaires à la liaison avec la plateforme de séquençage et en fournissant des sites d'amorçage pour l'amplification PCR.
- Séquençage de l'ADN par synthèse : Une fois les bibliothèques de séquençage préparées, le processus de séquençage de l'ADN par synthèse (SBS) commence. Au cours de ce processus, la séquence d'ADN est déterminée par l'ajout séquentiel de nucléotides au brin complémentaire. Cette étape implique des réactions cycliques d'incorporation de nucléotides, d'imagerie et de clivage, permettant la détermination de la séquence d'ADN sur la base des signaux fluorescents émis par les nucléotides incorporés.
- Séquençage massivement parallèle : Lors de la dernière étape, les modèles d'ADN amplifiés et séparés dans l'espace sont séquencés simultanément de manière massivement parallèle. Cette approche de séquençage à haut débit permet de générer des millions ou des milliards de lectures de séquençage en un seul cycle de séquençage, ce qui permet une détermination efficace et rapide des séquences d'ADN.
Comment fonctionne la fragmentation ultrasonique de l'ADN ?
La sonication, également connue sous le nom de traitement acoustique des échantillons, est une méthode largement utilisée pour fragmenter l'ADN. Pour le cisaillement ultrasonique de l'ADN, les échantillons sont exposés à des ondes ultrasoniques dans des conditions contrôlées. Le principe de fonctionnement de la fragmentation ultrasonique de l'ADN repose sur les vibrations et la cavitation générées par les ondes ultrasoniques. Les forces de cisaillement qui résultent de la cavitation ultrasonique (acoustique) brisent les molécules d'ADN de poids moléculaire élevé. Les paramètres de sonication tels que l'intensité (amplitude, durée), le mode de pulsation et la température permettent une fragmentation précise de l'ADN jusqu'à une certaine longueur souhaitée de fragments d'ADN. Alors que l'ADN est souvent réduit à 100 à 600 pb par ultrasons, des fragments d'ADN plus longs, jusqu'à 1300 pb, peuvent être obtenus lorsque des conditions ultrasoniques plus douces sont appliquées.
Cisaillement ultrasonique de l'ADN pendant la ChIP – immunoprécipitation de la chromatine
Adapté de Jkwchui sous CC-BY-SA.03
Contrôle de la température pour prévenir la dégradation de l'ADN
La forme moléculaire double brin de l'ADN est très sensible aux températures élevées, de sorte que le contrôle exact de la température pendant les étapes de préparation des échantillons est un facteur crucial pour obtenir des résultats d'analyse fiables.
Que vous utilisiez les ultrasons à sonde de Hielscher, le VialTweeter ou l'UIP400MTP – La surveillance et le contrôle continus de la température sont assurés par un capteur de température enfichable et le logiciel de l'appareil intelligent. Afin de maintenir la température dans une certaine plage, il est possible de définir une limite de température supérieure et inférieure. Par conséquent, l'appareil à ultrasons se met en pause dès que cette limite de température est dépassée et continue automatiquement à soniquer lorsque la température a baissé d'un ∆T défini.
Le logiciel sophistiqué des appareils à ultrasons Hielscher assure le maintien fiable des conditions idéales de traitement des échantillons.
Fragmentation de l'ADN d'un échantillon de masse avec l'ultrasonateur pour plaques multipuits UIP400MTP
Le nombre d'échantillons dans les sciences de la vie a considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. Cela signifie qu'un très grand nombre d'échantillons (par exemple, 384, 1536 ou 3456 puits par microplaque) doivent être traités lors de la préparation et de l'analyse des échantillons dans des conditions uniformes afin d'obtenir des résultats comparables et valides. Avec l'UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics suit la tendance du traitement de masse des échantillons. L'UIP400MTP est un appareil à ultrasons destiné à la préparation d'échantillons à l'aide de microplaques. L'UIP400MTP peut traiter des plaques de 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ou 3456 puits. Selon le type de microplaque, chaque puits peut contenir des volumes d'échantillons allant de quelques dizaines de nanolitres à plusieurs millilitres. Largement utilisé dans la recherche en sciences de la vie, l'UIP400MTP est très couramment utilisé pour la préparation d'échantillons avant des essais tels que l'ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ou la PCR, avant l'analyse des protéines, ainsi que pour la préparation de la chromatine avant CHiP et CHiP-seq, l'identification des modifications d'histones et d'autres traitements analytiques (par exemple, électrophorèse sur gel, spectrométrie de masse).
Le VialTweeter pour la séparation d'échantillons jusqu'à 10 flacons
Le VialTweeter est un ultrasoniseur de laboratoire très répandu qui permet de sonifier efficacement et confortablement jusqu'à 10 flacons simultanément. Comme les flacons et les tubes à essai (par exemple, les flacons Eppendorf, les cryoflacons, les tubes à centrifuger) sont sonifiés indirectement, toute contamination croisée est évitée. La même intensité d'ultrasons étant délivrée à chaque échantillon, tous les résultats de la sonication sont homogènes et reproductibles. Le VialTweeter offre toutes les fonctions intelligentes de nos autres appareils numériques (par exemple, menu intelligent, réglages programmables, contrôle de la température, commande à distance, etc.
Sondes multidoigts pour plaques à micropuits
Disponibles pour les homogénéisateurs à sonde ultrasonique UP200Ht et UP200St, les sondes multidoigts avec 4 ou 8 doigts sont une option confortable pour soniquer plusieurs échantillons en même temps dans les mêmes conditions. Par exemple, la sonotrode MTP-24-8-96 est une sonde à huit doigts, idéale pour l'intégration dans des systèmes automatisés ou pour la préparation manuelle efficace d'échantillons dans les puits de plaques multi-puits. La sonotrode multidoigts est idéale pour les laboratoires automatisés, où l'on traite principalement des béchers et des tubes à essai à l'aide d'une sonotrode ultrasonique standard. Les sondes multidoigts et les sondes standard peuvent être rapidement interchangées en quelques minutes, transformant le sonotrode à sonde unique en un perturbateur ultrasonique à sondes multiples.
Ultrasons Hielscher pour la fragmentation de l'ADN
Hielscher Ultrasonics propose différentes plateformes basées sur les ultrasons pour la fragmentation de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine. Ces différentes plateformes comprennent des sondes ultrasoniques (sonotrodes), des solutions de sonication indirecte pour la préparation simultanée d'échantillons dans plusieurs tubes ou plaques à puits multiples (par exemple, plaques à 96 puits, plaques de microtitration), des sonéacteurs et des cuphores ultrasoniques. Toutes les plates-formes de cisaillement de l'ADN sont équipées de processeurs ultrasoniques haute performance à fréquence ajustée, qui sont contrôlables avec précision et donnent des résultats reproductibles.
Processeurs à ultrasons pour tous les nombres et tailles d'échantillons
Avec les ultrasons multi-échantillons VialTweeter (jusqu'à 10 tubes à essai) et UIP400MTP (pour les microplaques/plaques multipuits) de Hielscher, il devient facilement possible de réduire le temps de traitement des échantillons grâce à une ultrasonication intense et précisément contrôlable, tout en obtenant la distribution de taille des fragments d'ADN et le rendement souhaités. La fragmentation ultrasonique de l'ADN rend la préparation des échantillons efficace, fiable et évolutive. Les protocoles peuvent être linéairement étendus d'un à plusieurs échantillons en appliquant des ultrasons constamment contrôlés.
Les ultrasons à sonde avec un à cinq doigts sont idéaux pour la préparation d'un plus petit nombre d'échantillons. Les ultrasons de laboratoire Hielscher sont disponibles en différentes tailles afin que nous puissions vous recommander l'appareil idéal pour votre application et vos besoins.
un contrôle précis des processus
Il est essentiel de pouvoir contrôler avec précision les paramètres de sonication, car une sonification exhaustive peut détruire l'ADN, l'ARN et la chromatine, tandis qu'un cisaillement ultrasonique inadéquat produit des fragments d'ADN et de chromatine trop longs. Les appareils à ultrasons numériques de Hielscher peuvent être facilement réglés sur des paramètres de sonification précis. Des réglages spécifiques de sonification peuvent également être sauvegardés en tant que réglages programmés pour une répétition rapide de la même procédure.
Toutes les sonications sont automatiquement protocolées et stockées sous forme de fichier CSV sur une carte SD intégrée. Cela permet de documenter avec précision les essais réalisés et de réviser facilement les cycles de sonication.
Grâce à la commande à distance par navigateur, tous les ultrasons numériques peuvent être commandés et surveillés à partir de n'importe quel navigateur standard. L'installation d'un logiciel supplémentaire n'est pas nécessaire, puisqu'une connexion LAN permet une configuration plug-n-play très simple.
La plus grande convivialité dans la préparation d'échantillons par ultrasons
Tous les ultrasons Hielscher sont conçus pour fournir des ultrasons de haute performance, tout en restant très conviviaux et faciles à utiliser. Tous les réglages sont bien structurés dans un menu clair, facilement accessible via l'écran tactile coloré ou la télécommande du navigateur. Le logiciel intelligent, avec ses réglages programmables et l'enregistrement automatique des données, garantit des réglages de sonication optimaux pour des résultats fiables et reproductibles. L'interface de menu claire et facile à utiliser fait des ultrasons Hielscher des appareils conviviaux et efficaces.
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasons de laboratoire, qui sont idéaux pour les tâches de préparation d'échantillons telles que la fragmentation de l'ADN et de l'ARN, la lyse cellulaire et l'extraction de protéines :
| Dispositif | Puissance [W] | Type | Volume [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | pour microplaques | 6 – 3456 puits | VialTweeter | 200 | pour jusqu'à 10 flacons et possibilité de serrage | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | type de sonde | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | type de sonde | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | type de sonde | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | type de sonde | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | type de sonde | 5.0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, réacteur sonore | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | cellule d'écoulement sans contamination |
Contactez nous ! / Demandez-nous !
L'unité ultrasonique de préparation d'échantillons multiples VialTweeter permet de sonifier simultanément jusqu'à 10 flacons. Avec le dispositif de serrage VialPress, jusqu'à 4 tubes supplémentaires peuvent être pressés à l'avant pour une sonication intense.
La sonotrode MTP-24-8-96 comporte huit sondes ultrasoniques pour la sonication des puits des plaques de microtitration.
Littérature / Références
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Qu'il faut savoir
Qu'est-ce que le séquençage de nouvelle génération ?
Le séquençage de nouvelle génération, également appelé séquençage de nouvelle génération (NGS), séquençage à haut débit ou séquençage de deuxième génération, fait référence à l'approche du séquençage parallèle massif, où de très grandes quantités (massives) d'ADN de millions de fragments sont séquencées simultanément en parallèle par cycle.
Pour réaliser un séquençage de nouvelle génération, les trois étapes de base sont les suivantes
- préparation de la bibliothèque,
- le séquençage, et
- l'analyse des données
sont nécessaires.
Lors de la préparation des librairies, les brins d'ADN doivent être fragmentés en fragments d'ADN d'une certaine longueur. La sonication est l'une des techniques préférées pour fragmenter l'ADN.
Au cours du processus de séquençage de l'ADN, l'ordre des nucléotides dans l'ADN est modifié. – connue sous le nom de séquence d'acide nucléique - est déterminée. La séquence d'acide nucléique est composée de quatre bases nucléotidiques - adénine, cytosine, guanine, thymine. – dont le code pour l'information.
Le séquençage de nouvelle génération stimule la recherche dans le domaine des sciences de la vie et de la médecine personnalisée, car le séquençage de l'ADN et de l'ARN est largement utilisé dans la recherche génomique, la recherche sur le cancer, la recherche sur les maladies rares et complexes, la recherche microbienne, l'agrigénomique et bien d'autres domaines de recherche.
Séquençage de nouvelle génération et séquençage de Sanger
Alors que le séquençage de nouvelle génération (NGS) permet de séquencer un grand nombre d'échantillons génomiques, le séquençage Sanger (également connu sous le nom de méthode de terminaison de chaîne ou de séquençage de première génération) ne permet de séquencer qu'un petit nombre d'échantillons. Le séquençage de Sanger ne séquence qu'un seul fragment d'ADN à la fois et peut être réalisé en une seule journée. En raison de sa précision, le séquençage de Sanger est également considéré comme la technologie de référence, utilisée pour vérifier les résultats obtenus par le séquençage de nouvelle génération.
Le séquençage Sanger permet d'obtenir des longueurs de lecture d'environ 800 pb (typiquement 500-600 pb avec de l'ADN non enrichi). Les longueurs de lecture plus importantes du séquençage Sanger présentent des avantages significatifs par rapport à d'autres méthodes de séquençage, notamment en termes de séquençage des régions répétitives du génome. Le défi posé par les données de séquençage à lecture courte est particulièrement important pour le séquençage de nouveaux génomes (de novo) et pour le séquençage de segments de génome fortement réarrangés, typiquement ceux observés dans les génomes cancéreux ou dans les régions de chromosomes qui présentent des variations structurelles [cp. Morozova et al. [Morozova et Marra, 2008].
ADN – Acide désoxyribonucléique – Ses formes et ses fonctions
Chaque forme d'ADN possède des caractéristiques et des applications uniques, contribuant à un large éventail de domaines de recherche, notamment l'oncologie, la génétique, la médecine légale et la biologie évolutive. Les sonicateurs Hielscher constituent une solution très efficace et fiable pour isoler et fragmenter l'ADN et l'ARN à des fins d'analyse. Dans la liste ci-dessous, nous vous expliquons les formes spécifiques d'ADN et les classons en fonction de leur contexte biologique et de leurs fonctions :
- ADN génomique (ADNg)
ADN génomique (ADNg) : L'ensemble de l'ADN d'un organisme, y compris les régions codantes (gènes) et non codantes. - ADN extracellulaire
ADN tumoral circulant (ADNc) : Fragments d'ADN libérés dans le sang par les cellules tumorales.
ADN libre de cellules (cfDNA) : Fragments d'ADN circulant librement dans le sang et provenant de divers tissus. - ADN circulaire extrachromosomique (eccDNA) : Molécules d'ADN circulaires situées à l'extérieur des chromosomes dans les cellules eucaryotes.
ADN viral : ADN provenant de virus, soit intégré dans le génome de l'hôte, soit sous forme d'ADN épisomal. - ADN mitochondrial
ADN mitochondrial (ADNmt) : ADN situé dans les mitochondries, hérité de la mère et impliqué dans la production d'énergie. - ADN plasmidique
ADN plasmidique : Petites molécules d'ADN circulaires qui se répliquent indépendamment de l'ADN chromosomique, que l'on trouve couramment dans les bactéries et qui sont utilisées dans le génie génétique. - ADN nucléaire
ADN nucléaire (ADNn) : ADN contenu dans le noyau des cellules eucaryotes, constituant la majorité du matériel génétique d'un organisme. - ADN unicellulaire
ADN unicellulaire (ADNc) : ADN extrait d'une seule cellule, utilisé pour une analyse génomique détaillée au niveau de la cellule individuelle. - ADN recombinant
ADN recombinant (ADNr) : Molécules d'ADN formées par des méthodes de recombinaison génétique en laboratoire pour rassembler du matériel génétique provenant de sources multiples. - Formulaires spécialisés
ADN environnemental (ADNe) : ADN prélevé sur des échantillons environnementaux (sol, eau) sans isoler les organismes sources
ADN ancien (aDNA) : L'ADN extrait de spécimens anciens permet de mieux comprendre la biologie de l'évolution et les populations anciennes. - ADN chromosomique
ADN chromosomique : ADN qui constitue les chromosomes à l'intérieur du noyau cellulaire, comprenant à la fois des régions codantes et non codantes. - Formes virales et synthétiques
ADN viral : ADN dérivé de virus, qui peut être intégré dans le génome de l'hôte ou exister en tant qu'entité indépendante.
L'ADN synthétique : Séquences d'ADN synthétisées artificiellement et créées par des procédés chimiques, souvent utilisées dans la recherche et la biotechnologie.
Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons très performants à partir de laboratoires à taille industrielle.