Lyse des cellules BL21 par ultrasons
Les cellules BL21 sont une souche d'E. coli largement utilisée dans les laboratoires de recherche, la biotechnologie et la production industrielle en raison de leur capacité à exprimer des protéines de manière très efficace. La désintégration, la lyse et l'extraction des protéines par ultrasons sont des méthodes courantes pour isoler et collecter les protéines ciblées à l'intérieur des cellules BL21. Les ultrasons perturbent complètement la cellule et libèrent toutes les protéines piégées, rendant ainsi 100 % des protéines disponibles.
Cellules BL21 pour l'expression des protéines
La cellule BL21 est une souche bactérienne d'E. coli chimiquement compétente, adaptée à la transformation et à l'expression de protéines de haut niveau à l'aide d'un système d'induction ARN polymérase T7-IPTG. Les cellules BL21 permettent l'expression protéique à haut rendement de tout gène contrôlé par un promoteur T7. La souche BL21(DE3) d'E. coli est une souche de production de protéines basée sur l'ARN polymérase T7 combinée à des vecteurs d'expression basés sur le promoteur T7. Elle est largement utilisée dans les laboratoires et l'industrie pour produire des protéines recombinantes. Dans la souche BL21(DE3), l'expression du gène codant pour la protéine recombinante est transcrite par l'ARN polymérase T7 (RNAP T7) codée dans le chromosome, qui transcrit huit fois plus vite que la RNAP conventionnelle d'E. coli. Cela rend la souche BL21(DE3) très efficace et en fait l'un des systèmes cellulaires d'expression de protéines les plus appréciés.
Protocole de lyse ultrasonique et d'extraction des protéines des cellules BL21
La lyse cellulaire des cellules BL21 est généralement réalisée par ultrasons en combinaison avec du lauroyl sarcosinate de sodium (également connu sous le nom de sarkosyl) comme tampon de lyse. Les avantages de la désintégration cellulaire par ultrasons et de l'extraction des protéines résident dans la fiabilité, la reproductibilité ainsi que dans le fonctionnement simple, sûr et rapide des appareils à ultrasons. Le protocole ci-dessous décrit étape par étape la lyse ultrasonique des cellules BL21 :
- Afin d'éliminer les protéines chaperonnes, les culots bactériens BL21 ont été remis en suspension dans 50 ml de tampon Sodium Tris-EDTA (STE) glacé (composé de 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl complété par 100 mM PMSF).
- Ensuite, 500 ul de lysozyme (10 mg/ ml) sont ajoutés et les cellules sont incubées sur la glace pendant 15 minutes.
- Ensuite, 500 ul de DTT et 7 ml de sarkosyl (10% (w/v) dans le tampon STE) sont ajoutés.
- Il est essentiel de conserver tous les tampons de purification au froid et de maintenir les échantillons sur de la glace en permanence. Toutes les étapes de la purification doivent être effectuées dans la chambre froide si possible.
- Pour la lyse ultrasonique et l'extraction des protéines, les échantillons sont soumis à une sonification dans la chambre de combustion. Ultrasonateur VialTweeter MultiSample pendant 4 x 30 secondes à une amplitude de 100 % avec un intervalle de 2 minutes entre chaque sonication. On peut également utiliser un homogénéisateur ultrasonique de type sonde avec une micro-pointe, par exemple, UP200Ht avec S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. de pause entre les cycles d'ultrasons, 80% d'amplitude) peut être utilisé.
- Pour les étapes de purification ultérieures, les échantillons doivent être conservés sur de la glace ou à -80°C jusqu'au traitement ultérieur.
Perturbateur cellulaire à ultrasons UP200St avec micro-pointe S26d2 pour la lyse et l'extraction des protéines
Lyse ultrasonique sous contrôle de température précis
Le contrôle précis et fiable de la température est crucial lors de la manipulation d'échantillons biologiques. Les températures élevées provoquent une dégradation des protéines induite par la chaleur dans les échantillons.
Comme toutes les techniques de préparation mécanique des échantillons, la sonication génère de la chaleur. Cependant, la température des échantillons peut être bien contrôlée lors de l'utilisation du VialTweeter. Nous vous présentons différentes options pour surveiller et contrôler la température de vos échantillons tout en les préparant à l'analyse avec le VialTweeter et la VialPress.
- Contrôle de la température de l'échantillon : Le processeur ultrasonique UP200St, qui commande le VialTweeter, est équipé d'un logiciel intelligent et d'un capteur de température enfichable. Branchez le capteur de température sur l'UP200St et insérez la pointe du capteur de température dans l'un des tubes d'échantillon. Grâce à l'écran tactile numérique coloré, vous pouvez régler dans le menu de l'UP200St une plage de température spécifique pour la sonication de votre échantillon. L'appareil à ultrasons s'arrête automatiquement lorsque la température maximale est atteinte et fait une pause jusqu'à ce que la température de l'échantillon soit ramenée à la valeur inférieure de la température réglée ∆. La sonication reprend ensuite automatiquement. Cette fonction intelligente empêche la dégradation induite par la chaleur.
- Le bloc VialTweeter peut être pré-refroidi. Placer le bloc VialTweeter (uniquement la sonotrode sans transducteur !) au réfrigérateur ou au congélateur pour pré-refroidir le bloc de titane permet de retarder l'augmentation de la température de l'échantillon. Si possible, l'échantillon lui-même peut être pré-refroidi également.
- Utiliser de la glace sèche pour refroidir pendant la sonication. Utilisez un bac peu profond rempli de glace sèche et placez le VialTweeter sur la glace afin que la chaleur puisse se dissiper rapidement.
Des clients du monde entier utilisent le VialTweeter et le VialPress pour leurs travaux quotidiens de préparation d'échantillons dans les laboratoires biologiques, biochimiques, médicaux et cliniques. Grâce au logiciel intelligent et au contrôle de la température du processeur UP200St, la température est contrôlée de manière fiable et la dégradation des échantillons due à la chaleur est évitée. La préparation d'échantillons par ultrasons avec le VialTweeter et le VialPress donne des résultats extrêmement fiables et reproductibles !
Trouvez le broyeur ultrasonique optimal pour votre application de lyse
Hielscher Ultrasonics est un fabricant expérimenté de broyeurs cellulaires et d'homogénéisateurs à ultrasons de haute performance pour les laboratoires, les paillasses et les systèmes à l'échelle industrielle. La taille de votre culture de cellules bactériennes, votre objectif de recherche ou de production et le volume de cellules à traiter par heure ou par jour sont des facteurs essentiels pour trouver le broyeur cellulaire à ultrasons adapté à votre application.
Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions pour la sonication simultanée d'échantillons multiples (jusqu'à 10 flacons avec le VialTweeter) et d'échantillons de masse (c'est-à-dire des plaques de microtitration / plaques ELISA avec l'UIP400MTP), ainsi que l'ultrasonateur de laboratoire classique à sonde avec différents niveaux de puissance de 50 à 400 watts jusqu'aux processeurs ultrasoniques entièrement industriels avec jusqu'à 16 000 watts par unité pour la désintégration cellulaire commerciale et l'extraction de protéines en grande production. Tous les appareils à ultrasons Hielscher sont conçus pour fonctionner 24 heures sur 24, 7 jours sur 7 et 365 jours par an à pleine charge. La robustesse et la fiabilité sont des caractéristiques essentielles de nos appareils à ultrasons.
Tous les homogénéisateurs numériques à ultrasons sont équipés d'un logiciel intelligent, d'un écran tactile en couleur et d'un système de consignation automatique des données, ce qui fait de l'appareil à ultrasons un outil de travail pratique dans les laboratoires et les installations de production.
Faites-nous savoir quel type de cellules, quel volume, à quelle fréquence et avec quelle cible vous devez traiter vos échantillons biologiques. Nous vous recommanderons le broyeur cellulaire à ultrasons le mieux adapté à vos besoins.
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos systèmes à ultrasons, depuis les homogénéisateurs compacts portatifs et les ultrasons MultiSample jusqu'aux processeurs industriels à ultrasons pour les applications commerciales :
| Volume du lot | Débit | Dispositifs recommandés |
|---|---|---|
| Plaques de 96 puits / microtitres | n.d. | UIP400MTP |
| 10 flacons à 0,5 à 1,5mL | n.d. | VialTweeter à UP200St |
| 0De 0,01 à 250 ml | 5 à 100mL/min | UP50H |
| 0.01 à 500mL | 10 à 200mL/min | UP100H |
| 10 à 2000mL | 20 à 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 à 20L | 0.2 à 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 à 100L | 2 à 10L/min | UIP4000hdT |
| n.d. | 10 à 100L/min | UIP16000 |
| n.d. | plus grande | groupe de UIP16000 |
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Qu'il faut savoir
Bactéries Escherichia Coli
Escherichia coli est un type de bactérie non sporulée, Gram-négative et caractérisée par sa forme de bâtonnet droit. Les bactéries E. coli sont présentes dans l'environnement, les aliments et les intestins des humains et des animaux. Les E. coli sont généralement mobiles grâce à des flagelles péritriches, mais il existe également des types non mobiles. Les E. coli sont des organismes chimio-organotrophes anaérobies facultatifs, ce qui signifie qu'ils sont capables de métabolisme respiratoire et fermentaire. La plupart des types d'E.coli sont bénins et remplissent des fonctions utiles dans l'organisme, par exemple en supprimant la croissance d'espèces bactériennes nocives, en synthétisant des vitamines, etc.
Les cellules bactériennes Escherichia coli dites de type B constituent une catégorie particulière de souches E.coli, largement utilisées dans la recherche pour étudier des mécanismes tels que la sensibilité aux bactériophages ou les systèmes de modification par restriction. En outre, les bactéries E.coli sont considérées comme des outils fiables pour l'expression des protéines dans les laboratoires de biotechnologie et de sciences de la vie. Par exemple, E.coli est utilisé pour synthétiser des composés tels que des protéines et des oligosaccharides à l'échelle industrielle. En raison de caractéristiques spécifiques telles que l'absence de protéase, la faible production d'acétate à un niveau élevé de glucose et une perméabilité accrue, les cellules B d'E. coli sont les cellules hôtes les plus fréquemment utilisées pour la production de protéines issues du génie génétique.
Protéine recombinante
Les protéines recombinantes (rProt) gagnent en importance dans de nombreux domaines, notamment la production chimique, les industries pharmaceutique, cosmétique, la médecine humaine et animale, l'agriculture, l'alimentation et le traitement des déchets.
La production de protéines recombinantes nécessite l'utilisation d'un système d'expression. Les systèmes cellulaires d'expression pour la production d'ADN recombinant peuvent être utilisés aussi bien pour les cellules procaryotes que pour les cellules eucaryotes. Si les cellules bactériennes sont les plus utilisées pour l'expression des protéines en raison de facteurs tels que le faible coût, la facilité de mise à l'échelle et la simplicité des conditions de milieu, les cellules de mammifères, de levures, d'algues, d'insectes et les systèmes acellulaires sont des alternatives bien établies. Le type de protéine, l'activité fonctionnelle, ainsi que le rendement requis de la protéine exprimée influencent la sélection du système cellulaire utilisé pour l'expression des protéines.
Pour exprimer une protéine recombinante, une cellule particulière doit être transfectée avec un vecteur ADN contenant le modèle d'ADN recombinant. Les cellules transfectées avec le modèle sont ensuite mises en culture. En conséquence du mécanisme cellulaire, les cellules transcrivent et traduisent la protéine d'intérêt, produisant ainsi la protéine ciblée.
Comme les protéines exprimées sont piégées dans la matrice cellulaire, la cellule doit être lysée (perturbée et brisée) pour libérer les protéines. Lors d'une étape de purification ultérieure, la protéine est séparée et purifiée.
La première protéine recombinante utilisée dans un traitement a été l'insuline humaine recombinante en 1982. Aujourd'hui, plus de 170 types de protéines recombinantes sont produites dans le monde pour des traitements médicaux. Les protéines recombinantes couramment utilisées en médecine sont par exemple les hormones recombinantes, les interférons, les interleukines, les facteurs de croissance, les facteurs de nécrose tumorale, les facteurs de coagulation sanguine, les médicaments thrombolytiques et les enzymes pour le traitement de maladies majeures telles que le diabète, le nanisme, l'infarctus du myocarde et les maladies cardio-vasculaires, le nanisme, l'infarctus du myocarde, l'insuffisance cardiaque congestive, l'apoplexie cérébrale, la sclérose en plaques, la neutropénie, la thrombocytopénie, l'anémie, l'hépatite, la polyarthrite rhumatoïde, l'asthme, la maladie de Crohn et les thérapies anticancéreuses. (cf. Phuc V. Pham, dans Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Littérature / Références
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Sonicateur VialTweeter pour la sonication simultanée de 10 échantillons, par exemple pour désintégrer des cellules BL21
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