Lyse cellulaire des cellules BL21 par ultrasons

Les cellules BL21 sont une souche d’E. coli largement utilisée dans les laboratoires de recherche, en biotechnologie et dans la production industrielle en raison de leur capacité à exprimer des protéines de manière très efficace. La désintégration cellulaire, la lyse et l’extraction de protéines par ultrasons constituent la méthode courante pour isoler et recueillir les protéines ciblées à partir de l’intérieur cellulaire des cellules BL21. La sonication désintègre complètement la cellule et libère toutes les protéines piégées, rendant 100% de la protéine disponible.

Cellules BL21 pour l’expression de protéines

La cellule BL21 est une souche bactérienne d’E. coli chimiquement compétente, adaptée à la transformation et à l’expression de protéines à haut niveau au moyen d’un système d’induction ARN polymérase T7-IPTG. Les cellules BL21 permettent une expression protéique à haute efficacité de tout gène placé sous le contrôle d’un promoteur T7. La souche d’E. coli BL21(DE3) est une souche de production de protéines basée sur l’ARN polymérase T7, combinée à des vecteurs d’expression basés sur le promoteur T7, et elle est largement utilisée en laboratoire et dans l’industrie pour produire des protéines recombinantes. Dans BL21(DE3), l’expression du gène codant la protéine recombinante est transcrite par l’ARN polymérase T7 (T7 RNAP) codée chromosomiquement, qui transcrit huit fois plus vite que la RNAP conventionnelle d’E. coli. Cela rend la souche BL21(DE3) très efficace et en fait l’un des systèmes cellulaires d’expression de protéines les plus prisés.

Protocole de lyse par ultrasons et d’extraction de protéines à partir de cellules BL21

La lyse cellulaire des cellules BL21 est le plus souvent réalisée par sonication en combinaison avec du lauroylsarcosinate de sodium (également appelé sarkosyl) comme tampon de lyse. Les avantages de la désintégration cellulaire et de l’extraction de protéines par ultrasons résident dans la fiabilité, la reproductibilité ainsi que dans l’utilisation simple, sûre et rapide des ultrasonicateurs. Le protocole ci-dessous donne des instructions étape par étape pour la lyse des cellules BL21 par ultrasons :

• Afin d’éliminer les protéines chaperonnes, les culots bactériens BL21 ont été remis en suspension dans 50 ml de tampon Sodium Tris-EDTA (STE) glacé (composé de 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, complété par 100 mM PMSF).
• Ensuite, 500 ul de lysozyme (10 mg/ ml) sont ajoutés et les cellules sont incubées sur glace pendant 15 min.
• Puis, 500 ul de DTT et 7 ml de sarkosyl (10% (p/v) préparé dans du tampon STE) sont ajoutés.
• Il est essentiel de maintenir tous les tampons de purification glacés et de garder les échantillons sur glace en permanence. Toutes les étapes de purification doivent, si possible, être effectuées en chambre froide.



• Pour la lyse par ultrasons et l’extraction de protéines, les échantillons sont soumis à la sonication dans le VialTweeter, ultrasonicateur MultiSample pendant 4 x 30 sec à 100% d’amplitude, avec un intervalle de 2 min entre chaque sonication. Alternativement, un homogénéisateur à ultrasons de type sonde avec micro-pointe, p. ex. UP200Ht avec S26d2 (3 x 30 sec, pause de 2 min. entre les cycles d’ultrasons, amplitude de 80%), peut être utilisé.
• Pour les étapes de purification ultérieures, les échantillons doivent être conservés sur glace ou, alternativement, stockés à -80°C jusqu’à la suite du traitement.

Lyse par ultrasons avec un contrôle précis de la température

Un contrôle précis et fiable de la température est crucial lors de la manipulation d’échantillons biologiques. Des températures élevées déclenchent une dégradation thermique des protéines dans les échantillons.
Comme toutes les techniques mécaniques de préparation d’échantillons, la sonication génère de la chaleur. Toutefois, la température des échantillons peut être bien contrôlée lors de l’utilisation du VialTweeter. Nous vous présentons différentes options pour surveiller et contrôler la température de vos échantillons pendant que vous les préparez pour l’analyse avec le VialTweeter et le VialPress.

1. Surveillance de la température de l’échantillon : le processeur à ultrasons UP200St, qui pilote le VialTweeter, est équipé d’un logiciel intelligent et d’un capteur de température enfichable. Branchez le capteur de température sur l’UP200St et insérez la pointe du capteur de température dans l’un des tubes d’échantillon. Via l’écran tactile couleur numérique, vous pouvez définir dans le menu de l’UP200St une plage de température spécifique pour la sonication de vos échantillons. L’ultrasonicateur s’arrête automatiquement lorsque la température maximale est atteinte et reste en pause jusqu’à ce que la température de l’échantillon soit redescendue à la valeur inférieure du ∆ de température défini. La sonication reprend alors automatiquement. Cette fonction intelligente empêche la dégradation induite par la chaleur.
2. Le bloc VialTweeter peut être prérefroidi. Placer le bloc VialTweeter (uniquement la sonotrode, sans transducteur !) au réfrigérateur ou au congélateur pour prérefroidir le bloc de titane aide à retarder la hausse de température dans l’échantillon. Si possible, l’échantillon lui-même peut également être prérefroidi.
3. Utilisez de la glace sèche pour refroidir pendant la sonication. Utilisez un bac peu profond rempli de glace sèche et placez le VialTweeter sur la glace afin que la chaleur puisse se dissiper rapidement.

Des clients du monde entier utilisent le VialTweeter et le VialPress pour leurs travaux quotidiens de préparation d’échantillons dans des laboratoires biologiques, biochimiques, médicaux et cliniques. Grâce au logiciel intelligent et au contrôle de la température du processeur UP200St, la température est contrôlée de manière fiable et la dégradation des échantillons induite par la chaleur est évitée. La préparation d’échantillons par ultrasons avec le VialTweeter et le VialPress fournit des résultats hautement fiables et reproductibles !

Trouvez le désintégrateur à ultrasons optimal pour votre application de lyse

Hielscher Ultrasonics est un fabricant expérimenté de longue date de désintégrateurs cellulaires et d’homogénéisateurs à ultrasons haute performance pour les laboratoires, ainsi que de systèmes de paillasse et à l’échelle industrielle. La taille de votre culture de cellules bactériennes, votre objectif de recherche ou de production et le volume de cellules à traiter par heure ou par jour sont des facteurs essentiels pour trouver le désintégrateur cellulaire à ultrasons adapté à votre application.
Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions pour la sonication simultanée de multi-échantillons (jusqu’à 10 flacons avec le VialTweeter) et d’échantillons en masse (c.-à-d. plaques de microtitration / plaques ELISA avec l’UIP400MTP), ainsi que l’ultrasonicateur de laboratoire classique de type sonde avec différents niveaux de puissance de 50 à 400 watts, jusqu’aux processeurs à ultrasons entièrement industriels d’une puissance allant jusqu’à 16 000 watts par unité pour la désintégration cellulaire et l’extraction de protéines à des fins commerciales dans le cadre d’une production à grande échelle. Tous les ultrasonicateurs Hielscher sont conçus pour un fonctionnement 24/7/365 à pleine charge. La robustesse et la fiabilité sont des caractéristiques essentielles de nos appareils à ultrasons.
Tous les homogénéisateurs à ultrasons numériques sont équipés d’un logiciel intelligent, d’un écran tactile couleur et d’un protocolage automatique des données, qui font de l’appareil à ultrasons un outil de travail pratique en laboratoire et dans les installations de production.
Indiquez-nous quel type de cellules, quel volume, à quelle fréquence et avec quel objectif vous devez traiter vos échantillons biologiques. Nous vous recommanderons le désintégrateur cellulaire à ultrasons le plus adapté aux exigences de votre procédé.

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos systèmes à ultrasons, des homogénéisateurs portatifs compacts et des ultrasonicateurs MultiSample jusqu’aux processeurs à ultrasons industriels pour les applications commerciales :

Bibliographie / Références

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