Lyse cellulaire des cellules BL21 par ultrasons
Les cellules BL21 pour l'expression des protéines
La cellule BL21 est une souche bactérienne d'E. coli chimiquement compétente, adaptée à la transformation et à l'expression de protéines de haut niveau à l'aide d'un système d'induction d'ARN polymérase-IPTG T7. Les cellules BL21 permettent une expression protéique à haut rendement de tout gène qui est sous le contrôle d'un promoteur T7. La souche BL21(DE3) d'E. coli est une souche de production de protéines à base d'ARN polymérase T7 combinée à des vecteurs d'expression à base de promoteur T7 et est largement appliquée dans les laboratoires et l'industrie pour produire des protéines recombinantes. Dans la souche BL21(DE3), l'expression du gène codant pour la protéine recombinante est transcrite par l'ARN polymérase T7 codée sur le chromosome (RNAP T7), qui transcrit huit fois plus vite que la RNAP classique d'E. coli. Cela rend la souche BL21(DE3) très efficace et en fait l'un des systèmes cellulaires d'expression protéique les plus prisés.
Protocole pour la lyse ultrasonique et l'extraction de protéines des cellules BL21
La lyse cellulaire des cellules BL21 est principalement réalisée par ultrasons en combinaison avec du lauroyl sarcosinate de sodium (également appelé sarkosyl) comme tampon de lyse. Les avantages de la désintégration cellulaire par ultrasons et de l'extraction des protéines résident dans la fiabilité, la reproductibilité ainsi que dans le fonctionnement simple, sûr et rapide des ultrasonateurs. Le protocole ci-dessous donne une orientation étape par étape pour la lyse des cellules BL21 par ultrasons :
Perturbateur cellulaire à ultrasons UP200St avec micro-pointe S26d2 pour la lyse et l'extraction de protéines
- Afin d'éliminer les protéines de chaperon, des granulés bactériens BL21 ont été remis en suspension dans 50 ml de tampon Tris-EDTA (STE) de sodium glacé (composé de 10 mM de Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM d'EDTA, 150 mM de NaCl complétés par 100 mM de PMSF).
- On ajoute 500 ul de lysozyme (10 mg/ ml) et les cellules sont incubées sur de la glace pendant 15 minutes.
- Ensuite, on ajoute 500 ul de TNT et 7 ml de sarkosyl (10 % (p/v) constitué dans le tampon STE).
- Il est essentiel de conserver toutes les tampons de purification au froid et de maintenir les échantillons sur la glace en permanence. Toutes les étapes de purification doivent être effectuées dans la chambre froide si possible.
- Pour la lyse ultrasonique et l'extraction des protéines, les échantillons sont soniqués dans le VialTweeter Ultrasoniseur multi-échantillons pendant 4 x 30 secondes à 100% d'amplitude avec un intervalle de 2 min entre chaque sonication. Il est également possible d'utiliser un homogénéisateur ultrasonore à sonde avec micro-pointe, par exemple, UP200Ht avec S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. de pause entre les cycles ultrasoniques, 80% d'amplitude) peut être utilisé.
- Pour les étapes de purification ultérieures, les échantillons doivent être conservés sur de la glace ou stockés à -80°C jusqu'à leur traitement ultérieur.
La lyse par ultrasons sous contrôle de température précis
Le contrôle précis et fiable de la température est crucial lors de la manipulation d'échantillons biologiques. Les températures élevées déclenchent la dégradation des protéines induite thermiquement dans les échantillons.
Comme toutes les techniques de préparation mécanique des échantillons, la sonication crée de la chaleur. Cependant, la température des échantillons peut être bien contrôlée en utilisant le VialTweeter. Nous vous présentons différentes options pour surveiller et contrôler la température de vos échantillons tout en les préparant avec le VialTweeter et le VialPress pour l'analyse.
- Contrôle de la température de l'échantillon : Le processeur ultrasonique UP200St, qui pilote le VialTweeter, est équipé d'un logiciel intelligent et d'un capteur de température enfichable. Branchez le capteur de température sur l'UP200St et insérez la pointe du capteur de température dans l'un des tubes d'échantillonnage. Grâce à l'écran tactile numérique en couleur, vous pouvez définir dans le menu de l'UP200St une plage de température spécifique pour votre échantillon de sonication. L'ultrasonateur s'arrêtera automatiquement lorsque la température maximale sera atteinte et fera une pause jusqu'à ce que la température de l'échantillon soit descendue à la valeur inférieure de la température réglée ∆. Ensuite, la sonication redémarre automatiquement. Cette fonction intelligente empêche la dégradation induite par la chaleur.
- Le bloc VialTweeter peut être pré-refroidi. Mettez le bloc VialTweeter (uniquement la sonotrode sans transducteur !) au réfrigérateur ou au congélateur pour pré-refroidir le bloc en titane, ce qui permet de retarder l'augmentation de la température de l'échantillon. Si possible, l'échantillon lui-même peut aussi être pré-refroidi.
- Utilisez de la glace sèche pour refroidir pendant la sonication. Utilisez un plateau peu profond rempli de glace sèche et placez le VialTweeter sur la glace pour que la chaleur puisse se dissiper rapidement.
Les clients du monde entier utilisent le VialTweeter et le VialPress pour leur travail quotidien de préparation d'échantillons dans les laboratoires biologiques, biochimiques, médicaux et cliniques. Grâce au logiciel intelligent et au contrôle de la température du processeur UP200St, la température est contrôlée de manière fiable et la dégradation des échantillons induite par la chaleur est évitée. La préparation d'échantillons par ultrasons avec le VialTweeter et le VialPress donne des résultats très fiables et reproductibles !
Trouvez le perturbateur ultrasonore optimal pour votre application de lyse
Hielscher Ultrasonics est un fabricant expérimenté de longue date de broyeurs et d'homogénéisateurs de cellules à ultrasons de haute performance pour les laboratoires, les paillasses et les balances industrielles. La taille de votre culture cellulaire bactérienne, votre objectif de recherche ou de production et le volume de cellules à traiter par heure ou par jour sont des facteurs essentiels pour trouver le broyeur cellulaire à ultrasons adapté à votre application.
Hielscher Ultrasons propose diverses solutions pour la sonication simultanée de plusieurs échantillons (jusqu'à 10 flacons avec le VialTweeter) et d'échantillons de masse (c'est-à-dire des plaques de microtitration / plaques ELISA avec l'UIP400MTP), ainsi que l'ultrasonateur de laboratoire classique à sonde avec différents niveaux de puissance de 50 à 400 watts jusqu'aux processeurs ultrasoniques entièrement industriels avec jusqu'à 16 000 watts par unité pour la désintégration cellulaire commerciale et l'extraction de protéines en grande production. Tous les ultrasonateurs Hielscher sont construits pour fonctionner 24 heures sur 24, 7 jours sur 7 et 365 jours par an à pleine charge. La robustesse et la fiabilité sont des caractéristiques essentielles de nos appareils à ultrasons.
Tous les homogénéisateurs numériques à ultrasons sont équipés d'un logiciel intelligent, d'un écran tactile couleur et d'un enregistrement automatique des données, ce qui fait de l'appareil à ultrasons un outil de travail pratique dans les laboratoires et les installations de production.
Faites-nous savoir, quel type de cellules, quel volume, avec quelle fréquence et avec quelle cible vous avez pour traiter vos échantillons biologiques. Nous vous recommanderons le broyeur cellulaire à ultrasons le mieux adapté à vos besoins.
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos systèmes à ultrasons, des homogénéisateurs portables compacts et des ultrasons multi-échantillons aux processeurs ultrasoniques industriels pour les applications commerciales :
| lot Volume | Débit | Appareils recommandés |
|---|---|---|
| 96 puits / plaques de microtitration | n / a. | UIP400MTP |
| 10 flacons de 0,5 à 1,5mL | n / a. | VialTweeter à UP200St |
| 0.01 à 250mL | 5 à 100mL/min | UP50H |
| 0.01 à 500mL | 10 à 200 ml / min | UP100H |
| 10 à 2000mL | 20 à 400 ml / min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 20L | 00,2 à 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 à 100l | 2 à 10 L / min | UIP4000hdT |
| n / a. | 10 à 100 litres / min | UIP16000 |
| n / a. | plus grand | groupe de UIP16000 |
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appareil à ultrasons UP200Ht avec micropointe de 2 mm S26d2 pour la sonication de petits échantillons
Littérature / Références
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Qu'il faut savoir
Bactéries Escherichia Coli
Escherichia coli est un type de bactérie non sporulée, Gram-négative et caractérisée par sa forme de tige droite. La bactérie E.coli est présente dans l'environnement, les aliments et les intestins des humains et des animaux. E. coli est généralement mobile grâce à l'utilisation de flagelles péritriches, mais il existe aussi des types non mobiles. Les E.coli sont des organismes chimioorganotrophes anaérobies facultatifs, ce qui signifie qu'ils sont capables d'un métabolisme à la fois respiratoire et fermentaire. La plupart des types d'E.coli sont bénins et remplissent des fonctions utiles dans l'organisme, par exemple la suppression de la croissance d'espèces bactériennes nuisibles, la synthèse de vitamines, etc.
Les cellules bactériennes d'Escherichia coli de type B sont une catégorie spéciale de souches d'E.coli, qui sont largement utilisées dans la recherche pour étudier des mécanismes tels que la sensibilité des bactériophages ou les systèmes de restriction-modification. En outre, les bactéries E.coli sont considérées comme des bêtes de somme fiables pour l'expression des protéines dans les laboratoires de biotechnologie et de sciences de la vie. Par exemple, les E.coli sont utilisées pour synthétiser des composés tels que des protéines et des oligosaccharides à l'échelle industrielle. En raison de caractéristiques spécifiques telles qu'une déficience en protéase, une faible production d'acétate à un niveau élevé de glucose et une perméabilité accrue, les cellules B d'E.coli sont les cellules hôtes les plus fréquemment utilisées pour la production de protéines génétiquement modifiées.
Protéine recombinante
Les protéines recombinantes (rProt) gagnent en importance dans de nombreuses branches, notamment dans la production chimique, la pharmacie, les cosmétiques, la médecine humaine et animale, l'agriculture, l'alimentation ainsi que les industries de traitement des déchets.
La production de protéines recombinantes nécessite l'utilisation d'un système d'expression. En tant que systèmes d'expression cellulaire pour la production d'ADN recombinant, les cellules procaryotes et eucaryotes peuvent être utilisées. Alors que les cellules bactériennes sont les plus utilisées pour l'expression des protéines en raison de facteurs tels que le faible coût, la facilité de mise à l'échelle et la simplicité des conditions du milieu, les systèmes sans cellules, mammifères, levures, algues et insectes sont des alternatives bien établies. Le type de protéine, l'activité fonctionnelle, ainsi que le rendement requis de la protéine exprimée influencent la sélection du système cellulaire utilisé pour l'expression des protéines.
Afin d'exprimer une protéine recombinante, une cellule particulière doit être transfectée avec un vecteur d'ADN contenant la matrice d'ADN recombinant. Les cellules transfectées avec la matrice sont ensuite cultivées. En conséquence du mécanisme cellulaire, les cellules transcrivent et traduisent la protéine d'intérêt, produisant ainsi la protéine ciblée.
Comme les protéines exprimées sont piégées dans la matrice cellulaire, la cellule doit être lysée (perturbée et brisée) pour libérer les protéines. Dans une étape de purification ultérieure, la protéine est séparée et purifiée.
La première protéine recombinante utilisée dans le traitement a été l'insuline humaine recombinante en 1982. Aujourd'hui, plus de 170 types de protéines recombinantes sont produits dans le monde entier pour les traitements médicaux. Les protéines recombinantes couramment utilisées en médecine sont par exemple les hormones recombinantes, les interférons, les interleukines, les facteurs de croissance, les facteurs de nécrose tumorale, les facteurs de coagulation sanguine, les médicaments thrombolytiques et les enzymes pour le traitement de maladies importantes telles que le diabète, nanisme, infarctus du myocarde, insuffisance cardiaque congestive, apoplexie cérébrale, sclérose en plaques, neutropénie, thrombocytopénie, anémie, hépatite, polyarthrite rhumatoïde, asthme, maladie de Crohn et traitements des cancers. (cf. Phuc V. Pham, dans Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
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