Protocole d'inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 par sonication

Le Hielscher VialTweeter est une unité unique de préparation d'échantillons multiples par ultrasons, utilisée pour inactiver le coronavirus SARS-COV-2. Le VialTweeter permet de préparer jusqu'à 10 flacons d'échantillons simultanément et constitue donc l'unité idéale pour le traitement d'échantillons en masse.

Inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 avec le VialTweeter

Après avoir retiré le fixateur, les monocouches ont été lavées trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant de racler les cellules dans 1mL de MEM/5% de FBS et de les soniquer (3 × 10 secondes de marche, 10 secondes d'arrêt à 100% de puissance et d'amplitude) à l'aide du processeur ultrasonique Hielscher UP200St avec VialTweeter fixation. Les surnageants ont été clarifiés par centrifugation à 3000 × g pendant 10 minutes. Lire le protocole complet de l'inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 par Welch et al. (2020) ci-dessous :

Cellules et virus

Les cellules Vero E6 (Vero C1008 ; ATCC CRL-1586) ont été cultivées dans du milieu minimum essentiel d'Eagle modifié (MEM) complété par 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal (FCS). Le virus utilisé était la souche SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, isolée par PHE à partir du premier groupe de patients au Royaume-Uni le 29/01/2020. Ce virus a été obtenu au passage 1 et utilisé pour les études d'inactivation au passage 2 ou 3.
Pour les réactifs et les produits chimiques utilisés pour l'inactivation du SARS-CoV-2 ainsi que pour l'élimination de la cytotoxicité des réactifs, veuillez consulter le rapport scientifique de Welch et al. (2020).

Inactivation des virus par les détergents – Protocole d'inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 par Welch et al. 2020

Inactivation du SARS-CoV-2

Pour les produits commerciaux, les préparations virales (liquide de culture tissulaire, titres allant de 1 × 10⁶ à 1 × 10⁸ PFU/ml) ont été traités en trois exemplaires avec des réactifs aux concentrations et pendant les temps de contact recommandés dans les instructions d'utilisation des fabricants, lorsqu'elles sont disponibles, ou aux concentrations et aux temps spécifiquement demandés par les laboratoires d'essai. Lorsqu'une gamme de concentrations était indiquée par le fabricant, le rapport le plus faible entre le produit et l'échantillon a été testé (c'est-à-dire la concentration la plus faible recommandée pour le produit à tester). Les réactifs pour tubes de transport d'échantillons ont été testés en utilisant un rapport d'un volume de liquide de culture tissulaire pour dix volumes de réactif, à moins qu'un rapport de volume entre le liquide de l'échantillon et le réactif n'ait été spécifié par le fabricant. Les détergents, les fixateurs et les solvants ont été testés aux concentrations et aux durées indiquées. Toutes les étapes d'inactivation ont été réalisées à température ambiante (18 - 25°C). Pour tester d'autres types d'échantillons, le virus a été ajouté à la matrice de l'échantillon indiqué dans un rapport de 1:9, puis traité avec les réactifs de test comme indiqué ci-dessus. Toutes les expériences comprenaient des échantillons témoins traités en trois exemplaires avec un volume équivalent de PBS à la place du réactif d'essai. Immédiatement après le temps de contact requis, 1 ml d'échantillon traité a été traité à l'aide de la matrice de filtration sélectionnée de manière appropriée. L'élimination des réactifs pour les tests d'inactivation a été effectuée dans un format de colonne d'essorage plus grand en utilisant les colonnes d'essorage Pierce 4mL Detergent Removal (Thermo Fisher), ou en remplissant des colonnes de centrifugation Pierce vides d'une capacité de 10mL (Thermo Fisher) avec des billes biologiques SM2, du Sephacryl S-400HR ou du Sephadex LH-20 pour obtenir 4mL de billes emballées/résine. Pour la purification à l'aide de filtres Amicon, 2 × 500μl d'échantillons ont été purifiés à l'aide de deux filtres centrifuges selon la méthode décrite précédemment, puis regroupés. Pour l'élimination du formaldéhyde et du formaldéhyde avec glutaraldéhyde, un filtre a été utilisé avec un volume d'échantillon de 1× 500μl, remis en suspension après traitement dans 500μl de PBS, et ajouté à 400ul MEM/5% FBS. Pour l'inactivation des cellules infectées monocouches, 12,5 cm² flacons de cellules Vero E6 (2,5 × 10⁶ cellules/flacon dans 2,5mL MEM/5% FBS) ont été infectées à la MOI 0,001 et incubées à 37°C/5% CO₂ pendant 24 heures. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été fixées à l'aide de 5 ml de formaldéhyde, ou de formaldéhyde et de glutaraldéhyde à température ambiante pendant 15 ou 60 minutes. Le fixateur a été éliminé et les monocouches ont été lavées trois fois avec du PBS avant de racler les cellules dans 1mL de MEM/5% de FBS et de les soniquer (3 × 10 secondes de marche, 10 secondes d'arrêt à 100% de puissance et d'amplitude) à l'aide d'un UP200St avec un accessoire VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Les surnageants ont été clarifiés par centrifugation à 3000 × g pendant 10 minutes.

Détails du réactif utilisé pour l'inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 avec le VialTweeter ultrasonique selon le protocole de Welch et al. 2020

Le protocole complet incluant l'utilisation du Hielscher VialTweeter est disponible ici :
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

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