Technologie des ultrasons Hielscher

Protocole pour l'inactivation du coronavirus SRAS-CoV-2 par sonication

Le Hielscher VialTweeter est une unité unique de préparation d'échantillons multiples par ultrasons, qui est utilisée pour inactiver le coronavirus SARS-COV-2. Le VialTweeter permet de préparer jusqu'à 10 flacons d'échantillons simultanément et constitue ainsi l'unité idéale pour le traitement d'échantillons de masse.

Inactivation du coronavirus SRAS-CoV-2 avec le VialTweeter

Après avoir retiré le fixateur, les monocouches ont été lavées trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant de racler les cellules en 1mL MEM/5% FBS et de les soniquer (3 × 10 secondes en marche, 10 secondes en arrêt à 100% de puissance et d'amplitude) en utilisant le processeur ultrasonique Hielscher UP200St avec VialTweeter de l'attachement. Les surnageants ont été clarifiés par centrifugation à 3000 × g pendant 10 minutes. Read le protocole complet ici pour l'inactivation du coronavirus SRAS-CoV-2 par Welch et al. (2020) ci-dessous :

Cellules et virus

Les cellules Vero E6 (Vero C1008 ; ATCC CRL-1586) ont été cultivées dans le milieu essentiel minimum (MEM) de Eagle modifié, complété par 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal (FCS). Le virus utilisé était la souche hCOV-19/England/2/2020 du SRAS-CoV-2, isolée par PHE à partir du premier groupe de patients au Royaume-Uni le 29/01/2020. Ce virus a été obtenu au passage 1 et utilisé pour des études d'inactivation au passage 2 ou 3.
Pour les réactifs et les produits chimiques utilisés pour l'inactivation du CoV-2 du SRAS ainsi que pour l'élimination de la cytotoxicité des réactifs, veuillez consulter le rapport scientifique de Welch et al. (2020).

The ultrasonic sample preparation unit VialTweeter is used for the inactivation of SARS-CoV-2 coronavirus

Inactivation des virus par les détergents – Protocole d'inactivation du coronavirus SRAS-CoV-2 par Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 Inactivation

Pour les produits commerciaux, les préparations virales (liquide de culture des tissus, titres allant de 1 × 106 à 1 × 108 PFU/ml) ont été traités en trois exemplaires avec des réactifs aux concentrations et aux temps de contact recommandés dans les instructions d'utilisation des fabricants, lorsqu'elles étaient disponibles, ou aux concentrations et aux temps spécifiquement demandés par les laboratoires d'essai. Lorsqu'une fourchette de concentrations a été donnée par le fabricant, le rapport le plus faible entre le produit et l'échantillon a été testé (c'est-à-dire la concentration la plus faible recommandée du produit à tester). Les réactifs des tubes de transport d'échantillons ont été testés en utilisant un ratio d'un volume de liquide de culture tissulaire pour dix volumes de réactif, à moins qu'un ratio de volume de liquide d'échantillon par rapport au réactif n'ait été spécifié par le fabricant. Les détergents, les fixateurs et les solvants ont été testés aux concentrations indiquées pour les durées indiquées. Toutes les étapes d'inactivation ont été réalisées à température ambiante (18 - 25°C). Pour tester d'autres types d'échantillons, le virus a été ajouté à la matrice d'échantillon indiquée dans un rapport de 1:9, puis traité avec les réactifs de test comme ci-dessus. Toutes les expériences comprenaient des échantillons de contrôle simulés en trois exemplaires avec un volume équivalent de PBS à la place du réactif de test. Immédiatement après le temps de contact requis, 1 ml d'échantillon traité a été traité en utilisant la matrice de filtration choisie de manière appropriée. L'élimination des réactifs pour les tests d'inactivation a été effectuée dans un format de colonne d'essorage plus grand en utilisant des colonnes d'essorage Pierce de 4 ml pour l'élimination des détergents (Thermo Fisher), ou en remplissant des colonnes de centrifugation Pierce vides d'une capacité de 10 ml (Thermo Fisher) avec des billes biologiques SM2, du Sephacryl S-400HR ou du Sephadex LH-20 pour obtenir 4 ml de billes/résine conditionnées. Pour la purification à l'aide de filtres Amicon, 2 × 500μl échantillons ont été purifiés à l'aide de deux filtres centrifuges selon la méthode décrite précédemment, puis mis en commun. Pour le formaldéhyde et le formaldéhyde avec élimination du glutaraldéhyde, un filtre a été utilisé avec un volume d'échantillon de 1× 500μl, remis en suspension après traitement dans du PBS 500μl, et ajouté à du MEM 400ul/5% FBS. Pour l'inactivation des VialTweeter at the ultrasonic processor UP200STmonocouches, 12,5 cm2 flacons de cellules Vero E6 (2,5 × 106 dans 2,5 ml de MEM/5% de FBS) ont été infectés à la MOI 0,001 et incubés à 37°C/5% de CO2 pendant 24 heures. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été fixées en utilisant 5 ml de formaldéhyde, ou de formaldéhyde et de glutaraldéhyde à température ambiante pendant 15 ou 60 minutes. Le fixateur a été retiré, et les monocouches ont été lavées trois fois avec du PBS avant de racler les cellules en 1mL MEM/5% FBS et de les soniquer (3 × 10 secondes en marche, 10 secondes en arrêt à 100% de puissance et d'amplitude) à l'aide d'un UP200St avec fixation VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Les surnageants ont été clarifiés par centrifugation à 3000 × g pendant 10 minutes.

Tweeter de flacon pour la sonication intense de flacons fermés

VialTweeter pour la sonication intense des flacons fermés

Demande d'information





Various reagents have been tested for the inactivation of the SARS-CoV-2 coronavirus using the ultrasonic sample prep unit VialTweeter.

Détails du réactif utilisé pour l'inactivation du coronavirus SRAS-CoV-2 avec le VialTweeter à ultrasons selon le protocole de Welch et al. 2020

Le protocole complet incluant l'utilisation du Hielscher VialTweeter peut être trouvé ici :
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

The multi-sample ultrasonicator VialTweeter allows for simultaneous sample preparation of up to 10 vials under same process conditions. The VialTweeter is an established ultrasonic device used for the inactivation of corona virus SARS-CoV-2 (Click to enlarge!)

VialTweeter pour l'inactivation des virus par ultrasons

Les avantages du VialTweeter un coup d'oeil

  • Sonication de 10 flacons maximum simultanément
  • Pas de contamination croisée
  • Pas de perte d'échantillon
  • Enregistrement automatique des données
  • Facile et sûr à utiliser
Le VialTweeter est également utilisé pour

  • Lyse cellulaire
  • Perturbation par particules virales
  • Extraction des acides nucléiques : Isolation de l'ADN/ARN
  • Fragmentation de l'ADN/ARN
  • Solubilisation des lysats
  • Démembreurs à ultrasons sophistiqués et disrupteurs cellulaires

    Le VialTweeter à ultrasons multi-échantillons n'est qu'une des nombreuses solutions ultrasoniques pour la préparation des échantillons dans les laboratoires biologiques, biochimiques et cliniques. Hielscher Ultrasons propose le démembreur ultrasonique idéal pour votre application, par exemple la lyse cellulaire, l'extraction de cellules, l'homogénéisation de tissus, la solubilisation de lysats, la dissolution, le dégazage d'échantillons, etc.
    Faites-nous savoir combien d'échantillons vous devez traiter par heure et par jour, si vous préférez une sonication directe ou indirecte et quel est l'objectif du traitement des échantillons par ultrasons. Nous vous recommanderons l'appareil à ultrasons le mieux adapté à votre routine de travail quotidienne !
    Les processeurs numériques à ultrasons de Hielscher Ultrasonics sont équipés d'un logiciel intelligent, d'un enregistrement automatique des données, d'options de préréglage facile pour le contrôle de la température, de la durée de sonication, du mode cycle/impulsion ainsi que de l'illumination de l'échantillon et de la télécommande du navigateur. Nous nous efforçons de rendre nos appareils à ultrasons aussi intelligents que possible afin que votre recherche et votre travail deviennent aussi pratiques et fructueux que possible.
    Cliquez ici, pour trouver d'autres applications, notamment les protocoles de préparation d'échantillons par ultrasons avec le VialTweeter !

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    Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

    Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs ultrasoniques à haute performance pour des applications de mélange, de dispersion, d'émulsification et d'extraction à l'échelle du laboratoire, du pilote et de l'industrie.

    Littérature / Références



    Qu'il faut savoir

    Que sont les Vero Cells ?

    Le Vero E6, également connu sous le nom de Vero C1008 (ATCC n° CRL-1586) est une lignée cellulaire clone du Vero 76 et est utilisé dans la recherche des coronavirus SRAS-CoV et SRAS-CoV-2. Les cellules Vero sont une lignée de cellules utilisées dans des cultures cellulaires. Les cellules "Vero" sont une lignée de cellules utilisées dans des cultures cellulaires.’ La lignée a été isolée à partir de cellules épithéliales rénales extraites d'un singe vert africain (Chlorocebus sp.).
    Les cellules Vero E6 présentent une certaine inhibition de contact, elles conviennent donc à la propagation de virus qui se répliquent lentement. Les lignées de cellules Vero E6 sont couramment utilisées pour étudier la cytopathologie des coronavirus SRAS-CoV et SRAS-CoV-2, car les cellules Vero (cellules de rein de singe vert africain) présentent une expression abondante des récepteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2). Les récepteurs ACE2 sont un site d'amarrage important pour le coronavirus SRAS-CoV-2.
    Par exemple, Ogando et al. (2020) ont constaté que le SARS-CoV-2 – par rapport au SRAS-CoV – a généré des niveaux plus élevés d'ARN viral intracellulaire, mais il est frappant de constater qu'environ 50 fois moins de descendants viraux infectieux ont été récupérés dans le milieu de culture. En outre, ils ont déterminé que la sensibilité des deux virus à trois inhibiteurs établis de la réplication des coronavirus (Remdesivir, Alisporivir et chloroquine) est très similaire, mais que l'infection par le CoV-2 du SRAS était nettement plus sensible au prétraitement des cellules par l'interféron alpha pégylé. Une différence importante entre les deux virus est le fait que – lors du passage dans les cellules Vero E6 – Le SARS-CoV-2 est apparemment soumis à une forte pression de sélection pour acquérir des mutations adaptatives dans son gène de la protéine de pointe. Ces mutations modifient ou suppriment un supposé "site de clivage de type furine" dans la région reliant les domaines S1 et S2 et entraînent un changement phénotypique très important dans les tests en plaque.