Protocole d'inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 par sonication

Le Hielscher VialTweeter est une unité unique de préparation d'échantillons multiples par ultrasons, utilisée pour inactiver le coronavirus SARS-COV-2. Le VialTweeter permet de préparer jusqu'à 10 flacons d'échantillons simultanément et constitue donc l'unité idéale pour le traitement d'échantillons en masse.

Inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 avec le VialTweeter

Après avoir retiré le fixateur, les monocouches ont été lavées trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant de racler les cellules dans 1mL de MEM/5% de FBS et de les soniquer (3 × 10 secondes de marche, 10 secondes d'arrêt à 100% de puissance et d'amplitude) à l'aide du processeur ultrasonique Hielscher UP200St avec VialTweeter fixation. Les surnageants ont été clarifiés par centrifugation à 3000 × g pendant 10 minutes. Lire le protocole complet de l'inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 par Welch et al. (2020) ci-dessous :

Cellules et virus

Les cellules Vero E6 (Vero C1008 ; ATCC CRL-1586) ont été cultivés dans un milieu minimal essentiel (MEM) modifié d’Eagle complété par 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal (FCS). Le virus utilisé était la souche hCOV-19/England/2/2020 du SARS-CoV-2, isolée par PHE à partir du premier groupe de patients au Royaume-Uni le 29/01/2020. Ce virus a été obtenu au passage 1 et utilisé pour des études d’inactivation au passage 2 ou 3.
Pour les réactifs et les produits chimiques utilisés pour l'inactivation du SARS-CoV-2 ainsi que pour l'élimination de la cytotoxicité des réactifs, veuillez consulter le rapport scientifique de Welch et al. (2020).

Inactivation des virus par les détergents – Protocole d'inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 par Welch et al. 2020

Inactivation du SARS-CoV-2

Pour les produits commerciaux, les préparations virales (liquide de culture tissulaire, titres allant de 1 × 10⁶ à 1 × 10⁸ PFU/ml) ont été traités en trois exemplaires avec des réactifs aux concentrations et aux temps de contact recommandés par les fabricants’ les instructions d’utilisation, le cas échéant, ou pour les concentrations et les durées spécifiquement demandées par les laboratoires d’essais. Lorsqu’une gamme de concentrations a été donnée par le fabricant, le rapport le plus bas entre le produit et l’échantillon a été analysé (c.-à-d. la concentration la plus basse recommandée du produit d’essai). Les réactifs du tube de transport d’échantillon ont été testés en utilisant un rapport d’un volume de liquide de culture tissulaire pour dix volumes de réactif, à moins qu’un rapport volumique entre le liquide de l’échantillon et le réactif n’ait été spécifié par le fabricant. Les détergents, les fixateurs et les solvants ont été testés aux concentrations indiquées pendant les durées indiquées. Toutes les étapes d’inactivation ont été effectuées à température ambiante ambiante (18 – 25 °C). Pour tester d’autres types d’échantillons, le virus a été injecté dans la matrice d’échantillon indiquée dans un rapport de 1:9, puis traité avec des réactifs de test comme ci-dessus. Toutes les expériences comprenaient des échantillons de contrôle en trois exemplaires traités par simulation avec un volume équivalent de PBS à la place du réactif d’essai. Immédiatement après le temps de contact requis, 1 ml d’échantillon traité a été traité à l’aide de la matrice de filtration correctement sélectionnée. L’élimination des réactifs pour les essais d’inactivation a été effectuée dans un format de colonne de centrifugation plus grand à l’aide de colonnes de centrifugation d’élimination du détergent Pierce de 4 ml (Thermo Fisher), ou en remplissant des colonnes de centrifugeuse vides de 10 ml (Thermo Fisher) avec des biobilles SM2, du Sephacryl S-400HR ou du Sephadex LH-20 pour obtenir des billes ou de la résine emballées de 4 ml. Pour la purification à l’aide de filtres Amicon, 2 échantillons × 500 μl ont été purifiés à l’aide de deux filtres centrifuges selon la méthode décrite précédemment, puis regroupés. Pour le formaldéhyde et le formaldéhyde avec élimination du glutaraldéhyde, un filtre a été utilisé avec un volume d’échantillon de 1× 500 μl, remis en suspension après traitement dans 500 μl de PBS et ajouté à 400ul MEM/5 % FBS. Pour l’inactivation des personnes infectées monocouches, 12,5 cm² flacons de cellules Vero E6 (2,5 × 10⁶ cellules/flacon dans 2,5mL MEM/5% FBS) ont été infectées à la MOI 0,001 et incubées à 37°C/5% CO₂ pendant 24 heures. Le surnageant a été éliminé et les cellules ont été fixées à l'aide de 5 ml de formaldéhyde, ou de formaldéhyde et de glutaraldéhyde à température ambiante pendant 15 ou 60 minutes. Le fixateur a été éliminé et les monocouches ont été lavées trois fois avec du PBS avant de racler les cellules dans 1mL de MEM/5% de FBS et de les soniquer (3 × 10 secondes de marche, 10 secondes d'arrêt à 100% de puissance et d'amplitude) à l'aide d'un UP200St avec un accessoire VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Les surnageants ont été clarifiés par centrifugation à 3000 × g pendant 10 minutes.

Détails du réactif utilisé pour l'inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 avec le VialTweeter ultrasonique selon le protocole de Welch et al. 2020

Le protocole complet incluant l'utilisation du Hielscher VialTweeter est disponible ici :
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

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