Protocole d’inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 par sonication

Le VialTweeter de Hielscher est une unité unique de préparation ultrasonique multi-échantillons, utilisée pour inactiver le coronavirus SARS-COV-2. Le VialTweeter permet de préparer jusqu’à 10 flacons d’échantillons simultanément et constitue ainsi l’unité idéale pour le traitement d’échantillons en masse.

Inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 avec le VialTweeter

Après retrait du fixateur, les monocouches ont été lavées trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant que les cellules ne soient grattées dans 1mL de MEM/5% FBS et soumises à sonication (3 × 10 secondes marche, 10 secondes arrêt à 100% de puissance et d’amplitude) à l’aide du processeur à ultrasons Hielscher UP200St avec VialTweeter en accessoire. Les surnageants ont été clarifiés par centrifugation à 3000 × g pendant 10 min. Lisez ci-dessous le protocole complet d’inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 par Welch et al. (2020) :

Cellules et virus

Les cellules Vero E6 (Vero C1008 ; ATCC CRL-1586) ont été cultivées dans un milieu essentiel minimum modifié de Eagle (MEM) additionné de 10% (v/v) de sérum de veau fœtal (FCS). Le virus utilisé était la souche SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, isolée par le PHE à partir du premier groupe de patients au Royaume-Uni le 29/01/2020. Ce virus a été obtenu au passage 1 et utilisé pour les études d’inactivation aux passages 2 ou 3.
Pour les réactifs et produits chimiques utilisés pour l’inactivation du SARS-CoV-2 ainsi que pour l’élimination de la cytotoxicité des réactifs, veuillez consulter le rapport scientifique de Welch et al. (2020).

Inactivation du virus par les détergents – protocole d’inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 par Welch et al. 2020

Inactivation du SARS-CoV-2


Pour les produits commerciaux, les préparations virales (liquide de culture tissulaire, titres allant de 1 × 10⁶ à 1 × 10⁸ PFU/ml) ont été traitées en triple exemplaire avec des réactifs aux concentrations et pour les durées de contact recommandées dans les instructions d’utilisation du fabricant, lorsqu’elles étaient disponibles, ou aux concentrations et durées spécifiquement demandées par les laboratoires d’essai. Lorsqu’une plage de concentrations était indiquée par le fabricant, le rapport produit/échantillon le plus faible a été testé (c.-à-d. la concentration recommandée la plus faible du produit testé). Les réactifs des tubes de transport d’échantillons ont été testés en utilisant un rapport d’un volume de liquide de culture tissulaire pour dix volumes de réactif, sauf si un rapport volumique entre le liquide d’échantillon et le réactif était spécifié par le fabricant. Les détergents, fixateurs et solvants ont été testés aux concentrations indiquées pendant les durées indiquées. Toutes les étapes d’inactivation ont été réalisées à température ambiante (18 – 25°C). Pour tester d’autres types d’échantillons, le virus a été inoculé dans la matrice d’échantillon indiquée selon un rapport de 1:9, puis traité avec les réactifs d’essai comme ci-dessus. Toutes les expériences comprenaient des échantillons témoins traités de façon fictive en triple exemplaire avec un volume équivalent de PBS à la place du réactif testé. Immédiatement après la durée de contact requise, 1mL de l’échantillon traité a été traité à l’aide de la matrice de filtration sélectionnée de manière appropriée. L’élimination du réactif pour les essais d’inactivation a été réalisée dans un format de colonne de centrifugation plus grand à l’aide de colonnes Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), ou en remplissant des colonnes de centrifugation Pierce vides d’une capacité de 10mL (Thermo Fisher) avec des SM2 Bio-Beads, du Sephacryl S-400HR ou du Sephadex LH-20 afin d’obtenir 4mL de billes/résine tassées. Pour la purification à l’aide de filtres Amicon, 2 × 500μl d’échantillons ont été purifiés à l’aide de deux filtres centrifuges selon la méthode décrite précédemment, puis regroupés. Pour l’élimination du formaldéhyde et du formaldéhyde avec glutaraldéhyde, un filtre a été utilisé avec un volume d’échantillon de 1× 500μl, remis en suspension après traitement dans 500μl de PBS, et ajouté à 400ul de MEM/5% FBS. Pour l’inactivation de monocouches infectées, des flacons de 12,5 cm² de cellules Vero E6 (2,5 × 10⁶ cellules/flacon dans 2,5mL de MEM/5% FBS) ont été infectés à une MOI de 0,001 et incubés à 37°C/5% de CO₂ pendant 24 heures. Le surnageant a été retiré, et les cellules fixées à l’aide de 5mL de formaldéhyde, ou de formaldéhyde et de glutaraldéhyde à température ambiante pendant 15 ou 60 min. Le fixateur a été retiré, et les monocouches lavées trois fois avec du PBS avant que les cellules ne soient grattées dans 1mL de MEM/5% FBS et soumises à sonication (3 × 10 secondes marche, 10 secondes arrêt à 100% de puissance et d’amplitude) à l’aide d’un UP200St avec accessoire VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Les surnageants ont été clarifiés par centrifugation à 3000 × g pendant 10 min.


Détails du réactif utilisé pour l’inactivation du coronavirus SARS-CoV-2 avec le VialTweeter à ultrasons selon le protocole de Welch et al. 2020

Le protocole complet, incluant l’utilisation du VialTweeter de Hielscher, est disponible ici :
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Désintégrateurs à ultrasons et disrupteurs cellulaires perfectionnés

L’ultrasonicateur multi-échantillons VialTweeter n’est que l’une des nombreuses solutions ultrasoniques de préparation d’échantillons dans les laboratoires biologiques, biochimiques et cliniques. Hielscher Ultrasonics propose le désintégrateur à ultrasons idéal pour votre application, p. ex. lyse cellulaire, extraction cellulaire, homogénéisation de tissus, solubilisation de lysat, dissolution, dégazage d’échantillons, etc.
Faites-nous savoir combien d’échantillons vous devez traiter par heure et par jour, si vous préférez la sonication directe ou indirecte et quel est l’objectif du traitement d’échantillons par ultrasons. Nous vous recommanderons l’unité à ultrasons la plus adaptée à votre routine de travail quotidienne !
Les processeurs à ultrasons numériques de Hielscher Ultrasonics sont équipés d’un logiciel intelligent, d’un enregistrement automatique des données, d’options de préréglage faciles pour le contrôle de la température, la durée de sonication, le mode cycle/impulsion, ainsi que d’un éclairage de l’échantillon et d’une commande à distance par navigateur. Nous nous efforçons de rendre nos appareils à ultrasons aussi intelligents que possible afin que vos recherches et votre routine de travail deviennent aussi pratiques et fructueuses que possible.
Cliquez ici pour découvrir d’autres applications, y compris des protocoles de préparation d’échantillons par ultrasons avec le VialTweeter !