Cisaillement ultrasonique de l'ADN
Lors du cisaillement de l'ADN et de l'ARN, les longues molécules d'ADN sont fragmentées en morceaux plus petits, une étape cruciale dans la préparation des échantillons pour la construction de bibliothèques de séquençage de nouvelle génération (NGS). Le cisaillement ultrasonique de l'ADN utilise les forces de cavitation acoustique pour casser l'ADN ou l'ARN en fragments allant de 100 pb à 5 kb. Cette méthode permet un contrôle précis de la taille des fragments, facilitant la personnalisation à la longueur d'ADN souhaitée pour des résultats de séquençage optimaux.
Cisaillement de l'ADN par ultrasons
Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions basées sur les ultrasons pour le cisaillement de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine. Choisissez entre un ultrasonateur à sonde (par exemple UP100H) pour une sonication directe à l'aide d'une micro-pointe, ou utilisez le VialTweeeter ou le cuphorn ultrasonique pour une préparation indirecte de l'ADN de plusieurs échantillons en même temps. Hielscher propose l'appareil idéal en fonction de vos besoins : que vous ayez 1 ou jusqu'à 10 échantillons, des volumes allant du microlitre au litre. – Les sonicateurs Hielscher répondront à vos exigences pour préparer des fragments d'ADN, d'ARN et de chromatine à la bonne longueur. La reproductibilité, la facilité d'utilisation et le contrôle précis permettent d'obtenir une bibliothèque fiable pour le séquençage de la prochaine génération.
Contrairement à la fragmentation enzymatique de l'ADN, le cisaillement ultrasonique applique des forces de cisaillement purement mécaniques sans ajouter de produits chimiques. Grâce à un réglage précis des paramètres du processus, le cisaillement par ultrasons produit des fragments d'ADN de poids moléculaire élevé (ADN plasmidique et génomique).
Les acides nucléiques purifiés peuvent être amplifiés avant ou après une étape de fragmentation.
Les paramètres de sonication (puissance, cycle d'impulsion / rafales, durée et température) peuvent être contrôlés en toute sécurité par le biais de paramètres logiciels.
- contrôle précis
- cycles et temps de sonication adaptables avec précision à la taille souhaitée de l'ADN
- fragments d'ADN de poids moléculaire élevé
- contrôle de la température
- Rapide
- des résultats reproductibles
- Autoclavable
- diverses solutions : type de sonde, VialTweeter et CupHorn
Protocoles pour le cisaillement ultrasonique de l'ADN
Pour l'essai d'immunoprécipitation de la chromatine
Brièvement, les cellules ont été placées dans des boîtes de 60 mm de diamètre (400 000 par boîte) et transfectées avec l'ARNsi RhoA (comme décrit) ; après 72 h, elles ont été incubées avec du formaldéhyde (concentration finale, 1 %) pendant 10 min à 37 °C pour réticuler les protéines à l'ADN. La réaction de réticulation a été inhibée par l'ajout d'un dixième de volume de glycine 1,25 mol/L, ce qui donne une concentration finale de 125 mmol/L. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS glacé, remises en suspension dans un tampon d'essai de radioimmunoprécipitation [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% désoxycholate, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)] contenant 1 mmol/L de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 1 Ag/mL d'aprotinine et 1 Ag/mL de pepstatine A, et maintenues sur la glace pendant 30 minutes. Ensuite, les lysats cellulaires ont été sonifiés sur la glace avec un sonificateur Hielscher UP200S (3 x 40 s, amplitude 40 %, cycle 1 ; Hielscher Ultrasonics GmbH) jusqu'à ce que les chromatines réticulées soient cisaillées pour donner des fragments d'ADN entre 200 et 1 000 pb. Un dixième du lysat entier a été utilisé pour quantifier la quantité d'ADN présente dans les différents échantillons et considérée comme “ADN d'entrée total”. Les surnageants ont été incubés avec de l'agarose ADN/protéine de sperme de saumon-50% pour réduire le bruit de fond non spécifique. L'immunoprécipitation a ensuite été réalisée pendant une nuit à 4°C avec 5 Ag d'anti-NF-nB p65 (Upstate) ou sans anticorps (contrôle négatif). Ces surnageants ont été additionnés de 5 mol/L NaCl et chauffés pendant une nuit à 65°C pour inverser les liaisons transversales protéine-ADN. Les immunocomplexes ont ensuite été traités avec de la protéinase K exempte de DNase et de RNase, et l'ADN a été purifié par extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l'éthanol. La PCR a été effectuée avec des amorces spécifiques correspondant à une séquence de la région promotrice du gène iNOS humain (amorce p1 : 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶ ; amorce p2 : GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)
Études d'expression EGFP
Pour les études d'expression, la souche recombinante de L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Allemagne) avec le gène de l'EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), chromosomique ssu intégré, a été cultivée dans les différents milieux décrits précédemment et complétés par 100 mg l-1 Nourseothricine (Jena Bioscience, Allemagne). Pendant la culture, des échantillons de 1 ml ont été prélevés, centrifugés (2000 × g, 20°C, 10 min) et lavés avec une solution de NaCl à 0,9%. Le culot a été remis en suspension dans un tampon (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) et désintégré par sonification à l'aide d'un processeur à ultrasons. UP400S (application d'une énergie ∼ 400 Ws). Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation (6000 × g, 4°C, 5 min) et analysés par électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium - polyacrylamide (SDS-PAGE) dans des conditions réductrices selon la méthode de Laemmli (1970) avec des gels de polyacralamide à 12,5 %. L'expression de l'EGFP a été examinée en culture agitée. (Fritsche et al. 2007)

Analyses électrophorétiques de l'ADN génomique de E. coli EDL933 soumis à une ultrasonication de 0 à 15 minutes. L indique l'échelle d'ADN. (Basselet et al. 2008)

Sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP pour le cisaillement de l'ADN à haut débit
immunoprécipitation de la chromatine
L'essai d'immunoprécipitation de la chromatine a été réalisé à l'aide de la méthode ChIP-ITTM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) selon les instructions du fabricant avec quelques modifications. Brièvement, des podocytes humains différenciés ont été réticulés avec du formaldéhyde à 1 % pendant 10 minutes à température ambiante. Les cellules ont été lavées avec du PBS glacé et la réaction de fixation a été arrêtée en ajoutant de la glycine 0,125 M pendant 5 minutes à température ambiante. Les cellules ont été lavées à nouveau avec du PBS glacé et retirées de la boîte. Les cellules ont été culottées par centrifugation et remises en suspension dans le tampon de lyse. Après la centrifugation, les noyaux ont été remis en suspension dans le tampon de cisaillement, incubés sur de la glace pendant 30 minutes et la chromatine a été cisaillée par sonication, par exemple, en utilisant le tampon de cisaillement. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Allemagne) à une puissance de 25 %, 5 impulsions de 20 secondes chacune sur de la glace, en fragments d'environ 200-600 pb. La chromatine cisaillée a ensuite été centrifugée et le surnageant a été recueilli. Pour les immunoprécipitations, 60 μl de chromatine ont été incubés avec 1 μg d'anticorps Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ou NF-κB p50 (Abcam) ou avec des IgG de lapin (Zymed Laboratories), comme contrôle négatif, pendant une nuit à 4°C avec une rotation douce. Les immunocomplexes liés aux billes magnétiques ont été collectés à l'aide d'un support magnétique, lavés abondamment, et les liaisons croisées protéine/ADN ont été inversées et l'ADN élué pour l'analyse PCR en temps réel. (Ristola et al. 2009)
Préparation de l'ADN des EHEC pour l'analyse des puces à ADN
Disposition des lysats cellulaires et des ADN extraits
Les culots bactériens suspendus dans du PBS à la concentration finale souhaitée ont été traités avec du disjoncteur à ultrasons UP100H (Hielscher GmbH, Allemagne) équipé d'une micropointe MS1 (1 mm de diamètre). La fréquence de fonctionnement était de 30 kHz et la puissance de sortie effective de 100 W. Pendant l'opération, les échantillons étaient refroidis dans un bain d'eau glacée, mélangés et centrifugés. Les échantillons ont été utilisés pour les études de cytométrie de flux, tandis que pour les manipulations ultérieures, les échantillons ont été soumis à un traitement thermique (95°C, 5 min). Les lysats cellulaires bruts ont été traités avec un mélange de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1). Un volume égal de ce mélange a été ajouté à l'échantillon de lysat, la solution a été vigoureusement vortexée pendant 15 s et centrifugée à 15 000 x g pendant 2 min à température ambiante (TA) autour de 22°C. La phase aqueuse supérieure contenant l'ADN génomique a été soigneusement séparée et recueillie dans un nouveau tube Eppendorf stérile.
Ensuite, les échantillons ont été sonifiés pour fragmenter l'ADN. L'étape de sonication a été réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Pour évaluer les effets de la fragmentation sur l'ADN génomique, les échantillons ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose.
(…) Les échantillons préalablement sonifiés pendant 2,5 minutes ont été soumis à une étape d'extraction après traitement thermique et centrifugation. L'ADN libéré a été extrait deux fois avec un mélange phénol/chloroforme/alcool isoamylique, puis soumis à une seconde sonication pendant 0 à 15 minutes. L'électrophorèse sur gel d'agarose a été utilisée pour déterminer la distribution de la taille de l'ADN soumis à une fragmentation ultrasonique après extraction (Fig. en haut à droite). L'ADN hautement fragmenté était évident en raison de la présence d'un frottis d'ADN plutôt que de bandes de poids moléculaire élevé qui ont été éliminées des échantillons sonifiés pendant 2,5 minutes ou plus. Une sonication plus longue a progressivement réduit la longueur des fragments à environ 150 - 600 pb, et une sonication de 15 minutes a encore dégradé ces fragments, comme on peut le voir principalement dans la partie supérieure du frottis. Ainsi, la taille moyenne des fragments d'ADN diminue progressivement avec le temps d'ultrasonication et le traitement de 5 minutes a permis d'obtenir les tailles de fragments d'ADN les plus appropriées pour les essais sur puce. Enfin, la procédure de préparation de l'analyte ADN comprenant un traitement ultrasonique de 2 minutes, l'extraction de l'ADN (2×) et une sonication de 5 minutes a été établie. (Basselet et al. 2008)
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
Les cellules HEK293 ont été cultivées comme décrit ci-dessus et fixées avec 2 mM de disuccinimidyl-glutarate pendant 45 minutes à température ambiante. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS. La chromatine a été réticulée pendant 10 minutes à température ambiante avec 1% (v/v) de formaldéhyde et lavée deux fois avec du PBS glacé. La réaction de réticulation a été arrêtée par incubation avec de la glycine à une concentration finale de 0,125 M pendant 5 minutes à température ambiante. Après incubation avec la trypsine, les cellules ont été retirées de la boîte de culture cellulaire et lavées deux fois avec du PBS. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans un tampon de lyse (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl et 0,5 % (v/v) Nonidet P-40), incubé sur de la glace pendant 10 minutes et homogénéisé à l'aide d'un homogénéisateur Dounce. Ensuite, les noyaux ont été concentrés par centrifugation (3500 x g, 5 min, 4 °C) et remis en suspension dans un tampon pour noyaux (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA, et 1 % (p/v) SDS). Les noyaux ont été désagrégés par sonication avec trois impulsions de 20 secondes dans un appareil de sonification. Sonicateur UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) avec un cycle de 0,5 et une amplitude de 30 %, ce qui permet d'obtenir des fragments d'ADN génomique d'une taille globale de 200 à 1 000 pb. Pour la ChIP, 50 g d'ADN ont été dilués 4 fois dans un tampon d'immunoprécipitation (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1 % (v/v) Triton X-100 et 0,01 % (w/v) SDS) (Weiske et al. 2006).
Analyse des modifications des histones par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
En bref, 6 x 106 Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et réticulées sur la plaque de culture pendant 15 minutes à température ambiante en présence de formaldéhyde à 0,5 %. La réaction de réticulation a été stoppée par l'ajout de 0,125 M de glycine. Toutes les étapes suivantes ont été réalisées à 48°C. Tous les tampons ont été pré-réfrigérés et contenaient des inhibiteurs de protéase (Complete Mini, Roche). Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et ensuite grattées. Les culots collectés ont été dissous dans 1 ml de tampon de lyse (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) et ont été soniqués dans un bain d'éthanol froid pendant 10 cycles à 100% d'amplitude à l'aide d'un sonificateur. Sonicateur UP50H (Hielscher, Teltow, Allemagne). La fragmentation de la chromatine a été visualisée dans un gel d'agarose à 1 %. Les fragments obtenus étaient de l'ordre de 200-500pb. La chromatine soluble a été obtenue en centrifugeant les échantillons soniqués à 14 000g pendant 10 minutes à 48°C. La fraction soluble a été diluée au 1/10 dans un tampon de dilution (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) puis aliquotée et conservée à 80°C jusqu'à utilisation. (Rodriguez et al. 2008)
Dispositif | Puissance [W] | Type | Volume [mL] | ||
---|---|---|---|---|---|
UIP400MTP | 400 | pour microplaques | à partir de 6 | – | 3465 puits | VialTweeter | 200 | autonome | 0.5 | – | 1.5 |
UP50H | 50 | à main ou sur pied | 0.01 | – | 250 |
UP100H | 100 | à main ou sur pied | 0.01 | – | 500 |
UP200Ht | 200 | à main ou sur pied | 0.1 | – | 1000 |
UP200St | 200 | Monté sur pied | 0.1 | – | 1000 |
UP400St | 400 | Monté sur pied | 5.0 | – | 2000 |
CupHorn | 200 | CupHorn, réacteur sonore | 10 | – | 200 |
GDmini2 | 200 | cellule d'écoulement sans contamination |

VialTweeter pour la préparation d'échantillons par ultrasons, par exemple fragmentation des plasmides (ADNp).
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Littérature/références
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008) : Traitement des échantillons pour l'analyse des Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) à l'aide d'un réseau de puces à ADN. Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008) : L'inhibition de RhoA inverse la résistance à la doxorubicine dans les cellules cancéreuses humaines du côlon. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008) : Évaluation de la méthode d'extraction de l'ADN de Fusarium à partir de mycéliums et de blé pour la quantification par PCR en temps réel en aval et la corrélation avec les niveaux de mycotoxines. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007) : Caractérisation du comportement de croissance de Leishmania tarentolae - un nouveau système d'expression pour les protéines recombinantes. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384-393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009) : Régulation du gène Neph3 dans les podocytes - rôles clés des facteurs de transcription NF-κB et Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008) : Suivi à l'échelle du génome des répétitions Alu de l'ADN non méthylé dans les cellules normales et cancéreuses. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006) : La protéine triade histidine Hint1 déclenche l'apoptose indépendamment de son activité enzymatique. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, n° 37, 2006. 27356-27366.
Qu'il faut savoir
Qu'est-ce que la tonte de l'ADN ?
Le cisaillement de l'ADN est un processus utilisé pour fragmenter les molécules d'ADN en morceaux plus petits, généralement par des forces mécaniques telles que la sonication. Cette technique est couramment utilisée en biologie moléculaire pour préparer l'ADN au séquençage ou à d'autres analyses, en veillant à ce que les fragments soient de taille gérable et cohérente. Le cisaillement perturbe les longs brins d'ADN sans couper de séquence spécifique, contrairement à la digestion enzymatique, qui clive des sites spécifiques.

Le cisaillement ultrasonique de l'ADN est basé sur la cavitation acoustique et ses forces de cisaillement hydrodynamiques.
Pourquoi l'ADN doit-il être cisaillé ?
L'ADN doit être cisaillé pour créer des fragments de taille gérable et uniforme qui conviennent au séquençage, à la préparation de bibliothèques et à d'autres techniques de biologie moléculaire. Dans des applications telles que le séquençage de nouvelle génération, l'ADN fragmenté permet de générer des séquences qui se chevauchent et qui peuvent être réassemblées par calcul pour reconstituer la séquence d'ADN d'origine. Le cisaillement contribue également à randomiser l'ADN, permettant un échantillonnage complet du matériel génétique, ce qui est crucial pour l'analyse et l'identification précises des variations génétiques.
Comment cisailler l'ADN génomique ?
L'ADN génomique peut être cisaillé en appliquant des forces mécaniques, telles que la sonication, qui utilise des ondes ultrasonores pour briser l'ADN. Il est également possible d'utiliser le cisaillement enzymatique avec des endonucléases pour une fragmentation contrôlée. Le choix de la méthode et des conditions, telles que la durée et l'intensité, dépend de la taille du fragment souhaité et des applications en aval.