• Lors du cisaillement de l'ADN et de l'ARN, les molécules d'ADN sont brisées en plus petits morceaux. La fragmentation de l'ADN et de l'ARN est l'une des étapes importantes de la préparation des échantillons nécessaires à la création de bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération (NGS).
• cisaillement d'ADN à ultrasons utilise les forces de cavitation acoustique pour rompre l'ADN ou de l'ARN en morceaux de 100 – 5kb pb.
• cisaillement par ultrasons permet une fragmentation de l'ADN et l'adaptation précise à la longueur de l'ADN désiré.

Cisaillement de l'ADN par ultrasonication

Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions ultrasons pour l'ADN, l'ARN et le cisaillement de la chromatine. Choisir entre un ultrasonicators type de sonde (par exemple UP100H) pour sonication directe en utilisant une micropointe, ou utiliser le VialTweeeter ou le cuphorn à ultrasons pour la préparation de l'ADN indirect de divers échantillons simultanément. Hielscher offre l'appareil idéal compte tenu de vos besoins: vous avez 1 wether ou jusqu'à 10 échantillons, les volumes de microlitre à des volumes de litres – processeurs à ultrasons Hielscher sont disponibles pour répondre à vos besoins pour préparer l'ADN, l'ARN et les fragments chromatine à la bonne longueur. Reproductibilité, facilité d'utilisation et un contrôle précis permettent une bibliothèque fiable pour le séquençage de nouvelle génération.
Contrairement à la fragmentation d'ADN enzymatique, le cisaillement ultrasonore applique des forces pures de cisaillement mécaniques sans ajouter de produits chimiques. Par le réglage précis des paramètres du procédé, le cisaillement ultrasonore produit des fragments d'ADN de poids moléculaire élevé (de plasmides et d'ADN génomique).
Les acides nucléiques purifiés peuvent être amplifiés avant ou après une étape de fragmentation.
paramètres de sonication (puissance, cycle d'impulsion / salves, le temps et la température) peuvent être en toute sécurité commandées par les paramètres du logiciel.

Protocoles pour l'ADN par ultrasons Shearing

Pour chromatine immunoprécipitation dosage

Brièvement, les cellules ont été étalées dans des boîtes de 60 mm de diamètre (400 000 par boîte) et transfectées avec du siRNA RhoA (comme décrit); après 72 h, ils ont été incubés avec du formaldéhyde (concentration finale, 1%) pendant 10 min à 37 ° C pour réticuler les protéines à l'ADN. La réaction de reticulation a été stoppée par l'addition d'un dixième de volume de 1,25 mol / L de glycine, donnant une concentration finale de 125 mmol / 1. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS glacé, remises en suspension dans du tampon de radioimmunoprécipitation (150 mmol / L de NaCl, 1% de NP40, 0,5% de désoxycholate, 0,1% de SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L de Tris-HCl )] contenant 1 mmol / L de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 1 Ag / mL d'aprotinine et 1 Ag / mL de pepstatine A, et conservé sur de la glace pendant 30 min. Ensuite, les lysats cellulaires ont été soniqués sur de la glace avec un Hielscher UP200S sonificateur ultrasons (3 x 40 s, amplitude 40%, cycle 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) jusqu'à chromatine réticulé ont été cisaillées pour donner des fragments d'ADN entre 200 et 1000 pb. Un dixième de lysat tout a été utilisé pour quantifier la quantité d'ADN présent dans différents échantillons et considérés comme “ADN total d'entrée”. Les surnageants ont été incubés avec la suspension d'ADN / protéine de sperme de saumon d'agarose à 50% pour réduire la fond non spécifique. L'immunoprécipitation a ensuite été effectuée pendant une nuit à 4 ° C avec 5 Ag d'anticorps anti-p65 NF-nB (Upstate) ou sans anticorps (témoin négatif). Ces surnageants ont été complétés avec 5 mol / L de NaCl et on a chauffé pendant une nuit à 65 ° C pour revenir reticulations protéine-ADN. Les immunocomplexes ont été en outre traitées avec DNase et RNase protéinase-K libre, et l'ADN a été purifié par extraction au phénol / chloroforme et précipitation à l'éthanol. La PCR a été réalisée avec des amorces spécifiques correspondant à une séquence dans la région du promoteur du gène iNOS humaine (amorce P1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; amorce p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Des études d'expression EGFP

Pour les études d'expression, la souche recombinante L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Allemagne) avec le gène EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), chromosomique SSU intégré, a été cultivé dans les différents médias comme décrit précédemment et en outre, additionné de 100 mg l^-1 Nourseothricine (Jena Bioscience, Allemagne). En cours de culture, échantillons de 1 ml ont été prélevés, centrifugés (2000 x g, 20 ° C, 10 min) et lavées avec une solution de NaCl à 0,9%. Le culot a été remis en suspension dans du tampon (HEPES 20 mM, EDTA 5 mM, DTT 2 mM) et désintégré par sonification avec le processeur à ultrasons UP400S (Application de l'énergie ~ 400 Ws). Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation (6000 x g, 4 ° C, 5 min) et analysé par le dodécylsulfate de sodium - électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) dans des conditions réductrices selon la méthode de Laemmli (1970) avec 12,5% de gels de polyacralamide . EGFP expression a été examinée dans la culture agitée. (Fritsche et al., 2007)

chromatine immunoprécipitation

Le dosage de la chromatine immunoprécipitation a été réalisée en utilisant le ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) selon les instructions avec quelques modifications du fabricant. En bref, des podocytes humains différenciés ont été réticulé avec 1% de formaldehyde pendant 10 minutes à température ambiante. Les cellules ont été lavées avec du PBS refroidi à la glace et la réaction de fixation est stoppée par addition de glycine 0,125 M pendant 5 min à température ambiante. Les cellules ont été à nouveau lavées avec du PBS glacé et raclées de la boîte. Les cellules ont été sédimentées par centrifugation et remises en suspension dans le tampon de lyse. Après centrifugation, les noyaux en culot sont remises en suspension dans le tampon de cisaillement, mises en incubation sur de la glace pendant 30 min et la chromatine a été cisaillé par sonication, par exemple, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Allemagne) à 25% de puissance 5 impulsions de 20 secondes chacune sur de la glace en fragments d'environ 200-600 pb. La chromatine cisaillée a ensuite été centrifugée et le surnageant a été recueilli. Pour les immunoprécipitations, 60 μl de chromatine ont été incubés avec 1 μg d'anticorps Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ou NF-κB p50 (Abcam) ou avec du lapin. IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), en tant que contrôle négatif, pendant une nuit à 4 ° C avec une rotation douce. Immunocomplexes liés à des billes magnétiques ont été recueillies en utilisant un support magnétique, lavé abondamment, et les liaisons croisées protéine / ADN ont été inversées et l'ADN élue pour l'analyse par PCR en temps réel. (Ristola et al., 2009)

préparation d'ADN EHEC pour l'analyse de réseau de puces

Arrangement de lysats de cellules et des ADN extraits
Les culots bactériens en suspension dans du PBS à la concentration finale désirée ont été traitées avec échographie disrupteur UP100H (Hielscher GmbH, Allemagne) équipé d'une micropointe MS1 (1 mm de diamètre). La fréquence de fonctionnement était de 30 kHz et la puissance de sortie effective était de 100 W. Pendant l'opération, les échantillons ont été refroidis dans un bain d'eau glacée, mélangés et centrifugés. Les échantillons ont été utilisés pour des études de cytométrie de flux, tandis que pour une manipulation ultérieure, les échantillons ont été soumis à un traitement thermique (95 ° C, 5 min). Les lysats cellulaires bruts ont été traités avec un mélange de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1). Un volume égal de ce mélange a été ajouté à l'échantillon de lysat, la solution a été vortexée vigoureusement pendant 15 s et centrifugée à 15 000 xg pendant 2 minutes à température ambiante (RT) autour de 22 ° C. La phase aqueuse supérieure contenant l'ADN génomique a été soigneusement séparée et recueillie dans un nouveau tube Eppendorf stérile.
Par la suite, les échantillons ont été traités par ultrasons pour fragmenter l'ADN. L'étape de sonication a été réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Pour évaluer les effets de la fragmentation sur l'ADN génomique, les échantillons ont été analysés en utilisant l'électrophorèse sur gel d'agarose.
(…Les échantillons soumis à une sonication préalable pendant 2,5 minutes ont été soumis à une étape d'extraction après traitement thermique et centrifugation. L'ADN libéré a été extrait deux fois avec un mélange de phénol: chloroforme: alcool isoamylique, puis soumis à une seconde sonication pendant 0 à 15 min. Une électrophorèse sur gel d'agarose a été utilisée pour déterminer la distribution de taille de l'ADN soumis à une fragmentation ultrasonore post-extraction (figure en haut à droite). L'ADN hautement fragmenté était évident à partir de la présence d'un frottis d'ADN plutôt que de bandes de haut poids moléculaire qui ont été éliminées des échantillons traités aux ultrasons pendant 2,5 minutes ou plus. Une sonication plus longue a progressivement réduit la longueur des fragments à environ 150 - 600 pb, et la sonication pendant 15 min a encore dégradé ces fragments, comme on peut le voir principalement par la partie supérieure du frottis. Ainsi, la taille moyenne des fragments d'ADN diminuait progressivement avec le temps d'ultrasonication et le traitement de 5 minutes permettait d'obtenir les tailles de fragments d'ADN les plus appropriés pour les dosages sur puce. Enfin, la procédure de préparation de l'analyte de l'ADN comprenant les 2 premières minutes du traitement par ultrasons, l'extraction de l'ADN (2 ×) et la sonication subséquente de 5 minutes a été établie. (Basselet et al., 2008)

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

Les cellules HEK293 ont été cultivées comme décrit ci-dessus et fixées avec du disuccinimidyl-glutarate 2 mM pendant 45 minutes à température ambiante. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS. La Chromatine a été réticulée pendant 10 min à température ambiante en utilisant du formaldehyde à 1% (v / v) et lavée deux fois avec du PBS glacé. La réaction de reticulation a été arrêtée par incubation avec de la glycine à une concentration finale de 0,125 M pendant 5 minutes à température ambiante. Après incubation avec de la trypsine, les cellules ont été raclées de la boîte de culture cellulaire et lavées deux fois avec du PBS. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans du tampon de lyse (Pipes 5 mM, pH 8,0, KCl 85 mM et 0,5% (v / v) de Nonidet P-40), incubé sur de la glace pendant 10 min et homogénéisé avec un homogénéisateur Dounce. Ensuite, les noyaux ont été pastillés par centrifugation (3500 xg, 5 min, 4 ° C) et remis en suspension dans du tampon de noyaux (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, EDTA 10 mM et SDS 1% (p / v)). Les noyaux ont été perturbés par sonication avec trois impulsions de 20 s dans un UP50H sonicateur (Hielscher Ultraschall Technologie) à un réglage de cycle de 0,5 et une amplitude de 30%, ce qui donne des fragments d'ADN génomique avec une taille apparente de 200 à 1000 pb. Pour ChIP, 50 g d'ADN a été dilué quatre fois dans du tampon d'immunoprécipitation (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM d'EDTA, 1,1% (v / v) de Triton X-100, et 0,01% (p / v) de SDS). (Weiske et al., 2006)

analyse de la modification des histones par immunoprécipitation de chromatine (ChIP)

En bref, 6 x 10⁶ les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et réticulées sur la plaque de culture pendant 15 minutes à température ambiante en présence de formaldéhyde à 0,5%. La réaction de reticulation a été arrêtée en ajoutant 0,125 M de glycine. Toutes les étapes suivantes ont été réalisées à 48 ° C. Tous les tampons étaient pré-réfrigérés et contenaient des inhibiteurs de protéase (Complete Mini, Roche). Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS puis grattées. Les culots collectés ont été dissous dans 1 ml de tampon de lyse (1% de SDS, 5 mM d'EDTA, 50 mM de Tris pH 8) et ont été traités aux ultrasons dans un bain d'éthanol froid pendant 10 cycles à 100% d'amplitude en utilisant un UP50H sonicateur (Hielscher, Teltow, Allemagne). la fragmentation de la chromatine a été visualisée en gel d'agarose à 1%. fragments obtenus ont été dans la gamme 200-500pb. chromatine soluble a été obtenu par centrifugation des échantillons soniqués à 14,000g pendant 10 min à 48 ° C. La fraction soluble a été diluée au 1/10 dans du tampon de dilution (1% de Triton X-100, 2 mM d'EDTA, 20 mM de Tris pH 8, NaCl 150 mM) puis aliquotés et congelés à 80 ° C jusqu'à utilisation. (Rodriguez et al., 2008)