Cisaillement de l’ADN par ultrasons

Lors du cisaillement de l’ADN et de l’ARN, les longues molécules d’ADN sont fragmentées en morceaux plus petits, une étape cruciale de la préparation des échantillons pour la construction de banques destinées au séquençage de nouvelle génération (NGS). Le cisaillement de l’ADN par ultrasons utilise les forces de cavitation acoustique pour fragmenter l’ADN ou l’ARN en fragments allant de 100 bp à 5 kb. Cette méthode permet un contrôle précis de la taille des fragments, facilitant leur adaptation à la longueur d’ADN souhaitée pour des résultats de séquençage optimaux.

Cisaillement de l’ADN par sonication

Hielscher Ultrasonics propose différentes solutions à ultrasons pour le cisaillement de l’ADN, de l’ARN et de la chromatine. Choisissez un appareil à ultrasons à sonde (p. ex. UP100H) pour une sonication directe à l’aide d’une micropointe, ou utilisez le VialTweeeter ou le cuphorn à ultrasons pour la préparation indirecte de l’ADN de plusieurs échantillons simultanément. Hielscher propose l’appareil idéal en fonction de vos besoins : que vous ayez 1 ou jusqu’à 10 échantillons, avec des volumes allant du microlitre au litre, les sonicateurs Hielscher répondront à vos exigences pour préparer des fragments d’ADN, d’ARN et de chromatine à la longueur appropriée. La reproductibilité, la simplicité d’utilisation et le contrôle précis permettent d’obtenir une banque fiable pour le séquençage de nouvelle génération.
Contrairement à la fragmentation enzymatique de l’ADN, le cisaillement par ultrasons applique des forces de cisaillement purement mécaniques, sans ajout de produits chimiques. Grâce au réglage précis des paramètres du procédé, le cisaillement par ultrasons produit des fragments d’ADN de haut poids moléculaire (ADN plasmidique et génomique).
Les acides nucléiques purifiés peuvent être amplifiés avant ou après une étape de fragmentation.
Les paramètres de sonication (puissance, cycle d’impulsions / salves, durée et température) peuvent être contrôlés de manière sûre au moyen des réglages du logiciel.

Protocoles de cisaillement de l’ADN par ultrasons

Pour l’essai d’immunoprécipitation de la chromatine

En bref, les cellules ont été ensemencées dans des boîtes de 60mm de diamètre (400 000 par boîte) et transfectées avec un siRNA ciblant RhoA (comme décrit) ; après 72 h, elles ont été incubées avec du formaldéhyde (concentration finale, 1%) pendant 10 min à 37°C pour réticuler les protéines à l’ADN. La réaction de réticulation a été arrêtée par l’ajout d’un dixième de volume de glycine à 1,25 mol/L, donnant une concentration finale de 125 mmol/L. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS glacé, remises en suspension dans un tampon d’essai de radio-immunoprécipitation [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% désoxycholate, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] contenant 1 mmol/L de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 1 Ag/mL d’aprotinine et 1 Ag/mL de pepstatine A, puis maintenues sur glace pendant 30 min. Les lysats cellulaires ont ensuite été soniqués sur glace avec un sonicateur à ultrasons Hielscher UP200S (3 x 40 s, amplitude 40%, cycle 1 ; Hielscher Ultrasonics GmbH) jusqu’à ce que les chromatines réticulées soient cisaillées pour obtenir des fragments d’ADN compris entre 200 et 1 000 bp. Un dixième du lysat total a été utilisé pour quantifier la quantité d’ADN présente dans les différents échantillons et considéré comme l’« ADN total d’entrée ». Les surnageants ont été incubés avec une suspension à 50% d’ADN de sperme de saumon/agarose-protéine pour réduire le bruit de fond non spécifique. L’immunoprécipitation a ensuite été réalisée pendant une nuit à 4°C avec 5 Ag d’anti-NF-nB p65 (Upstate) ou sans anticorps (témoin négatif). Du NaCl à 5 mol/L a été ajouté à ces surnageants, qui ont été chauffés pendant une nuit à 65°C pour inverser les réticulations protéine-ADN. Les complexes immuns ont ensuite été traités avec de la protéinase K exempte de DNase et de RNase, et l’ADN a été purifié par extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l’éthanol. La PCR a été réalisée avec des amorces spécifiques correspondant à une séquence située dans la région promotrice du gène iNOS humain (amorce p1 : 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶ ; amorce p2 : GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Études de l’expression de l’EGFP

Pour les études d’expression, la souche recombinante L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Allemagne), portant le gène de l’EGFP (protéine fluorescente verte améliorée) intégré au locus chromosomique ssu, a été cultivée dans les différents milieux comme décrit précédemment, avec un supplément de 100 mg l^-1 de Nourseothricin (Jena Bioscience, Allemagne). Pendant la culture, des échantillons de 1 ml ont été prélevés, centrifugés (2000 × g, 20°C, 10 min) et lavés avec une solution de NaCl à 0,9%. Le culot a été remis en suspension dans un tampon (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) et désintégré par sonication avec le processeur à ultrasons UP400S (énergie appliquée ∼ 400 Ws). Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation (6000 × g, 4°C, 5 min) et analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), dans des conditions réductrices, selon la méthode de Laemmli (1970), avec des gels de polyacrylamide à 12,5%. L’expression de l’EGFP a été étudiée en culture agitée. (Fritsche et al. 2007)

Immunoprécipitation de la chromatine

L’essai d’immunoprécipitation de la chromatine a été réalisé à l’aide du ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, États-Unis), conformément aux instructions du fabricant, avec quelques modifications. En bref, des podocytes humains différenciés ont été réticulés avec du formaldéhyde à 1% pendant 10 min à température ambiante. Les cellules ont été lavées avec du PBS glacé, et la réaction de fixation a été arrêtée par l’ajout de glycine à 0,125 M pendant 5 min à température ambiante. Les cellules ont été lavées à nouveau avec du PBS glacé et détachées de la boîte par grattage. Les cellules ont été recueillies en culot par centrifugation et remises en suspension dans le tampon de lyse. Après centrifugation, les noyaux recueillis en culot ont été remis en suspension dans le tampon de cisaillement, incubés sur glace pendant 30 min, puis la chromatine a été cisaillée par sonication, par exemple avec le UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Allemagne) à une puissance de 25%, avec 5 impulsions de 20 sec chacune sur glace, pour obtenir des fragments d’environ 200–600 bp. La chromatine cisaillée a ensuite été centrifugée et le surnageant a été recueilli. Pour les immunoprécipitations, 60 μl de chromatine ont été incubés avec 1 μg d’anticorps dirigés contre Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, États-Unis), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) ou NF-κB p50 (Abcam), ou avec des IgG de lapin (Zymed Laboratories) comme témoin négatif, pendant une nuit à 4°C sous rotation douce. Les complexes immuns liés aux billes magnétiques ont été recueillis à l’aide d’un support magnétique, lavés soigneusement, puis les réticulations protéine/ADN ont été inversées et l’ADN a été élué pour une analyse par PCR en temps réel. (Ristola et al. 2009)

Préparation de l’ADN d’EHEC pour l’analyse sur puces à ADN

Préparation des lysats cellulaires et des ADN extraits
Les culots bactériens mis en suspension dans du PBS à la concentration finale souhaitée ont été traités avec le désintégrateur à ultrasons UP100H (Hielscher GmbH, Allemagne) équipé d’une micropointe MS1 (1mm de diamètre). La fréquence de fonctionnement était de 30 kHz et la puissance de sortie effective de 100 W. Pendant le fonctionnement, les échantillons ont été refroidis dans un bain d’eau glacée, mélangés et centrifugés. Les échantillons ont été utilisés pour des études de cytométrie en flux, tandis que, pour les manipulations ultérieures, ils ont été soumis à un traitement thermique (95°C, 5 min). Les lysats cellulaires bruts ont été traités avec un mélange de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1). Un volume égal de ce mélange a été ajouté à l’échantillon de lysat ; la solution a été agitée vigoureusement au vortex pendant 15 s et centrifugée à 15 000 x g pendant 2 min à température ambiante (RT), soit environ 22°C. La phase aqueuse supérieure contenant l’ADN génomique a été soigneusement séparée et recueillie dans un nouveau tube Eppendorf stérile.
Les échantillons ont ensuite été soniqués pour fragmenter l’ADN. L’étape de sonication a été réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Pour évaluer les effets de la fragmentation sur l’ADN génomique, les échantillons ont été analysés par électrophorèse sur gel d’agarose.
(…) Les échantillons préalablement soniqués pendant 2,5 min ont été soumis à une étape d’extraction après traitement thermique et centrifugation. L’ADN libéré a été extrait deux fois avec un mélange de phénol:chloroforme:alcool isoamylique, puis soumis à une seconde sonication pendant 0 – 15 min. L’électrophorèse sur gel d’agarose a été utilisée pour déterminer la distribution des tailles de l’ADN soumis à une fragmentation par ultrasons après extraction (figure en haut à droite). La présence d’une traînée d’ADN, plutôt que de bandes de haut poids moléculaire, qui disparaissaient des échantillons soniqués pendant 2,5 min ou plus, témoignait d’un ADN fortement fragmenté. Une sonication plus longue a progressivement réduit la longueur des fragments à environ 150 – 600 bp, et une sonication de 15 min a dégradé davantage ces fragments, comme le montre principalement la partie supérieure de la traînée. Ainsi, la taille moyenne des fragments d’ADN a progressivement diminué avec la durée de sonication, et le traitement de 5 min a permis d’obtenir les tailles de fragments d’ADN les plus adaptées aux essais sur puces à ADN. Finalement, la procédure de préparation de l’ADN à analyser a été établie : d’abord 2 min de traitement par ultrasons, puis extraction de l’ADN (2×), suivie d’une sonication de 5 min. (Basselet et al. 2008)

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

Les cellules HEK293 ont été cultivées comme décrit ci-dessus et fixées avec du disuccinimidyl-glutarate à 2 mM pendant 45 min à température ambiante. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du PBS. La chromatine a été réticulée pendant 10 min à température ambiante avec du formaldéhyde à 1% (v/v), puis lavée deux fois avec du PBS glacé. La réaction de réticulation a été arrêtée par incubation avec de la glycine à une concentration finale de 0,125 M pendant 5 min à température ambiante. Après incubation avec de la trypsine, les cellules ont été détachées de la boîte de culture par grattage et lavées deux fois avec du PBS. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans un tampon de lyse (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl et 0,5% (v/v) Nonidet P-40), incubé sur glace pendant 10 min et homogénéisé avec un homogénéisateur de Dounce. Les noyaux ont ensuite été recueillis en culot par centrifugation (3500 x g, 5 min, 4 °C) et remis en suspension dans un tampon pour noyaux (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA et 1% (w/v) SDS). Les noyaux ont été désintégrés par sonication avec trois impulsions de 20-s dans un sonicateur UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) réglé sur un cycle de 0,5 et une amplitude de 30%, produisant des fragments d’ADN génomique dont la taille était majoritairement comprise entre 200 – 1000 bp. Pour la ChIP, 50g d’ADN ont été dilués d’un facteur 4 dans un tampon d’immunoprécipitation (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 et 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analyse des modifications des histones par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

En bref, 6 x 10⁶ cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et réticulées sur la plaque de culture pendant 15 min à température ambiante en présence de formaldéhyde à 0,5%. La réaction de réticulation a été arrêtée par l’ajout de glycine à 0,125 M. Toutes les étapes suivantes ont été réalisées à 48°C. Tous les tampons ont été prérefroidis et contenaient des inhibiteurs de protéases (Complete Mini, Roche). Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, puis détachées par grattage. Les culots recueillis ont été dissous dans 1 ml de tampon de lyse (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) et soniqués dans un bain d’éthanol froid pendant 10 cycles à une amplitude de 100% à l’aide d’un sonicateur UP50H (Hielscher, Teltow, Allemagne). La fragmentation de la chromatine a été visualisée sur un gel d’agarose à 1%. Les fragments obtenus se situaient dans la plage de 200–500pb. La chromatine soluble a été obtenue en centrifugeant les échantillons soniqués à 14 000g pendant 10 min à 48°C. La fraction soluble a été diluée à 1/10 dans un tampon de dilution (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), puis répartie en aliquotes et conservée à 80°C jusqu’à utilisation. (Rodriguez et al. 2008)