Préparation d’échantillons par ultrasons pour les dosages ELISA

Les dosages tels que l’ELISA sont largement utilisés pour le diagnostic in vitro, la détection de protéines associées à des maladies et le contrôle qualité (p. ex. la surveillance des allergènes alimentaires). La préparation d’échantillons par ultrasons est une technique rapide, fiable et reproductible pour lyser les cellules et isoler les protéines intracellulaires, l’ADN, l’ARN et les organites. Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions à ultrasons pour la préparation pratique d’échantillons uniques, de plusieurs flacons ainsi que de microplaques et de plaques à 96 puits.

ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (dosage immuno-enzymatique sur support solide)

ELISA signifie « enzyme-linked immunosorbent assay » (dosage immuno-enzymatique sur support solide) ; il s’agit d’une technique d’analyse biochimique largement utilisée, appartenant à la catégorie des dosages par liaison de ligands. Dans l’ELISA, un échantillon liquide est ajouté sur une phase solide stationnaire dotée de propriétés de liaison particulières. En général, la phase solide stationnaire est appliquée sous forme de revêtement sur une plaque à puits ou plaque ELISA. Ensuite, divers réactifs liquides sont ajoutés successivement, incubés et lavés, de sorte qu’un changement optique (p. ex. le développement d’une couleur par le produit d’une réaction enzymatique) se produise finalement dans le liquide final du puits. Le changement optique permet de mesurer la quantité d’analyte par une « lecture » dite quantitative. Pour la lecture quantitative, un spectrophotomètre, un fluorimètre ou un luminomètre est utilisé pour détecter et mesurer l’intensité de la lumière transmise. La sensibilité de détection est influencée par l’amplification du signal au cours des réactions analytiques. Les réactions enzymatiques étant des processus d’amplification bien étudiés et fiables, des enzymes sont utilisées pour générer le signal. Les enzymes sont liées aux réactifs de détection dans des proportions fixes afin de permettre une quantification précise, ce qui explique également le nom de dosage immunologique « lié à une enzyme » (« enzyme-linked »).
Comme les dosages ELISA sont réalisés dans des microplaques / plaques à 96 puits, l’ELISA est connue comme une technique de dosage sur plaque ; elle est utilisée p. ex. dans le diagnostic clinique in vitro, la recherche, le développement de médicaments, etc. pour détecter et quantifier des anticorps, des peptides, des protéines et des hormones.
La technique ELISA est fréquemment utilisée comme outil de diagnostic en médecine, en biotechnologie et en phytopathologie, et constitue également une mesure importante de contrôle qualité dans de nombreuses industries.

Préparation d’échantillons par ultrasons avant l’ELISA

Avant de pouvoir réaliser le dosage ELISA, les échantillons nécessitent des étapes de préparation telles que la lyse cellulaire et l’extraction de protéines intracellulaires, d’ADN, d’ARN, etc. L’avantage de la lyse cellulaire et de l’isolement des protéines par ultrasons réside dans leur grande efficacité, leur fiabilité et leur reproductibilité. Tous ces facteurs sont importants pour obtenir des résultats de diagnostic et de recherche de haute qualité

Protocole de lyse cellulaire par ultrasons avant l’ELISA

• Pour les cultures cellulaires : Avant la lyse cellulaire par ultrasons, centrifugez les cellules pendant 5 min à 270 x g dans une microcentrifugeuse. Éliminez le surnageant par aspiration et remettez les cellules en suspension dans 30 – 100 μL de tampon RIPA. Ensuite, incubez le culot cellulaire sur glace pendant 30 min.
• L’échantillon cellulaire est maintenant prêt pour la lyse par ultrasons :
  Utilisez un sonicateur à sonde (p. ex. UP200Ht avec la sonde S26d2) ou un appareil à ultrasons multi-échantillons (p. ex. le VialTweeter pour la sonication simultanée de jusqu’à 10 flacons ou l’UIP400MPT pour les microplaques / plaques à 96 puits), selon le nombre d’échantillons que vous devez préparer.
  Pour la sonication à sonde d’un échantillon unique, placez les cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
• Prédéfinissez la durée de sonication, l’apport énergétique total, le mode cyclique et/ou les limites de température dans le menu numérique du sonicateur. Cela garantit une sonication hautement fiable et une bonne répétabilité.
• Insérez la sonotrode et mettez l’appareil à ultrasons en marche. Déplacez doucement la micro-pointe de la sonde à ultrasons dans l’échantillon afin de le soniquer uniformément.
  Pour la plupart des cellules, la lyse par ultrasons est achevée après 2–4 cycles de 10 s de sonication.
• Après la sonication, retirez la sonotrode de l’échantillon. Les échantillons doivent être incubés sur glace pendant 5 min. Ensuite, centrifugez à 10 000 x g pendant 20 min pour culotter les débris. Transférez les surnageants dans un nouveau tube de microcentrifugation. Étiquetez les analytes et conservez-les à -20°C.
• La sonotrode à ultrasons peut être nettoyée en l’essuyant soigneusement avec de l’alcool ou en la soniquant dans un bécher rempli d’alcool, p. ex. d’éthanol à 70%. Toutes les sondes à ultrasons en titane sont autoclavables.

• Rincez soigneusement le tissu avec du PBS glacé (0,01M, pH=7,4) afin d’éliminer l’excès de sang hémolysé.
• Pesez le tissu (rein, cœur, poumon, rate, etc.) et découpez-le en petits morceaux, qui sont homogénéisés dans du PBS. Le volume de PBS nécessaire dépend du poids du tissu. En règle générale, 1g de tissu nécessite env. 9mL de PBS. Il est recommandé d’ajouter un peu d’inhibiteur de protéases au PBS. (Un tampon RIPA ou un tampon de lyse hypotonique contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases peut être utilisé en alternative.)
• Selon la taille du tissu, un bref traitement au vortex (env. 1–2 min par impulsions de 15 s) peut être utile pour prétraiter le tissu.
• Montez une micro-pointe, p. ex. S26d2, sur votre sonicateur. Placez le tube d’échantillon contenant le tissu dans un bain de glace.
• Soniquez l’échantillon avec votre sonicateur, p. ex. UP200St (80% d’amplitude), pendant 1 min en mode pulsé (15 s en marche, 15 s de pause). Maintenez l’échantillon dans le bain de glace.
• Les homogénats sont ensuite centrifugés afin d’obtenir des fractions spécifiques (cytosolique, nucléaire, mitochondriale ou lysosomale) pour enrichir la protéine en vue de l’analyse. En centrifugeant l’échantillon pendant 5 minutes à 5000×g, on récupère le surnageant.

Contrôle fiable de la température pendant la sonication

La température est un facteur déterminant du procédé, particulièrement important pour le traitement d’échantillons biologiques, p. ex. pour éviter la dégradation thermique des protéines. Comme toutes les techniques mécaniques de préparation d’échantillons, la sonication génère de la chaleur. Cependant, la température des échantillons peut être bien contrôlée lors de l’utilisation des appareils Hielscher Ultrasonics. Nous vous présentons diverses options pour surveiller et contrôler la température de vos échantillons lors de leur préparation pré-analytique avec un sonicateur à sonde ou le VialTweeter.

1. Surveillance de la température de l’échantillon : tous les processeurs à ultrasons numériques Hielscher sont équipés d’un logiciel intelligent et d’un capteur de température enfichable. Branchez le capteur de température sur l’appareil à ultrasons (p. ex. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP) et insérez la pointe du capteur de température dans l’un des tubes d’échantillon. Via l’écran tactile numérique couleur, vous pouvez définir dans le menu du processeur à ultrasons une plage de température spécifique pour la sonication de votre échantillon. Le sonicateur s’arrête automatiquement lorsque la température maximale est atteinte et reste en pause jusqu’à ce que la température de l’échantillon redescende à la valeur inférieure du ∆ de température défini. La sonication redémarre alors automatiquement. Cette fonction intelligente empêche la dégradation induite par la chaleur.
2. Concernant l’unité à ultrasons multi-échantillons VialTweeter, le bloc en titane qui maintient les tubes d’échantillon peut être prérefroidi. Placer le bloc VialTweeter (uniquement la sonotrode, sans le transducteur !) au réfrigérateur ou au congélateur pour prérefroidir le bloc en titane permet de retarder l’élévation de température dans l’échantillon. Si possible, l’échantillon lui-même peut également être prérefroidi.
3. Utilisez un bain de glace ou de la glace carbonique pour refroidir pendant la sonication. Placez votre ou vos tubes d’échantillon dans un bain de glace pendant la sonication. Pour le VialTweeter, utilisez un plateau peu profond rempli de glace carbonique et posez le VialTweeter sur la glace carbonique afin que la chaleur puisse se dissiper rapidement.

Des clients du monde entier utilisent les sonicateurs à sonde Hielscher ainsi que les unités de sonication multi-échantillons VialTweeter et UIP400MTP pour leurs travaux quotidiens de préparation d’échantillons dans des laboratoires biologiques, biochimiques, médicaux et cliniques. Grâce au logiciel intelligent et au contrôle de la température des processeurs Hielscher, la température est contrôlée de manière fiable et la dégradation des échantillons induite par la chaleur est évitée. La préparation d’échantillons par ultrasons avec les solutions à ultrasons Hielscher fournit des résultats hautement fiables et reproductibles !
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