Technologie des ultrasons Hielscher

Préparation des échantillons par ultrasons pour les tests ELISA

Des tests tels que l'ELISA sont largement utilisés pour les diagnostics in vitro, la détection des protéines liées à la maladie et le contrôle de la qualité (par exemple, la surveillance des allergènes alimentaires). La préparation d'échantillons par ultrasons est une technique rapide, fiable et reproductible pour lyser les cellules et isoler les protéines intracellulaires, l'ADN, l'ARN et les organites. Hielscher Ultrasons propose diverses solutions ultrasoniques pour la préparation pratique d'échantillons uniques, de flacons multiples ainsi que pour les plaques de microtitration et les plaques à 96 puits.

ELISA – Test d'immuno-absorption enzymatique

ELISA est l'acronyme de "enzyme-linked immunosorbent assay" et est une technique d'analyse biochimique largement utilisée dans la catégorie des tests de liaison aux ligands. Dans l'ELISA, un échantillon liquide est ajouté à une phase solide stationnaire ayant des propriétés de liaison particulières. Normalement, la phase solide stationnaire est appliquée comme revêtement sur une plaque à puits ou une plaque ELISA. Ensuite, divers réactifs liquides sont successivement ajoutés, incubés et lavés, de sorte qu'un changement optique (par exemple, le développement de la couleur par le produit d'une réaction enzymatique) se produit dans le liquide final du puits. Le changement optique permet de mesurer la quantité de l'analyte par une méthode dite quantitative. “lecture". Pour la lecture quantitative, un spectrophotomètre, un fluorimètre ou un luminomètre est utilisé pour détecter et mesurer l'intensité de la lumière transmise. La sensibilité de la détection est influencée par l'amplification du signal pendant les réactions analytiques. Comme les réactions enzymatiques sont bien étudiées et que les processus d'amplification sont fiables, des enzymes sont utilisées pour créer le signal. Les enzymes sont liées aux réactifs de détection dans des proportions fixes pour permettre une quantification précise, ce qui explique également le nom de test immunosorbant "lié aux enzymes".
Comme les tests ELISA sont effectués sur des plaques de microtitration / plaques à 96 puits, il s'agit d'une technique de test sur plaque qui est utilisée par exemple dans le diagnostic clinique in vitro, la recherche, le développement de médicaments, etc. pour détecter et quantifier les anticorps, les peptides, les protéines et les hormones.
La technique ELISA est fréquemment utilisée comme outil de diagnostic en médecine, en biotechnologie, en phytopathologie et constitue également une mesure importante de contrôle de la qualité dans de nombreuses industries.

configuration complète VialTweeter: VialTweeter sonotrode à ultrasons processeur UP200St

L'unité de préparation des échantillons par ultrasons VialTweeter est utilisé pour la lyse des cellules et l'extraction des protéines avant les tests ELISA

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Préparation des échantillons par ultrasons avant l'ELISA

Avant que le test ELISA puisse être effectué, les échantillons nécessitent des étapes de préparation telles que la lyse des cellules et l'extraction des protéines intracellulaires, de l'ADN, de l'ARN, etc. L'avantage de la lyse cellulaire par ultrasons et de l'isolement des protéines est sa grande efficacité, sa fiabilité et sa reproductibilité. Tous ces facteurs sont importants pour obtenir des diagnostics et des résultats de recherche de haute qualité

Avantages de la lyse ultrasonique avant l'ELISA

  • Traitement homogène des échantillons
  • Lyse complète
  • Extraction complète de protéines (par exemple, anticorps, ADN)
  • Adaptation optimale au type de cellule
  • Pour toute taille d'échantillon
  • reproductible
  • Température contrôlée
  • Protocole automatique de données sur la carte SD

Protocole pour la lyse cellulaire par ultrasons pré-ELISA

Sonde de type ensonorisateur UP200St pour la lyse

  • Pour les cultures cellulaires : Avant la lyse cellulaire par ultrasons, centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 270 x g dans une microcentrifugeuse. Enlever le surnageant par aspiration et remettre les cellules en suspension dans 30 à 100 μL de tampon RIPA. Ensuite, incuber le culot cellulaire sur de la glace pendant 30 min.
  • Maintenant, l'échantillon de cellules est prêt pour la lyse ultrasonique :
    Utilisez un ultrasonateur à sonde (par exemple UP200Ht avec la sonde S26d2) ou un dispositif ultrasonique multi-échantillons (par exemple le VialTweeter pour la sonication simultanée de 10 flacons maximum ou l'UIP400MPT pour les plaques de microtitration / plaques à 96 puits) selon la quantité d'échantillons à préparer.
    Pour la sonication par sonde d'un seul échantillon, placer les cellules dans des tubes à microcentrifuger de 1,5 ml.
  • Vous pouvez prérégler la durée de l'ultrason, l'énergie totale absorbée, le mode de cycle et/ou les limites de température dans le menu numérique de l'ultrasonateur. Cela garantit une sonication et une répétabilité très fiables.
  • Insérez la sonotrode et allumez l'appareil à ultrasons. Déplacez doucement la micro pointe de la sonde ultrasonore dans l'échantillon pour le soniquer uniformément.
    Pour la plupart des cellules, la lyse ultrasonique sera terminée après 2 à 4 cycles de sonication de 10 secondes.
  • Après la sonication, retirez la sonotrode de l'échantillon. Les échantillons doivent être incubés sur de la glace pendant 5 minutes. Ensuite, centrifuger à 10 000 x g pendant 20 min pour agglomérer les débris. Transférez les surnageants dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Marquez les analytes et stockez-les à -20°C.
  • La sonotrode à ultrasons peut être nettoyée en l'essuyant correctement avec de l'alcool ou du sonicate dans un bécher rempli d'alcool, par exemple de l'éthanol à 70 %. Toutes les sondes ultrasoniques en titane sont autoclavables.

Pour les homogénéisats tissulaires :

  • Rincez le tissu avec du PBS glacé (0,01M, pH=7,4) pour éliminer l'excès de sang d'hémolyse.
  • Pesez les tissus (rein, cœur, poumon, rate, etc.) et faites-les macérer en petits morceaux, qui sont homogénéisés dans du PBS. Le volume de PBS nécessaire est lié au poids du tissu. En règle générale, 1 g de tissu nécessite environ 9 ml de PBS. Il est recommandé d'ajouter un inhibiteur de protéase au PBS. (Le RIPA ou un tampon de lyse hypotonique contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase peut être utilisé en alternative).
  • Selon la taille du tissu, un court traitement par vortex (environ 1 à 2 minutes en impulsions de 15 secondes) peut être utile pour prétraiter le tissu.
  • Montez une micropointe, par exemple S26d2, sur votre ultrasonateur. Placez le tube à échantillon avec le tissu dans un bain de glace.
  • Sondez l'échantillon avec votre ultrasonateur, par exemple UP200St (80% d'amplitude) pendant 1 minute en mode pulsé (15sec on, 15sec pause). Conservez l'échantillon dans le bain de glace.
  • Les homogénats sont ensuite centrifugés pour obtenir des pools spécifiques (cytosolique, nucléaire, mitochondrial ou lysosomal) afin d'enrichir la protéine pour l'analyse. En centrifugeant l'échantillon pendant 5 minutes à 5000×g, le surnageant est récupéré.
La sonotrode MTP-24-8-96 possède huit sondes ultrasoniques pour la sonication des puits des plaques de microtitration.

La sonotrode MTP-24-8-96 possède huit sondes ultrasoniques pour la sonication des puits des plaques de microtitration.

Contrôle fiable de la température pendant la sonication

La température est un facteur crucial qui influe sur le processus et qui est particulièrement important pour le traitement des échantillons biologiques, par exemple pour empêcher la dégradation thermique des protéines. Comme toutes les techniques de préparation mécanique des échantillons, la sonication crée de la chaleur. Cependant, la température des échantillons peut être bien contrôlée en utilisant les appareils Hielscher Ultrasons. Nous vous présentons différentes options pour surveiller et contrôler la température de vos échantillons tout en les préparant avec un ultrasonateur de type sonde ou le VialTweeter en pré-analyse.

  1. Contrôle de la température de l'échantillon : Tous les processeurs numériques à ultrasons Hielscher sont équipés d'un logiciel intelligent et d'un capteur de température enfichable. Branchez le capteur de température sur l'appareil à ultrasons (par ex, UP200Ht, UP200St, VialTweeterUIP400MTP) et insérez l'extrémité du capteur de température dans l'un des tubes d'échantillonnage. Grâce à l'écran tactile numérique en couleur, vous pouvez définir dans le menu du processeur à ultrasons une plage de température spécifique pour votre échantillon de sonication. L'ultrasonateur s'arrêtera automatiquement lorsque la température maximale sera atteinte et fera une pause jusqu'à ce que la température de l'échantillon soit descendue à la valeur inférieure de la température réglée ∆. Ensuite, la sonication redémarre automatiquement. Cette fonction intelligente empêche la dégradation induite par la chaleur.
  2. En ce qui concerne le VialTweeter, l'unité ultrasonique à échantillons multiples, le bloc de titane, qui contient les tubes à échantillons, peut être pré-refroidi. Mettez le bloc VialTweeter (uniquement la sonotrode sans transducteur !) au réfrigérateur ou au congélateur pour pré-refroidir le bloc de titane, ce qui permet de retarder l'augmentation de la température de l'échantillon. Si possible, l'échantillon lui-même peut aussi être pré-refroidi.
  3. Utilisez un bain de glace ou de la glace sèche pour refroidir pendant la sonication. Placez votre (vos) tube(s) de prélèvement pendant la sonication dans un bain de glace. Pour le VialTweeter, utilisez un plateau peu profond rempli de glace sèche et placez le VialTweeter sur la glace sèche afin que la chaleur puisse se dissiper rapidement.

Les clients du monde entier utilisent les sondes-ultrasons Hielscher ainsi que les appareils de sonication multi-échantillons VialTweeter et UIP400MTP pour leur travail quotidien de préparation d'échantillons dans les laboratoires biologiques, biochimiques, médicaux et cliniques. Grâce au logiciel intelligent et au contrôle de la température des processeurs Hielscher, la température est contrôlée de manière fiable et la dégradation des échantillons induite par la chaleur est évitée. La préparation d'échantillons par ultrasons avec les solutions ultrasoniques de Hielscher donne des résultats très fiables et reproductibles !

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Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs ultrasoniques à haute performance pour des applications de mélange, de dispersion, d'émulsification et d'extraction à l'échelle du laboratoire, du pilote et de l'industrie.

Littérature / Références



Qu'il faut savoir

Types d'ELISA

Il existe plusieurs types d'ELISA, qui se distinguent par leur principe de fonctionnement. Ils sont connus sous les noms d'ELISA direct, ELISA indirect, ELISA sandwich, ELISA compétitif et ELISA inverse. Nous vous présentons ci-dessous un aperçu des différents types d'ELISA, ainsi que de leurs principales caractéristiques et différences.
L'ELISA peut être réalisé sous une forme qualitative ou quantitative. Les résultats qualitatifs donnent un simple résultat positif ou négatif, tandis que dans le cas de l'ELISA quantitatif, la densité optique (DO) de l'échantillon est comparée à une courbe standard, qui est généralement une dilution en série d'une solution de concentration connue de la molécule cible.

ELISA direct

L'ELISA direct est la forme de test la plus simple d'Elisa, où seul un anticorps primaire marqué par une enzyme est utilisé et où les anticorps secondaires ne sont pas nécessaires. L'anticorps primaire marqué par une enzyme se lie directement à la cible, c'est-à-dire l'antigène. La solution d'antigène tamponnée est ajoutée à chaque puits d'une plaque de microtitration (généralement des plaques 96 puits, des plaques ELISA), où elle adhère à la surface plastique par des interactions de charge. Lorsque l'enzyme liée à l'anticorps primaire réagit avec son substrat, elle produit un signal visible qui peut être mesuré par un spectrophotomètre, un fluorimètre ou un luminomètre.

ELISA indirect

Pour le test ELISA indirect, un anticorps primaire et un anticorps secondaire sont tous deux nécessaires. Cependant, contrairement au test ELISA direct, ce n'est pas l'anticorps primaire, mais l'anticorps secondaire qui est marqué par une enzyme. L'antigène est immobilisé sur la plaque du puits et lié par l'anticorps primaire. Par la suite, l'anticorps secondaire marqué par une enzyme se lie à l'anticorps primaire. Enfin, l'enzyme liée à l'anticorps secondaire réagit avec son substrat pour produire un signal visible qui peut être détecté.

Sandwich ELISA

Alors que dans les tests ELISA directs et indirects, l'antigène est immobilisé et enduit à la surface de la plaque du puits, dans le test ELISA en sandwich, l'anticorps est immobilisé à la surface plastique de la plaque ELISA. Les anticorps immobilisés dans le test ELISA en sandwich sont appelés anticorps de capture. En plus des anticorps de capture, les anticorps de détection sont également nécessaires dans le test ELISA en sandwich. Les anticorps de détection comprennent un anticorps de détection primaire non marqué et un anticorps de détection secondaire marqué par une enzyme.
Par étapes, l'antigène d'intérêt se lie à l'anticorps de capture immobilisé sur la plaque. Ensuite, l'anticorps de détection primaire se lie à l'antigène. Ensuite, l'anticorps de détection secondaire se lie à l'anticorps de détection primaire. Dans l'étape finale de la réaction, l'enzyme réagit avec son substrat pour produire un signal visible qui peut être détecté optiquement.

ELISA compétitif

Le test ELISA compétitif, également appelé test ELISA d'inhibition, est le type de test ELISA le plus complexe car il implique l'utilisation d'un antigène inhibiteur. Chacun des trois formats, direct, indirect et sandwich ELISA, peut être adapté au format ELISA compétitif. Dans le format ELISA compétitif, l'antigène inhibiteur et l'antigène d'intérêt sont en concurrence pour se lier à l'anticorps primaire.
Pour le test ELISA compétitif, l'anticorps non marqué est incubé en présence de son antigène, c'est-à-dire de l'échantillon. Ces complexes anticorps/antigène liés sont ensuite ajoutés à un puits revêtu d'antigène.
La plaque est lavée, de sorte que les anticorps non liés sont éliminés. Le test ELISA compétitif doit son nom au fait que plus il y a d'antigènes dans l'échantillon, plus il se forme de complexes antigènes-anticorps. Cela signifie qu'il y a moins d'anticorps non liés disponibles pour se lier à l'antigène dans le puits et que les antigènes doivent entrer en compétition pour obtenir un anticorps disponible. Un anticorps secondaire, correspondant à l'anticorps primaire, est ajouté. Ce second anticorps est lié à l'enzyme. Lorsque le substrat est ajouté, les enzymes restantes produisent un signal chromogène ou fluorescent.
À ce stade, la réaction est arrêtée pour éviter la saturation éventuelle du signal.
Certains kits ELISA compétitifs comprennent un antigène lié à une enzyme au lieu d'un anticorps lié à une enzyme. L'antigène marqué entre en compétition avec l'antigène de l'échantillon (non marqué) pour les sites de liaison des anticorps primaires. Moins il y a d'antigène dans l'échantillon, plus l'antigène marqué est retenu dans le puits et plus le signal est fort.

ELISA inversé

L'ELISA inverse n'utilise pas de plaques de puits, mais laisse les antigènes en suspension dans le liquide de test. Le test ELISA inversé mesure la quantité d'anticorps liés par l'antigène. Il a été développé spécifiquement pour détecter et étudier la protéine d'enveloppe du virus du Nil occidental et comment elle est capable de trouver des anticorps spécifiques au virus.

Marqueur enzymatique utilisé pour ELISA

La liste ci-dessous donne les marqueurs enzymatiques les plus courants utilisés dans les tests ELISA, qui permettent de mesurer les résultats du test une fois celui-ci terminé.

  • L'OPD (dihydrochlorure d'o-phénylènediamine) prend une couleur ambrée pour détecter la HRP (peroxydase de raifort), qui est souvent utilisée comme protéine conjuguée.
  • TMB (3,3′,5,5′La couleur de l'acide sulfurique ou de l'acide phosphorique (par exemple, la -tétraméthylbenzidine) devient bleue lors de la détection de l'HRP et jaune après l'ajout d'acide sulfurique ou phosphorique.
  • ABTS (2,2′-L'azinobis [acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique] (sel de diammonium) devient vert lors de la détection du HRP.
  • Le PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, sel disodique) devient jaune lors de la détection de la phosphatase alcaline.