Préparation d'échantillons par ultrasons pour les essais ELISA

Les tests tels que l'ELISA sont largement utilisés pour les diagnostics in vitro, la détection de protéines liées à des maladies et le contrôle de la qualité (par exemple, la surveillance des allergènes alimentaires). La préparation d'échantillons par ultrasons est une technique rapide, fiable et reproductible pour lyser les cellules et isoler les protéines intracellulaires, l'ADN, l'ARN et les organites. Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions ultrasoniques pour la préparation pratique d'échantillons uniques, de flacons multiples ainsi que pour les plaques de microtitration et les plaques à 96 puits.

ELISA – Test d'immuno-absorption lié à l'enzyme (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

ELISA signifie enzyme-linked immunosorbent assay et est une technique d'analyse biochimique largement utilisée dans la catégorie des tests de liaison aux ligands. Dans le test ELISA, un échantillon liquide est ajouté à une phase solide stationnaire ayant des propriétés de liaison particulières. Normalement, la phase solide stationnaire est appliquée comme revêtement sur une plaque à puits ou une plaque ELISA. Ensuite, divers réactifs liquides sont successivement ajoutés, incubés et lavés, de sorte qu'un changement optique (par exemple, le développement de la couleur par le produit d'une réaction enzymatique) se produit dans le liquide final dans le puits. Le changement optique permet de mesurer la quantité de l'analyte par une méthode dite quantitative. “lecture". Pour la lecture quantitative, un spectrophotomètre, un fluoromètre ou un luminomètre est utilisé pour détecter et mesurer l'intensité de la lumière transmise. La sensibilité de la détection est influencée par l'amplification du signal au cours des réactions analytiques. Les réactions enzymatiques étant des processus d'amplification fiables et bien étudiés, des enzymes sont utilisées pour créer le signal. Les enzymes sont liées aux réactifs de détection dans des proportions fixes afin de permettre une quantification précise, ce qui explique également le nom de l'essai immuno-absorbant "lié aux enzymes".
Les tests ELISA étant effectués dans des plaques de microtitration / plaques à 96 puits, il s'agit d'une technique de test basée sur des plaques, utilisée par exemple dans le diagnostic clinique in vitro, la recherche, le développement de médicaments, etc. pour détecter et quantifier des anticorps, des peptides, des protéines et des hormones.
La technique ELISA est fréquemment utilisée comme outil de diagnostic en médecine, en biotechnologie et en phytopathologie. Elle constitue également une mesure importante de contrôle de la qualité dans de nombreuses industries.

Préparation de l'échantillon par ultrasons avant ELISA

Avant que le test ELISA puisse être effectué, les échantillons doivent être préparés par des étapes telles que la lyse cellulaire et l'extraction des protéines intracellulaires, de l'ADN, de l'ARN, etc. L'avantage de la lyse cellulaire et de l'isolement des protéines par ultrasons est sa grande efficacité, sa fiabilité et sa reproductibilité. Tous ces facteurs sont importants pour obtenir des diagnostics et des résultats de recherche de haute qualité.

Protocole de lyse cellulaire pré-ELISA par ultrasons

• Pour les cultures cellulaires : Avant la lyse cellulaire ultrasonique, centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 270 x g dans une microcentrifugeuse. Retirer le surnageant par aspiration et remettre les cellules en suspension dans 30 à 100 μL de tampon RIPA. Ensuite, incuber le culot cellulaire sur la glace pendant 30 min.
• L'échantillon de cellules est maintenant prêt pour la lyse ultrasonique :
  Utiliser un appareil à ultrasons de type sonde (par ex. UP200Ht avec sonde S26d2) ou un appareil ultrasonique multi-échantillons (par exemple VialTweeter pour la sonication simultanée de jusqu'à 10 flacons ou l'UIP400MPT pour les plaques de microtitration / plaques à 96 puits) en fonction de la quantité d'échantillons à préparer.
  Pour la sonication de type sonde d'un seul échantillon, placer les cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml.
• Réglez à l'avance la durée des ultrasons, l'énergie totale absorbée, le mode de cycle et/ou les limites de température dans le menu numérique de l'ultrasonificateur. Cela garantit une sonication et une répétabilité extrêmement fiables.
• Insérer la sonotrode et mettre l'appareil à ultrasons en marche. Déplacer doucement la micro-pointe de la sonde ultrasonique à travers l'échantillon pour soniquer l'échantillon uniformément.
  Pour la plupart des cellules, la lyse ultrasonique est terminée après 2 à 4 cycles de sonication de 10 secondes.
• Après la sonication, retirer la sonotrode de l'échantillon. Les échantillons doivent être incubés sur de la glace pendant 5 minutes. Ensuite, centrifuger à 10 000 x g pendant 20 minutes pour éliminer les débris. Transférer les surnageants dans un nouveau tube de microcentrifugation. Étiqueter les analytes et les conserver à -20°C.
• La sonotrode à ultrasons peut être nettoyée en l'essuyant correctement avec de l'alcool ou en la soniquant dans un bécher rempli d'alcool, par exemple de l'éthanol à 70 %. Toutes les sondes ultrasoniques en titane sont autoclavables.

• Rincer le tissu avec du PBS glacé (0,01M, pH=7,4) pour éliminer complètement l'excès de sang hémolysé.
• Peser le tissu (rein, cœur, poumon, rate, etc.) et le faire macérer en petits morceaux, qui sont homogénéisés dans du PBS. Le volume de PBS nécessaire est lié au poids du tissu. En règle générale, 1 g de tissu nécessite environ 9 ml de PBS. Il est recommandé d'ajouter un inhibiteur de protéase au PBS. (On peut également utiliser un tampon de lyse RIPA ou hypotonique contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase).
• En fonction de la taille du tissu, un court traitement au vortex (environ 1 à 2 minutes par impulsions de 15 secondes) peut être utile pour prétraiter le tissu.
• Montez une micropointe, par exemple S26d2, sur votre appareil à ultrasons. Placer le tube d'échantillonnage avec le tissu dans un bain de glace.
• Soniquer l'échantillon avec votre appareil à ultrasons, par exemple UP200St (amplitude de 80 %) pendant 1 minute en mode pulsé (15 secondes de marche, 15 secondes de pause). Maintenir l'échantillon dans le bain de glace.
• Les homogénats sont ensuite centrifugés pour obtenir des pools spécifiques (cytosolique, nucléaire, mitochondrial ou lysosomal) afin d'enrichir la protéine pour l'analyse. En centrifugeant l'échantillon pendant 5 minutes à 5000×g, le surnageant est récupéré.

Contrôle fiable de la température pendant la sonication

La température est un facteur crucial qui influence le processus et qui est particulièrement important pour le traitement des échantillons biologiques, par exemple pour éviter la dégradation thermique des protéines. Comme toutes les techniques de préparation mécanique des échantillons, la sonication génère de la chaleur. Cependant, la température des échantillons peut être bien contrôlée en utilisant les appareils Hielscher Ultrasonics. Nous vous présentons différentes options pour surveiller et contrôler la température de vos échantillons tout en les préparant avec un ultrasonateur à sonde ou le VialTweeter avant l'analyse.

1. Contrôle de la température de l'échantillon : Tous les processeurs numériques à ultrasons Hielscher sont équipés d'un logiciel intelligent et d'un capteur de température enfichable. Branchez le capteur de température sur l'appareil à ultrasons (par ex, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonicateur pour plaques multi-puits UIP400MTP) et insérez la pointe du capteur de température dans l'un des tubes d'échantillon. Grâce à l'écran tactile numérique coloré, vous pouvez régler dans le menu du processeur ultrasonique une plage de température spécifique pour la sonication de votre échantillon. L'appareil à ultrasons s'arrête automatiquement lorsque la température maximale est atteinte et fait une pause jusqu'à ce que la température de l'échantillon soit ramenée à la valeur inférieure de la température réglée ∆. La sonication reprend ensuite automatiquement. Cette fonction intelligente empêche la dégradation induite par la chaleur.
2. En ce qui concerne l'unité ultrasonique multi-échantillons VialTweeter, le bloc de titane, qui contient les tubes d'échantillonnage, peut être pré-refroidi. Placer le bloc VialTweeter (uniquement la sonotrode sans le transducteur !) dans le réfrigérateur ou le congélateur pour pré-refroidir le bloc de titane permet de retarder l'augmentation de la température de l'échantillon. Si possible, l'échantillon lui-même peut être pré-refroidi également.
3. Utilisez un bain de glace ou de la glace sèche pour refroidir pendant la sonication. Placer le(s) tube(s) à échantillon dans un bain de glace pendant la sonication. Pour le VialTweeter, utilisez un plateau peu profond rempli de glace sèche et placez le VialTweeter sur la glace sèche afin que la chaleur puisse se dissiper rapidement.

Des clients du monde entier utilisent les ultrasons Hielscher de type sonde ainsi que les unités de sonication multi-échantillons VialTweeter et UIP400MTP pour leurs travaux quotidiens de préparation d'échantillons dans les laboratoires de biologie, de biochimie, de médecine et de clinique. Grâce au logiciel intelligent et au contrôle de la température des processeurs Hielscher, la température est contrôlée de manière fiable et la dégradation des échantillons due à la chaleur est évitée. La préparation d'échantillons par ultrasons avec les solutions ultrasoniques Hielscher donne des résultats extrêmement fiables et reproductibles !
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