Lyse par ultrasons d’échantillons de Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster est largement utilisée en laboratoire comme organisme modèle. Par conséquent, des étapes de préparation pré-analytique telles que la lyse, la rupture cellulaire, l’extraction de protéines et le cisaillement de l’ADN d’échantillons de Drosophila melanogaster doivent être fréquemment réalisées. Les dismembrateurs à ultrasons sont fiables et efficaces et peuvent être utilisés pour effectuer facilement diverses tâches telles que la lyse, l’extraction de protéines ou la fragmentation de l’ADN, simplement en ajustant les paramètres du procédé ultrasonore. Les homogénéisateurs à ultrasons sont ainsi des outils flexibles offrant un large éventail d’applications.

Lyse et extraction de protéines par ultrasons

La lyse, la solubilisation cellulaire, l’homogénéisation de tissus et l’extraction de protéines sont des tâches typiques des dismembrateurs à ultrasons dans les laboratoires de biologie. Les dismembrateurs à ultrasons et les désintégrateurs cellulaires sont parfaitement adaptés à l’homogénéisation de tissus animaux, d’insectes (p. ex. Drosophila melanogaster, C. elegans) ou de spécimens végétaux. Les applications subséquentes de l’ultrasonication sont la lyse de suspensions cellulaires et de culots ainsi que l’extraction de protéines intracellulaires.
La lyse et l’extraction de protéines par ultrasons sont des procédés hautement fiables et reproductibles, qui peuvent être réalisés sur la base de protocoles établis. Comme l’intensité du procédé ultrasonore peut être réglée avec exactitude via des paramètres de sonication tels que l’amplitude, le mode cycle / pulsé, la température et le volume d’échantillon, des protocoles une fois éprouvés peuvent être répétés encore et encore avec le même résultat.

Fragmentation de l’ADN et de l’ARN par ultrasons

Après la lyse cellulaire et l’extraction de protéines, une étape couramment requise dans la préparation des échantillons est le cisaillement et la fragmentation de l’ADN, de l’ARN et de la chromatine, p. ex. avant une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). La fragmentation de l’ADN et de l’ARN peut être obtenue de manière fiable en rompant, par des forces physiques, les liaisons covalentes qui maintiennent l’ADN. Avec un cisaillement physique tel que la sonication, les brins d’ADN sont d’abord rompus, puis l’ADN est fragmenté en morceaux plus petits.
La fragmentation de l’ADN par ultrasons est fiable et efficace pour cisailler l’ADN jusqu’à une longueur cible, p. ex. 500bp (paires de bases). Les principaux avantages de la fragmentation de l’ADN par ultrasons incluent le contrôle précis des paramètres et de l’intensité du procédé ultrasonore. Les paramètres du procédé ultrasonore peuvent être ajustés en réglant précisément l’intensité de sonication, les cycles et la durée. Cela permet d’obtenir les tailles d’ADN souhaitées, et la longueur d’ADN ciblée peut être produite et reproduite de manière fiable. Le cisaillement de l’ADN par ultrasons est également idéal pour créer des fragments d’ADN de haut poids moléculaire.

Protocoles de lyse par ultrasons de Drosophila melanogaster

Vous trouverez ci-dessous différents protocoles pour la lyse assistée par ultrasons, l’extraction de protéines et la fragmentation de l’ADN ou de la chromatine d’échantillons de Drosophila.

Lyse par ultrasons pour le test d’immunoprécipitation après réticulation (CLIP)

Le test CLIP a été réalisé comme décrit précédemment, avec quelques modifications. Environ 20 mg d’ovaires de femelles de type sauvage âgées de 0 à 1 jour ont été réticulés aux UV (3 × 2000 μJ/cm2), homogénéisés sur glace dans 1 mL de tampon RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saccharose, 1 mM DTT, 1× Complete Protease Inhibitors sans EDTA, 1 mM PMSF) supplémenté de 300 U de RNAseOUT, puis placés sur glace pendant 30 min. L’homogénat a été soniqué sur glace, à 80% de puissance, cinq fois par salves de 20 s avec une pause de 60 s entre chaque salve, à l’aide du processeur à ultrasons Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) puis centrifugé (16 000 × g pendant 5 min à 4°C). L’extrait soluble a été pré-clarifié avec 20 μl de dynabeads Protein-G pendant 20 min à 4°C. Après prélèvement d’échantillons pour l’immunotransfert et la quantification de l’ARN d’entrée (1%), HP1 a été immunoprécipitée avec l’anticorps anti-HP1 9A9 à partir de 450 μl d’extrait pré-clarifié, par incubation pendant 4 h avec 50 μl de dynabeads Protein-G. Les immunoprécipités ont été lavés 4 fois avec du RCB. Pour éluer les ARN immunoprécipités, les billes culottées ont été bouillies dans 100 μL d’eau UltraPure traitée au DEPC pendant 5 min. 900 μL de réactif Qiazol ont été ajoutés au surnageant récupéré pour la préparation de l’ARN. L’ARN purifié a été utilisé comme matrice pour synthétiser l’ADNc à l’aide d’oligo dT, d’hexamères aléatoires et de la transcriptase inverse SuperScript III, selon le protocole du fabricant.
(Cassale et al. 2019)

Lyse par ultrasons pour le test d’immunoprécipitation de la chromatine

L’immunoprécipitation de la chromatine a été réalisée selon la méthode décrite par Menet, avec des modifications mineures. Environ 20 mg d’ovaires de femelles de type sauvage âgées de 0 à 1 jour ont été homogénéisés dans 1 mL de tampon NEB (10 mM HEPES-Na à pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na à pH 8, 0,5 mM EDTA-Na à pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidine, 0,15 mM spermine, 1× Complete Protease Inhibitors sans EDTA) avec un homogénéisateur / disperseur à immersion pendant 1 min (à 3000 rpm). L’homogénat a été transféré dans un homogénéisateur Dounce en verre pré-refroidi et 15 passages complets ont été effectués avec un pilon serré. Les noyaux libres ont ensuite été centrifugés à 6000xg pendant 10 min à 4°C. Les culots contenant les noyaux ont été remis en suspension dans 1 mL de NEB et centrifugés à 20 000 × g pendant 20 min sur gradient de saccharose (0,65 mL de saccharose 1,6 M dans du NEB, 0,35 mL de saccharose 0,8 M dans du NEB). Le culot a été remis en suspension dans 1 mL de NEB additionné de formaldéhyde à une concentration finale de 1%. Les noyaux ont été réticulés pendant 10 min à température ambiante, et la réaction a été arrêtée par ajout de 1/10 vol de glycine 1,375 M. Les noyaux ont été récupérés par centrifugation à 6000 × g pendant 5 min. Les noyaux ont été lavés deux fois dans 1 mL de NEB et remis en suspension dans 1 mL de tampon de lyse (15 mM HEPES-Na à pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA à pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% désoxycholate de Na, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine et 1× Complete Protease Inhibitors sans EDTA). Les noyaux ont été soniqués à l’aide d’un processeur à ultrasons Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) six fois, 20 s en marche et 1 min sur glace. Les noyaux soniqués ont été centrifugés à 13 000 × g pendant 4 min à 4°C. La majorité de la chromatine soniquée avait une longueur de 500 à 1000 paires de bases (bp). Pour chaque immunoprécipitation, 15 μg de chromatine ont été incubés en présence de 10 μg d’anticorps monoclonal HP1 9A9 (3 h à 4°C sur une roue rotative). Ensuite, 50 μl de dynabeads protein G ont été ajoutés et l’incubation a été poursuivie pendant la nuit à 4°C. Les surnageants ont été éliminés et les échantillons ont été lavés deux fois dans le tampon de lyse (chaque lavage 15 min à 4 °C) et deux fois dans le tampon TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl à pH 8). La chromatine a été éluée des billes en deux étapes ; d’abord dans 100 μl de tampon d’élution 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl à pH 8) à 65°C pendant 15 min, suivie d’une centrifugation et de la récupération du surnageant. Le matériel des billes a été ré-extrait dans 100 μl de TE + 0,67% SDS. L’éluat combiné (200 μl) a été incubé pendant la nuit à 65°C pour inverser les réticulations, puis traité par 50 μg/ml de RNaseA pendant 15 min à 65°C et par 500 μg/ml de protéinase K pendant 3 h à 65°C. Les échantillons ont été extraits au phénol–chloroforme et précipités à l’éthanol. L’ADN a été remis en suspension dans 25 μl d’eau. Afin de maximiser les analyses moléculaires avec l’ADN immunoprécipité, les gènes candidats ont été amplifiés par paires au moyen d’un protocole de PCR duplex optimisé, en utilisant dans une même réaction deux jeux d’amorces différents ayant des températures de fusion similaires.
(Casale et al. 2019)

Désintégrateurs cellulaires à ultrasons haute performance pour échantillons biologiques

Hielscher Ultrasonics est votre partenaire de longue expérience en matière d’ultrasonicateurs haute performance pour la rupture cellulaire, la lyse, l’extraction de protéines, la fragmentation de l’ADN, de l’ARN et de la chromatine ainsi que pour d’autres étapes de préparation pré-analytique des échantillons. Grâce à un portefeuille complet d’homogénéisateurs de laboratoire à ultrasons et d’unités de préparation d’échantillons, Hielscher dispose de l’appareil à ultrasons idéal pour votre application biologique et vos exigences.
L’ultrasonicateur classique de type sonde avec micropointe, tel que le UP200St (200W ; voir photo à gauche), ou l’une des unités de préparation d’échantillons à ultrasons VialTweeter ou UP200ST_TD_CupHorn avec VialHolder sont des modèles plébiscités dans les laboratoires de recherche et d’analyse. La sonde à ultrasons classique est idéale lorsque peu d’échantillons doivent être lysés, extraits ou fragmentés. Les unités de préparation d’échantillons VialTweeter et UP200St_TD_CupHorn permettent la sonication simultanée de respectivement jusqu’à 10 ou 5 flacons.
Si un grand nombre d’échantillons (p. ex. plaques 96 puits, plaques de microtitration, etc.) doit être traité, le UIP400MTP est la configuration de sonication idéale. Le UIP400MTP fonctionne comme un cuphorn de plus grande taille, rempli d’eau et offrant suffisamment d’espace pour accueillir des plaques à micropuits. Alimenté par un puissant processeur à ultrasons de 400 watts, le UIP400MTP assure une sonication très uniforme et intense des plaques multipuits afin de désintégrer les cellules, lyser les échantillons, solubiliser les culots, extraire les protéines ou cisailler l’ADN.

Contrôle précis grâce à un logiciel intelligent

Toutes les solutions de sonication Hielscher à partir de 200 watts sont équipées d’un écran tactile couleur numérique et d’un logiciel intelligent. Grâce à l’enregistrement intelligent des données, tous les paramètres du procédé ultrasonore sont automatiquement sauvegardés sous forme de fichier CSV sur une carte SD intégrée dès que l’ultrasonicateur est mis en marche. La recherche et la documentation des protocoles en deviennent bien plus pratiques. Après les essais de sonication ou la préparation des échantillons, vous pouvez simplement consulter les paramètres de sonication de chaque passage de sonication et les comparer.
Via le menu intuitif, de nombreux paramètres peuvent être prédéfinis avant la sonication : par exemple, pour contrôler la température de l’échantillon et prévenir sa dégradation thermique, une limite supérieure de température de l’échantillon peut être définie. Un capteur de température enfichable, fourni avec l’unité à ultrasons, transmet au processeur à ultrasons un retour sur la température réelle de sonication. Lorsque la limite supérieure de température est atteinte, l’appareil à ultrasons se met en pause jusqu’à ce que la limite inférieure du ∆T défini soit atteinte, puis reprend automatiquement la sonication.
Si une sonication avec un apport d’énergie spécifique est requise, vous pouvez prédéfinir l’énergie ultrasonore finale du passage de sonication. Bien entendu, la pulsation ultrasonore et le mode cycle peuvent également être réglés individuellement.
Pour réutiliser vos paramètres de sonication les plus efficaces, vous pouvez enregistrer divers modes de sonication (p. ex. durée de sonication, intensité, mode cycle, etc.) en tant que modes prédéfinis, afin de pouvoir les relancer facilement et rapidement.
Pour un confort d’utilisation accru, toutes les unités à ultrasons numériques peuvent être commandées à distance via n’importe quel navigateur courant (p. ex. InternetExplorer, Safari, Chrome, etc.). La connexion LAN est une configuration plug-n-play simple et ne nécessite aucune installation de logiciel supplémentaire.
Chez Hielscher, nous savons que la sonication réussie d’échantillons biologiques exige précision et répétabilité. C’est pourquoi nous avons conçu nos ultrasonicateurs comme des appareils intelligents dotés de toutes les fonctionnalités permettant une préparation des échantillons efficace, fiable, reproductible et pratique.

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos systèmes à ultrasons, des micropointes ultrasonores et homogénéisateurs à ultrasons classiques jusqu’aux ultrasonicateurs MultiSample, pour la préparation pratique et fiable de nombreux échantillons :