Drosophila melanogaster est largement utilisée dans les laboratoires comme organisme modèle. Par conséquent, les étapes de préparation pré-analytique telles que la lyse, la désintégration cellulaire, l'extraction des protéines et le cisaillement de l'ADN des échantillons de Drosophila melanogaster doivent être fréquemment effectuées. Les démembreurs à ultrasons sont fiables et efficaces et peuvent être utilisés pour effectuer diverses tâches telles que la lyse, l'extraction de protéines ou la fragmentation de l'ADN en toute simplicité en ajustant uniquement les paramètres du processus ultrasonique. Les homogénéisateurs à ultrasons sont donc des outils flexibles offrant un large éventail d'applications.

Lyse par ultrasons et extraction de protéines

La lyse, la solubilisation des cellules, l'homogénéisation des tissus et l'extraction des protéines sont des tâches typiques des démembreurs ultrasoniques dans les laboratoires biologiques. Les démembreuses et les broyeurs cellulaires à ultrasons sont bien adaptés à l'homogénéisation de tissus animaux, d'insectes (par exemple, Drosophila melanogaster, C. elegans) ou de spécimens végétaux. Les applications ultérieures des ultrasons sont la lyse de suspensions et de granules cellulaires ainsi que l'extraction de protéines intracellulaires.
La lyse ultrasonique et l'extraction de protéines sont des procédés très fiables et reproductibles, qui peuvent être réalisés sur la base de protocoles établis. Comme l'intensité du processus ultrasonore peut être réglée avec précision grâce à des paramètres de sonication tels que l'amplitude, le mode cycle/impulsion, la température et le volume de l'échantillon, des protocoles une fois éprouvés peuvent être répétés à l'infini avec le même résultat.

Fragmentation de l'ADN et de l'ARN par ultrasons

Après la lyse des cellules et l'extraction des protéines, une étape courante requise dans la préparation des échantillons est le cisaillement et la fragmentation de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine, par exemple avant l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). La fragmentation de l'ADN et de l'ARN peut être réalisée de manière fiable en brisant les liens covalents qui maintiennent l'ADN ensemble par des forces physiques. Grâce à un cisaillement physique tel que la sonication, les brins d'ADN sont d'abord brisés, puis l'ADN est fragmenté en plus petits morceaux.
La fragmentation ultrasonique de l'ADN est fiable et efficace pour cisailler l'ADN à une longueur ciblée, par exemple 500 pb (paires de bases). Les principaux avantages de la fragmentation de l'ADN par ultrasons comprennent le contrôle précis des paramètres et de l'intensité du processus ultrasonore. Les paramètres du processus ultrasonore peuvent être ajustés en réglant avec précision l'intensité, les cycles et la durée de la sonication. Il est ainsi possible de créer les tailles d'ADN souhaitées et la longueur d'ADN ciblée peut être produite et reproduite de manière fiable. Le cisaillement de l'ADN par ultrasons est également idéal pour créer des fragments d'ADN de poids moléculaire élevé.

Protocoles pour la lyse ultrasonique de Drosophila melanogaster

Vous trouverez ci-dessous différents protocoles pour la lyse assistée par ultrasons, l'extraction de protéines et la fragmentation de l'ADN ou de la chromatine des échantillons de drosophile.

Lyse ultrasonique pour le test d'immunoprécipitation réticulée (CLIP)

Le test CLIP a été effectué comme indiqué précédemment avec quelques modifications. Environ 20 mg d'ovaires de femelles de type sauvage âgées de 0 à 1 jour ont été réticulés aux UV (3 × 2000 μJ/cm2), homogénéisés sur glace dans 1 ml de tampon RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM de saccharose, 1 mM de TNT, 1× inhibiteurs de protéase complète sans EDTA, 1 mM de PMSF) complété avec 300 U RNAseOUT et placé sur la glace pendant 30 min. L'homogénat a été soniqué sur la glace, à 80 % de sa puissance, cinq fois en 20 s avec un repos de 60 s entre les deux à l'aide du processeur ultrasonique Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) et centrifugé (16000 × g pendant 5 min à 4°C). L'extrait soluble a été pré-clavé avec 20 billes de μl protéine G pendant 20 min à 4°C. Après élimination des échantillons pour l'immunoblotting et la quantification de l'ARN entrant (1 %), la HP1 a été immunoprécipitée avec l'anticorps anti-HP1 9A9 de 450 extraits pré-clavés de μl par incubation pendant 4 h avec 50 dynabées de μl Protein-G. Les immunoprécipités ont été lavés 4 fois avec la RCB. Pour éluer les ARN immunoprécipités, les billes granulées ont été bouillies dans 100 μL d'eau ultrapure traitée au DEPC pendant 5 min. 900 μL Le réactif Qiazol a été ajouté au surnageant récupéré pour la préparation de l'ARN. L'ARN purifié a été utilisé comme modèle pour synthétiser l'ADNc en utilisant l'oligo dT, les hexamères aléatoires et la transcriptase inverse III SuperScript selon le protocole du fabricant.
(Cassale et al. 2019)

Lyse ultrasonique pour le test d'immunoprécipitation de la chromatine

L'immunoprécipitation de la chromatine a été réalisée selon la méthode décrite par Menet avec des modifications mineures. Environ 20 mg d'ovaires de femelles de type sauvage âgées de 0 à 1 jour ont été homogénéisés dans 1 ml de tampon NEB (10 mM HEPES-Na à pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na à pH 8, 0.5 mM EDTA-Na à pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidine, 0,15 mM Spermine, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) avec un homogénéisateur / disperseur à immersion 1 min (à 3000 tr/min). L'homogénat a été transféré dans une douche de verre pré-refroidie et 15 coups complets ont été appliqués avec un pilon étanche. Les noyaux libres ont ensuite été centrifugés à 6000xg pendant 10 min à 4°C. Les pastilles contenant les noyaux ont été remises en suspension dans 1 ml de NEB et centrifugées à 20000 × g pendant 20 min sur un gradient de saccharose (0,65 ml de saccharose 1,6 M dans le NEB, 0,35 ml de saccharose 0,8 M dans le NEB). Le culot a été remis en suspension dans 1 ml de NEB et de formaldéhyde jusqu'à une concentration finale de 1 %. Les noyaux ont été réticulés pendant 10 minutes à température ambiante et trempés en ajoutant 1/10 vol de 1,375 M de glycine. Les noyaux ont été recueillis par centrifugation à 6000 × g pendant 5 min. Les noyaux ont été lavés deux fois dans 1 ml de NEB et remis en suspension dans 1 ml de tampon de lyse (15 mM HEPES-Na à pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA à pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Désoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine et 1× inhibiteurs de protéase complète sans EDTA). Les noyaux ont été soniqués à l'aide d'un processeur ultrasonique Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) six fois pendant 20 s sur et 1 min sur glace. Les noyaux soniqués ont été centrifugés à 13000 × g pendant 4 min à 4°C. La majorité de la chromatine soniquée avait une longueur de 500 à 1000 paires de bases (pb). Pour chaque immunoprécipitation, 15 μg de chromatine ont été incubés en présence de 10 μg d'anticorps monoclonal HP1 9A9 (3 h à 4°C dans une roue rotative). Ensuite, 50 μl de protéine G de dynabeads ont été ajoutés et l'incubation a été poursuivie pendant la nuit à 4°C. Les surnageants ont été jetés et les échantillons ont été lavés deux fois dans du tampon de lyse (chaque lavage 15 min à 4 °C) et deux fois dans du tampon TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl à pH 8). La chromatine a été éluée des billes en deux étapes ; d'abord dans 100 μl de tampon d'élution 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl à pH 8) à 65°C pendant 15 min, puis par centrifugation et récupération du surnageant. La matière des billes a été ré-extraite dans 100 μl de TE + 0,67% SDS. L'éluat combiné (200 μl) a été incubé pendant une nuit à 65°C pour inverser les réticulations et traité par 50 μg/ml de RNaseA pendant 15 min à 65°C et par 500 μg/ml de protéinase K pendant 3 h à 65°C. Les échantillons ont été extraits du phénol-chloroforme et l'éthanol a été précipité. L'ADN a été remis en suspension dans 25 μl d'eau. Pour maximiser les analyses moléculaires avec l'ADN immunoprécipité, les gènes candidats ont été amplifiés par paires grâce à un protocole de PCR duplex optimisé en utilisant deux séries différentes d'amorces ayant des températures de fusion similaires dans une seule réaction.
(Casale et al. 2019)
 

Perturbateurs cellulaires à ultrasons haute performance pour les échantillons biologiques

Hielscher Ultrasons est votre partenaire de longue date en matière d'ultrasons haute performance pour la désintégration cellulaire, la lyse, l'extraction de protéines, la fragmentation de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine ainsi que pour d'autres étapes de préparation d'échantillons pré-analytiques. Proposant une gamme complète d'homogénéisateurs de laboratoire à ultrasons et d'unités de préparation d'échantillons, Hielscher possède l'appareil à ultrasons idéal pour votre application biologique et vos besoins.
Les ultrasons classiques à sonde avec micropointe comme le UP200St (200W ; voir photo de gauche) ou l'une des unités de préparation des échantillons par ultrasons VialTweeter ou UP200St_TD_CupHorn avec VialHolder sont les modèles préférés des laboratoires de recherche et d'analyse. La sonde ultrasonique classique est idéale, lorsque l'on prépare moins d'échantillons qui doivent être lysés, extraits ou fragmentés. Les unités de préparation d'échantillons VialTweeter et UP200St_TD_CupHorn permettent de sonifier simultanément jusqu'à 10 ou 5 flacons, respectivement.
S'il faut traiter un grand nombre d'échantillons (par exemple, des plaques de 96 puits, des plaques de microtitration, etc. UIP400MTP est le dispositif de sonication idéal. L'UIP400MTP fonctionne comme un grand cornet rempli d'eau et dispose de suffisamment d'espace pour contenir des plaques de micropuits. Alimenté par un puissant processeur à ultrasons de 400 watts, l'UIP400MTP délivre une sonication très uniforme et intense des plaques multipuits afin de perturber les cellules, lyser les échantillons, solubiliser les pastilles, extraire les protéines ou cisailler l'ADN.

Un contrôle précis grâce à un logiciel intelligent

Toutes les solutions de sonorisation Hielscher à partir de 200 watts sont équipées d'un écran tactile couleur numérique et d'un logiciel intelligent. Grâce au protocole de données intelligent, tous les paramètres du processus ultrasonore sont automatiquement enregistrés en fichier CSV sur une carte SD intégrée dès que l'ultrasonateur est mis en marche. Cela rend la recherche et l'établissement de protocoles beaucoup plus pratiques. Après les essais de sonication ou la préparation des échantillons, vous pouvez simplement passer en revue les paramètres de chaque sonication et les comparer.
Grâce au menu intuitif, de nombreux paramètres peuvent être préréglés avant la sonication : Par exemple, pour contrôler la température de l'échantillon et empêcher sa dégradation thermique, une limite supérieure de température de l'échantillon peut être définie. Un capteur de température enfichable, fourni avec l'appareil à ultrasons, donne au processeur à ultrasons un retour d'information sur la température réelle de la sonication. Lorsque la limite supérieure de température est atteinte, l'appareil à ultrasons fait une pause jusqu'à ce que la limite inférieure de l'ensemble ∆T soit atteinte et recommence alors à sonner automatiquement.
Si une sonication avec un apport d'énergie spécifique est nécessaire, vous pouvez prérégler l'énergie ultrasonique finale de la sonication. Bien entendu, la pulsation ultrasonore et le mode de cycle peuvent également être réglés individuellement.
Pour réutiliser vos paramètres de sonication les plus performants, vous pouvez enregistrer différents modes de sonication (par exemple, la durée de sonication, l'intensité, le mode de cycle, etc.) comme modes préréglés, afin de pouvoir les relancer facilement et rapidement.
Pour un plus grand confort d'utilisation, tous les appareils numériques à ultrasons peuvent être commandés par une télécommande de navigateur dans n'importe quel navigateur courant (par exemple, InternetExplorer, Safari, Chrome, etc.). La connexion LAN est une simple installation plug-n-play et ne nécessite aucune installation de logiciel supplémentaire.
Chez Hielscher, nous savons que la réussite de la sonication d'échantillons biologiques exige précision et répétabilité. C'est pourquoi nous avons conçu nos ultrasonateurs comme des appareils intelligents dotés de toutes les caractéristiques permettant une préparation efficace, fiable, reproductible et pratique des échantillons.

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos systèmes à ultrasons, depuis les micropointes à ultrasons et les homogénéisateurs à ultrasons classiques jusqu'aux ultrasonateurs MultiSample pour la préparation pratique et fiable de nombreux échantillons :