Lyse ultrasonique d'échantillons de Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster est largement utilisée en laboratoire comme organisme modèle. Par conséquent, les étapes de préparation pré-analytique telles que la lyse, la désintégration des cellules, l'extraction des protéines et le cisaillement de l'ADN des échantillons de Drosophila melanogaster doivent être fréquemment effectuées. Les démembreurs ultrasoniques sont fiables et efficaces et peuvent être utilisés pour effectuer diverses tâches telles que la lyse, l'extraction de protéines ou la fragmentation de l'ADN en ajustant simplement les paramètres du processus ultrasonique. Les homogénéisateurs à ultrasons sont donc des outils flexibles avec une large gamme d'applications.

Lyse ultrasonique et extraction des protéines

La lyse, la solubilisation des cellules, l'homogénéisation des tissus et l'extraction des protéines sont des tâches typiques des démembreurs à ultrasons dans les laboratoires de biologie. Les démembreurs à ultrasons et les broyeurs de cellules sont bien adaptés à l'homogénéisation des tissus animaux, des insectes (par exemple, Drosophila melanogaster, C. elegans) ou des spécimens de plantes. Les applications ultérieures de l'ultrasonication sont la lyse des suspensions et des culots cellulaires ainsi que l'extraction des protéines intracellulaires.
La lyse ultrasonique et l'extraction de protéines sont des processus hautement fiables et reproductibles, qui peuvent être réalisés sur la base de protocoles établis. L'intensité du processus ultrasonique pouvant être réglée avec précision grâce aux paramètres de sonication tels que l'amplitude, le cycle/mode d'impulsion, la température et le volume de l'échantillon, les protocoles éprouvés peuvent être répétés à l'infini avec le même résultat.

Fragmentation ultrasonique de l'ADN et de l'ARN

Après la lyse cellulaire et l'extraction des protéines, une étape courante de la préparation des échantillons est le cisaillement et la fragmentation de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine, par exemple avant l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). La fragmentation de l'ADN et de l'ARN peut être réalisée de manière fiable en brisant les liaisons covalentes qui maintiennent l'ADN ensemble par des forces physiques. En utilisant un cisaillement physique tel que la sonication, les brins d'ADN sont d'abord cassés, puis l'ADN est fragmenté en plus petits morceaux.
La fragmentation ultrasonique de l'ADN est fiable et efficace pour cisailler l'ADN à une longueur ciblée, par exemple 500 pb (paires de bases). Les principaux avantages de la fragmentation ultrasonique de l'ADN comprennent le contrôle précis des paramètres et de l'intensité du processus ultrasonique. Les paramètres du processus ultrasonique peuvent être ajustés en réglant précisément l'intensité, les cycles et la durée de la sonication. Il est ainsi possible de créer les tailles d'ADN souhaitées et la longueur d'ADN ciblée peut être produite et reproduite de manière fiable. Le cisaillement de l'ADN par ultrasons est également idéal pour créer des fragments d'ADN de poids moléculaire élevé.

Protocoles pour la lyse ultrasonique de Drosophila melanogaster

Vous trouverez ci-dessous différents protocoles pour la lyse assistée par ultrasons, l'extraction de protéines et la fragmentation de l'ADN ou de la chromatine d'échantillons de drosophile.

Lyse ultrasonique pour l'essai d'immunoprécipitation par réticulation (CLIP)

Le test CLIP a été réalisé comme indiqué précédemment avec quelques modifications. Environ 20 mg d'ovaires de femelles de type sauvage âgées de 0 à 1 jour ont été réticulés aux UV (3 × 2000 μJ/cm2), homogénéisés sur glace dans 1 mL de tampon RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0,1 % Triton X-100, 250 mM de saccharose, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) additionné de 300 U RNAseOUT et placé sur la glace pendant 30 min. L'homogénat a été soniqué sur de la glace, à une puissance de 80 %, cinq fois en rafales de 20 secondes avec un repos de 60 secondes entre les deux à l'aide du Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) et centrifugé (16000 × g pendant 5 min à 4°C). L'extrait soluble a été pré-nettoyé avec 20 μl de dynabeads Protein-G pendant 20 min à 4°C. Après élimination des échantillons pour l'immunoblotting et la quantification de l'apport en ARN (1 %), HP1 a été immunoprécipité avec l'anticorps anti-HP1 9A9 à partir de 450 μl d'extrait pré-nettoyé par incubation pendant 4 h avec 50 μl de Protein-G dynabeads. Les immunoprécipités ont été lavés 4 fois avec du RCB. Pour éluer les ARN immunoprécipités, les billes culbutées ont été bouillies dans 100 μL d'eau ultra-pure traitée au DEPC pendant 5 min. 900 μL de réactif Qiazol ont été ajoutés au surnageant récupéré pour la préparation de l'ARN. L'ARN purifié a été utilisé comme modèle pour synthétiser l'ADNc à l'aide d'oligo dT, d'hexamères aléatoires et de la transcriptase inverse SuperScript III selon le protocole du fabricant.
(Cassale et al. 2019)

Lyse ultrasonique pour l'essai d'immunoprécipitation de la chromatine

L'immunoprécipitation de la chromatine a été réalisée selon la méthode décrite par Menet avec des modifications mineures. Environ 20 mg d'ovaires de femelles de type sauvage âgées de 0 à 1 jour ont été homogénéisés dans 1 ml de tampon NEB (10 mM HEPES-Na à pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na à pH 8, 0.5 mM EDTA-Na à pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidine, 0,15 mM Spermine, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) avec un homogénéisateur / disperseur à immersion 1 min (à 3000 rpm). L'homogénat a été transféré dans une louche en verre pré-réfrigérée et 15 coups complets ont été appliqués avec un pilon serré. Les noyaux libres ont ensuite été centrifugés à 6000xg pendant 10 minutes à 4°C. Les culots contenant les noyaux ont été remis en suspension dans 1 ml de NEB et centrifugés à 20000 × g pendant 20 min sur un gradient de saccharose (0,65 ml de saccharose 1,6 M dans NEB, 0,35 ml de saccharose 0,8 M dans NEB). Le culot a été remis en suspension dans 1 ml de NEB et de formaldéhyde à une concentration finale de 1 %. Les noyaux ont été réticulés pendant 10 minutes à température ambiante et refroidis par l'ajout de 1/10 vol de glycine 1,375 M. Les noyaux ont été recueillis par centrifugation. Les noyaux ont été collectés par centrifugation à 6000 × g pendant 5 minutes. Les noyaux ont été lavés deux fois dans 1 ml de NEB et remis en suspension dans 1 ml de tampon de lyse (15 mM HEPES-Na à pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA à pH 8, 1 % Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1 % Na Deoxycholate, 0,1 % SDS, 0,5 % N-lauroylsarcosine et 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors). Les noyaux ont été soniqués à l'aide d'un processeur ultrasonique Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) six fois pendant 20 s sur et 1 min sur glace. Les noyaux soniqués ont été centrifugés à 13 000 × g pendant 4 minutes à 4 °C. La majorité de la chromatine soniquée avait une longueur de 500 à 1000 paires de bases (pb). Pour chaque immunoprécipitation, 15 μg de chromatine ont été incubés en présence de 10 μg d'anticorps monoclonal HP1 9A9 (3 h à 4°C dans une roue rotative). Ensuite, 50 μl de dynabeads protéine G ont été ajoutés et l'incubation s'est poursuivie toute la nuit à 4°C. Les surnageants ont été jetés et les échantillons ont été lavés deux fois dans du tampon de lyse (chaque lavage 15 min à 4 °C) et deux fois dans du tampon TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl à pH 8). La chromatine a été éluée des billes en deux étapes ; d'abord dans 100 μl de tampon d'élution 1 (10 mM EDTA, 1 % SDS, 50 mM TrisHCl à pH 8) à 65 °C pendant 15 min, suivi d'une centrifugation et d'une récupération du surnageant. Le matériel des billes a été réextrait dans 100 μl de TE + 0,67 % de SDS. L'éluat combiné (200 μl) a été incubé pendant une nuit à 65°C pour inverser les liaisons croisées et traité par 50 μg/ml de RNaseA pendant 15 min à 65°C et par 500 μg/ml de protéinase K pendant 3 h à 65°C. Les échantillons ont été extraits au phénol-chloroforme et précipités à l'éthanol. L'ADN a été remis en suspension dans 25 μl d'eau. Pour maximiser les analyses moléculaires avec l'ADN immunoprécipité, les gènes candidats ont été amplifiés par paires grâce à un protocole optimisé de duplex-PCR en utilisant deux ensembles différents d'amorces ayant des températures de fusion similaires dans une seule réaction.
(Casale et al. 2019)
 

Perturbateurs cellulaires ultrasoniques à haute performance pour les échantillons biologiques

Hielscher Ultrasonics est votre partenaire expérimenté lorsqu'il s'agit d'ultrasons de haute performance pour la désintégration cellulaire, la lyse, l'extraction de protéines, la fragmentation de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine, ainsi que d'autres étapes de préparation d'échantillons pré-analytiques. Avec une gamme complète d'homogénéisateurs de laboratoire à ultrasons et d'unités de préparation d'échantillons, Hielscher dispose de l'appareil à ultrasons idéal pour votre application biologique et vos exigences.
Ultrasons classiques de type sonde avec micro-pointe, tels que le UP200St (200W ; voir photo à gauche) ou l'une des unités de préparation d'échantillons par ultrasons VialTweeter ou UP200ST_TD_CupHorn avec VialHolder sont les modèles préférés des laboratoires de recherche et d'analyse. La sonde à ultrasons classique est idéale lorsque peu d'échantillons doivent être lysés, extraits ou fragmentés. Les unités de préparation d'échantillons VialTweeter et UP200St_TD_CupHorn permettent de sonifier simultanément jusqu'à 10 ou 5 flacons, respectivement.
Si un grand nombre d'échantillons (par exemple, des plaques à 96 puits, des plaques de microtitration, etc. UIP400MTP est l'installation de sonication idéale. L'UIP400MTP fonctionne comme un cornet plus grand, rempli d'eau et suffisamment spacieux pour contenir des plaques à micropuits. Alimenté par un puissant processeur ultrasonique de 400 watts, l'UIP400MTP permet une sonication très uniforme et intense des plaques multi-puits afin de perturber les cellules, lyser les échantillons, solubiliser les pastilles, extraire les protéines ou cisailler l'ADN.

Contrôle précis grâce à un logiciel intelligent

Toutes les solutions de sonification Hielscher à partir de 200 watts sont équipées d'un écran tactile couleur numérique et d'un logiciel intelligent. Grâce au protocole de données intelligent, tous les paramètres du processus ultrasonique sont automatiquement enregistrés sous forme de fichier CSV sur une carte SD intégrée dès que l'appareil à ultrasons est mis en marche. Cela rend la recherche et l'établissement de protocoles beaucoup plus pratiques. Après les essais de sonication ou la préparation des échantillons, vous pouvez simplement revoir les paramètres de sonication de chaque cycle de sonication et les comparer.
Le menu intuitif permet de prérégler de nombreux paramètres avant la sonication : Par exemple, pour contrôler la température de l'échantillon et éviter sa dégradation thermique, une limite supérieure de température de l'échantillon peut être fixée. Un capteur de température enfichable, fourni avec l'appareil à ultrasons, donne au processeur ultrasonique un retour d'information sur la température réelle de la sonication. Lorsque la limite supérieure de température est atteinte, l'appareil à ultrasons fait une pause jusqu'à ce que la limite inférieure du ∆T réglé soit atteinte et recommence alors automatiquement la sonification.
Si une sonication avec un apport d'énergie spécifique est requise, vous pouvez prérégler l'énergie ultrasonique finale de la sonication. Bien entendu, la pulsation ultrasonique et le mode de cycle peuvent également être réglés individuellement.
Pour réutiliser vos paramètres de sonication les plus performants, vous pouvez enregistrer différents modes de sonication (par exemple, le temps de sonication, l'intensité, le mode de cycle, etc.) en tant que modes préréglés, afin de pouvoir les relancer facilement et rapidement.
Pour plus de commodité, tous les appareils numériques à ultrasons peuvent être commandés à distance à l'aide d'un navigateur courant (par exemple, InternetExplorer, Safari, Chrome, etc.). La connexion au réseau local est une simple configuration "plug-n-play" et ne nécessite aucune installation de logiciel supplémentaire.
Chez Hielscher, nous savons que la sonication réussie d'échantillons biologiques exige précision et répétabilité. C'est pourquoi nous avons conçu nos ultrasons comme des appareils intelligents dotés de toutes les fonctions permettant une préparation efficace, fiable, reproductible et pratique des échantillons.

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos systèmes ultrasoniques, depuis les micro-pointes ultrasoniques et les homogénéisateurs ultrasoniques classiques jusqu'aux ultrasons MultiSample pour la préparation pratique et fiable de nombreux échantillons :