Préparation par ultrasons d’échantillons de C. elegans

C. elegans, un ver nématode, est un organisme modèle largement utilisé en biologie. La préparation des échantillons avant analyse nécessite la lyse, l’extraction des protéines et des lipides ainsi que la fragmentation de l’ARN, qui peuvent être réalisées de manière fiable par sonication. Les disrupteurs cellulaires à ultrasons sont des appareils fiables, sophistiqués et faciles à utiliser pour la préparation rapide d’échantillons de C. elegans.

Préparation par ultrasons d’échantillons de C. elegans

C. elegans sont des vers ronds largement utilisés dans les laboratoires de recherche pour étudier la génomique, la biologie du développement et les maladies. De nombreux gènes du génome de C. elegans ont des équivalents fonctionnels chez l’homme. Ce ver nématode constitue ainsi un modèle extrêmement utile pour les maladies humaines. D’autres avantages expliquent la large utilisation de C. elegans : sa culture facile et peu coûteuse sur des plaques contenant des bactéries (p. ex. E. coli), sa transparence, sa manipulation pratique, ainsi que la possibilité de congeler et de conserver les vers pendant une période prolongée.
L’analyse des protéines et des lipides est une procédure courante dans les laboratoires, et la préparation d’échantillons par ultrasons est la méthode établie pour lyser les nématodes C. elegans à tous les stades de développement (c.-à-d. embryons, larves L1–L4, adultes). Étant donné que C. elegans est également utilisé comme système d’expression protéique pour surexprimer des protéines ciblées, une méthode de lyse et d’extraction des protéines fiable et reproductible, offrant des rendements protéiques élevés, est nécessaire. Les systèmes de disruption cellulaire et d’extraction par ultrasons sont disponibles sous forme d’homogénéisateurs de type sonde et d’appareils à ultrasons multi-échantillons. Pour une préparation pratique des échantillons et pour toutes les tailles et tous les nombres d’échantillons, Hielscher Ultrasonics dispose du disrupteur cellulaire à ultrasons idéal pour votre procédure de laboratoire.

Protocoles par ultrasons pour la disruption et la lyse de C. elegans

L’homogénéisation et la lyse de C. elegans par ultrasons, ainsi que l’extraction ultérieure des protéines et des lipides, peuvent être réalisées selon diverses procédures, avec différents tampons d’homogénéisation et de lyse, etc. Tous les protocoles de lyse ont en commun le fait que les échantillons doivent être maintenus en permanence sur glace afin d’éviter la dégradation des protéines. Nous vous présentons ci-dessous quelques protocoles de lyse et d’extraction par ultrasons fiables et rapides pour la préparation d’échantillons de C. elegans de haute qualité contenant des protéines ou des lipides.

Avantages de la lyse de C. elegans par ultrasons

• fiable
• reproductible
• à température contrôlée avec précision
• contrôle fiable du procédé
• méthode douce
• facile à mettre en œuvre
• sûr

Extraction des protéines d’échantillons de C. elegans par ultrasons

La lyse et l’extraction des protéines de vers C. elegans par ultrasons peuvent être réalisées selon divers protocoles. Nous vous présentons ci-dessous quelques protocoles de lyse fiables et rapides permettant d’obtenir des résultats d’extraction des protéines reproductibles.

Préparation rapide d’extrait cytosolique de vers C. elegans par sonication

Avec le protocole suivant, vous pouvez préparer des lysats de C. elegans en moins de 30 minutes.
Collecte de C. elegans
Prélevez les vers C. elegans souhaités dans un tube de 1,5ml contenant du tampon phosphate salin (PBS) ou rincez-les d’une plaque avec 1,5ml de PBS. Centrifugez pendant 1min à 2000rpm pour former un culot. Maintenez les échantillons en permanence sur glace.
Lavez ensuite les vers deux fois avec du PBS.
Puis lavez les vers deux fois avec du ddH₂O.
Resuspendez les vers dans au moins 500ul de tampon d’homogénéisation (HB). Les échantillons de vers sont maintenant prêts pour la lyse par ultrasons.
Pour une meilleure qualité de l’extrait protéique, vous pouvez réduire la contamination bactérienne en lavant les vers pendant 5min chacun dans du PBS et dans de l’eau stérile ultra-pure (ddH₂O) ou effectuer une flottation sur saccharose. Maintenez les échantillons de vers en permanence sur glace.

Protocole de lyse de C. elegans par ultrasons

• Veillez à préparer l’appareil à ultrasons à l’avance afin que l’homogénéisateur à ultrasons soit prêt à l’emploi (sonde montée, programme de sonication préréglé). 

Si votre appareil à ultrasons est monté sur statif, placez le bain de glace contenant vos tubes d’échantillons sous la sonde à ultrasons et insérez la sonde à ultrasons dans le tube de 1,5ml.

• Pour la lyse de C. elegans avec l’UP200St ou l’UP200Ht, la sonication doit être réalisée à l’aide d’une micro-pointe (p. ex. sonde de 2mm S26d2 ; voir l’image à gauche) à 40% d’amplitude pendant 1sec, avec des pauses de 30sec entre les impulsions. 5 cycles de sonication de 1 seconde chacun avec des pauses de 30sec sont idéaux pour la lyse de C. elegans. Si vous effectuez la lyse pour la première fois, vous pouvez vérifier la progression de la lyse au microscope sur de petites aliquotes de l’échantillon après chaque impulsion.
• La lyse est terminée avec succès lorsque les vers sont désintégrés. Une sonication excessive entraîne la rupture des noyaux et devient visible lorsque l’échantillon devient visqueux ou mousse. Pour éviter la dégradation de l’échantillon, utilisez davantage d’impulsions si nécessaire. N’augmentez pas la durée de chaque cycle d’impulsion ultrasonore, afin d’obtenir des extraits protéiques de haute qualité.
• Clarifiez le lysat cellulaire en centrifugeant les vers lysés par ultrasons à 14 000rpm pendant 10min à 4ºC.
• Transférez ensuite le surnageant dans un tube neuf et préparez-le pour l’immunoprécipitation ou d’autres essais.

Remarque concernant le tampon d’homogénéisation : préparez le tampon d’homogénéisation pour le protocole de lyse par ultrasons ci-dessus comme suit :

Lyse à haute cadence de C. elegans en plaques 96 puits avec le sonicateur pour plaques UIP400MTP

Lyse de C. elegans (nématodes adultes)
UIP400MTP 80% d’amplitude, 20 cycles (chaque cycle de sonication : 30 sec ON, 30 sec OFF)
Tampon de lyse :

• Option 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Option 2) pour la co-immunoprécipitation (co-IP) : 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (cocktail complet d’inhibiteurs de protéinases)

Fragmentation de l’ADN à haute cadence
C. elegans (nématodes adultes) ADN 200–300bp : sonicateur pour plaques UIP400MTP – régler 80% d’amplitude, 30 impulsions – chacune 30sec on, 30sec off

Le sonicateur pour plaques UIP400MTP pour la préparation d’échantillons à haute cadence sonique uniformément les échantillons dans les plaques multipuits, les plaques de microtitration et les plaques 96 puits

Lyse de C. elegans par ultrasons pour des essais quantitatifs de purification par affinité

Des embryons de C. elegans (∼2 millions par réplicat) ont été fraîchement récoltés en triplicat biologique par blanchiment de jeunes hermaphrodites gravides et soniqués sur glace (cycle : 0,5 s, amplitude : 40–45%, 5 coups/session, 5 sessions, intervalle entre les sessions : 30 s ; processeur à ultrasons UP200S avec micro-pointe S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) dans un tampon de lyse (volume total : ∼600 μl ; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycérol, mélange d’inhibiteurs de protéases, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Après la sonication, du Nonidet P-40 Substitute a été ajouté jusqu’à 1% et les lysats ont été incubés sous rotation tête-bêche à 4°C pendant 30 min, puis centrifugés à 20 000 × g pendant 20 min à 4°C. Le lysat clarifié a ensuite été aspiré sans perturber la couche lipidique supérieure et réparti par moitié soit sur les billes d’agarose anti-GFP, soit sur les billes de contrôle bloquées (40–50 μl). Après rotation tête-bêche à 4°C pendant 60–90 min, les billes ont été lavées une fois avec du tampon de lyse contenant 0,1% de Nonidet P-40 Substitute, puis lavées deux fois soit dans le tampon I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), soit dans le tampon II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), soit dans les deux. Pour les pull-downs GFP:MBK-2, deux expériences distinctes ont été réalisées avec des conditions de lavage différentes. Les protéines ont été éluées par agitation orbitale dans 50 μl de 6 m urée/2 M thiourée à température ambiante. Pour les expériences de pull-down MBK-1::GFP, les protéines ont été éluées deux fois par agitation dans 50μl de 8 m chlorure de guanidinium à 90°C, puis précipitées à l’éthanol. Les échantillons protéiques élués ont ensuite été digérés en solution.
(cf. Chen et al., 2016)

Homogénéisation et lyse des vers par ultrasons

Pour la procédure de lyse et d’extraction des protéines de C. elegans, 30 000 nématodes du stade concerné ont été collectés par échantillon et lavés dans du S-basal glacé, concentrés par centrifugation à 1500 rpm pendant 2 min., lavés six fois avec du S-basal glacé pour éliminer les bactéries résiduelles, puis conservés sur glace jusqu’à utilisation. Pour l’extraction des protéines, on a laissé les vers adultes gravides former un culot compact après le dernier lavage au S-basal. Les culots de vers ont ensuite été resuspendus dans 1 ml de tampon d’extraction glacé [20 mM phosphate de potassium, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibiteurs de protéases (Sigma P2714)] et traités immédiatement.
∼30 000 vers adultes gravides (correspondant à ∼100 mg de poids humide) ont été soniqués sur glace à l’aide d’un appareil à ultrasons de type sonde (p. ex. UP50H avec micro-pointe MS2) à 40% d’amplitude pendant 10 cycles de 3 sec on, 30 sec off, dans 1 ml de tampon d’extraction glacé. (cf. Baskharan et al. 2012)

Extraction des lipides de C. elegans par ultrasons

En lipidomique, une branche de la métabolomique, l’ensemble des lipides des systèmes biologiques est caractérisé et analysé. C. elegans est largement utilisé en lipidomique pour étudier l’interaction des lipides métaboliques et leurs effets sur la santé et la durée de vie.
La lyse et l’extraction par ultrasons sont utilisées pour libérer des lipides tels que les sphingolipides à partir d’embryons, de larves et de vers adultes de C. elegans. La sonication est utilisée pour préparer des homogénats de vers, puis pour extraire les lipides de l’échantillon.
Protocole d’extraction des lipides de C. elegans par ultrasons
Décongelez le culot de C. elegans sur glace et resuspendez-le dans 0,5 ml d’ultrawater. Soniquez les échantillons de C. elegans dans des tubes à essai de 1,5mL, en maintenant les échantillons en permanence sur glace.
La sonication peut être réalisée à l’aide d’un appareil à ultrasons de type sonde tel que l’appareil UP200Ht, l’unité de préparation d’échantillons à ultrasons VialTweeter (sonication simultanée de 10 échantillons) ou le UIP400MTP (pour la sonication de plaques multipuits telles que les plaques 96 puits). Pour la lyse par ultrasons avec l’UP200Ht, utilisez la micro-pointe S26d2. Préréglez le mode cycle ultrasonore dans le menu numérique. Réglez l’amplitude sur 10% et le mode cycle de sonication sur des impulsions de 2 sec, 20 cycles, avec une pause de 30 sec. entre chaque salve d’impulsions ultrasonores.
Transférez les surnageants dans des tubes en verre à bouchon vissé. Effectuez une extraction de Folch en ajoutant 1 ml d’ultrawater dans chaque tube en verre, puis 6 ml de mélange chloroforme/méthanol (rapport = 2:1) dans chaque tube en verre.
Vortexez chaque tube en verre pendant 30 sec, 4 fois. Centrifugez les tubes à 1 258 x g pendant 15 min (Eppendorf, 5810 R) pour améliorer encore la séparation des phases. Transférez la fraction hydrophobe inférieure dans un tube en verre propre à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Séchez la fraction hydrophobe inférieure sous flux d’azote dans un évaporateur à azote. Conservez le culot séché dans un congélateur à -80 °C jusqu’à utilisation. 


Préparation de lysats de vers par ultrasons

Lysat de vers : des vers au stade L4 ont été récoltés et lavés trois fois avec du tampon M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl et 0,87 mM MgSO₄) afin d’éliminer toutes les bactéries. Après avoir retiré autant de tampon M9 que possible, les vers ont été resuspendus dans un tampon de lyse : 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM phosphate β-glycérol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorure de sodium, 1 mM orthovanadate de sodium, 5 mM pyrophosphate de sodium, 0,2 mM fluorure de phénylméthanesulfonyle et inhibiteur de protéases. Les vers ont été congelés dans l’azote liquide et décongelés à 37°C à trois reprises, puis soniqués sur glace carbonique avec une unité VialTweeter à ultrasons pour la préparation simultanée de 10 tubes d’échantillons. La sonication a été réalisée à 50% d’amplitude en 10 cycles de 2 sec. avec une pause de 30 sec entre les salves de sonication. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 12 000 rpm à 4°C pendant 15 min. Le surnageant a été recueilli et conservé à -70°C. Une aliquote a été utilisée pour la quantification des protéines par dosage de Bradford.
Détermination du glutathion total, du GSH et du GSSG : pour la quantification du glutathion, les lysats et la détermination ont été réalisés le même jour. Des larves L4, nourries au glucose ou témoins, ont été récoltées et lavées trois fois avec du tampon M9. Après avoir retiré autant de tampon M9 que possible, les vers ont été resuspendus dans de l’acide métaphosphorique glacé (5% w/v), puis soniqués dans la glace avec un VialTweeter à ultrasons à 50% d’amplitude en dix cycles de sonication de 2 sec. avec une pause de 30 sec. entre chaque cycle. Ensuite, centrifugation à 12 000 rpm à 4 ̊C pendant 15 min.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Préparation des échantillons de C. elegans avant l’immunoprécipitation et le Western blot

En bref, pour les extraits embryonnaires, des larves L1 de C. elegans ont été cultivées jusqu’à l’âge adulte dans des cultures liquides à grande échelle en milieu S. Les embryons ont été recueillis selon la méthode standard au blanchiment et mis en suspension dans un tampon de lyse (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glycérol, 0,05% NP-40, 1􏰅 cocktail d’inhibiteurs de protéases et 1􏰅 cocktail d’inhibiteurs de phosphatases I et II), rapidement congelés dans l’azote liquide et lysés par disruption cellulaire par ultrasons à l’aide d’un appareil à ultrasons équipé d’une micro-pointe, tel que l’appareil UP200Ht avec S26d2, pendant 10 impulsions sur 10 s à 30% d’amplitude. Si un plus grand nombre d’échantillons doit être préparé, l’unité à ultrasons VialTweeter ou l’appareil à ultrasons multi-échantillons UIP400MTP pour plaques à puits sont recommandés. Après la sonication, les extraits ont été préclarifiés par centrifugation à 30 000g pendant 20 min à 4°C. L’extrait préclarifié (300µg de protéines totales) a été incubé avec 40µ􏰂g d’anticorps anti-CDC-25.1 purifié par affinité (cette étude) réticulé à la protéine A-agarose ou, comme contrôle, une quantité similaire d’immunoglobuline (Ig)G de lapin réticulée à la protéine A-agarose a été utilisée, dans un volume total de 200µl de tampon de lyse contenant 1% de NP-40, dont l’ajout réduisait la liaison non spécifique des protéines à la matrice. Les échantillons ont été mis en rotation pendant 1 h à 4°C, les billes ont été lavées trois fois avec du tampon de lyse et éluées avec 30µl de glycine/HCl et 200 mM NaCl, pH 2,2. Après l’immunoprécipitation, les éluats ont été dilués dans 30µ􏰂l de tampon d’échantillon SDS, chauffés à 95°C pendant 4 min, et typiquement 3% du total pour l’input et 30% pour les éluats ont été déposés en SDS-PAGE, suivie d’un Western blot avec des anticorps anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitine (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) ou anti-􏰁β-actine (1:2000). Lorsque les extraits n’ont pas été soumis à une immunoprécipitation, la même quantité de protéines totales issue de ces extraits a été resuspendue dans du tampon d’échantillon SDS, chauffée à 95°C, puis directement déposée en SDS-PAGE et analysée par Western blot. (cf. Segref et al. 2020)

Lyse par ultrasons sous contrôle précis de la température

Un contrôle précis et fiable de la température est essentiel lors de la manipulation d’échantillons biologiques. Des températures élevées déclenchent une dégradation thermique des protéines dans les échantillons.
Comme toutes les techniques mécaniques de préparation d’échantillons, la sonication génère de la chaleur. Toutefois, la température des échantillons peut être bien contrôlée avec le VialTweeter. Nous vous présentons différentes options pour surveiller et contrôler la température de vos échantillons pendant leur préparation pour l’analyse avec le VialTweeter et le VialPress.

1. Surveillance de la température de l’échantillon : le processeur à ultrasons UP200St, qui alimente le VialTweeter, est équipé d’un logiciel intelligent et d’un capteur de température enfichable. Branchez le capteur de température sur l’UP200St et insérez la pointe du capteur de température dans l’un des tubes d’échantillons. Via l’écran tactile numérique couleur, vous pouvez définir dans le menu de l’UP200St une plage de température spécifique pour la sonication de votre échantillon. L’appareil à ultrasons s’arrête automatiquement lorsque la température maximale est atteinte et reste en pause jusqu’à ce que la température de l’échantillon redescende à la valeur inférieure du ∆ de température défini. La sonication redémarre alors automatiquement. Cette fonction intelligente empêche la dégradation induite par la chaleur.
2. Le bloc VialTweeter peut être pré-refroidi. Placer le bloc VialTweeter (uniquement la sonotrode, sans transducteur !) au réfrigérateur ou au congélateur pour pré-refroidir le bloc en titane permet de retarder la hausse de température dans l’échantillon. Si possible, l’échantillon lui-même peut aussi être pré-refroidi.
3. Utilisez de la glace carbonique pour refroidir pendant la sonication. Utilisez un bac peu profond rempli de glace carbonique et placez le VialTweeter sur la glace carbonique afin que la chaleur puisse se dissiper rapidement.

Trouvez le disrupteur cellulaire à ultrasons optimal pour votre application de lyse

Hielscher Ultrasonics est un fabricant de longue expérience de disrupteurs cellulaires et d’homogénéisateurs à ultrasons haute performance pour les laboratoires, ainsi que de systèmes de paillasse et à l’échelle industrielle. La taille de votre culture de cellules bactériennes, votre objectif de recherche ou de production et le volume de cellules à traiter par heure ou par jour sont des facteurs essentiels pour trouver le disrupteur cellulaire à ultrasons adapté à votre application.
Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions pour la sonication simultanée de plusieurs échantillons (jusqu’à 10 flacons) ainsi que d’échantillons en grand nombre (c.-à-d. plaques de microtitration / plaques 96 puits), de l’appareil à ultrasons de laboratoire classique de type sonde, avec différents niveaux de puissance de 50 à 400 watts, jusqu’aux processeurs à ultrasons entièrement industriels d’une puissance allant jusqu’à 16 000watts par unité pour la disruption cellulaire et l’extraction des protéines à l’échelle commerciale dans le cadre d’une production à grande échelle. Tous les appareils à ultrasons Hielscher sont conçus pour fonctionner 24/7/365 à pleine charge. La robustesse et la fiabilité sont des caractéristiques essentielles de nos appareils à ultrasons.
Tous les homogénéisateurs à ultrasons numériques sont équipés d’un logiciel intelligent, d’un écran tactile couleur et d’un protocolage automatique des données, qui font de l’appareil à ultrasons un outil de travail pratique en laboratoire et dans les installations de production.
Indiquez-nous quel type de cellules, quel volume, à quelle fréquence et dans quel but vous devez traiter vos échantillons biologiques. Nous vous recommanderons le disrupteur cellulaire à ultrasons le mieux adapté aux exigences de votre procédé.

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos systèmes à ultrasons, des homogénéisateurs portatifs compacts et des appareils à ultrasons multi-échantillons jusqu’aux processeurs à ultrasons industriels pour les applications commerciales :