Préparation ultrasonique des échantillons de C. Elegans

C. elegans, un ver nématode, est un organisme modèle largement utilisé en biologie. La préparation des échantillons avant analyse nécessite la lyse, l'extraction des protéines et des lipides ainsi que la fragmentation de l'ARN, qui peuvent être réalisées de manière fiable par sonication. Les broyeurs cellulaires à ultrasons sont des appareils fiables, sophistiqués et faciles à utiliser pour la préparation rapide des échantillons de C. elegans.

Préparation ultrasonique des échantillons de C. Elegans

Les C. elegans sont des vers ronds largement utilisés dans les laboratoires de recherche pour étudier la génomique, la biologie du développement et les maladies. De nombreux gènes du génome de C. elegans ont des équivalents fonctionnels chez l'homme. Ce ver nématode est donc un modèle extrêmement utile pour les maladies humaines. D'autres avantages de l'utilisation de C. elegans sont sa culture facile et peu coûteuse sur des plaques contenant des bactéries (par exemple, E. coli), sa transparence, sa manipulation pratique, ainsi que la possibilité de congeler et de conserver les vers pendant une période plus longue.
L'analyse des protéines et des lipides est une procédure régulière dans les laboratoires et la préparation ultrasonique des échantillons est la méthode établie pour lyser les nématodes C. elegans à chaque stade de développement (c'est-à-dire les embryons, les larves L1-L4, les adultes). C. elegans étant également utilisé comme système d'expression de protéines pour surexprimer des protéines ciblées, une méthode de lyse et d'extraction de protéines fiable et reproductible, permettant d'obtenir des rendements élevés en protéines, est nécessaire. Les systèmes de désintégration cellulaire et d'extraction par ultrasons sont disponibles sous forme d'homogénéisateurs à sonde et d'ultrasons à échantillons multiples. Hielscher Ultrasonics propose le broyeur cellulaire à ultrasons idéal pour votre procédure de laboratoire, afin de faciliter la préparation des échantillons et de répondre à toutes les tailles d'échantillons.

Protocoles ultrasoniques pour la perturbation et la lyse de C. Elegans

L'homogénéisation et la lyse ultrasoniques de C. elegans et l'extraction ultérieure des protéines et des lipides peuvent être effectuées selon diverses procédures utilisant différents tampons d'homogénéisation et de lyse, etc. Tous les protocoles de lyse ont en commun le fait que les échantillons doivent être maintenus en permanence sur de la glace pour éviter la dégradation des protéines. Tous les protocoles de lyse ont en commun le fait que les échantillons doivent être conservés en permanence sur de la glace pour éviter la dégradation des protéines. Nous vous présentons ci-dessous quelques protocoles fiables et rapides de lyse et d'extraction par ultrasons pour la préparation d'échantillons de C. elegans contenant des protéines ou des lipides de haute qualité.

Avantages de la lyse ultrasonique de C. elegans

• Fiable
• reproductible
• contrôlé avec précision par la température
• un contrôle fiable des processus
• méthode douce
• facile à appliquer
• sûr

Extraction ultrasonique de protéines à partir d'échantillons de C. elegans

La lyse ultrasonique et l'extraction des protéines des vers C. elegans peuvent être réalisées à l'aide de différents protocoles. Nous vous présentons ci-dessous quelques protocoles de lyse fiables et rapides pour des résultats d'extraction de protéines reproductibles.

Préparation rapide de l'extrait cytosolique des vers C. elegans par sonication

Le protocole suivant permet de préparer des lysats de C. elegans en moins de 30 minutes.
Collection de C. elegans
Prélever les vers C. elegans souhaités dans un tube de 1,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou les laver à partir d'une plaque avec 1,5 ml de PBS. Centrifuger pendant 1 minute à 2000 tours/minute pour obtenir un culot. Conserver les échantillons sur de la glace.
Ensuite, laver les vers deux fois avec du PBS.
Ensuite, laver les vers deux fois avec du ddH₂O.
Remettre les vers en suspension dans au moins 500 ml de tampon d'homogénéisation (HB). Les échantillons de vers sont maintenant prêts pour la lyse ultrasonique.
Pour obtenir un extrait protéique de meilleure qualité, vous pouvez réduire la contamination bactérienne en lavant les vers pendant 5 minutes dans du PBS et de l'eau ultra-pure stérile (ddH₂O) ou effectuer une flottation au saccharose. Conserver les échantillons de vers en permanence sur de la glace.

Protocole de lyse ultrasonique de C. elegans

• Veillez à préparer l'appareil à ultrasons à l'avance afin que l'homogénéisateur à ultrasons soit prêt à l'emploi (sonde montée, programme de sonication préréglé).

Si votre ultrasoniseur est monté sur pied, placez le bain de glace avec vos tubes d'échantillon sous la sonde ultrasonique et insérez la sonde ultrasonique dans le tube de 1,5 ml.

• Pour la lyse de C. elegans avec l'UP200St ou l'UP200Ht, la sonication doit être effectuée à l'aide d'une micropointe (par exemple, la sonde S26d2 de 2 mm ; voir l'image de gauche) à une amplitude de 40 % pendant 1 seconde avec des pauses de 30 secondes entre les deux. 5 cycles de sonication pour chaque 1 seconde avec des pauses de 30 secondes sont idéaux pour la lyse de C. elegans. Si vous effectuez la lyse pour la première fois, vous pouvez vérifier la progression de la lyse dans de petites aliquotes de l'échantillon après chaque impulsion à l'aide d'un microscope.
• La lyse est achevée avec succès lorsque les vers sont perturbés. Une sonication excessive entraîne la rupture des noyaux et devient visible lorsque l'échantillon devient visqueux ou mousseux. Pour éviter la dégradation de l'échantillon, utiliser plus d'impulsions si nécessaire. Ne pas augmenter la durée de chaque cycle d'impulsions ultrasoniques pour obtenir des extraits de protéines de haute qualité.
• Éliminer le lysat cellulaire en centrifugeant les vers lysés par ultrasons à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à 4ºC.
• Transférer ensuite le surnageant dans un nouveau tube et préparer l'immunoprécipitation ou d'autres tests.

Note concernant le tampon d'homogénéisation : Préparer le tampon d'homogénéisation pour le protocole de lyse ultrasonique ci-dessus comme suit :

Lyse à haut débit de C. elegans dans des plaques à 96 puits à l'aide du sonificateur de plaques UIP400MTP

C. elegans Lysis (nématodes adultes)
UIP400MTP 80% d'amplitude, 20 cycles (chaque cycle de sonication : 30 sec ON, 30 sec OFF)
Tampon de lyse :

• Option 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Option 2) pour la co-immunoprécipitation (co-IP) : Tris HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, NP-40 0,5 % (cocktail complet d'inhibiteurs de protéinases).

Fragmentation de l'ADN à haut débit
ADN de C. elegans (nématodes adultes) 200-300bp : sonicateur de plaque UIP400MTP – amplitude de 80 %, 30 impulsions – chaque 30sec on, 30sec off

Le sonicateur de plaques UIP400MTP pour la préparation d'échantillons à haut débit sonifie uniformément les échantillons dans les plaques multi-puits, les plaques de microtitration et les plaques à 96 puits.

Lyse ultrasonique de C. elegans pour les essais quantitatifs de purification par affinité

Les embryons de C. elegans (∼2 millions par réplicat) ont été fraîchement récoltés en triplicat biologique par blanchiment de jeunes hermaphrodites gravides et soniqués sur de la glace (cycle : 0,5 s, amplitude : 40-45%, 5 coups/session, 5 sessions, intervalle entre les sessions : 30 s ; Processeur à ultrasons UP200S avec la micro-pointe S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) dans un tampon de lyse (volume total : ∼600 μl ; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10 % de glycérol, mélange d'inhibiteurs de protéase, 0,1 % de Nonidet P-40 Substitut). Après sonication, le substitut de Nonidet P-40 a été ajouté jusqu'à 1% et les lysats ont été incubés en rotation tête-bêche à 4°C pendant 30 minutes, suivi d'une centrifugation à 20 000 × g pendant 20 minutes à 4°C. Le lysat clarifié a ensuite été aspiré sans perturber la couche lipidique supérieure et divisé en deux dans les billes d'agarose anti-GFP ou les billes de contrôle bloquées (40-50 μl). Après une rotation tête-bêche à 4°C pendant 60-90 min, les billes ont été lavées une fois avec un tampon de lyse contenant 0,1% de Nonidet P-40 Substitute, suivi de deux lavages dans le tampon I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ou le tampon II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ou les deux à la fois. Pour l'extraction de la GFP:MBK-2, deux expériences distinctes ont été réalisées en utilisant des conditions de lavage différentes. Les protéines ont été éluées par agitation orbitale dans 50 μl de 6 m d'urée/2 M de thiourée à température ambiante. Pour les expériences de pull-down de MBK-1::GFP, les protéines ont été éluées deux fois par agitation dans 50μl de chlorure de guanidinium 8 m à 90°C, suivie d'une précipitation à l'éthanol. Les échantillons de protéines éluées ont ensuite été digérés en solution.
(cf. Chen et al., 2016)

Homogénéisation et lyse des vers par ultrasons

Pour la lyse de C.elegans et la procédure d'extraction des protéines, 30 000 némotodes du stade concerné ont été collectés par échantillon et lavés dans du S-basal glacé, concentrés par centrifugation à 1500 rpm pendant 2 minutes, lavés six fois avec du S-basal glacé pour éliminer les bactéries résiduelles, puis stockés sur de la glace jusqu'à ce qu'ils soient prêts à l'emploi. Pour l'extraction des protéines, on a laissé les vers adultes gravides former un culot compact après le dernier lavage au S-basal. Les culots de vers ont ensuite été remis en suspension dans 1 ml de tampon d'extraction glacé [20 mM de phosphate de potassium, pH 7,4, 2 mM d'EDTA, 1% de Triton-X-100, inhibiteurs de protéase (Sigma P2714)] et traités immédiatement.
∼30 000 vers adultes gravides (correspondant à ∼100 mg de poids humide), ont été soniqués sur de la glace à l'aide d'un appareil à ultrasons de type sonde (par exemple UP50H avec micropointe MS2) à 40 % d'amplitude pendant 10 cycles de 3 sec on, 30 sec off, dans 1 ml de tampon d'extraction refroidi à la glace. (cf. Baskharan et al. 2012)

Extraction ultrasonique des lipides de C. elegans

La lipidomique, une branche de la métabolomique, permet de caractériser et d'analyser le complément lipidique des systèmes biologiques. Les C. elegans sont largement utilisés en lipidomique pour étudier l'interaction des lipides métaboliques et leurs effets sur la santé et la durée de vie.
La lyse et l'extraction par ultrasons sont utilisées pour libérer les lipides tels que les sphingolipides des embryons, des larves et des vers adultes de C. elegans. Les ultrasons sont utilisés pour préparer les homogénats de vers, puis pour extraire les lipides de l'échantillon.
Protocole d'extraction ultrasonique des lipides de C. elegans
Décongeler le culot de C. elegans sur de la glace et le remettre en suspension avec 0,5 ml d'eau ultra pure. Soniquer les échantillons de C. elegans dans des tubes à essai de 1,5 ml, tout en gardant les échantillons continuellement sur la glace.
La sonication peut être réalisée à l'aide d'une sonde-ultrasonique telle que le UP200Htl'unité de préparation d'échantillons par ultrasons VialTweeter (sonication simultanée de 10 échantillons) ou le UIP400MTP (pour la sonication des plaques multi-puits telles que les plaques à 96 puits).Pour la lyse ultrasonique avec l'UP200Ht, utiliser la micro-pointe S26d2. Pré-réglage du mode de cycle ultrasonique dans le menu numérique. Régler l'amplitude à 10 % et le mode de cycle de sonication à 2 secondes d'impulsions de 20 cycles avec une pause de 30 secondes entre chaque salve de pulsations ultrasoniques.
Transférer les surnageants dans des tubes de verre munis d'un bouchon à vis. Effectuer l'extraction de Folch en ajoutant 1 ml d'eau ultra dans chaque tube de verre, puis 6 ml de mélange chloroforme/méthanol (ratio = 2:1) dans chaque tube de verre.
Vortexer chaque tube de verre pendant 30 secondes à 4 reprises. Centrifuger les tubes à 1 258 x g pendant 15 minutes (Eppendorf, 5810 R) pour améliorer encore la séparation des phases. Transférer la fraction hydrophobe inférieure dans un tube de verre propre à l'aide d'une pipette Pasteur en verre. Sécher la fraction hydrophobe inférieure sous flux d'azote dans un évaporateur d'azote. Conserver le culot séché dans un congélateur à -80 °C jusqu'à utilisation.

Préparation ultrasonique des lysats de vers

Lysat de vers : Les vers au stade L4 ont été récoltés et lavés trois fois avec du tampon M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl, et 0,87 mM MgSO₄) afin d'éliminer toutes les bactéries. Après avoir éliminé autant que possible le tampon M9, les vers ont été remis en suspension dans un tampon de lyse : 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM phosphate β-glycérol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorure de sodium, 1 mM orthovanadate de sodium, 5 mM pyrophosphate de sodium, 0,2 mM phénylméthanesulfonylfluoride et inhibiteur de protéase. Les vers ont été congelés dans de l'azote liquide et décongelés à 37°C à trois reprises, puis les vers ont été sonifiés sur de la glace sèche avec un appareil ultrasonique VialTweeter pour la préparation simultanée de 10 tubes d'échantillons. La sonication a été effectuée à une amplitude de 50 % en 10 cycles de 2 secondes avec une pause de 30 secondes entre les salves de sonication. Ensuite, les échantillons ont été centrifugés à 12000 rpm à 4°C pendant 15 minutes. Le surnageant a été recueilli et conservé à -70°C. Une aliquote a été utilisée pour la quantification des protéines par le test de Bradford.
Détermination du glutathion total, du GSH et du GSSG : Pour la quantification du glutathion, les lysats et la détermination ont été effectués le même jour. Les larves L4 nourries au glucose et les larves témoins ont été récoltées et lavées trois fois avec du tampon M9. Après avoir éliminé autant que possible le tampon M9, les vers ont été remis en suspension dans de l'acide métaphosphorique glacé (5% w/v), puis les vers ont été sonifiés dans la glace avec un VialTweeter ultrasonique à 50% d'amplitude en dix cycles de sonication de 2 secondes avec une pause de 30 secondes entre chaque cycle. Ensuite, les vers ont été centrifugés à 12000 rpm à 4 ̊C pendant 15 min.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Préparation des échantillons de C. elegans avant l'immunoprécipitation et le Western Blotting

En bref, pour les extraits embryonnaires, les larves L1 de C. elegans ont été cultivées dans des cultures liquides S-medium à grande échelle jusqu'à l'âge adulte. Les embryons ont été collectés à l'aide de la méthode de blanchiment standard et suspendus dans un tampon de lyse (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7 % glycérol, 0,05 % NP-40, 1􏰅 Cocktail d'inhibiteurs de protéase et 1􏰅 Cocktail d'inhibiteurs de phosphatase I et II), rapidement congelés dans l'azote liquide et lysés par fragmentation cellulaire ultrasonique à l'aide d'un appareil à ultrasons avec micro-pointe tel que le UP200Ht avec S26d2 pour 10 impulsions sur 10 s à 30% d'amplitude. Si un plus grand nombre d'échantillons doit être préparé, l'appareil à ultrasons VialTweeter ou le MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP pour les plaques sont recommandés. Après sonication, les extraits ont été pré-nettoyés par centrifugation à 30 000g pendant 20 min à 4°C. L'extrait pré-épuré (300µg de protéines totales) a été incubé avec 40µ􏰂g d'anticorps anti-CDC-25.1 purifié par affinité (cette étude) réticulé à la protéine A-agarose, ou comme contrôle, une quantité similaire d'immunoglobuline (Ig)G de lapin réticulée à la protéine A-agarose a été utilisée dans un volume total de 200µl de tampon de lyse contenant 1% de NP-40, l'inclusion de ce dernier réduisant la liaison non spécifique des protéines à la matrice. Les échantillons ont été mis en rotation pendant 1 h à 4°C, les billes ont été lavées trois fois avec du tampon de lyse, et éluées avec 30µl de glycine/HCl et 200 mM NaCl, pH 2.2. Après immunoprécipitation, les éluats ont été dilués dans 30µ􏰂l de tampon d'échantillon SDS, chauffés à 95°C pendant 4 min, et typiquement 3% du total pour l'input et 30% pour les éluats ont été appliqués au SDS-PAGE suivi d'un Western blot avec des anticorps anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitine (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500), ou anti-􏰁β-actine (1:2000). Lorsque les extraits n'ont pas été soumis à l'immunoprécipitation, la même quantité de protéines totales dérivées de ces extraits a été resuspendue dans un tampon d'échantillon SDS, chauffée à 95°C, puis directement appliquée à la SDS-PAGE et analysée par Western blotting. (cf. Segref et al. 2020)

Lyse ultrasonique sous contrôle de température précis

Le contrôle précis et fiable de la température est crucial lors de la manipulation d'échantillons biologiques. Les températures élevées provoquent une dégradation des protéines induite par la chaleur dans les échantillons.
Comme toutes les techniques de préparation mécanique des échantillons, la sonication génère de la chaleur. Cependant, la température des échantillons peut être bien contrôlée lors de l'utilisation du VialTweeter. Nous vous présentons différentes options pour surveiller et contrôler la température de vos échantillons tout en les préparant à l'analyse avec le VialTweeter et la VialPress.

1. Contrôle de la température de l'échantillon : Le processeur ultrasonique UP200St, qui commande le VialTweeter, est équipé d'un logiciel intelligent et d'un capteur de température enfichable. Branchez le capteur de température sur l'UP200St et insérez la pointe du capteur de température dans l'un des tubes d'échantillon. Grâce à l'écran tactile numérique coloré, vous pouvez régler dans le menu de l'UP200St une plage de température spécifique pour la sonication de votre échantillon. L'appareil à ultrasons s'arrête automatiquement lorsque la température maximale est atteinte et fait une pause jusqu'à ce que la température de l'échantillon soit ramenée à la valeur inférieure de la température réglée ∆. La sonication reprend ensuite automatiquement. Cette fonction intelligente empêche la dégradation induite par la chaleur.
2. Le bloc VialTweeter peut être pré-refroidi. Placer le bloc VialTweeter (uniquement la sonotrode sans transducteur !) dans le réfrigérateur ou le congélateur pour pré-refroidir le bloc de titane permet de retarder l'augmentation de la température dans l'échantillon. Si possible, l'échantillon lui-même peut être pré-refroidi également.
3. Utiliser de la glace sèche pour refroidir pendant la sonication. Utilisez un plateau peu profond rempli de glace sèche et placez le VialTweeter sur la glace sèche afin que la chaleur puisse se dissiper rapidement.

Trouvez le broyeur cellulaire ultrasonique optimal pour votre application de lyse

Hielscher Ultrasonics est un fabricant expérimenté de broyeurs cellulaires et d'homogénéisateurs à ultrasons de haute performance pour les laboratoires, les paillasses et les systèmes à l'échelle industrielle. La taille de votre culture de cellules bactériennes, votre objectif de recherche ou de production et le volume de cellules à traiter par heure ou par jour sont des facteurs essentiels pour trouver le broyeur cellulaire à ultrasons adapté à votre application.
Hielscher Ultrasonics propose diverses solutions pour la sonication simultanée d'échantillons multiples (jusqu'à 10 flacons) et d'échantillons de masse (c'est-à-dire des plaques de microtitration? plaques à 96 puits), de l'ultrasonateur de laboratoire classique à sonde avec différents niveaux de puissance de 50 à 400 watts aux processeurs ultrasoniques entièrement industriels avec jusqu'à 16 000 watts par unité pour la désintégration de cellules commerciales et l'extraction de protéines en grande production. Tous les appareils à ultrasons Hielscher sont conçus pour fonctionner 24 heures sur 24, 7 jours sur 7 et 365 jours par an à pleine charge. La robustesse et la fiabilité sont des caractéristiques essentielles de nos appareils à ultrasons.
Tous les homogénéisateurs numériques à ultrasons sont équipés d'un logiciel intelligent, d'un écran tactile en couleur et d'un système de consignation automatique des données, ce qui fait de l'appareil à ultrasons un outil de travail pratique dans les laboratoires et les installations de production.
Faites-nous savoir quel type de cellules, quel volume, à quelle fréquence et avec quelle cible vous devez traiter vos échantillons biologiques. Nous vous recommanderons le broyeur cellulaire à ultrasons le mieux adapté à vos besoins.

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos systèmes à ultrasons, depuis les homogénéisateurs compacts portatifs et les ultrasons MultiSample jusqu'aux processeurs industriels à ultrasons pour les applications commerciales :