C. elegans, un ver nématode, est un organisme modèle largement utilisé en biologie. La préparation des échantillons avant l'analyse nécessite une lyse, une extraction des protéines et des lipides ainsi qu'une fragmentation de l'ARN, qui peuvent être effectuées de manière fiable par sonication. Les broyeurs cellulaires à ultrasons sont des appareils fiables, sophistiqués et faciles à utiliser pour la préparation rapide des échantillons de C. elegans.

Préparation par ultrasons des échantillons de C. Elegans

C. elegans est un ver rond, largement utilisé dans les laboratoires de recherche pour étudier la génomique, la biologie du développement et les maladies. De nombreux gènes du génome de C. elegans ont des homologues fonctionnels chez l'homme. Ainsi, le ver nématode est un modèle extrêmement utile pour les maladies humaines. Les autres avantages de la large utilisation de C. elegans sont sa culture facile et bon marché sur des plaques contenant des bactéries (par exemple, E. coli), sa transparence, sa manipulation pratique, ainsi que la possibilité de congeler et de stocker les vers pendant une période plus longue.
L'analyse des protéines et des lipides est une procédure régulière dans les laboratoires et la préparation des échantillons par ultrasons est la méthode établie pour lyser les nématodes C. elegans à chaque stade de développement (c'est-à-dire embryons, larves L1-L4, adultes). Étant donné que C. elegans est également utilisé comme système d'expression des protéines pour surexprimer les protéines ciblées, une méthode de lyse et d'extraction des protéines fiable et reproductible, qui donne des rendements protéiques élevés, est nécessaire. Des systèmes de désintégration et d'extraction cellulaire par ultrasons sont disponibles sous forme d'homogénéisateurs de type sonde et d'ultrasonateurs multi-échantillons. Pour la préparation pratique des échantillons et pour toutes sortes de tailles d'échantillons, Hielscher Ultrasons dispose du broyeur cellulaire à ultrasons idéal pour votre procédure de laboratoire.

Protocoles ultrasoniques pour la perturbation et la lyse de C. Elegans

L'homogénéisation et la lyse ultrasoniques de C. elegans et l'extraction ultérieure des protéines et des lipides peuvent être effectuées selon des procédures variées utilisant différents tampons d'homogénéisation et de lyse, etc. Tous les protocoles de lyse ont en commun que les échantillons doivent être continuellement conservés sur glace pour éviter la dégradation des protéines. Nous vous présentons ci-dessous quelques protocoles fiables et rapides de lyse et d'extraction par ultrasons pour la préparation d'échantillons de C. elegans de haute qualité contenant des protéines ou des lipides.

Avantages de la lyse ultrasonique de C. elegans

• fiable
• reproductible
• température contrôlée avec précision
• un contrôle fiable des processus
• méthode douce
• facile à appliquer
• sûr

Extraction ultrasonique de protéines à partir d'échantillons de C. elegans

La lyse ultrasonique et l'extraction des protéines des vers C. elegans peuvent être réalisées à l'aide de différents protocoles. Nous vous présentons ci-dessous quelques protocoles de lyse fiables et rapides pour des résultats d'extraction de protéines reproductibles.

Préparation rapide d'un extrait cytosolique de vers C. elegans par sonication

Grâce au protocole suivant, vous pouvez préparer les lysats de C. elegans en moins de 30 minutes.
Collection de C. elegans
Prélevez les vers C. elegans souhaités dans un tube de 1,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou lavez-les dans une assiette avec 1,5 ml de PBS. Centrifuger pendant 1 minute à 2000 tours/minute pour obtenir un culot. Conservez les échantillons à tout moment sur de la glace.
Ensuite, lavez les vers deux fois avec du PBS.
Ensuite, lavez les vers deux fois avec du ddH₂O.
Remettez les vers en suspension dans au moins 500ul de tampon d'homogénéisation (HB). Les échantillons de vers sont maintenant prêts pour la lyse ultrasonique.
Pour obtenir un extrait protéique de meilleure qualité, vous pouvez réduire la contamination bactérienne en lavant les vers pendant 5 minutes chacun dans du PBS et de l'eau stérile ultra-pure (ddH₂O) ou effectuer la flottation du saccharose. Gardez les échantillons de vers continuellement sur la glace.

Protocole de lyse ultrasonique de C. elegans

• Veillez à préparer l'appareil à l'avance afin que l'homogénéisateur à ultrasons soit prêt à l'emploi (monté sur la sonde, programme de sonication préréglé).

Si votre ultrasonateur est monté sur pied, placez le bain de glace avec vos tubes de prélèvement sous la sonde ultrasonore et insérez la sonde ultrasonore dans le tube de 1,5 ml.

• Pour la lyse de C. elegans avec l'UP200St ou l'UP200Ht, l'ultrason doit être effectué à l'aide d'une micropointe (par exemple, une sonde de 2 mm S26d2 ; voir l'image de gauche) à une amplitude de 40 % pendant 1 seconde avec des pauses de 30 secondes entre les deux. 5 cycles de sonication pour chaque seconde avec des pauses de 30 secondes sont idéaux pour la lyse de C. elegans. Si vous effectuez la lyse pour la première fois, vous pouvez vérifier la progression de la lyse dans de petites aliquotes de l'échantillon après chaque impulsion à l'aide d'un microscope.
• La lyse est terminée avec succès lorsque les vers sont perturbés. La sur-sonification entraîne la rupture des noyaux et devient visible lorsque l'échantillon devient visqueux ou mousseux. Pour éviter la dégradation de l'échantillon, utilisez plus d'impulsions si nécessaire. N'augmentez pas la durée de chaque cycle d'impulsions ultrasoniques pour obtenir des extraits protéiques de haute qualité.
• Dégager le lysat cellulaire en centrifugeant les vers lysés par ultrasons à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à 4ºC.
• Ensuite, transférez le surnageant dans un tube frais et préparez l'immunoprécipitation ou d'autres tests.

Note pour le tampon d'homogénéisation : Préparer le tampon d'homogénéisation pour le protocole de lyse ultrasonique ci-dessus comme suit :

Lyse à haut débit de C. elegans dans des plaques à 96 puits à l'aide du sonificateur de plaques UIP400MTP

C. elegans Lysis (nématodes adultes)
UIP400MTP 80% d'amplitude, 20 cycles (chaque cycle de sonication : 30 sec ON, 30 sec OFF)
Tampon de lyse :

• Option 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Option 2) pour la co-immunoprécipitation (co-IP) : Tris HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, NP-40 0,5 % (cocktail complet d'inhibiteurs de protéinases).

Fragmentation de l'ADN à haut débit
ADN de C. elegans (nématodes adultes) 200-300bp : sonicateur de plaque UIP400MTP – fixer une amplitude de 80 %, 30 impulsions – chaque 30sec on, 30sec off

Le sonicateur de plaques UIP400MTP pour la préparation d'échantillons à haut débit sonifie uniformément les échantillons dans les plaques multi-puits, les plaques de microtitration et les plaques à 96 puits.

Lyse ultrasonique de C. elegans pour les essais de purification par affinité quantitative

Les embryons de C. elegans (∼2 millions par réplique) ont été fraîchement récoltés en triple exemplaire biologique par blanchiment de jeunes hermaphrodites gravides et soniqués sur glace (cycle : 0,5 s, amplitude : 40-45%, 5 coups/session, 5 séances, intervalle entre les séances : 30 s ; Processeur à ultrasons UP200S avec micro-pointe S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) dans un tampon de lyse (volume total : ∼600 μl ; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycérol, mélange d'inhibiteurs de protéase, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Après sonication, le substitut P-40 de Nonidet a été ajouté jusqu'à 1 % et les lysats ont été incubés avec une rotation tête/queue à 4°C pendant 30 min, suivie d'une centrifugation à 20 000 × g pendant 20 min à 4°C. Le lysat clair a ensuite été aspiré sans perturber la couche lipidique supérieure et divisé par deux, soit en billes d'agarose anti-GFP, soit en billes de contrôle bloquées (40-50 μl). Après une rotation tête-bêche à 4°C pendant 60-90 minutes, les billes ont été lavées une fois avec un tampon de lyse contenant 0,1 % de substitut P-40 nonidet, puis deux fois dans le tampon I (25 mm de Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm de NaCl, 1 mm de MgCl2) ou le tampon II (1 mm de Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm de NaCl, 1 mm de MgCl2) ou les deux. Pour les arrachages de GFP:MBK-2, deux expériences distinctes ont été réalisées dans des conditions de lavage différentes. Les protéines ont été éluées par agitation orbitale dans 50 μl de 6 m d'urée/2 M de thiourée à température ambiante. Pour les expériences de pull-down MBK-1::GFP, les protéines ont été éluées deux fois par agitation dans 50μl de 8 m de chlorure de guanidinium à 90°C, suivie d'une précipitation d'éthanol. Les échantillons de protéines élués ont ensuite été digérés en solution.
(cf. Chen et al., 2016)

Homogénéisation et lyse des vers par ultrasons

Pour la lyse de C.elegans et la procédure d'extraction des protéines, 30 000 némotodes de l'étape concernée ont été collectés par échantillon et lavés dans du S-basal glacé, concentré par centrifugation à 1500 tours/minute pendant 2 minutes, lavé six fois avec du S-basal glacé pour éliminer les bactéries résiduelles, puis stocké sur de la glace jusqu'à ce qu'il soit prêt à être utilisé. Pour l'extraction des protéines, les vers adultes ont été autorisés à former une boulette compacte après le dernier lavage au S-basal. Les boulettes de vers ont ensuite été remises en suspension dans 1 ml de tampon d'extraction glacé [20 mM de phosphate de potassium, pH 7,4, 2mM d'EDTA, 1% de Triton-X-100, inhibiteurs de protéase (Sigma P2714)] et traitées immédiatement.
∼30, 000 vers adultes gravides (correspondant à ∼100 mg de poids humide), ont été soniqués sur la glace à l'aide d'un ultrasonateur à sonde (par exemple UP50H avec micropointe MS2) à une amplitude de 40% pour 10 cycles de 3 sec on, 30 sec off, dans 1 ml de tampon d'extraction glacé. (cf. Baskharan et al. 2012)

Extraction ultrasonique des lipides de C. elegans

En lipidomique, une branche de la métabolomique, le complément lipidique des systèmes biologiques est caractérisé et analysé. C. elegans est largement utilisé en lipidomique pour étudier l'interaction des lipides métaboliques et leurs effets sur la santé et la durée de vie.
La lyse et l'extraction par ultrasons sont utilisées pour libérer des lipides tels que les sphingolipides des embryons, des larves et des vers adultes de C. elegans. L'ultrason est utilisé pour préparer des homogénats de vers et ensuite pour extraire les lipides de l'échantillon.
Protocole pour l'extraction ultrasonique des lipides de C. elegans
Décongelez le culot de C. elegans sur de la glace et remettez-le en suspension avec 0,5 ml d'eau. Sonicate les échantillons de C. elegans dans des tubes à essai de 1,5 ml, tout en gardant les échantillons continuellement sur la glace.
La sonication peut être effectuée à l'aide d'une sonde ultrasonique telle que la UP200Htl'unité de préparation des échantillons par ultrasons VialTweeter (sonication simultanée de 10 échantillons) ou le UIP400MTP (pour la sonication des plaques à plusieurs puits comme les plaques à 96 puits).For la lyse ultrasonique avec l'UP200Ht utilise le micro embout S26d2. Prérégler le mode de cycle ultrasonore dans le menu numérique. Réglez l'amplitude à 10% et le mode de cycle de sonication sur des impulsions de 2 secondes de 20 cycles avec une pause de 30 secondes entre chaque rafale de pulsations ultrasonores.
Transférer les surnageants dans des tubes de verre avec bouchon à vis. Perform Folch extraction en ajoutant 1 ml d'ultrawater à chaque tube de verre, puis en ajoutant 6 ml de mélange 
of chloroforme/méthanol (rapport = 2:1) à chaque tube de verre.
Vortexez chaque tube de verre pendant 30 secondes à quatre reprises. Centrifuge les tubes à 1,258 x g pendant 15 min (Eppendorf, 5810 R) pour améliorer encore la phase 
separation. Transfer la fraction hydrophobe inférieure à un tube de verre propre par une pipette Pasteur en verre. Dry la fraction hydrophobe inférieure sous flux d'azote dans un évaporateur d'azote. Store le granulé séché dans un congélateur à -80 °C jusqu'à son utilisation.

Préparation par ultrasons de lysats de vers

Lysat de ver : Les vers du stade L4 ont été récoltés et lavés trois fois avec le tampon M9 (42,26 mM Na₂HPO₄22.04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl et 0,87 mM MgSO₄) afin d'éliminer toutes les bactéries. Après avoir retiré autant que possible le tampon M9, les vers ont été remis en suspension dans le tampon de lyse : 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM phosphate β-glycérol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorure de sodium, 1 mM orthovanadate de sodium, 5 mM pyrophosphate de sodium, 0,2 mM fluorure de phénylméthanesulfonyle et inhibiteur de protéase. Les vers ont été congelés dans de l'azote liquide et décongelés à 37°C pendant trois fois, puis les vers ont été soniqués sur de la glace sèche avec un appareil à ultrasons VialTweeter pour la préparation simultanée de 10 tubes d'échantillons. La sonication a été effectuée à 50 % d'amplitude en 10 cycles de 2 secondes avec une pause de 30 secondes entre les rafales de sonication. Ensuite, les échantillons ont été centrifugés à 12000 tours/minute à 4°C pendant 15 minutes. Le surnageant a été recueilli et stocké à -70°C. Une aliquote a été utilisée pour la quantification des protéines par le test de Bradford.
Détermination du glutathion total, du GSH et du GSSG : pour la quantification du glutathion, les lysats et la détermination ont été effectués le même jour. Les larves L4 nourries au glucose et les larves témoins ont été récoltées et lavées trois fois avec le tampon M9. Après avoir retiré le plus possible de tampon M9, les vers ont été remis en suspension dans de l'acide métaphosphorique glacé (5 % p/v), puis les vers ont été soniqués dans la glace avec un VialTweeter à ultrasons à 50 % d'amplitude en dix cycles de sonication de 2 secondes avec une pause de 30 secondes entre chaque cycle. Ensuite, ils ont été centrifugés à 12000 tours/minute à 4 ̊C pendant 15 min.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Préparation des échantillons de C. elegans avant l'immunoprécipitation et le Western Blotting

En bref, pour les extraits embryonnaires, les larves L1 de C. elegans ont été cultivées dans des cultures liquides S-medium à grande échelle jusqu'à l'âge adulte. Les embryons ont été collectés en utilisant la méthode standard de blanchiment et mis en suspension dans un tampon de lyse (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7 % glycérol, 0,05 % NP-40, 1 cocktail d'inhibiteur de protéase et 1 cocktail d'inhibiteur de phosphatase I et II), rapidement congelés dans l'azote liquide, et lysés par désintégration cellulaire par ultrasons à l'aide d'un appareil à micropointes tel que le UP200Ht avec S26d2 pour 10 impulsions sur 10 s à une amplitude de 30 %. Si un plus grand nombre d'échantillons doit être préparé, l'ultrason VialTweeter ou le MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP pour les plaques de puits sont recommandés. Après la sonication, les extraits ont été pré-claircis par centrifugation à 30 000 g pendant 20 minutes à 4°C. L'extrait pré-clairci (300µg de protéine totale) a été incubé avec 40µg d'anticorps anti-CDC-25.1 purifié par affinité (cette étude) réticulé à la protéine A-agarose, ou comme contrôle, une quantité similaire d'immunoglobuline (Ig)G de lapin réticulée à la protéine A-agarose a été utilisée dans un volume total de 200µl de tampon de lyse contenant 1% de NP-40, dont l'inclusion a réduit la liaison non spécifique des protéines à la matrice. Les échantillons ont été tournés pendant 1 h à 4°C, les billes ont été lavées trois fois avec le tampon de lyse, et éluées avec 30µl de glycine/HCl et 200 mM de NaCl, pH 2,2. Après immunoprécipitation, les éluats ont été dilués dans 30µl de tampon d'échantillon SDS, chauffés à 95°C pendant 4 min, et typiquement 3% du total pour l'entrée et 30% pour les éluats ont été appliqués à la SDS-PAGE, suivis par un Western blotting avec des anticorps anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitine (1:1000), anti-GSK3 (1:500), ou anti-β-actine (1:2000). Lorsque les extraits n'ont pas été soumis à une immunoprécipitation, la même quantité de protéines totales dérivées de ces extraits a été remise en suspension dans un tampon d'échantillon SDS, chauffée à 95°C, puis directement appliquée sur SDS-PAGE et analysée par Western blotting. (cf. Segref et al. 2020)

La lyse par ultrasons sous contrôle de température précis

Le contrôle précis et fiable de la température est crucial lors de la manipulation d'échantillons biologiques. Les températures élevées déclenchent la dégradation des protéines induite thermiquement dans les échantillons.
Comme toutes les techniques de préparation mécanique des échantillons, la sonication crée de la chaleur. Cependant, la température des échantillons peut être bien contrôlée en utilisant le VialTweeter. Nous vous présentons différentes options pour surveiller et contrôler la température de vos échantillons tout en les préparant avec le VialTweeter et le VialPress pour l'analyse.

1. Contrôle de la température de l'échantillon : Le processeur ultrasonique UP200St, qui pilote le VialTweeter, est équipé d'un logiciel intelligent et d'un capteur de température enfichable. Branchez le capteur de température sur l'UP200St et insérez la pointe du capteur de température dans l'un des tubes d'échantillonnage. Grâce à l'écran tactile numérique en couleur, vous pouvez définir dans le menu de l'UP200St une plage de température spécifique pour votre échantillon de sonication. L'ultrasonateur s'arrêtera automatiquement lorsque la température maximale sera atteinte et fera une pause jusqu'à ce que la température de l'échantillon soit descendue à la valeur inférieure de la température réglée ∆. Ensuite, la sonication redémarre automatiquement. Cette fonction intelligente empêche la dégradation induite par la chaleur.
2. Le bloc VialTweeter peut être pré-refroidi. Mettez le bloc VialTweeter (uniquement la sonotrode sans transducteur !) au réfrigérateur ou au congélateur pour pré-refroidir le bloc en titane, ce qui permet de retarder l'augmentation de la température de l'échantillon. Si possible, l'échantillon lui-même peut aussi être pré-refroidi.
3. Utilisez de la glace sèche pour refroidir pendant la sonication. Utilisez un plateau peu profond rempli de glace sèche et placez le VialTweeter sur la glace sèche afin que la chaleur puisse se dissiper rapidement.

Trouvez le broyeur cellulaire à ultrasons optimal pour votre application de lyse

Hielscher Ultrasonics est un fabricant expérimenté de longue date de broyeurs et d'homogénéisateurs de cellules à ultrasons de haute performance pour les laboratoires, les paillasses et les balances industrielles. La taille de votre culture cellulaire bactérienne, votre objectif de recherche ou de production et le volume de cellules à traiter par heure ou par jour sont des facteurs essentiels pour trouver le broyeur cellulaire à ultrasons adapté à votre application.
Hielscher Ultrasons propose différentes solutions pour la sonication simultanée de plusieurs échantillons (jusqu'à 10 flacons) ainsi que d'échantillons de masse (c'est-à-dire des plaques de microtitration / plaques à 96 puits), de l'ultrasonateur de laboratoire classique à sonde avec différents niveaux de puissance de 50 à 400 watts aux processeurs ultrasoniques entièrement industriels avec jusqu'à 16 000 watts par unité pour la désintégration cellulaire commerciale et l'extraction de protéines dans les grandes productions. Tous les ultrasonateurs Hielscher sont construits pour fonctionner 24 heures sur 24, 7 jours sur 7 et 365 jours par an à pleine charge. La robustesse et la fiabilité sont des caractéristiques essentielles de nos appareils à ultrasons.
Tous les homogénéisateurs numériques à ultrasons sont équipés d'un logiciel intelligent, d'un écran tactile couleur et d'un enregistrement automatique des données, ce qui fait de l'appareil à ultrasons un outil de travail pratique dans les laboratoires et les installations de production.
Faites-nous savoir, quel type de cellules, quel volume, avec quelle fréquence et avec quelle cible vous avez pour traiter vos échantillons biologiques. Nous vous recommanderons le broyeur cellulaire à ultrasons le mieux adapté à vos besoins.

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos systèmes à ultrasons, des homogénéisateurs portables compacts et des ultrasons multi-échantillons aux processeurs ultrasoniques industriels pour les applications commerciales :