Lyse ultrasonique pour le Western Blotting

• Le western blot est une procédure analytique permettant de détecter des protéines spécifiques dans un échantillon d'homogénat de tissu ou d'extrait cellulaire.
• Pour réaliser un Western blot ou mesurer l'activité enzymatique, de nombreux essais nécessitent l'accès aux matériaux (protéines, ADN, fragments subcellulaires, etc.) piégés dans la cellule.
• La sonication est une méthode fiable et facile à mettre en œuvre pour la désintégration et la lyse cellulaires contrôlées.

Perturbation cellulaire par ultrasons

L'extraction des protéines des tissus et des cellules cultivées est la première étape de nombreuses techniques biologiques, biochimiques et analytiques (PAGE, Western blotting, ELISA, spectrométrie de masse, etc.) ou de la purification des protéines. Pour obtenir un rendement élevé en protéines, le matériel cellulaire et les tissus doivent être efficacement déstructurés/lysés. Qu'il s'agisse de cellules végétales ou de tissus animaux, la sonication est la méthode qui permet de préparer facilement et rapidement votre lysat cellulaire.

Avantages de la sonication

• Rapide & Efficace
• Facilité d'utilisation
• rendement élevé en protéines
• reproductible/ répétable
• contrôlé avec précision
• modulable

Protocole d'immunoprécipitation pour l'immunoblotage occidental

A. Réactifs

Pour la préparation des solutions, utiliser de l'eau purifiée telle que Milli-Q.

• Solution saline tamponnée au phosphate 1X (PBS)
• Tampon de lyse cellulaire 1X : 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM Pyrophosphate de sodium, 1 mM β-glycérophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptine
  Important : ajouter 1 mM de PMSF immédiatement avant l'utilisation.
• 15 μl de protéine A+15 μl de protéine G suffisent pour l'IP, mais cela peut dépendre de votre anticorps primaire et du volume de l'échantillon. Vous pouvez également utiliser de l'agarose pré-mélangé protéine A/ G (par exemple, la protéine A pour l'extraction des IgG de lapin et la protéine G pour l'extraction des IgG de souris).
• Tampon d'échantillon SDS 3X : 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 à 25°C), 6% p/v SDS, 30% glycérol, 150 mM DTT, 0,03% p/v bleu de bromophénol

B. Préparation des lysats cellulaires

• Récolter les cellules. Pour récolter les cellules dans des conditions de non-dénaturation, retirer le milieu et rincer les cellules une fois avec du PBS glacé.
• Retirer le PBS et ajouter 0,5 ml de tampon de lyse cellulaire 1X glacé à chaque plaque (10 cm) et incuber les plaques sur la glace pendant 5 minutes.
• Racler les cellules des plaques et les transférer dans des tubes de microcentrifugation. Conserver sur de la glace.
• Soniquer deux fois pendant 10 secondes dans un tampon d'immunoprécipitation glacé (tampon IP : 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 et le mélange d'inhibiteurs de protéase). Pour la sonication, le VialTweeter ou un appareil à ultrasons à sonde tel que le UP100H ou UP200Ht sont les plus appropriés.
• Centrifuger les lysats à 15 000 g pendant 10 minutes à 4°C.
• Transférer le surnageant dans un nouveau tube. (Si nécessaire, le lysat peut être conservé à -80°C.)
• Ajouter l'anticorps primaire au surnageant. Le surnageant avec l'anticorps primaire est incubé pendant 1 heure à 4°C sous légère agitation. L'anticorps primaire est généralement ajouté dans une quantité 10x plus concentrée que celle utilisée pour le western blotting. (Vous pouvez commencer avec 1μg pour 100μL).
• Le surnageant est ensuite incubé avec le mélange de quantités égales d'agarose de protéine A (Invitrogen) et d'agarose de protéine G pendant encore 1 heure.
• Laver les culots d'agarose trois fois avec le tampon IP. Ensuite, extraire les protéines liées avec le tampon de chargement SDS-PAGE en chauffant à 95°C pendant 5 minutes.

C. Immunoprécipitation

• Prélever 200 μl de lysat cellulaire et ajouter l'anticorps primaire. Incuber en agitant doucement pendant une nuit à 4°C.
• Ajouter des billes d'agarose de protéine A ou G (20 μl de bouillie de billes à 50 %). Incuber en agitant doucement pendant 1 à 3 heures à 4°C.
• Microcentrifuger pendant 30 secondes à 4°C. Laver le culot cinq fois avec 500 µl de tampon de lyse cellulaire 1X. Garder sur la glace pendant les lavages.
• Remettre en suspension le culot avec 20 μl de tampon d'échantillonnage SDS 3X. Vortexer, puis microcentrifuger pendant 30 secondes.
• Chauffer l'échantillon à 95-100°C pendant 2-5 minutes et microcentrifuger pendant 1 minute à 14 000 X g.
• Charger l'échantillon (15-30 μl) sur un gel SDS-PAGE (12-15%).
• Analyser l'échantillon par Western blotting.

Analyse Western Blot avec le Sonicator UP50H

Le protocole suivant utilisant le sonicateur à sonde UP50H a été utilisé dans l'étude de Kriebisch et al. (2011) :
Les protéines totales ont été isolées à partir de cellules MC3T3-E1 traitées avec du 1,25(OH)₂d₃ (10^-8 M) ou le véhicule. Les cellules ont été lysées avec un tampon contenant 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich) ; 150 mM NaCl (Fisher Scientific) ; 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS) (Fisher Scientific) ; 1% d'IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) et 0,5% de désoxycholate de sodium (Merck). Le lysat cellulaire a été sonifié pendant 2 × 10 s au cycle 1 et à l'amplitude 80 avec la sonique UP50H Processeur à ultrasons (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Allemagne). Ensuite, le matériel a été centrifugé pendant 10 minutes à 14 000 rpm et le surnageant a été utilisé pour le Western blotting. Vingt-cinq μg de protéines ont été bouillis dans un tampon d'échantillonnage et un agent réducteur (Invitrogen), puis séparés par SDS-PAGE à l'aide de gels de polyacrylamide à 4-12 % (Invitrogen) et transférés sur une membrane de nitrocellulose (GE health care). La membrane a été bloquée pendant 1 heure avec du TBS (10 mM Tris-HCl ; pH 7,6 ; 150 mM NaCl) contenant 1% de caséine (Sigma-Aldrich) et 1% de Tris (1 M). Après blocage, la membrane a été incubée avec une légère agitation pendant une nuit à 4°C avec l'anticorps primaire (lapin anti-human CBS 1/500, développé dans le laboratoire du Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). L'incubation avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HPR) (Dako) a été réalisée pendant 1 heure à température ambiante. Tous les blots ont été développés par chimiluminescence améliorée (Perkin Elmer).
 

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Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasons de laboratoire :

Littérature / Références