Lyse par ultrasons pour le Western blot

• Le Western blot est une procédure analytique permettant de détecter des protéines spécifiques dans un échantillon d’homogénat tissulaire ou d’extrait cellulaire.
• Pour réaliser un Western blot ou mesurer l’activité enzymatique, de nombreux dosages nécessitent d’accéder aux substances (par exemple, protéines, ADN, fragments subcellulaires) contenues dans la cellule.
• La sonication est une méthode fiable et facile à mettre en œuvre pour une rupture et une lyse cellulaires contrôlées.

Rupture cellulaire par ultrasons

L’extraction des protéines à partir de tissus et de cellules en culture constitue la première étape de nombreuses techniques biologiques, biochimiques et analytiques (PAGE, Western blot, ELISA, spectrométrie de masse, etc.) ou de la purification des protéines. Pour obtenir un rendement élevé en protéines, le matériel cellulaire et les tissus doivent être efficacement désintégrés ou lysés. Qu’il s’agisse de cellules végétales ou de tissus animaux, la sonication permet de préparer votre lysat cellulaire facilement et rapidement.

Avantages de la sonication

• rapide et efficace
• utilisation facile
• rendement élevé en protéines
• reproductible / répétable
• contrôle précis
• adaptable à différentes échelles

Protocole d’immunoprécipitation pour l’immunoblot de type Western

A. Réactifs

Pour préparer les solutions, utilisez de l’eau purifiée, telle que l’eau Milli-Q.

• Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X
• Tampon de lyse cellulaire 1X : 20 mM de Tris (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA, 1 mM d’EGTA, 1% de Triton X-100, 2,5 mM de pyrophosphate de sodium, 1 mM de β-glycérophosphate, 1 mM de Na3VO4, 1 μg/ml de leupeptine
  Important : ajoutez 1 mM de PMSF immédiatement avant utilisation.
• 15 μl de protéine A+15 μl de protéine G suffisent pour l’IP, mais cela peut dépendre de votre anticorps primaire et du volume de l’échantillon. Vous pouvez également utiliser un mélange prémélangé de protéines A/G couplées à l’agarose (par exemple, la protéine A pour la capture des IgG de lapin et la protéine G pour la capture des IgG de souris).
• Tampon d’échantillon SDS 3X : 187,5 mM de Tris-HCl (pH 6,8 à 25°C), 6% w/v de SDS, 30% de glycérol, 150 mM de DTT, 0,03% w/v de bleu de bromophénol

B. Préparation des lysats cellulaires

• Récoltez les cellules. Pour récolter les cellules dans des conditions non dénaturantes, retirez le milieu de culture et rincez les cellules une fois avec du PBS glacé.
• Retirez le PBS, ajoutez 0,5 ml de tampon de lyse cellulaire 1X glacé à chaque boîte (10 cm), puis incubez les boîtes sur glace pendant 5 minutes.
• Détachez les cellules des boîtes par grattage et transférez-les dans des tubes de microcentrifugation. Maintenez-les sur glace.
• Effectuez deux sonications de 10 secondes dans un tampon d’immunoprécipitation glacé (tampon IP : 50 mM de Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM de NaCl, 5 mM d’EDTA, 0,1% de NP-40 et le mélange d’inhibiteurs de protéases). Pour la sonication, le VialTweeter ou un sonicateur à sonde tel que le UP100H ou le UP200Ht sont les appareils les mieux adaptés.
• Centrifugez les lysats à 15 000 g pendant 10 minutes à 4°C.
• Transférez le surnageant dans un nouveau tube. (Si nécessaire, le lysat peut être conservé à –80°C.)
• Ajoutez l’anticorps primaire au surnageant. Incubez le surnageant contenant l’anticorps primaire pendant 1 h à 4°C sous agitation légère. L’anticorps primaire est généralement ajouté à une concentration 10x supérieure à celle utilisée pour le Western blot. (Vous pouvez commencer avec 1μg pour 100μL.)
• Incubez ensuite le surnageant pendant encore 1 h avec un mélange de quantités égales de protéine A couplée à l’agarose (Invitrogen) et de protéine G couplée à l’agarose.
• Lavez les culots d’agarose trois fois avec le tampon IP. Extrayez ensuite les protéines liées à l’aide du tampon de chargement SDS-PAGE en chauffant à 95°C pendant 5 minutes.

C. Immunoprécipitation

• Prélevez 200 μl de lysat cellulaire et ajoutez l’anticorps primaire. Incubez toute la nuit à 4°C sous agitation douce par basculement.
• Ajoutez des billes d’agarose couplées à la protéine A ou G (20 μl d’une suspension de billes à 50%). Incubez sous agitation douce par basculement pendant 1–3 heures à 4°C.
• Microcentrifugez pendant 30 secondes à 4°C. Lavez le culot cinq fois avec 500 µl de tampon de lyse cellulaire 1X. Maintenez sur glace pendant les lavages.
• Remettez le culot en suspension dans 20 μl de tampon d’échantillon SDS 3X. Agitez au vortex, puis microcentrifugez pendant 30 secondes.
• Chauffez l’échantillon à 95–100°C pendant 2–5 minutes, puis microcentrifugez pendant 1 minute à 14 000 X g.
• Chargez l’échantillon (15–30 μl) sur un gel SDS-PAGE (12–15%).
• Analysez l’échantillon par Western blot.

Analyse par Western blot avec le sonicateur UP50H

Le protocole suivant, utilisant le sonicateur à sonde UP50H, a été employé dans l’étude de Kriebisch et al. (2011) :
Les protéines totales ont été isolées à partir de cellules MC3T3-E1 traitées avec du 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ou avec le véhicule. Les cellules ont été lysées avec un tampon contenant 50 mM de Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich) ; 150 mM de NaCl (Fisher Scientific) ; 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS) (Fisher Scientific) ; 1% d’IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) et 0,5% de désoxycholate de sodium (Merck). Le lysat cellulaire a été soumis à une sonication pendant 2 × 10 s, au cycle 1 et à l’amplitude 80, avec le processeur à ultrasons UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Allemagne). Le matériel a ensuite été centrifugé pendant 10 min à 14 000 rpm et le surnageant a été utilisé pour le Western blot. Vingt-cinq μg de protéines ont été portés à ébullition dans un tampon d’échantillon contenant un agent réducteur (Invitrogen), puis séparés par SDS-PAGE sur des gels de polyacrylamide à 4–12% (Invitrogen) et transférés sur une membrane de nitrocellulose (GE health care). La membrane a été bloquée pendant 1 h avec du TBS (10 mM de Tris-HCl ; pH 7,6 ; 150 mM de NaCl) contenant 1% de caséine (Sigma-Aldrich) et 1% de Tris (1 M). Après blocage, la membrane a été incubée sous agitation légère toute la nuit à 4°C avec l’anticorps primaire (anticorps de lapin anti-CBS humaine, 1/500, développé dans le laboratoire du Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, États-Unis). L’incubation avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HPR) (Dako) a été réalisée pendant 1 h à température ambiante. Tous les blots ont été révélés par chimioluminescence amplifiée (Perkin Elmer).
 

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Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité approximative de traitement de nos sonicateurs de laboratoire :

Bibliographie / Références

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.