Ultrasons Lyse pour Western Blot

• Le western blot est une méthode d'analyse pour la détection de protéines spécifiques dans un échantillon d'homogénat de tissu ou d'un extrait cellulaire.
• Pour exécuter un transfert Western ou pour mesurer l'activité enzymatique, de nombreux tests nécessitent un accès aux matériaux (par exemple les protéines, l'ADN, des fragments subcellulaires) piégées dans la cellule.
• Le traitement par ultrasons est une méthode fiable et facile à manipuler pour la rupture et la lyse cellulaire contrôlée.

La perturbation de cellules par ultrasons

L'extraction des protéines des tissus et des cellules cultivées est la première étape pour de nombreuses techniques biologiques, biochimiques et analytiques (PAGE, Western blot, ELISA, spectrométrie de masse, etc.) ou la purification des protéines. Pour obtenir un rendement en protéines, le matériau cellulaire et tissulaire doit être efficacement perturbé / lysées. Que ce soit une cellule végétale ou un tissu animal, sonication est la méthode pour préparer votre lysat cellulaire facile et rapide.

Avantages de sonication

• Vite & efficace
• opération facile
• rendement élevé de protéines
• reproductible / reproductible
• contrôlée avec précision
• évolutive

Protocole de immunoprécipitation Pour Western immunoblot

A. Réactifs

Pour la préparation des solutions, en utilisant de l'eau purifiée comme eau Milli-Q.

• 1X saline tamponnée au phosphate (PBS)
• 1X Tampon de lyse cellulaire: 20 mM de Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, 2,5 mM de pyrophosphate de sodium, 1 mM de β-glycérophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml de leupeptine
  Important: Ajouter 1 mM PMSF immédiatement avant l'utilisation.
• 15 ul de protéine A + 15 pi protéine G est suffisante pour la propriété intellectuelle, mais elle peut dépendre de votre anticorps primaire et un volume d'échantillon. Vous pouvez également utiliser la protéine d'agarose pré-mélangée A / G (par exemple la protéine A pour IgG lapin tirer vers le bas et la protéine G pour les IgG de souris tirer vers le bas)
• 3X SDS tampon d'échantillon: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 à 25 ° C), 6% p / v de SDS, 30% de glycerol, 150 mM de DTT, 0,03% p / v de bleu de bromophénol

B. Préparation de lysats cellulaires

• Récolter les cellules. Pour récolter les cellules dans des conditions non dénaturants, éliminer les cellules médias et rincer une fois avec du PBS glacé.
• Retirer le PBS et ajouter 0,5 ml de tampon refroidi à la glace de lyse cellulaire 1X à chaque plaque (10 cm) et incuber les plaques sur de la glace pendant 5 minutes.
• Racler les cellules situées au large des plaques et transférer dans des tubes de microcentrifugation. Gardez sur la glace.
• Traitement par ultrasons deux fois pendant 10 secondes dans du tampon d'immunoprécipitation glacé (tampon IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 0,1% de NP-40 et le mélange d'inhibiteurs de proteases). Pour sonication, la VialTweeter ou un appareil à ultrasons à sonde telle que la UP100H ou UP200Ht sont les plus appropriés.
• Centrifuger les lysats à 15 000 g pendant 10 minutes à 4 ° C.
• Transférer le surnageant dans un nouveau tube. (Le cas échéant, le lysat peut être stocké à -80 ° C).
• Ajouter l'anticorps primaire au surnageant. Le surnageant avec l'anticorps primaire est mis en incubation pendant 1 h à 4 ° C sous agitation légère. L'anticorps primaire est généralement ajouté en une quantité 10 fois plus concentrée que celle utilisée pour Western Blot. (Vous pouvez commencer par 1 ug par 100 pi.)
• Le surnageant est ensuite incubé avec en outre le mélange de quantités égales de protéine A-agarose (Invitrogen) et d'agarose de protéine G pendant encore 1 h.
• Laver les pastilles d'agarose à trois fois avec un tampon IP. Ensuite, extraire les protéines liées avec le tampon de charge SDS-PAGE par chauffage à 95 ° C pendant 5 minutes.

C. immunoprécipitation

• Prenez lysat cellulaire 200 ul et ajouter anticorps primaire. Incuber avec doux balancement pendant une nuit à 4 ° C.
• Ajouter une ou l'autre protéine des billes d'agarose A ou G (20 ul de suspension de billes à 50%). Incuber avec doux balancement pendant 1-3 heures à 4 ° C.
• Microcentrifugeuse pendant 30 secondes à 4 ° C. Laver culot cinq fois avec 500 pi de tampon de lyse cellulaire 1X. Gardez sur la glace lors de lavages.
• Remettre en suspension le culot avec 20 ul de tampon d'échantillon SDS 3X. Vortex, puis microcentrifugeuse pendant 30 secondes.
• Chauffer l'échantillon à 95-100 ° C pendant 2-5 minutes et microcentrifugeuse pendant 1 minute à 14 000 x g.
• Charger l'échantillon (15 à 30 ul) sur un gel SDS-PAGE (12-15%).
• Analyser l'échantillon par Western Blot.

analyse Western Blot avec UP50H appareil à ultrasons

protocole suivant a été utilisé dans l'étude de Kriebisch et al. (2011):
La protéine totale a été isolé à partir de cellules MC3T3-E1 traités avec 1,25 (OH)₂ré₃ (dix^-8 M) ou d'un véhicule. Les cellules ont été lysées avec un tampon contenant du Tris-HCl 50 mM, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% de dodécylsulfate de sodium (SDS) (Fisher Scientific); 1% d'IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) et 0,5% de désoxycholate de sodium (Merck). Le lysat cellulaire a été traitée aux ultrasons pendant 2 x 10 s au cycle 1 et l'amplitude 80 de la Processeur UP50H ultrasons (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Allemagne). Ensuite, le matériau a été centrifugé pendant 10 min à 14 000 tr / min et le surnageant a été utilisé pour le transfert Western. Vingt-cinq ug de protéine ont été bouillis dans un tampon d'échantillon et un agent réducteur (Invitrogen) et ensuite séparés par SDS-PAGE en utilisant 4-12% de gels de polyacrylamide (Invitrogen) et transférés sur une membrane de nitrocellulose (GE health care). La membrane a été bloquée pendant 1 h avec du TBS (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM) contenant 1% de caséine (Sigma-Aldrich) et 1% de Tris (1 M). Après blocage, la membrane a été incubée avec une légère agitation pendant une nuit à 4 ° C avec l'anticorps primaire (CBS 1/500 de lapin anti-humain, développé dans le laboratoire du Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). L'incubation avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HPR) (Dako) a été réalisée pendant 1 h à température ambiante. Tous les transferts ont été développés par chimiluminescence améliorée (Perkin Elmer).

Littérature / Références