Technologie des ultrasons Hielscher

Extraction des protéines par ultrasons des cultures de tissus et de cellules

  • L'extraction des protéines est une étape de préparation d'échantillon essentiel en protéomique.
  • Les protéines peuvent être extraites de tissus végétaux et animaux, les levures et les micro-organismes.
  • Le traitement par ultrasons est une méthode d'extraction de protéines fiable, efficace donnant des rendements en protéines dans un court laps de temps d'extraction.

 

Extraction de protéines à partir de tissus et de cellules

L'extraction des protéines à partir de tissus et cellules en culture est une étape de préparation d'échantillon essentielle qui est effectuée pendant de nombreuses techniques biochimiques et analytiques telles que ELISA, PAGE, Western blot, Spectrométrie de masse, ou la purification des protéines. Ultrasonique rupture des cellules, la lyse et l'extraction est une technique précisément contrôlable pour assurer des rendements élevés de protéines.

L'extraction des protéines à partir de tissus d'origine animale

Pour la préparation de tissus entiers (rein, coeur, poumon, muscle, etc.), le tissu doit être disséqué en très petits morceaux avec des outils propres, de préférence sur de la glace, et aussi rapidement que possible pour éviter la dégradation par les protéases (par ex. un tampon de lyse tel que RIPA ou un tampon de lyse hypotonique contenant une protease et un cocktail d'inhibiteur de phosphatase). Après dissection, l'échantillon est immergé dans de l'azote liquide pour un congélation rapide. L'échantillon peut être conservé à -80 ° C pour une utilisation ultérieure ou être conservé sur de la glace pour une homogénéisation immédiate. Immédiatement avant l'extraction par ultrasons, un tampon de lyse glacé (avec inhibiteurs de protéase DTT, leupeptine et aprotinine) est rapidement ajouté dans le tube à échantillon (pour ~ 10 mg de tissu environ ~ 600 μL de tampon sont recommandés). Environ. 20-60mg de tissu est recommandé par tube d'échantillon.
homogénéisation par ultrasons, la lyse et l'extraction est effectuée avec un homogénéisateur à ultrasons tel que le UP200Ht ou UP200St, Équipé d'un micro-pointe sonotrode. la durée de traitement par ultrasons est 60-90 sec. à un mode de cycle à ultrasons de 15 sec. sonication et 10 sec. temps de repos. L'échantillon doit être conservé dans la glace tout le temps.
Après homogénéisation / extraction à ultrasons, le lysat est centrifugé à 27,000g pendant env. 20 min. Ensuite, le surnageant est recueilli, de sorte que la concentration en protéine peut être déterminée par un dosage de protéine tel que dosage de protéines BCA de Pierce.

La sonication protéique est une méthode importante de préparation des échantillons.

Extraction ultrasonique de protéines à partir de cellules avec UP200St

Demande d'information





L'extraction des protéines du sérum sanguin

Pour un mélange homogène du sérum et du tampon phosphate, l'échantillon est vortexé avant la lyse des cellules ultrasonores. Pour la lyse par ultrasons, l'échantillon est soniqué avec un homogénéisateur de laboratoire à ultrasons tel que le UP100H pendant 8 cycles à amplitude de 20%, pour les cycles de toutes les 5 secondes et 15 secondes d'arrêt. Sonocation est réalisée par sonicationg en cycles et en plaçant l'échantillon sur de la glace de telle sorte qu'une surchauffe et une dégradation thermique de l'échantillon est évitée. Étant donné que le sérum contient une grande quantité de protéines de poids moléculaire élevé (tels que l'albumine, α1-antitrypsine, la transferrine, l'haptoglobine, immunoglobuline G et immunoglobuline A), qui interfèrent avec la séparation des protéines de faible poids moléculaire au cours de l'IEF, il est recommandé de les épuiser à partir du sérum en utilisant une colonne d'épuisement.

L'extraction des protéines à partir de tissus végétaux

tissu végétal frais, doux, par exemple, mousse, etc., peut être facilement perturbé en plaçant simplement l'échantillon haché dans un tampon de lyse pour sonication. Difficiles, les tissus végétaux ligenous, tels que les semences, les aiguilles de sapin, etc., doivent être broyés à sec. Certains disques, des matériaux végétaux ligneux doivent être congelés et broyés dans l'azote liquide avant d'être extraite par sonication. Pour des suspensions de culture de cellules de plante, un traitement aux ultrasons entre 30 et 150 secondes dans un tampon de lyse est le plus souvent suffisant. matériau plus résistant comme les graines de citrouille nécessitent une sonication plus intense comme décrit ci-dessous.

Protocole pour l'extraction par ultrasons de l'albumine à partir de graines de citrouille

homogénéisateur tissu ultrasonique UP400St avec S24d40 - pour l'extraction des protéines à partir de tissus végétaux et animaux (Cliquez pour agrandir!)Pour l'extraction des protéines par ultrasons de l'albumine à partir de poudre de graines de citrouille finement moulu, 10 g de poudre de graines de citrouille dégraissée et 100 mL d'eau désionisée en tant que solvant sont ajoutés dans un bêcher en verre de 250 ml. L'extraction de la protéine consiste en deux étapes: d'abord, l'échantillon est traité par ultrasons avec un appareil à ultrasons de type sonde UP400St (400W, 24kHz) avec sonotrode montée S24d7. Le bêcher en verre est placé dans un bain d'eau froide au cours de l'homogénéisation par ultrasons. Le réglage du appareil à ultrasons UP400St Avec le capteur de température enfichable, la température de l'échantillon est toujours maintenue en dessous de 30 ° C. Par le contrôle précis de la température pendant la sonication, une dénaturation de l'albumine est évitée. Deuxièmement, l'extraction a été effectuée avec un mélangeur à une vitesse de 200 tr / min et à 30 ° C. Ensuite, le bécher est transféré dans un agitateur thermostatique. La globuline est éliminée par dialyse avec de l'eau distillée. Après l'élimination de la globuline, l'extrait protéique peut être échantillonné pour la détermination du profil d'albumine et est ensuite ajusté à pI = 3,0 en utilisant 0,1 M HCl pour la coagulation de l'albumine. La phase solide est séparée par centrifugation à 5000g, 20 ° C et redissoute dans de l'eau désionisée. La coagulation de l'albumine est effectuée deux fois pour augmenter le taux de protéines dans le concentré d'albumine.

extraction de protéines alcalin à ultrasons pour la préparation d'un concentré de protéines à partir de son de riz montre que les résultats de traitement par ultrasons dans le rendement en protéines plus élevée en un temps significativement plus court extraction – par rapport aux procédés classiques d'extraction.

Appareil à ultrasons VialTweeter pour l'extraction des protéines à partir d'échantillons de tissus (Cliquez pour agrandir!)

VialTweeter pour sonication indirecte.

avantages

  • rapide
  • rendements élevés
  • très efficace
  • Un contrôle précis de paramètres
  • des résultats reproductibles
  • évolutivité linéaire

protocole de préparation des échantillons pour l'enzyme iNOS fonctionnelle

Pour obtenir l'enzyme iNOS entièrement fonctionnel (par exemple pour le dépistage de drogues), le protocole suivant est recommandé: La suspension cellulaire doit être placé sur de la glace et de sonication avec un UP100H à une amplitude de 10 pm au mode de cycle de 5 sec. sonication et 25 sec. reposer sur la glace. La procédure doit être répétée environ. 3 fois. Le temps de repos entre les cycles de sonication réduit l'élévation de température et réduira donc le risque de dénaturation.

Ultrasons protéines Solubilisation

Sonication peut accélérer le processus de solubilisation de protéines, ce qui nécessite généralement plusieurs heures. Afin de ne pas surchauffer l'échantillon et de prévenir la dégradation des protéines et des modifications dans les solutions contenant de l'urée, les rafales à ultrasons ne doivent pas durer plus de quelques secondes.

Instructions générales

Contrôle de la température: Afin d'assurer un rendement élevé de protéines sans dénaturation thermique, la température pendant l'extraction doivent être contrôlées. de Hielscher état de l'art des homogénéisateurs à ultrasons – également appelé désintégrateur ultrasonique ou sonificator – sont précisément contrôlable. Ils viennent avec un capteur de température embrochable. Dans les options de réglage de l'homogénéisateur à ultrasons, une température maximale peut être réglée. Lorsque cette température maximale est atteinte, l'appareil à ultrasons arrête automatiquement jusqu'à ce que l'échantillon soit refroidi.
Tampon: Le choix d'un tampon approprié et le bon volume de tampon varie d'un tissu à et doit être compris, par des tests d'essais et d'erreurs.
Isolement / purification: Les lysats protéiques peuvent contenir un excès de biomolécules telles que des ADN ou des hydrates de carbone, qui peuvent être éliminés par précipitation de la protéine (acide désoxycholate-trichloroacétique) ou un échange de tampon.

Chittapalo et Noomhorm (2009) ont rapporté que le rendement en protéines a augmenté en utilisant sonication et que le processus d'homogénéisation et la lyse des tissus par ultrasons peut améliorer les processus d'extraction existants de manière significative – permettant de nouvelles possibilités d'exploitation commerciale.

protection sonore avec l'enceinte acoustique de Hielscher SPB-L et le dispositif à ultrasons UP200St. (Cliquez pour agrandir!)

homogénéisateur de tissus par ultrasons UP200St pour l'extraction efficace des protéines

Un contrôle précis du traitement par ultrasons (Cliquez pour agrandir!)

le contrôle du navigateur pour un fonctionnement précis et le contrôle du processus de sonication

Equipement ultrasonique pour l'extraction des protéines

Hielscher Ultrasonics offre une large gamme de homogénéisateurs à ultrasons pour la désintégration des cellules, des tissus, des bactéries, des micro-organismes, des levures et des spores.
ultrasonicators de laboratoire Hielscher sont puissants et faciles à utiliser. Conçu pour un fonctionnement 24/7, ils sont conçus comme robustes et efficaces appareils haut banc de laboratoire et. Pour tous les appareils peuvent être contrôlés avec précision la production d'énergie et l'amplitude. La large gamme de Accessoires ouvre de nouvelles options de configuration. Les appareils numériques tels que VialTweeter, UP200Ht, UP200St, et UP400St avoir un contrôle de la température intégré et un haut-carte SD pour l'enregistrement automatique des données.
Pour les effets indirects, sans contamination croisée et sonication simultanée de plusieurs échantillons, nous offrons la VialTweeter ou la cuphorn à ultrasons.
En fonction de votre application, le matériel et le volume de l'échantillon, nous vous recommandons la configuration la plus appropriée pour votre préparation d'échantillons. Contactez-nous dès aujourd'hui!

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Littérature / Références

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic extraction assistée alcalin de protéine à partir de son de riz dégraissé et les propriétés des concentrés de protéines. Int J Food Sei Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes, André E.S:; Pereira, Diane M;. Amaral, Joan. Nunes, Ana M;. Gomes, Sofia E. Roberts, Peter M;. Lo, Adrian C. D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J;. Thibodeau, Stephen C. Borralho, Peter M;. Rodrigues, Cecilia M. P. (2013): récupération efficace de protéines à partir de plusieurs échantillons de source après Trizol LS ou Trizol extraction d'ARN et le stockage à long terme. BMC Genomics, 2013, 14: 181.


Qu'il faut savoir

protéomique

Est le domaine Proteomics de recherche qui étudie les protéines et le protéome. Les protéines fullfil une vaste gamme de fonctions vitales dans les organismes. Le protéome est l'ensemble des protéines exprimées par un génome, une cellule, un tissu ou un organisme à un moment donné. Le protéome varie avec le temps et des exigences distinctes, ou souligne qu'une cellule ou un organisme subit. Plus précisément, il est l'ensemble des protéines exprimées dans un type donné de cellule ou un organisme, à un moment donné, dans des conditions définies. Le terme est un mélange de protéines et génome. Proteomics est l'étude du protéome.

Protéine

Les protéines sont sont grandes biomolécules, macromolécules soi-disant – qui sont composés d'une ou plusieurs longues chaînes de résidus d'acides aminés. Les protéines sont présentes dans tous les organismes d'origine végétale et animale et sont cruciales pour la plupart des fonctions biologiques. Comme les protéines contiennent beaucoup d'informations biologiques, elles sont extraites à des fins analytiques, par exemple pour la recherche protéomique. La fonction la plus importante des protéines est la catalyse des réactions métaboliques, la réplication de l'ADN, la réponse aux stimuli et le transport des molécules d'un endroit à l'autre. Les protéines diffèrent les unes des autres principalement dans leur séquence d'acides aminés, qui est dictée par la séquence nucléotidique de leurs gènes, et qui entraîne habituellement le repliement des protéines dans une structure tridimensionnelle spécifique qui détermine son activité. Les protéines sont – En plus des peptides – l'un des éléments clés de la nourriture. Par conséquent, la protéomique est un outil puissant dans la science alimentaire pour optimiser les processus, la sécurité et l'évaluation nutritionnelle des aliments.

gel Electrophoresis

L'électrophorèse sur gel est la principale méthode pour la séparation et l'analyse des macromolécules telles que l'ADN, l'ARN et des protéines, ainsi que leurs fragments, en fonction de leur taille et de la charge. Il est utilisé dans la chimie clinique pour séparer les protéines en charge et / ou de la taille (IEF agarose, la taille essentiellement indépendante) et en biochimie, biologie moléculaire et de la protéomique pour séparer une population mixte de fragments d'ADN et d'ARN par longueur, pour estimer la taille de l'ADN et des fragments d'ARN ou pour la séparation des protéines par la charge.

Cultures cellulaires

La culture cellulaire est le processus de croissance contrôlée par lequel les cellules sont cultivées dans des conditions contrôlées. conditions de culture cellulaire varient pour chaque type de cellule. En général, le milieu de culture cellulaire est constitué d'un récipient approprié (par exemple de boîte de Petri) avec un substrat ou support qui fournit les éléments nutritifs essentiels (acides aminés, glucides, vitamines, minéraux), des facteurs de croissance, les hormones, et les gaz (CO2, La2), Et régule l'environnement physico-chimique (tampon de pH, la pression osmotique, température). La plupart des cellules ont besoin d'une surface ou d'un substrat artificiel, tandis que d'autres cultures de cellules peuvent être cultivées libre flottant dans un milieu de culture (culture en suspension, la suspension cellulaire).
cultures de masse de lignées cellulaires animales sont utilisés dans la production industrielle de vaccins viraux et d'autres produits dérivés biotechnologiquement. Les cellules souches humaines sont cultivées pour augmenter le nombre de cellules et de différencier les cellules dans différents types de cellules somatiques à des fins de transplantation.

Des échantillons de tissus

Le tissu terme décrit un intermédiaire cellulaire, où le matériau cellulaire est sur un niveau de l'organisation entre les cellules et un organe complet. Dans les tissus, les cellules semblables, de la même origine qui, ensemble, réaliser une fonction spécifique, sont assemblés. Le groupement fonctionnel de plusieurs tissus, les structures complexes des organes sont formés.
Le tissu est prélevé pour la recherche en biologie, histologie / histopathologie, parasitologie, la biochimie, l'immunohistochimie, ainsi que de cultiver et d'extraire l'ADN. Elle se distingue entre l'animal (subdivision: tissu mammifère) et un tissu végétal. Les tissus animaux sont regroupés dans les quatre principaux types de conjonctifs, les muscles, nerveux, et le tissu épithélial. Le tissu végétal est subdivisé en trois systèmes de tissus suivants: l'épiderme, le tissu du sol, et le tissu vasculaire.
Des échantillons de tissus peuvent être préparés à partir de parties animales ou végétales, par exemple os, les muscles, les feuilles, etc.

Fluides corporels

Le sang, le sérum, le plasma, le liquide céphalorachidien, la salive et le liquide synovial sont fluides corporels, qui offrent une grande source d'information pertinente pour le diagnostic. Par conséquent, une préparation sophistiquée d'échantillons de fluide corporel pour l'analyse est importante. La première difficulté est liée à la large plage dynamique des composants présents dans les fluides corporels.

Détermination de la concentration en protéines

dosage de Bradford, Lowry et dosage dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) sont des essais courants pour déterminer la concentration de protéines. sérum-albumine bovine (BSA) est l'un de la norme de protéines les plus fréquemment utilisés.

tampon de lyse

un tampon de lyse doit être choisie en fonction de la matière cellulaire ou tissulaire (culture de tissus, plantes, bactéries, champignons, etc.), et si les cellules sont dans une structure et le type de structure. Une large gamme de lyse des tampons pour l'extraction des protéines, les membranes et les organites sont formulés avec un ou plusieurs détergents. Le détergent est habituellement choisie par des tests d'essais et d'erreurs ou – si disponible – selon un protocole d'extraction des protéines existant. Le détergent doit être compatible avec la source de tissu et les protéines. En général, le détergent doux qui fonctionne pour un tissu / protéine spécifique, est choisie de manière à maintenir la fonctionnalité maximale de l'extrait. En outre, dans le cas d'une extraction des membranes et organites, un détergent doux maintient la membrane intacte. détergents couramment utilisés dans les tampons de lyse sont essentiellement non ionique ou zwitterionique, par exemple, CHAPS, désoxycholate, Triton ™ X-100, NP40 et Tween 20.
Par exemple, les tissus tels que le cerveau, le foie, les intestins, les reins, la rate, etc., peuvent être simplement mises en mémoire tampon avec RIPA – cependant des inhibiteurs de la protéase et du DTT (par exemple pour l'électrophorèse sur gel) devraient être inclus.
un tampon de lyse pour le tissu de muscle squelettique (glacé): 20 mM de Tris (pH 7,8), 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1% de Triton X-100, 10% (p / v) de glycerol, EDTA 1 mM , 1 mM de dithiothréitol additionné de protéase et un inhibiteur de phosphatase cocktail
Table des tampons ordinaires et leur gamme de pH. En général, ces tampons sont normalement utilisés à des concentrations de 20 à 50 mM.

Tampon plage de pH
Acide citrique – NaOH 2,2 – 6.5
Citrate de sodium – Acide citrique 3,0 – 6.2
L'acétate de sodium – acide acétique 3.6 – 5,6
sel de sodium de l'acide cacodylique – HCl 5.0 – 7.4
SEM – NaOH 5,6 – 6.8
dihydrogénophosphate de sodium – phosphate d'hydrogène disodique 5,8 – 8.0
imidazole – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
chlorhydrate de Triéthanolamine – NaOH 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
HÉPES – NaOH 7.2 – 8.2
tricine – NaOH 7.6 – 8.6
tétraborate de sodium – acide borique 7.6 – 9.2
bicine – NaOH 7.7 – 8,9
glycine – NaOH 8.6 – 10,6

La plupart des tampons montrent un pH-dépendance avec la température. Cela est particulièrement vrai pour les tampons Tris. Le pKa passe de 8,06 à 25 ° C à 8,85 à 0 ° C.
(PH et pKa d'un tampon: pH mesure la concentration d'ions hydrogène dans une solution aqueuse pKa (= constante de dissociation acide) est une mesure apparentée, mais plus spécifique, en ce sens qu'elle permet de prédire comment une molécule agira à une spécifique. PH.)

TRIzol

TRIzol est une solution de produit chimique utilisé pour extraire l'ARN / ADN / protéine pendant l'extraction guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme. L'utilisation des résultats d'extraction assistée par ultrasons Trizol dans l'ADN de haut, l'ARN et les rendements en protéines du même échantillon et excelle ainsi d'autres méthodes d'extraction.