Extraction de protéines par ultrasons à partir de tissus et de cultures cellulaires
- L’extraction de protéines est une étape essentielle de la préparation des échantillons en protéomique.
- Les protéines peuvent être extraites de tissus végétaux et animaux, de levures et de micro-organismes.
- La sonication est une méthode fiable et efficace d’extraction de protéines qui permet d’obtenir des rendements élevés en protéines en un temps d’extraction court.
Extraction de protéines à partir de tissus et de cellules
L’extraction de protéines à partir de tissus et de cellules en culture est une étape essentielle de la préparation des échantillons, réalisée dans le cadre de nombreuses techniques biochimiques et analytiques telles que l’ELISA, la PAGE, le Western blot, la spectrométrie de masse ou la purification de protéines. La désintégration cellulaire, la lyse et l’extraction par ultrasons constituent une technique non thermique, contrôlable avec précision, qui garantit des rendements élevés en protéines.
Extraction de protéines à partir de cellules avec la sonde à ultrasons UP200St
- Rapide
- Rendements élevés
- Très efficace
- Contrôle précis des paramètres
- Résultats reproductibles
- Mise à l’échelle linéaire
Instructions générales pour la lyse et l’extraction de protéines par ultrasons
- Contrôle de la température : Pour garantir un rendement élevé en protéines sans dénaturation thermique, la température doit être contrôlée pendant l’extraction. Les homogénéisateurs à ultrasons de pointe de Hielscher – également appelés désintégrateurs à ultrasons ou sonificateurs – sont contrôlables avec précision. Ils sont équipés d’un capteur de température enfichable. Une température maximale peut être définie dans les options de réglage de l’homogénéisateur à ultrasons. Lorsque cette température maximale est atteinte, l’appareil à ultrasons s’arrête automatiquement jusqu’à ce que l’échantillon ait refroidi.
- Tampon : Le choix d’un tampon adapté et du volume de tampon approprié varie d’un tissu à l’autre et doit être déterminé par des essais successifs.
- Isolement / purification : Les lysats protéiques peuvent contenir un excès de biomolécules telles que l’ADN ou les glucides, qui peuvent être éliminées par précipitation des protéines (désoxycholate–acide trichloroacétique) ou par échange de tampon.
Chittapalo et Noomhorm (2009) ont rapporté dans leur étude que le rendement en protéines augmentait avec la sonication et que le procédé d’homogénéisation et de lyse des tissus par ultrasons pouvait améliorer considérablement les procédés d’extraction existants – ouvrant ainsi de nouvelles possibilités d’extraction à l’échelle commerciale.
CupHorn à ultrasons pour la préparation simultanée et très efficace de plusieurs échantillons dans les mêmes conditions, pour l’isolement des protéines et la fragmentation de l’ADN.
Extraction de protéines à partir de tissus animaux
Pour la préparation d’un tissu entier (par exemple rein, cœur, poumon, muscle, etc.), le tissu doit être découpé en très petits morceaux avec des outils propres, de préférence sur glace et aussi rapidement que possible, afin d’éviter sa dégradation par les protéases (par exemple avec un tampon de lyse tel que le RIPA ou un tampon de lyse hypotonique contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases). Après la découpe, l’échantillon est immergé dans de l’azote liquide pour une congélation instantanée. L’échantillon peut être conservé à -80°C pour une utilisation ultérieure ou maintenu sur glace pour une homogénéisation immédiate. Juste avant l’extraction par ultrasons, un tampon de lyse glacé (contenant les inhibiteurs de protéases DTT, leupeptine et aprotinine) est rapidement ajouté au tube contenant l’échantillon (environ ~600 μL de tampon sont recommandés pour ~10 mg de tissu). Environ 20–60mg de tissu sont recommandés par tube d’échantillon.
L’homogénéisation, la lyse et l’extraction par ultrasons sont réalisées avec un homogénéisateur à ultrasons tel que l’UP100H ou l’UP200Ht, équipé d’une sonotrode à micropointe. La durée de sonication est de 60–90 sec., en mode cyclique avec 15 sec. de sonication et 10 sec. de repos. L’échantillon doit être maintenu dans la glace en permanence.
Après l’homogénéisation / l’extraction par ultrasons, le lysat est centrifugé à 27 000g pendant environ 20 min. Le surnageant est ensuite recueilli afin de déterminer la concentration en protéines par un dosage protéique tel que le dosage BCA de Pierce.
Extraction de protéines à partir du sérum sanguin
Pour obtenir un mélange homogène du sérum et du tampon phosphate, l’échantillon est d’abord agité au vortex avant la lyse cellulaire par ultrasons. Pour la lyse par ultrasons, l’échantillon est soniqué avec un homogénéisateur à ultrasons de laboratoire tel que l’UP100H pendant 8 cycles à 20% d’amplitude, chaque cycle comprenant 5 secondes de fonctionnement et 15 secondes d’arrêt. L’extraction de protéines est réalisée par sonication en cycles (mode pulsé), en plaçant l’échantillon sur glace afin d’éviter sa surchauffe et sa dégradation thermique. Le sérum contenant une grande quantité de protéines de masse moléculaire élevée (telles que l’albumine, l’α1-antitrypsine, la transferrine, l’haptoglobuline, l’immunoglobuline G et l’immunoglobuline A), qui interfèrent avec la séparation des protéines de faible masse moléculaire lors de l’IEF, il est recommandé de les éliminer du sérum à l’aide d’une colonne de déplétion.
Extraction de protéines à partir de tissus végétaux
Les tissus végétaux frais et tendres, tels que les mousses, peuvent être facilement désintégrés en plaçant simplement l’échantillon haché dans un tampon de lyse pour la sonication. Les tissus végétaux résistants et lignifiés, tels que les graines, les aiguilles de sapin, etc., doivent être broyés à sec. Certains matériaux végétaux durs et ligneux doivent être congelés et broyés dans de l’azote liquide avant l’extraction par sonication. Pour les suspensions de cultures de cellules végétales, un traitement par ultrasons de 30 à 150 secondes dans un tampon de lyse est généralement suffisant. Les matériaux plus résistants, tels que les graines de courge, nécessitent une sonication plus intense, comme décrit ci-dessous.
Protocole d’extraction de l’albumine des graines de courge par ultrasons
Pour l’extraction de l’albumine par ultrasons à partir de poudre de graines de courge finement broyées, 10 g de poudre de graines de courge dégraissées et 100 mL d’eau déionisée utilisée comme solvant sont ajoutés dans un bécher en verre de 250mL. L’extraction des protéines comporte deux étapes : tout d’abord, l’échantillon est soniqué avec un appareil à ultrasons à sonde UP400St (400W, 24kHz) équipé de la sonotrode S24d7. Le bécher en verre est placé dans un bain d’eau froide pendant l’homogénéisation par ultrasons. Le capteur de température enfichable et les réglages de contrôle de la température de l’appareil à ultrasons UP400St garantissent que la température de l’échantillon reste toujours inférieure à 30°C. Le contrôle précis de la température pendant la sonication évite la dénaturation de l’albumine. Dans un deuxième temps, l’extraction a été réalisée avec un mélangeur à une vitesse de 200 rpm et à 30°C. Le bécher est ensuite transféré dans un agitateur thermostaté. La globuline est éliminée par dialyse avec de l’eau distillée. Après l’élimination de la globuline, un prélèvement de l’extrait protéique peut être effectué pour déterminer le profil de l’albumine, puis l’extrait est ajusté à pI=3,0 avec du HCl 0,1 M pour provoquer la coagulation de l’albumine. La phase solide est séparée par centrifugation à 5000g, 20°C, puis redissoute dans de l’eau déionisée. La coagulation de l’albumine est effectuée deux fois afin d’augmenter la proportion de protéines dans le concentré d’albumine.
L’extraction alcaline de protéines par ultrasons pour la préparation de concentré protéique à partir de son de riz montre que le traitement par ultrasons permet d’obtenir un rendement en protéines plus élevé en un temps d’extraction nettement plus court – par rapport aux méthodes d’extraction conventionnelles.
Protocole de préparation des échantillons pour une enzyme iNOS fonctionnelle
Pour obtenir une enzyme iNOS pleinement fonctionnelle (par exemple pour le criblage de médicaments), le protocole suivant est recommandé : la suspension cellulaire doit être placée sur glace et soniquée avec un UP100H à une amplitude de 10µm, en mode cyclique avec 5 sec. de sonication et 25 sec. de repos sur glace. La procédure doit être répétée environ 3 fois. Le temps de repos entre les cycles de sonication réduit l’élévation de la température et diminue donc le risque de dénaturation.
Solubilisation des protéines par ultrasons
La sonication peut accélérer le processus de solubilisation des protéines, qui nécessite généralement plusieurs heures. Afin de ne pas surchauffer l’échantillon et d’éviter la dégradation et les modifications des protéines dans les solutions contenant de l’urée, les impulsions ultrasonores ne doivent pas durer plus de quelques secondes.
Appareil à ultrasons UP200Ht avec micropointe S26d2 de 2mm pour la sonication de petits échantillons.
Équipements à ultrasons pour l’extraction de protéines
Hielscher Ultrasonics propose une vaste gamme d’homogénéisateurs à ultrasons pour la désintégration des cellules, des tissus, des bactéries, des micro-organismes, des levures et des spores.
Les appareils à ultrasons de laboratoire Hielscher sont puissants et faciles à utiliser. Conçus pour fonctionner 24/7, ce sont des appareils de laboratoire et de paillasse robustes et efficaces. Pour tous les appareils, l’énergie délivrée et l’amplitude peuvent être contrôlées avec précision. La vaste gamme d’accessoires offre des possibilités de configuration supplémentaires. Les appareils à ultrasons numériques tels que le VialTweeter, l’UP200Ht, l’UP200St et l’UP400St disposent d’un contrôle intégré de la température et d’une carte SD intégrée pour l’enregistrement automatique des données.
Pour la sonication indirecte, simultanée et sans contamination croisée de plusieurs échantillons, nous proposons le VialTweeter ou le CupHorn à ultrasons.
Le tableau ci-dessous présente nos appareils à ultrasons pour la préparation des échantillons, la désintégration cellulaire et l’extraction. Cliquez sur le type d’appareil pour obtenir davantage d’informations sur chaque homogénéisateur à ultrasons. Notre personnel technique, bien formé et fort de nombreuses années d’expérience, se fera un plaisir de vous aider à choisir l’appareil à ultrasons le mieux adapté à la préparation de vos échantillons !
| Volume par lot | Débit | Appareils recommandés |
|---|---|---|
| jusqu’à 10 flacons ou tubes | sans objet | VialTweeter |
| plaques multipuits / de microtitration | sans objet | UIP400MTP |
| plusieurs tubes / récipients | sans objet | CupHorn |
| 1 à 500mL | 10 à 200mL/min | UP100H |
| 10 à 1000mL | 20 à 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 à 2000mL | 20 à 400mL/min | UP400St |
En fonction de votre application, du matériau et du volume de l’échantillon, nous vous recommanderons la configuration la mieux adaptée à la préparation de vos échantillons. Contactez-nous dès aujourd’hui !
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Les appareils à ultrasons numériques Hielscher disposent d’une commande à distance par navigateur et d’un enregistrement automatique des données sur une carte SD intégrée.
VialTweeter pour la sonication indirecte.
Informations utiles
Protéomique
La protéomique est le domaine de recherche qui étudie les protéines et le protéome. Les protéines remplissent une multitude de fonctions vitales au sein des organismes. Le protéome est l’ensemble des protéines exprimées par un génome, une cellule, un tissu ou un organisme à un moment donné. Le protéome varie au fil du temps et selon les besoins particuliers ou les contraintes auxquels une cellule ou un organisme est soumis. Plus précisément, il s’agit de l’ensemble des protéines exprimées dans un type donné de cellule ou d’organisme, à un moment donné et dans des conditions définies. Le terme combine les mots protéines et génome. La protéomique est l’étude du protéome.
Protéine
Les protéines sont de grandes biomolécules, appelées macromolécules – composées d’une ou de plusieurs longues chaînes de résidus d’acides aminés. Les protéines sont présentes dans tous les organismes d’origine végétale et animale et sont essentielles à la plupart des fonctions biologiques. Comme les protéines contiennent beaucoup d’informations biologiques, elles sont extraites à des fins analytiques, par exemple pour la recherche en protéomique. Parmi les fonctions les plus importantes assurées par les protéines figurent la catalyse des réactions métaboliques, la réplication de l’ADN, la réponse aux stimuli et le transport de molécules d’un endroit à un autre. Les protéines diffèrent principalement les unes des autres par leur séquence d’acides aminés, qui est déterminée par la séquence nucléotidique de leurs gènes et qui entraîne généralement leur repliement en une structure tridimensionnelle spécifique déterminant leur activité. Les protéines constituent – avec les peptides – l’un des composants essentiels des aliments. La protéomique est donc un outil puissant en science des aliments pour optimiser les procédés, la sécurité alimentaire et l’évaluation nutritionnelle.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction est une procédure préanalytique permettant de séparer et de préconcentrer les analytes. Associée aux ultrasons, l’extraction au point de trouble peut être intensifiée, ce qui rend le procédé plus efficace, plus rapide et plus respectueux de l’environnement. Avec les ultrasons, l’extraction au point de trouble est une méthode nettement plus efficace de préparation des analytes. En savoir plus sur l’extraction au point de trouble assistée par ultrasons !
Électrophorèse sur gel
L’électrophorèse sur gel est la principale méthode de séparation et d’analyse des macromolécules telles que l’ADN, l’ARN et les protéines, ainsi que de leurs fragments, selon leur taille et leur charge. Elle est utilisée en chimie clinique pour séparer les protéines selon leur charge et/ou leur taille (IEF sur agarose, essentiellement indépendante de la taille) et en biochimie, en biologie moléculaire et en protéomique pour séparer une population mixte de fragments d’ADN et d’ARN selon leur longueur, estimer la taille des fragments d’ADN et d’ARN ou séparer les protéines selon leur charge.
Cultures cellulaires
La culture cellulaire est le processus de croissance contrôlée par lequel des cellules sont cultivées dans des conditions maîtrisées. Les conditions de culture cellulaire varient selon le type de cellule. En général, l’environnement d’une culture cellulaire comprend un récipient adapté (par exemple une boîte de Petri) contenant un substrat ou un milieu qui fournit les nutriments essentiels (acides aminés, glucides, vitamines, minéraux), les facteurs de croissance, les hormones et les gaz (CO2, O2), et régule l’environnement physicochimique (tampon de pH, pression osmotique, température). La plupart des cellules ont besoin d’une surface ou d’un substrat artificiel, tandis que d’autres cultures cellulaires peuvent être cultivées en suspension libre dans le milieu de culture (culture en suspension, suspension cellulaire).
Les cultures à grande échelle de lignées cellulaires animales sont utilisées dans la production industrielle de vaccins viraux et d’autres produits issus de la biotechnologie. Les cellules souches humaines sont cultivées pour augmenter le nombre de cellules et les différencier en divers types de cellules somatiques à des fins de transplantation.
Échantillons de tissus
Le terme tissu désigne un ensemble cellulaire intermédiaire, dans lequel le matériel cellulaire se situe à un niveau d’organisation entre les cellules et un organe complet. Dans un tissu, des cellules similaires, de même origine et assurant ensemble une fonction spécifique, sont regroupées. Le regroupement fonctionnel de plusieurs tissus forme les structures complexes des organes.
Des tissus sont prélevés pour la recherche en biologie, en histologie/histopathologie, en parasitologie, en biochimie et en immunohistochimie, ainsi que pour la mise en culture et l’extraction d’ADN. On distingue les tissus animaux (sous-catégorie : tissus de mammifères) et les tissus végétaux. Les tissus animaux sont regroupés en quatre types fondamentaux : tissu conjonctif, musculaire, nerveux et épithélial. Les tissus végétaux sont subdivisés en trois systèmes tissulaires : l’épiderme, le tissu fondamental et le tissu vasculaire.
Les échantillons de tissus peuvent être préparés à partir de parties animales ou végétales, par exemple les os, les muscles, les feuilles, etc.
Liquides biologiques
Le sang, le sérum, le plasma, le liquide cérébrospinal, la salive et le liquide synovial sont des liquides biologiques qui constituent une riche source d’informations pertinentes pour le diagnostic. Une préparation rigoureuse des échantillons de liquides biologiques pour l’analyse est donc importante. La première difficulté est liée à la large plage dynamique des composants présents dans les liquides biologiques.
Détermination de la concentration en protéines
Le dosage de Bradford, le dosage de Lowry et le dosage à l’acide bicinchoninique (BCA) sont des méthodes courantes pour déterminer la concentration en protéines. L’albumine sérique bovine (BSA) est l’un des étalons protéiques les plus fréquemment utilisés.
Tampon de lyse
Le tampon de lyse doit être choisi en fonction du matériel cellulaire ou du tissu (culture tissulaire, plante, bactéries, champignons, etc.), ainsi que de la présence éventuelle des cellules au sein d’une structure et du type de structure. Une vaste gamme de tampons de lyse destinés à l’extraction des protéines, des membranes et des organites est formulée avec un ou plusieurs détergents. Le détergent est généralement sélectionné par des essais successifs ou – lorsqu’il existe – selon un protocole d’extraction de protéines établi. Le détergent doit être compatible avec le tissu d’origine et les protéines. En général, on choisit le détergent le plus doux qui soit efficace pour un tissu / une protéine spécifique, afin de préserver au maximum la fonctionnalité de l’extrait. De plus, lors de l’extraction de membranes et d’organites, un détergent doux maintient la membrane intacte. Les détergents couramment utilisés dans les tampons de lyse sont principalement non ioniques ou zwitterioniques, par exemple CHAPS, désoxycholate, Triton™ X-100, NP40 et Tween 20.
Par exemple, des tissus tels que le cerveau, le foie, l’intestin, le rein, la rate, etc., peuvent simplement être placés dans un tampon RIPA – mais des inhibiteurs de protéases et du DTT (par exemple pour l’électrophorèse sur gel) doivent être ajoutés.
Tampon de lyse pour le tissu musculaire squelettique (glacé) : 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) de glycérol, 1 mM EDTA, 1 mM de dithiothréitol, complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases
Tableau des tampons courants et de leur plage de pH. En général, ces tampons sont habituellement utilisés à des concentrations de 20–50 mM.
| Tampon | Plage de pH |
|---|---|
| Acide citrique – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Citrate de sodium – acide citrique | 3,0 – 6,2 |
| Acétate de sodium – acide acétique | 3,6 – 5,6 |
| Sel de sodium de l’acide cacodylique – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Dihydrogénophosphate de sodium – hydrogénophosphate disodique | 5,8 – 8,0 |
| Imidazole – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Chlorhydrate de triéthanolamine – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricine – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Tétraborate de sodium – acide borique | 7,6 – 9,2 |
| Bicine – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glycine – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Le pH de la plupart des tampons dépend de la température. Cela est particulièrement vrai pour les tampons Tris. Le pKa passe de 8,06 à 25°C à 8,85 à 0°C.
(pH et pKa d’un tampon : le pH mesure la concentration en ions hydrogène dans une solution aqueuse. Le pKa (= constante de dissociation acide) est une mesure apparentée, mais plus spécifique, qui aide à prévoir le comportement d’une molécule à une valeur de pH donnée.)
TRIzol
TRIzol est une solution chimique utilisée pour extraire l’ARN/ADN/les protéines lors de l’extraction au thiocyanate de guanidinium–phénol–chloroforme. L’extraction au TRIzol assistée par ultrasons permet d’obtenir des rendements élevés en ADN, en ARN et en protéines à partir du même échantillon et surpasse ainsi les autres méthodes d’extraction.
Bibliographie/Références
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.