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Extraction ultrasonique de protéines à partir de tissus et de cultures cellulaires

  • L'extraction des protéines est une étape essentielle de la préparation des échantillons en protéomique.
  • Les protéines peuvent être extraites de tissus végétaux et animaux, de levures et de micro-organismes.
  • La sonication est une méthode d'extraction de protéines fiable et efficace qui permet d'obtenir des rendements élevés en protéines dans un temps d'extraction court.

Extraction de protéines à partir de tissus et de cellules

L'extraction de protéines à partir de tissus et de cellules cultivées est une étape essentielle de la préparation des échantillons qui est réalisée au cours de nombreuses techniques biochimiques et analytiques telles que l'ELISA, la PAGE, le Western blotting, la spectrométrie de masse ou la purification des protéines. La désintégration, la lyse et l'extraction des cellules par ultrasons est une technique non thermique, contrôlable avec précision, qui permet d'obtenir des rendements élevés en protéines.

Demande d'information







Les ultrasons de type sonde tels que l'UP200St sont des homogénéisateurs de tissus fiables et largement utilisés pour la préparation d'échantillons dans la recherche génétique et protéomique.

Extraction de protéines à partir de cellules avec le sonde à ultrasons UP200St

Avantages de la lyse ultrasonique et de l'extraction des protéines
 

  • Rapide
  • des rendements élevés
  • Très efficace
  • Contrôle précis des paramètres
  • des résultats reproductibles
  • évolutivité linéaire

Instructions générales pour la lyse ultrasonique et l'extraction des protéines

  • Contrôle de la température : Pour garantir un rendement élevé en protéines sans dénaturation thermique, la température pendant l'extraction doit être contrôlée. Les homogénéisateurs ultrasoniques de pointe de Hielscher – également appelé désintégrateur à ultrasons ou ultrasonificateur – sont contrôlables avec précision. Ils sont équipés d'une sonde de température enfichable. Dans les options de réglage de l'homogénéisateur à ultrasons, une température maximale peut être définie. Lorsque cette température maximale est atteinte, l'homogénéisateur à ultrasons s'arrête automatiquement jusqu'à ce que l'échantillon ait refroidi.
  • Tampon : Le choix d'un tampon approprié et du volume adéquat de tampon varie d'un tissu à l'autre et doit être déterminé par des essais et des erreurs.
  • Isolement / purification : Les lysats de protéines peuvent contenir un excès de biomolécules telles que l'ADN ou les hydrates de carbone, qui peuvent être éliminés par précipitation des protéines (acide désoxycholate-trichloracétique) ou par échange de tampons.

Chittapalo et Noomhorm (2009) ont rapporté dans leur étude que le rendement en protéines augmentait grâce à la sonication et que le processus d'homogénéisation et de lyse des tissus par ultrasons pouvait améliorer de manière significative les processus d'extraction existants. – permettant de nouvelles possibilités d'extraction commerciale.
 

Cornet à ultrasons pour la préparation simultanée de plusieurs échantillons dans les mêmes conditions pour l'isolement des protéines et la fragmentation de l'ADN.

Cornet à ultrasons pour la préparation simultanée et très efficace de plusieurs échantillons dans les mêmes conditions pour l'isolement des protéines et la fragmentation de l'ADN.

Extraction de protéines à partir de tissus animaux

L'Ultrasonicator UP100H est un homogénéisateur de laboratoire souvent utilisé pour la préparation d'échantillons de plaques de culture cellulaire.Pour la préparation de tissus de taille entière (par exemple, rein, cœur, poumon, muscle, etc.), le tissu doit être disséqué en très petits morceaux à l'aide d'outils propres, de préférence sur de la glace, et aussi rapidement que possible pour éviter la dégradation par les protéases (par exemple, tampon de lyse tel que RIPA ou tampon de lyse hypotonique contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases). Après la dissection, l'échantillon est immergé dans l'azote liquide pour être congelé. L'échantillon peut être conservé à -80°C pour une utilisation ultérieure ou être gardé sur la glace pour une homogénéisation immédiate. Immédiatement avant l'extraction par ultrasons, un tampon de lyse glacé (avec des inhibiteurs de protéase DTT, leupeptine et aprotinine) est rapidement ajouté dans le tube d'échantillon (pour ~10 mg de tissu, environ ~600 μL de tampon sont recommandés). Il est recommandé d'utiliser environ 20 à 60 mg de tissu par tube d'échantillon.
L'homogénéisation, la lyse et l'extraction par ultrasons sont effectuées à l'aide d'un homogénéisateur à ultrasons tel que l'UP100H ou l'UP200Ht, équipé d'une sonotrode à micropointe. La durée de la sonication est de 60 à 90 secondes à un mode de cycle ultrasonique de 15 secondes de sonication et de 10 secondes de repos. L'échantillon doit être conservé dans de la glace pendant toute la durée de la sonication.
Après homogénéisation/extraction par ultrasons, le lysat est centrifugé à 27 000 g pendant environ 20 minutes. Le surnageant est ensuite recueilli, afin que la concentration en protéines puisse être déterminée par un test protéique tel que le test BCA de Pierce.

Extraction de protéines à partir du sérum sanguin

Pour obtenir un mélange homogène de sérum et de tampon phosphate, l'échantillon est d'abord vortexé avant la lyse cellulaire par ultrasons. Pour la lyse ultrasonique, l'échantillon est sonifié avec un homogénéisateur de laboratoire à ultrasons tel que l'UP100H pendant 8 cycles à 20% d'amplitude, pour des cycles de 5 secondes de marche et 15 secondes d'arrêt. L'extraction des protéines est réalisée par sonication en cycles (mode pulsation) et en plaçant l'échantillon sur de la glace afin d'éviter une surchauffe et une dégradation thermique de l'échantillon. Étant donné que le sérum contient une grande quantité de protéines de haut poids moléculaire (telles que l'albumine, l'α1-antitrypsine, la transferrine, l'haptoglobuline, l'immunoglobuline G et l'immunoglobuline A), qui interfèrent avec la séparation des protéines de faible poids moléculaire au cours de la FEI, il est recommandé de les éliminer du sérum à l'aide d'une colonne de déplétion.

Extraction de protéines à partir de tissus végétaux

Les tissus végétaux frais et mous, par exemple la mousse, etc., peuvent être facilement désagrégés en plaçant simplement l'échantillon haché dans un tampon de lyse pour la sonication. Les tissus végétaux durs et lignifiés, tels que les graines, les aiguilles de sapin, etc. doivent être broyés à sec. Certains matériaux végétaux durs et ligneux doivent être congelés et broyés dans de l'azote liquide avant d'être extraits par sonication. Pour les suspensions de cultures de cellules végétales, un traitement ultrasonique de 30 à 150 secondes dans un tampon de lyse est généralement suffisant. Les matières plus dures, comme les graines de citrouille, nécessitent une sonication plus intense, comme décrit ci-dessous.
 

Ce tutoriel explique quel type de sonicateur est le mieux adapté à vos tâches de préparation d'échantillons telles que la lyse, la désintégration cellulaire, l'isolement des protéines, la fragmentation de l'ADN et de l'ARN dans les laboratoires, l'analyse et la recherche. Choisissez le type de sonicateur idéal pour votre application, votre volume d'échantillon, votre nombre d'échantillons et votre débit. Hielscher Ultrasonics a l'homogénéisateur à ultrasons idéal pour vous !

Comment trouver le sonicateur parfait pour la désintégration des cellules et l'extraction des protéines en science et analyse

Vignette vidéo

 

Protocole d'extraction par ultrasons de l'albumine des graines de citrouille

Homogénéisateur de tissus à ultrasons UP400St avec S24d40 - pour l'extraction de protéines à partir de tissus végétaux et animaux (Cliquez pour agrandir !)Pour l'extraction protéique ultrasonique de l'albumine à partir de la poudre de graines de courge finement broyée, 10 g de poudre de graines de courge dégraissée et 100 ml d'eau désionisée comme solvant sont ajoutés dans un bécher en verre de 250 ml. L'extraction des protéines se fait en deux étapes : Premièrement, l'échantillon est sonifié avec un ultrasonateur à sonde UP400St (400W, 24kHz) équipé d'une sonotrode S24d7. Le bécher en verre est placé dans un bain d'eau froide pendant l'homogénéisation ultrasonique. Le capteur de température enfichable et les réglages de contrôle de la température de l'appareil à ultrasons UP400St garantissent que la température de l'échantillon est toujours maintenue en dessous de 30°C. Le contrôle précis de la température pendant la sonication permet d'éviter la dénaturation de l'albumine. Ensuite, l'extraction a été réalisée avec un mélangeur à une vitesse de 200 tours/minute et à 30°C. Ensuite, le bécher est transféré dans un agitateur thermostatique. La globuline est éliminée par dialyse avec de l'eau distillée. Après l'élimination de la globuline, l'extrait protéique peut être échantillonné pour déterminer le profil de l'albumine et est ensuite ajusté à pI=3,0 en utilisant du HCl 0,1 M pour la coagulation de l'albumine. La phase solide est séparée par centrifugation à 5000g, 20°C et redissoute dans de l'eau désionisée. La coagulation de l'albumine est effectuée deux fois pour augmenter le taux de protéines dans le concentré d'albumine.

L'extraction de protéines alcalines par ultrasons pour la préparation de concentrés de protéines à partir de son de riz montre que le traitement par ultrasons permet d'obtenir un rendement protéique plus élevé dans un temps d'extraction nettement plus court. – par rapport aux méthodes d'extraction conventionnelles.

Ce clip vidéo montre l'homogénéisateur à ultrasons UP100H de Hielscher, un appareil à ultrasons largement utilisé pour la préparation d'échantillons dans les laboratoires.

Homogénéisateur ultrasonique UP100H

Vignette vidéo

Protocole de préparation des échantillons pour l'enzyme iNOS fonctionnelle

Pour obtenir une enzyme iNOS entièrement fonctionnelle (par exemple pour le criblage de médicaments), le protocole suivant est recommandé : La suspension cellulaire doit être placée sur de la glace et sonifiée avec un UP100H à une amplitude de 10µm en mode cycle de 5 sec. de sonication et 25 sec. de repos sur de la glace. La procédure doit être répétée environ 3 fois. Le temps de repos entre les cycles de sonication réduit l'augmentation de la température et réduit donc le risque de dénaturation.

Solubilisation des protéines par ultrasons

La sonication peut accélérer le processus de solubilisation des protéines, qui prend généralement plusieurs heures. Afin de ne pas surchauffer l'échantillon et d'éviter la dégradation et la modification des protéines dans les solutions contenant de l'urée, les salves d'ultrasons ne doivent pas durer plus de quelques secondes.

Le VialTweeter est un système ultrasonique unique permettant de sonifier simultanément jusqu'à 10 flacons dans les mêmes conditions, sans contamination croisée.

UP200St avec VialTweeter pour la sonication de flacons fermés

Vignette vidéo

Ultrasonator UP200Ht avec micro-pointe S26d2 pour la lyse ultrasonique d'échantillons biologiques

Ultrasonateur UP200Ht avec micro-pointe de 2 mm S26d2 pour la sonication de petits échantillons.

Équipement ultrasonique pour l'extraction des protéines

Hielscher Ultrasonics propose une large gamme d'homogénéisateurs à ultrasons pour la désintégration des cellules, des tissus, des bactéries, des micro-organismes, des levures et des spores.
Les ultrasons de laboratoire Hielscher sont puissants et faciles à utiliser. Conçus pour fonctionner 24 heures sur 24 et 7 jours sur 7, ils sont conçus comme des appareils de laboratoire et de table robustes et efficaces. Pour tous les appareils, l'énergie produite et l'amplitude peuvent être contrôlées avec précision. La large gamme d'accessoires offre d'autres possibilités de configuration. Les ultrasons numériques tels que le VialTweeter, l'UP200Ht, l'UP200St et l'UP400St disposent d'un contrôle de température intégré et d'une carte SD intégrée pour l'enregistrement automatique des données.
Pour la sonication indirecte, sans contamination croisée et simultanée de plusieurs échantillons, nous proposons le VialTweeter ou le CupHorn ultrasonique.
Le tableau ci-dessous vous donne un aperçu de nos appareils à ultrasons pour la préparation d'échantillons, la désintégration et l'extraction de cellules. Cliquez sur le type d'appareil pour obtenir plus d'informations sur chaque homogénéisateur à ultrasons. Notre personnel technique bien formé et expérimenté se fera un plaisir de vous aider à choisir l'appareil à ultrasons le mieux adapté à la préparation de vos échantillons !
 

Volume du lot Débit Dispositifs recommandés
jusqu'à 10 flacons ou tubes n.d. VialTweeter
plaques multi-puits / microtitres n.d. UIP400MTP
tubes / récipients multiples n.d. CupHorn
1 à 500mL 10 à 200mL/min UP100H
10 à 1000mL 20 à 200mL/min UP200Ht, UP200St
10 à 2000mL 20 à 400mL/min UP400St

En fonction de votre application, du matériau et du volume de l'échantillon, nous vous recommanderons la configuration la plus adaptée à la préparation de votre échantillon. Contactez-nous dès aujourd'hui !

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Veuillez utiliser le formulaire ci-dessous pour demander des informations supplémentaires sur les homogénéisateurs à ultrasons, les applications en biotechnologie et en protéomique ainsi que les prix. Nous serons heureux de discuter avec vous de votre processus de désintégration cellulaire et d'extraction de protéines et de vous proposer un homogénéisateur à ultrasons répondant à vos exigences !









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La vidéo montre le système de préparation d'échantillons par ultrasons UIP400MTP, qui permet une préparation fiable des échantillons de toutes les plaques multipuits standard à l'aide d'ultrasons de haute intensité. Les applications typiques de l'UIP400MTP comprennent la lyse cellulaire, le cisaillement de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine, ainsi que l'extraction de protéines.

Ultrasonator UIP400MTP pour la sonication de plaques multi-puits

Vignette vidéo

Les appareils à ultrasons Hielscher peuvent être contrôlés à distance par le biais d'un navigateur. Les paramètres de sonication peuvent être contrôlés et ajustés précisément aux exigences du processus.

Les ultrasons numériques Hielscher sont dotés d'une télécommande à navigateur et d'un enregistrement automatique des données sur une carte SD intégrée.

Appareil à ultrasons VialTweeter pour l'extraction de protéines à partir d'échantillons de tissus (Cliquez pour agrandir !)

VialTweeter pour la sonication indirecte.



Qu'il faut savoir

protéomique

La protéomique est le domaine de recherche qui étudie les protéines et le protéome. Les protéines remplissent un large éventail de fonctions vitales au sein des organismes. Le protéome est l'ensemble des protéines exprimées par un génome, une cellule, un tissu ou un organisme à un moment donné. Le protéome varie en fonction du temps et des exigences distinctes, ou stress, que subit une cellule ou un organisme. Plus précisément, il s'agit de l'ensemble des protéines exprimées dans un type de cellule ou d'organisme donné, à un moment donné, dans des conditions définies. Le terme est un mélange de protéines et de génome. La protéomique est l'étude du protéome.

protéines

Les protéines sont des biomolécules de grande taille, appelées macromolécules. – qui sont composées d'une ou plusieurs longues chaînes de résidus d'acides aminés. Les protéines sont présentes dans tous les organismes d'origine végétale et animale et sont essentielles à la plupart des fonctions biologiques. Comme les protéines contiennent beaucoup d'informations biologiques, elles sont extraites à des fins d'analyse, par exemple pour la recherche protéomique. Les fonctions les plus importantes des protéines sont la catalyse des réactions métaboliques, la réplication de l'ADN, la réponse aux stimuli et le transport des molécules d'un endroit à un autre. Les protéines diffèrent les unes des autres principalement par leur séquence d'acides aminés, qui est dictée par la séquence nucléotidique de leurs gènes, et qui entraîne généralement le repliement de la protéine dans une structure tridimensionnelle spécifique qui détermine son activité. Les protéines sont – en plus des peptides – l'un des principaux composants des aliments. Par conséquent, la protéomique est un outil puissant dans la science alimentaire pour optimiser les processus, la sécurité alimentaire et l'évaluation nutritionnelle.

Cloud Point Extraction

Cloud Point Extraction est une procédure pré-analytique qui permet de séparer et de préconcevoir les analytes. Combinée aux ultrasons, l'extraction par point de trouble peut être intensifiée, ce qui rend le processus plus efficace, plus rapide et plus respectueux de l'environnement. Avec les ultrasons, l'extraction par point de trouble est une méthode de préparation des analytes nettement plus efficace. En savoir plus sur l'extraction de points de nuages assistée par ultrasons !

Électrophorèse sur gel

L'électrophorèse sur gel est la principale méthode de séparation et d'analyse des macromolécules telles que l'ADN, l'ARN et les protéines, ainsi que de leurs fragments, en fonction de leur taille et de leur charge. Elle est utilisée en chimie clinique pour séparer les protéines en fonction de leur charge et/ou de leur taille (agarose IEF, essentiellement indépendant de la taille) et en biochimie, biologie moléculaire et protéomique pour séparer une population mixte de fragments d'ADN et d'ARN en fonction de leur longueur, pour estimer la taille des fragments d'ADN et d'ARN ou pour séparer les protéines en fonction de leur charge.

cultures cellulaires

La culture cellulaire est le processus de croissance contrôlée par lequel des cellules sont cultivées dans des conditions contrôlées. Les conditions de culture cellulaire varient pour chaque type de cellule. En général, l'environnement d'une culture cellulaire consiste en un récipient approprié (par exemple, une boîte de Petri) avec un substrat ou un milieu qui fournit les nutriments essentiels (acides aminés, glucides, vitamines, minéraux), les facteurs de croissance, les hormones et les gaz (CO2, O2) et régule l'environnement physio-chimique (tampon pH, pression osmotique, température). La plupart des cellules ont besoin d'une surface ou d'un substrat artificiel, tandis que d'autres cultures cellulaires peuvent être cultivées en flottant librement dans un milieu de culture (culture en suspension, suspension cellulaire).
Les cultures de masse de lignées cellulaires animales sont utilisées dans la production industrielle de vaccins viraux et d'autres produits dérivés de la biotechnologie. Les cellules souches humaines sont cultivées pour augmenter le nombre de cellules et les différencier en divers types de cellules somatiques à des fins de transplantation.

Échantillons de tissus

Le terme "tissu" décrit un intermédiaire cellulaire, où le matériel cellulaire se situe à un niveau d'organisation entre les cellules et un organe complet. Dans un tissu, des cellules similaires, de même origine, qui remplissent ensemble une fonction spécifique, sont assemblées. Le regroupement fonctionnel de plusieurs tissus permet de former les structures complexes des organes.
Les tissus sont prélevés à des fins de recherche en biologie, en histologie/histopathologie, en parasitologie, en biochimie, en immunohistochimie ainsi que pour cultiver et extraire de l'ADN. On distingue les tissus animaux (subdivision : tissus de mammifères) et les tissus végétaux. Les tissus animaux sont regroupés en quatre types fondamentaux : tissus conjonctifs, musculaires, nerveux et épithéliaux. Les tissus végétaux sont subdivisés en trois systèmes tissulaires : l'épiderme, le tissu végétal et le tissu vasculaire.
Les échantillons de tissus peuvent être préparés à partir de parties d'animaux ou de plantes, par exemple des os, des muscles, des feuilles, etc.

Fluides corporels

Le sang, le sérum, le plasma, le liquide céphalo-rachidien, la salive et le liquide synovial sont des fluides corporels qui offrent une grande source d'informations utiles au diagnostic. C'est pourquoi il est important de préparer de manière sophistiquée les échantillons de liquides corporels en vue de leur analyse. La première difficulté est liée à la large gamme dynamique des composants présents dans les fluides corporels.

Détermination de la concentration en protéines

Les tests de Bradford, de Lowry et de l'acide bicinchoninique (BCA) sont des tests courants pour déterminer la concentration des protéines. L'albumine sérique bovine (BSA) est l'un des étalons protéiques les plus fréquemment utilisés.

tampon de lyse

Le tampon de lyse doit être choisi en fonction du matériel cellulaire ou du tissu (culture de tissu, plante, bactérie, champignon, etc.), et si les cellules sont dans une structure et le type de structure. Une large gamme de tampons de lyse pour l'extraction des protéines, des membranes et des organites est formulée avec un ou plusieurs détergents. Le détergent est généralement sélectionné par des tests d'essai et d'erreur ou par des tests d'analyse. – si disponible – selon un protocole d'extraction de protéines existant. Le détergent doit être compatible avec la source de tissu et les protéines. En général, le détergent le plus doux qui fonctionne pour un tissu / une protéine spécifique est choisi afin de maintenir la fonctionnalité maximale de l'extrait. En outre, dans le cas d'une extraction de membranes et d'organites, un détergent doux permet de conserver la membrane intacte. Les détergents couramment utilisés dans les tampons de lyse sont principalement non ioniques ou zwitterioniques, par exemple CHAPS, désoxycholate, Triton™ X-100, NP40 et Tween 20.
Par exemple, les tissus tels que le cerveau, le foie, l'intestin, les reins, la rate, etc. peuvent être simplement tamponnés avec RIPA – Toutefois, les inhibiteurs de protéase et le DTT (par exemple pour l'électrophorèse sur gel) doivent être inclus.
Tampon de lyse pour le tissu musculaire squelettique (froid) : Tris 20 mM (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) de glycérol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothréitol complété par un cocktail d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase.
Tableau des tampons courants et de leur plage de pH. En général, ces tampons sont utilisés à des concentrations de 20 à 50 mM.
 

tampon Gamme de pH
Acide citrique – NaOH 2.2 – 6.5
Citrate de sodium – Acide citrique 3.0 – 6.2
Acétate de sodium – acide acétique 3.6 – 5.6
Sel sodique de l'acide cacodylique – HCl 5.0 – 7.4
MES – NaOH 5.6 – 6.8
Dihydrogénophosphate de sodium – Hydrogénophosphate disodique 5.8 – 8.0
imidazole – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
Chlorhydrate de triéthanolamine – NaOH 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Tricine – NaOH 7.6 – 8.6
Tétraborate de sodium – acide borique 7.6 – 9.2
Bicine – NaOH 7.7 – 8.9
glycine – NaOH 8.6 – 10.6

La plupart des tampons présentent une dépendance du pH avec la température. C'est particulièrement vrai pour les tampons Tris. Le pKa passe de 8,06 à 25°C à 8,85 à 0°C.
(pH et pKa d'un tampon : le pH mesure la concentration d'ions hydrogène dans une solution aqueuse. Le pKa (= constante de dissociation de l'acide) est une mesure apparentée, mais plus spécifique, en ce sens qu'elle permet de prédire comment une molécule se comportera à une valeur de pH spécifique).

TRIzol

Le TRIzol est une solution chimique utilisée pour extraire l'ARN/l'ADN/les protéines lors de l'extraction au thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme. L'utilisation de l'extraction TRIzol assistée par ultrasons permet d'obtenir des rendements élevés d'ADN, d'ARN et de protéines à partir du même échantillon et surpasse ainsi les autres méthodes d'extraction.

Littérature/références

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