Extraction des protéines par ultrasons des cultures de tissus et de cellules

  • L'extraction des protéines est une étape de préparation d'échantillon essentiel en protéomique.
  • Les protéines peuvent être extraites de tissus végétaux et animaux, les levures et les micro-organismes.
  • Le traitement par ultrasons est une méthode d'extraction de protéines fiable, efficace donnant des rendements en protéines dans un court laps de temps d'extraction.

Extraction de protéines à partir de tissus et de cellules

L'extraction de protéines à partir de tissus et de cellules cultivées est une étape essentielle de la préparation des échantillons qui est réalisée au cours de nombreuses techniques biochimiques et analytiques telles que l'ELISA, la PAGE, le Western blotting, la spectrométrie de masse ou la purification des protéines. La désintégration, la lyse et l'extraction des cellules par ultrasons est une technique non thermique, contrôlable avec précision, qui permet d'obtenir des rendements élevés en protéines.

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Les ultrasons de type sonde tels que l'UP200St sont des homogénéisateurs de tissus fiables et largement utilisés pour la préparation d'échantillons dans la recherche génétique et protéomique.

Extraction de protéines à partir de cellules avec le sonde à ultrasons UP200St

Avantages de la lyse ultrasonique et de l'extraction des protéines
 

  • rapide
  • rendements élevés
  • très efficace
  • Un contrôle précis de paramètres
  • des résultats reproductibles
  • évolutivité linéaire

Instructions générales pour la lyse ultrasonique et l'extraction des protéines

  • Contrôle de la température: Afin d'assurer un rendement élevé de protéines sans dénaturation thermique, la température pendant l'extraction doivent être contrôlées. de Hielscher état de l'art des homogénéisateurs à ultrasons – également appelé désintégrateur à ultrasons ou ultrasonificateur – sont précisément contrôlable. Ils viennent avec un capteur de température embrochable. Dans les options de réglage de l'homogénéisateur à ultrasons, une température maximale peut être réglée. Lorsque cette température maximale est atteinte, l'appareil à ultrasons arrête automatiquement jusqu'à ce que l'échantillon soit refroidi.
  • Tampon: Le choix d'un tampon approprié et le bon volume de tampon varie d'un tissu à et doit être compris, par des tests d'essais et d'erreurs.
  • Isolement / purification: Les lysats protéiques peuvent contenir un excès de biomolécules telles que des ADN ou des hydrates de carbone, qui peuvent être éliminés par précipitation de la protéine (acide désoxycholate-trichloroacétique) ou un échange de tampon.

Chittapalo et Noomhorm (2009) ont rapporté dans leur étude que le rendement en protéines augmentait grâce à la sonication et que le processus d'homogénéisation et de lyse des tissus par ultrasons pouvait améliorer de manière significative les processus d'extraction existants. – permettant de nouvelles possibilités d'exploitation commerciale.
 

Cornet à ultrasons pour la préparation simultanée de plusieurs échantillons dans les mêmes conditions pour l'isolement des protéines et la fragmentation de l'ADN.

cuphorn à ultrasons pour la préparation simultanée et très efficace de plusieurs échantillons dans les mêmes conditions pour l'isolement des protéines et la fragmentation de l'ADN.

L'extraction des protéines à partir de tissus d'origine animale

L'Ultrasonicator UP100H est un homogénéisateur de laboratoire souvent utilisé pour la préparation des échantillons des plaques de culture cellulaire.Pour la préparation de tissus entiers (rein, coeur, poumon, muscle, etc.), le tissu doit être disséqué en très petits morceaux avec des outils propres, de préférence sur de la glace, et aussi rapidement que possible pour éviter la dégradation par les protéases (par ex. un tampon de lyse tel que RIPA ou un tampon de lyse hypotonique contenant une protease et un cocktail d'inhibiteur de phosphatase). Après dissection, l'échantillon est immergé dans de l'azote liquide pour un congélation rapide. L'échantillon peut être conservé à -80 ° C pour une utilisation ultérieure ou être conservé sur de la glace pour une homogénéisation immédiate. Immédiatement avant l'extraction par ultrasons, un tampon de lyse glacé (avec inhibiteurs de protéase DTT, leupeptine et aprotinine) est rapidement ajouté dans le tube à échantillon (pour ~ 10 mg de tissu environ ~ 600 μL de tampon sont recommandés). Environ. 20-60mg de tissu est recommandé par tube d'échantillon.
L'homogénéisation, la lyse et l'extraction par ultrasons sont effectuées à l'aide d'un homogénéisateur à ultrasons tel que l'UP100H ou l'UP200Ht, équipé d'une sonotrode à micropointe. La durée de la sonication est de 60 à 90 secondes à un mode de cycle ultrasonique de 15 secondes de sonication et de 10 secondes de repos. L'échantillon doit être conservé dans de la glace pendant toute la durée de la sonication.
Après homogénéisation / extraction à ultrasons, le lysat est centrifugé à 27,000g pendant env. 20 min. Ensuite, le surnageant est recueilli, de sorte que la concentration en protéine peut être déterminée par un dosage de protéine tel que dosage de protéines BCA de Pierce.

L'extraction des protéines du sérum sanguin

Pour obtenir un mélange homogène de sérum et de tampon phosphate, l'échantillon est d'abord vortexé avant la lyse cellulaire par ultrasons. Pour la lyse ultrasonique, l'échantillon est sonifié avec un homogénéisateur de laboratoire à ultrasons tel que l'UP100H pendant 8 cycles à 20% d'amplitude, pour des cycles de 5 secondes de marche et 15 secondes d'arrêt. L'extraction des protéines est réalisée par sonication en cycles (mode pulsation) et en plaçant l'échantillon sur de la glace afin d'éviter une surchauffe et une dégradation thermique de l'échantillon. Étant donné que le sérum contient une grande quantité de protéines de haut poids moléculaire (telles que l'albumine, l'α1-antitrypsine, la transferrine, l'haptoglobuline, l'immunoglobuline G et l'immunoglobuline A), qui interfèrent avec la séparation des protéines de faible poids moléculaire au cours de la FEI, il est recommandé de les éliminer du sérum à l'aide d'une colonne de déplétion.

L'extraction des protéines à partir de tissus végétaux

tissu végétal frais, doux, par exemple, mousse, etc., peut être facilement perturbé en plaçant simplement l'échantillon haché dans un tampon de lyse pour sonication. Difficiles, les tissus végétaux ligenous, tels que les semences, les aiguilles de sapin, etc., doivent être broyés à sec. Certains disques, des matériaux végétaux ligneux doivent être congelés et broyés dans l'azote liquide avant d'être extraite par sonication. Pour des suspensions de culture de cellules de plante, un traitement aux ultrasons entre 30 et 150 secondes dans un tampon de lyse est le plus souvent suffisant. matériau plus résistant comme les graines de citrouille nécessitent une sonication plus intense comme décrit ci-dessous.
 

Ce tutoriel explique quel type de sonicateur est le mieux adapté à vos tâches de préparation d'échantillons telles que la lyse, la désintégration cellulaire, l'isolement des protéines, la fragmentation de l'ADN et de l'ARN dans les laboratoires, l'analyse et la recherche. Choisissez le type de sonicateur idéal pour votre application, votre volume d'échantillon, votre nombre d'échantillons et votre débit. Hielscher Ultrasonics a l'homogénéisateur à ultrasons idéal pour vous !

Comment trouver le sonicateur parfait pour la désintégration des cellules et l'extraction des protéines en science et analyse

Vignette vidéo

 

Protocole pour l'extraction par ultrasons de l'albumine à partir de graines de citrouille

homogénéisateur tissu ultrasonique UP400St avec S24d40 - pour l'extraction des protéines à partir de tissus végétaux et animaux (Cliquez pour agrandir!)Pour l'extraction protéique ultrasonique de l'albumine à partir de la poudre de graines de courge finement broyée, 10 g de poudre de graines de courge dégraissée et 100 ml d'eau désionisée comme solvant sont ajoutés dans un bécher en verre de 250 ml. L'extraction des protéines se fait en deux étapes : Premièrement, l'échantillon est sonifié avec un ultrasonateur à sonde UP400St (400W, 24kHz) équipé d'une sonotrode S24d7. Le bécher en verre est placé dans un bain d'eau froide pendant l'homogénéisation ultrasonique. Le capteur de température enfichable et les réglages de contrôle de la température de l'appareil à ultrasons UP400St garantissent que la température de l'échantillon est toujours maintenue en dessous de 30°C. Le contrôle précis de la température pendant la sonication permet d'éviter la dénaturation de l'albumine. Ensuite, l'extraction a été réalisée avec un mélangeur à une vitesse de 200 tours/minute et à une température de 30°C. Ensuite, le bécher est transféré dans un agitateur thermostatique. La globuline est éliminée par dialyse avec de l'eau distillée. Après l'élimination de la globuline, l'extrait protéique peut être échantillonné pour déterminer le profil de l'albumine et est ensuite ajusté à pI=3,0 en utilisant du HCl 0,1 M pour la coagulation de l'albumine. La phase solide est séparée par centrifugation à 5000g, 20°C et redissoute dans de l'eau désionisée. La coagulation de l'albumine est effectuée deux fois pour augmenter le taux de protéines dans le concentré d'albumine.

extraction de protéines alcalin à ultrasons pour la préparation d'un concentré de protéines à partir de son de riz montre que les résultats de traitement par ultrasons dans le rendement en protéines plus élevée en un temps significativement plus court extraction – par rapport aux procédés classiques d'extraction.

Ce clip vidéo montre l'homogénéisateur à ultrasons UP100H de Hielscher, un ultrasoniseur largement utilisé pour la préparation des échantillons dans les laboratoires.

Homogénéisateur à ultrasons UP100H

Vignette vidéo

protocole de préparation des échantillons pour l'enzyme iNOS fonctionnelle

Pour obtenir une enzyme iNOS entièrement fonctionnelle (par exemple pour le criblage de médicaments), le protocole suivant est recommandé : La suspension cellulaire doit être placée sur de la glace et sonifiée avec un UP100H à une amplitude de 10µm en mode cycle de 5 sec. de sonication et 25 sec. de repos sur de la glace. La procédure doit être répétée environ 3 fois. Le temps de repos entre les cycles de sonication réduit l'augmentation de la température et réduit donc le risque de dénaturation.

Ultrasons protéines Solubilisation

Sonication peut accélérer le processus de solubilisation de protéines, ce qui nécessite généralement plusieurs heures. Afin de ne pas surchauffer l'échantillon et de prévenir la dégradation des protéines et des modifications dans les solutions contenant de l'urée, les rafales à ultrasons ne doivent pas durer plus de quelques secondes.

Le VialTweeter est un système ultrasonique unique en son genre permettant de sonifier simultanément jusqu'à 10 flacons dans les mêmes conditions, sans contamination croisée.

UP200St avec VialTweeter pour la sonication de flacons fermés

Vignette vidéo

Ultrasonicator UP200Ht avec micropointe S26d2 pour la lyse ultrasonique des échantillons biologiques

Ultrasonateur UP200Ht avec micro-pointe de 2 mm S26d2 pour la sonication de petits échantillons.

Equipement ultrasonique pour l'extraction des protéines

Hielscher Ultrasonics offre une large gamme de homogénéisateurs à ultrasons pour la désintégration des cellules, des tissus, des bactéries, des micro-organismes, des levures et des spores.
Les ultrasons de laboratoire Hielscher sont puissants et faciles à utiliser. Conçus pour fonctionner 24 heures sur 24 et 7 jours sur 7, ils sont conçus comme des appareils de laboratoire et de table robustes et efficaces. Pour tous les appareils, l'énergie produite et l'amplitude peuvent être contrôlées avec précision. La large gamme d'accessoires offre d'autres possibilités de configuration. Les ultrasons numériques tels que le VialTweeter, l'UP200Ht, l'UP200St et l'UP400St disposent d'un contrôle de température intégré et d'une carte SD intégrée pour l'enregistrement automatique des données.
Pour la sonication indirecte, sans contamination croisée et simultanée de plusieurs échantillons, nous proposons le VialTweeter ou le CupHorn ultrasonique.
Le tableau ci-dessous vous donne un aperçu de nos appareils à ultrasons pour la préparation d'échantillons, la désintégration et l'extraction de cellules. Cliquez sur le type d'appareil pour obtenir plus d'informations sur chaque homogénéisateur à ultrasons. Notre personnel technique bien formé et expérimenté se fera un plaisir de vous aider à choisir l'appareil à ultrasons le mieux adapté à la préparation de vos échantillons !
 

lot Volume Débit Appareils recommandés
jusqu'à 10 flacons ou tubes n / a. VialTweeter
plaques multipuits / microtitres n / a. UIP400MTP
tubes / récipients multiples n / a. Corne de cuivre
1 à 500 ml 10 à 200 ml / min UP100H
10 à 1000mL 20 à 200mL/min UP200Ht, UP200St
10 à 2000mL 20 à 400 ml / min UP400St

En fonction de votre application, le matériel et le volume de l'échantillon, nous vous recommandons la configuration la plus appropriée pour votre préparation d'échantillons. Contactez-nous dès aujourd'hui!

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Veuillez utiliser le formulaire ci-dessous pour demander des informations supplémentaires sur les homogénéisateurs à ultrasons, les applications en biotechnologie et en protéomique ainsi que les prix. Nous serons heureux de discuter avec vous de votre processus de désintégration cellulaire et d'extraction de protéines et de vous proposer un homogénéisateur à ultrasons répondant à vos exigences !









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La vidéo montre le système de préparation d'échantillons par ultrasons UIP400MTP, qui permet la préparation fiable d'échantillons sur n'importe quelle plaque multi-puits standard en utilisant des ultrasons de haute intensité. Les applications typiques de l'UIP400MTP comprennent la lyse cellulaire, le cisaillement de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine ainsi que l'extraction de protéines.

Ultrasonateur UIP400MTP pour la sonication de plaques multi-puits

Vignette vidéo

Les ultrasons Hielscher peuvent être contrôlés à distance par le biais d'un navigateur. Les paramètres de sonication peuvent être surveillés et ajustés précisément aux exigences du processus.

Les ultrasons numériques Hielscher sont dotés d'une télécommande à navigateur et d'un enregistrement automatique des données sur une carte SD intégrée.

Appareil à ultrasons VialTweeter pour l'extraction des protéines à partir d'échantillons de tissus (Cliquez pour agrandir!)

VialTweeter pour sonication indirecte.



Qu'il faut savoir

protéomique

Est le domaine Proteomics de recherche qui étudie les protéines et le protéome. Les protéines fullfil une vaste gamme de fonctions vitales dans les organismes. Le protéome est l'ensemble des protéines exprimées par un génome, une cellule, un tissu ou un organisme à un moment donné. Le protéome varie avec le temps et des exigences distinctes, ou souligne qu'une cellule ou un organisme subit. Plus précisément, il est l'ensemble des protéines exprimées dans un type donné de cellule ou un organisme, à un moment donné, dans des conditions définies. Le terme est un mélange de protéines et génome. Proteomics est l'étude du protéome.

Protéine

Les protéines sont sont grandes biomolécules, macromolécules soi-disant – qui sont composés d'une ou plusieurs longues chaînes de résidus d'acides aminés. Les protéines sont présentes dans tous les organismes d'origine végétale et animale et sont cruciales pour la plupart des fonctions biologiques. Comme les protéines contiennent beaucoup d'informations biologiques, elles sont extraites à des fins analytiques, par exemple pour la recherche protéomique. La fonction la plus importante des protéines est la catalyse des réactions métaboliques, la réplication de l'ADN, la réponse aux stimuli et le transport des molécules d'un endroit à l'autre. Les protéines diffèrent les unes des autres principalement dans leur séquence d'acides aminés, qui est dictée par la séquence nucléotidique de leurs gènes, et qui entraîne habituellement le repliement des protéines dans une structure tridimensionnelle spécifique qui détermine son activité. Les protéines sont – En plus des peptides – l'un des éléments clés de la nourriture. Par conséquent, la protéomique est un outil puissant dans la science alimentaire pour optimiser les processus, la sécurité et l'évaluation nutritionnelle des aliments.

Cloud Point Extraction

Cloud Point Extraction est une procédure pré-analytique qui permet de séparer et de préconcevoir les analytes. Combinée aux ultrasons, l'extraction par point de trouble peut être intensifiée, ce qui rend le processus plus efficace, plus rapide et plus respectueux de l'environnement. Avec les ultrasons, l'extraction par point de trouble est une méthode de préparation des analytes nettement plus efficace. En savoir plus sur l'extraction de points de nuages assistée par ultrasons !

gel Electrophoresis

L'électrophorèse sur gel est la principale méthode pour la séparation et l'analyse des macromolécules telles que l'ADN, l'ARN et des protéines, ainsi que leurs fragments, en fonction de leur taille et de la charge. Il est utilisé dans la chimie clinique pour séparer les protéines en charge et / ou de la taille (IEF agarose, la taille essentiellement indépendante) et en biochimie, biologie moléculaire et de la protéomique pour séparer une population mixte de fragments d'ADN et d'ARN par longueur, pour estimer la taille de l'ADN et des fragments d'ARN ou pour la séparation des protéines par la charge.

Cultures cellulaires

La culture cellulaire est le processus de croissance contrôlée par lequel les cellules sont cultivées dans des conditions contrôlées. conditions de culture cellulaire varient pour chaque type de cellule. En général, le milieu de culture cellulaire est constitué d'un récipient approprié (par exemple de boîte de Petri) avec un substrat ou support qui fournit les éléments nutritifs essentiels (acides aminés, glucides, vitamines, minéraux), des facteurs de croissance, les hormones, et les gaz (CO2, La2), Et régule l'environnement physico-chimique (tampon de pH, la pression osmotique, température). La plupart des cellules ont besoin d'une surface ou d'un substrat artificiel, tandis que d'autres cultures de cellules peuvent être cultivées libre flottant dans un milieu de culture (culture en suspension, la suspension cellulaire).
cultures de masse de lignées cellulaires animales sont utilisés dans la production industrielle de vaccins viraux et d'autres produits dérivés biotechnologiquement. Les cellules souches humaines sont cultivées pour augmenter le nombre de cellules et de différencier les cellules dans différents types de cellules somatiques à des fins de transplantation.

Des échantillons de tissus

Le tissu terme décrit un intermédiaire cellulaire, où le matériau cellulaire est sur un niveau de l'organisation entre les cellules et un organe complet. Dans les tissus, les cellules semblables, de la même origine qui, ensemble, réaliser une fonction spécifique, sont assemblés. Le groupement fonctionnel de plusieurs tissus, les structures complexes des organes sont formés.
Le tissu est prélevé pour la recherche en biologie, histologie / histopathologie, parasitologie, la biochimie, l'immunohistochimie, ainsi que de cultiver et d'extraire l'ADN. Elle se distingue entre l'animal (subdivision: tissu mammifère) et un tissu végétal. Les tissus animaux sont regroupés dans les quatre principaux types de conjonctifs, les muscles, nerveux, et le tissu épithélial. Le tissu végétal est subdivisé en trois systèmes de tissus suivants: l'épiderme, le tissu du sol, et le tissu vasculaire.
Des échantillons de tissus peuvent être préparés à partir de parties animales ou végétales, par exemple os, les muscles, les feuilles, etc.

Fluides corporels

Le sang, le sérum, le plasma, le liquide céphalorachidien, la salive et le liquide synovial sont fluides corporels, qui offrent une grande source d'information pertinente pour le diagnostic. Par conséquent, une préparation sophistiquée d'échantillons de fluide corporel pour l'analyse est importante. La première difficulté est liée à la large plage dynamique des composants présents dans les fluides corporels.

Détermination de la concentration en protéines

dosage de Bradford, Lowry et dosage dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) sont des essais courants pour déterminer la concentration de protéines. sérum-albumine bovine (BSA) est l'un de la norme de protéines les plus fréquemment utilisés.

tampon de lyse

un tampon de lyse doit être choisie en fonction de la matière cellulaire ou tissulaire (culture de tissus, plantes, bactéries, champignons, etc.), et si les cellules sont dans une structure et le type de structure. Une large gamme de lyse des tampons pour l'extraction des protéines, les membranes et les organites sont formulés avec un ou plusieurs détergents. Le détergent est habituellement choisie par des tests d'essais et d'erreurs ou – si disponible – selon un protocole d'extraction des protéines existant. Le détergent doit être compatible avec la source de tissu et les protéines. En général, le détergent doux qui fonctionne pour un tissu / protéine spécifique, est choisie de manière à maintenir la fonctionnalité maximale de l'extrait. En outre, dans le cas d'une extraction des membranes et organites, un détergent doux maintient la membrane intacte. détergents couramment utilisés dans les tampons de lyse sont essentiellement non ionique ou zwitterionique, par exemple, CHAPS, désoxycholate, Triton ™ X-100, NP40 et Tween 20.
Par exemple, les tissus tels que le cerveau, le foie, les intestins, les reins, la rate, etc., peuvent être simplement mises en mémoire tampon avec RIPA – cependant des inhibiteurs de la protéase et du DTT (par exemple pour l'électrophorèse sur gel) devraient être inclus.
un tampon de lyse pour le tissu de muscle squelettique (glacé): 20 mM de Tris (pH 7,8), 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1% de Triton X-100, 10% (p / v) de glycerol, EDTA 1 mM , 1 mM de dithiothréitol additionné de protéase et un inhibiteur de phosphatase cocktail
Table des tampons ordinaires et leur gamme de pH. En général, ces tampons sont normalement utilisés à des concentrations de 20 à 50 mM.
 

Tampon plage de pH
Acide citrique – NaOH 2,2 – 6.5
Citrate de sodium – Acide citrique 3,0 – 6.2
L'acétate de sodium – acide acétique 3.6 – 5,6
sel de sodium de l'acide cacodylique – HCl 5.0 – 7.4
SEM – NaOH 5,6 – 6.8
dihydrogénophosphate de sodium – phosphate d'hydrogène disodique 5,8 – 8.0
imidazole – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
chlorhydrate de Triéthanolamine – NaOH 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
HÉPES – NaOH 7.2 – 8.2
tricine – NaOH 7.6 – 8.6
tétraborate de sodium – acide borique 7.6 – 9.2
bicine – NaOH 7.7 – 8,9
glycine – NaOH 8.6 – 10,6

La plupart des tampons montrent un pH-dépendance avec la température. Cela est particulièrement vrai pour les tampons Tris. Le pKa passe de 8,06 à 25 ° C à 8,85 à 0 ° C.
(PH et pKa d'un tampon: pH mesure la concentration d'ions hydrogène dans une solution aqueuse pKa (= constante de dissociation acide) est une mesure apparentée, mais plus spécifique, en ce sens qu'elle permet de prédire comment une molécule agira à une spécifique. PH.)

TRIzol

TRIzol est une solution de produit chimique utilisé pour extraire l'ARN / ADN / protéine pendant l'extraction guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme. L'utilisation des résultats d'extraction assistée par ultrasons Trizol dans l'ADN de haut, l'ARN et les rendements en protéines du même échantillon et excelle ainsi d'autres méthodes d'extraction.

Littérature / Références

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