Lyse d’E. coli par ultrasons
- Les bactéries E. coli sont les bactéries les plus couramment utilisées en microbiologie et en biotechnologie.
- Les disrupteurs cellulaires à ultrasons fournissent des résultats fiables et reproductibles pour la lyse d’E. coli.
- Des forces de cavitation et de cisaillement intenses, mais contrôlables avec précision, permettent une rupture complète et des rendements d’extraction élevés (p. ex. protéines, ADN).
Pourquoi la rupture cellulaire d’E. coli par ultrasons est-elle la méthode privilégiée ?
Les homogénéisateurs à ultrasons ou ultrasonicateurs de type sonde offrent plusieurs avantages pour la lyse d’E. coli, car les ultrasons intenses rompent efficacement les parois et les membranes cellulaires. Les ultrasonicateurs de type sonde sont largement utilisés pour la lyse d’E. coli pour les raisons suivantes :
L’extraction de protéines à partir de cellules d’E.coli s’effectue efficacement avec la sonde à ultrasons UP200St
Un ultrasonicateur de type sonde offre de nombreux avantages pour la lyse d’E. coli. Le contrôle fiable et précis des paramètres du procédé ultrasonore permet d’optimiser les paramètres de fonctionnement, comme la puissance, la durée et la manipulation des échantillons, afin d’obtenir les résultats souhaités.
Analyses électrophorétiques de l’ADN génomique d’E. coli EDL933 soumis à 0 – 15 min d’ultrasonication. L désigne l’échelle d’ADN (DNA Ladder).
(étude et image : ©Basselet et al. 2008)
Rupture cellulaire par cavitation ultrasonore
Les homogénéisateurs à ultrasons de type sonde fonctionnent à environ 20 000 cycles par seconde (à 20kHz) et provoquent une cavitation dans les liquides ou les suspensions. La cavitation acoustique crée des zones microscopiques de pressions proches du vide et de températures élevées qui déchirent les cellules. Bien que les températures puissent atteindre plusieurs milliers de degrés Celsius, les volumes de cavitation sont si petits qu’ils ne chauffent pas sensiblement le procédé. La cavitation acoustique et les forces de cisaillement générées par les ultrasons perforent ou rompent la membrane cellulaire de cellules bactériennes comme E.coli. Les ultrasonicateurs Hielscher permettent un contrôle précis des paramètres de procédé tels que l’intensité ultrasonore, l’amplitude, l’apport d’énergie et la température. Le processus de lyse par ultrasons peut ainsi être adapté de manière optimale au type de cellule, à la culture cellulaire et à l’objectif du procédé.
- contrôle précis de la lyse (intensité, amplitude, température)
- résultats fiables et reproductibles
- adaptation optimale aux échantillons spécifiques
- contrôle de la température
- pour les échantillons très petits à très grands (µL à litres)
- traitement purement mécanique
- utilisation conviviale et sûre
- mise à l’échelle linéaire du laboratoire à la production
VialTweeter pour la lyse par ultrasons
Homogénéisateur à ultrasons et autres techniques de lyse
Alors que la lyse chimique et la lyse enzymatique peuvent poser problème – puisque la lyse chimique peut altérer la structure des protéines et entraîner des problèmes de purification, et que la lyse enzymatique nécessite de longs temps d’incubation et n’est pas reproductible –, la rupture par ultrasons est une méthode de rupture cellulaire sophistiquée et rapide.
La lyse par ultrasons repose uniquement sur des forces mécaniques. Aucun produit chimique n’est ajouté : la sonication rompt la paroi cellulaire par des forces de cisaillement. La lyse chimique peut altérer la structure des protéines et entraîner des problèmes de purification. La rupture enzymatique nécessite de longs temps d’incubation et n’est pas reproductible. La rupture cellulaire des bactéries E.coli par ultrasons est rapide, simple, fiable et reproductible. C’est pourquoi les ultrasonicateurs Hielscher sont utilisés dans des laboratoires de biologie et de biochimie du monde entier pour la préparation d’échantillons, la pré-analytique, le diagnostic in vitro et de nombreux essais.
Recommandations générales pour la lyse par ultrasons
La sonication est la technique la plus répandue pour lyser des quantités très petites, moyennes et grandes de suspensions cellulaires – de quelques picolitres jusqu’à 100L/hr (avec une cellule à circulation à ultrasons). Les cellules sont lysées par le cisaillement du liquide et la cavitation. L’ADN est également cisaillé pendant la sonication ; il n’est donc pas nécessaire d’ajouter de la DNase à la suspension cellulaire.
Contrôle de la température pendant la lyse d’E.coli par ultrasons
En pré-refroidissant l’échantillon et en le maintenant sur glace pendant la sonication, la dégradation thermique de l’échantillon peut être facilement évitée.
Idéalement, les échantillons doivent être maintenus à la température de la glace pendant la lyse, mais pour la plupart des échantillons, il suffit que la température ne dépasse pas celle de la culture ou du tissu d’origine. Il est donc recommandé de maintenir la suspension sur glace et de soniquer par plusieurs courtes impulsions ultrasonores de 5–10 sec, entrecoupées de pauses de 10–30 sec. Pendant les pauses, la chaleur peut se dissiper afin de rétablir une température basse. Pour des échantillons cellulaires plus importants, divers réacteurs à cellule à circulation avec double enveloppe de refroidissement sont disponibles.
Lisez ici des conseils et recommandations détaillés pour réussir une lyse par ultrasons !
Protocoles pour la préparation de lysats d’E. coli par ultrasons
Des chercheurs utilisent les homogénéisateurs à ultrasons Hielscher pour la rupture cellulaire d’E.coli. Vous trouverez ci-dessous divers protocoles testés et éprouvés pour la lyse d’E.coli à l’aide d’homogénéisateurs à ultrasons Hielscher, pour diverses applications liées à E. coli.
Croissance cellulaire, réticulation et préparation d’extraits cellulaires d’E. coli par ultrasons
Pour le ChIP-Chip de SeqA et de l’ARN polymérase, E. coli MG1655 ou MG1655 ΔseqA a été cultivé à 37°C jusqu’à une OD600 d’environ 0,15 dans 50 ml de LB (+ 0,2% de glucose) avant l’ajout de 27 μl de formaldéhyde (37%) par ml de milieu (concentration finale 1%). La réticulation a été réalisée sous agitation lente (100 rpm) à température ambiante pendant 20 min, suivie d’une neutralisation (quenching) avec 10 ml de glycine 2,5 M (concentration finale 0,5 M). Pour les expériences de choc thermique, E. coli MG1655 a été cultivé dans 65 ml de milieu LB à 30°C jusqu’à une OD600 d’environ 0,3. Ensuite, 30 ml de culture ont été transférés dans un flacon préchauffé à 43°C, le reste étant maintenu à 30°C. La réticulation et la neutralisation ont été effectuées comme décrit ci-dessus, sauf que les cellules ont été maintenues à 30 ou 43°C pendant 5 min avant la poursuite de l’agitation lente à température ambiante. Les cellules ont été récoltées par centrifugation et lavées deux fois avec du TBS froid (pH7.5). Après remise en suspension dans 1 ml de tampon de lyse (10 mM Tris (pH 8,0), 20% de saccharose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml de lysozyme) et incubation à 37°C pendant 30 min, suivie de l’ajout de 4 ml de tampon IP, les cellules ont été soniquées sur glace 12 fois 30 sec avec des pauses de 30 sec à l’aide du processeur à ultrasons Hielscher UP400St réglé à 100% de puissance. Après centrifugation pendant 10 min à 9000 g, des aliquotes de 800 μl du surnageant ont été conservées à -20°C. (Waldminghaus 2010)
Surproduction et purification d’enzymes avec une sonde à ultrasons
Pour la surproduction de protéines étiquetées décahistidine (His10), E. coli BL21(DE3) a été transformé avec des constructions pET19b. Une préculture de nuit a été récoltée par centrifugation, et 1% a été utilisé pour inoculer une culture d’expression. Les cellules portant pET19mgtB ont été cultivées à 22°C jusqu’à une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,7. La culture a été transférée à 17°C et induite par 100 μM d’IPTG. Après 16 h, la culture a été récoltée par centrifugation à 7 500 × g à 4°C. Les cellules ont été remises en suspension dans 50 mM de tampon phosphate salin (PBS) avec 0,3 M NaCl à pH 7,4 et lysées par ultrasonication avec une sonotrode à micropointe S2 montée sur l’ultrasonicateur Hielscher UP200St, à un cycle de 0,5 et une amplitude de 75%.
La surproduction de GtfC étiquetée décahistidine a été induite à 37°C à une OD600 de 0,6 avec 100 μM d’IPTG. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 4 h, récoltées et lysées comme indiqué ci-dessus pour MgtB.
Les extraits cellulaires bruts ont été centrifugés à 15 000 × g et 4°C pour sédimenter les débris cellulaires. Les extraits clarifiés ont été chargés sur des colonnes HisTrap FF Crude de 1 ml à l’aide d’un système ÄKTAprime Plus. Les enzymes ont été purifiées selon le protocole du fabricant pour l’élution en gradient de protéines étiquetées His. Les solutions de protéines éluées ont été dialysées deux fois contre 1 000 volumes de PBS 50 mM, pH 7,4, avec 0,3 M NaCl à 4°C. La purification a été analysée par SDS-PAGE à 12%. La concentration en protéines a été déterminée par la méthode de Bradford à l’aide de Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
Extraction par ultrasons de protéines à partir de bactéries E. coli
Une protéine appât d’intérêt (ici, MTV1 d’Arabidopsis thaliana) est fusionnée à une étiquette GST et exprimée dans des cellules d’Escherichia coli (E. coli) BL21.
- Prendre un culot de GST-MTV1 et un culot de GST (correspondant chacun à 50 ml de culture bactérienne) et remettre chacun en suspension dans 2,5 mL de tampon d’extraction glacé.
- Utiliser un ultrasonicateur UP100H (équipé d’une sonotrode à micropointe MS3 pour les petits volumes d’environ 2–5mL) pour rompre les cellules bactériennes jusqu’à leur lyse, indiquée par une opacité réduite et une viscosité accrue. Cette opération doit être réalisée sur glace, et il est recommandé de soniquer par intervalles (p. ex. 10 sec de sonication suivies de 10 sec de pause sur glace, et ainsi de suite). Il faut veiller à ne pas soniquer avec une intensité trop élevée. En cas de formation de mousse ou d’un précipité blanc, l’intensité doit être réduite.
- Transférer la solution de bactéries lysées dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger à 4°C, 16 000 x g pendant 20 min.
Les ultrasonicateurs de type sonde comme l’UP400St utilisent le principe de fonctionnement de la cavitation acoustique pour une lyse efficace d’E.coli.
Analyse de l’expression et purification d’une protéine recombinante par sonication
Le culot d’E. coli a été soniqué avec l’ultrasonicateur Hielscher UP100H. Pour ce faire, le culot cellulaire a été remis en suspension dans un tampon de lyse refroidi (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) et refroidi sur glace pendant 10 min. La suspension cellulaire a ensuite été soniquée par 10 courtes salves de 10 s, chacune suivie d’un intervalle de 30 s pour le refroidissement. Enfin, les débris cellulaires ont été éliminés par ultracentrifugation à 4°C pendant 15 min à 14 000 rpm. Pour confirmer l’expression de la rPR, le surnageant a été déposé sur un gel de polyacrylamide à 12% et analysé par SDS-PAGE et Western blot. La purification de la rPR a été réalisée à l’aide de résine Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) selon le guide du fabricant. À ce stade, une méthode de purification native a été utilisée. La pureté de la protéine purifiée a été évaluée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 12%, suivie d’une coloration au bleu de Coomassie. La concentration de la protéine purifiée a été mesurée à l’aide du kit de dosage des protéines Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
Homogénéisateurs à ultrasons pour la lyse d’E. coli
Hielscher Ultrasonics conçoit, fabrique et distribue des homogénéisateurs à ultrasons haute performance pour la lyse fiable et efficace des bactéries E. coli et d’autres types de cellules, tissus et cultures cellulaires.
La vaste gamme de sondes à ultrasons ainsi que de systèmes de sonication indirecte nous permet de vous proposer l’homogénéisateur de tissus à ultrasons idéal pour votre application de rupture cellulaire et d’extraction.
Conception, fabrication et conseil – qualité Made in Germany
Les ultrasonicateurs Hielscher sont réputés pour leurs normes de qualité et de conception les plus élevées. Logiciel intelligent, menu intuitif, réglages programmables et enregistrement automatique des données ne sont que quelques-unes des caractéristiques des ultrasonicateurs Hielscher. Leur robustesse et leur facilité d’utilisation permettent une intégration aisée de nos ultrasonicateurs dans les installations de recherche et de biotechnologie. Même les conditions difficiles et les environnements exigeants sont facilement maîtrisés par les ultrasonicateurs Hielscher.
Hielscher Ultrasonics est une entreprise certifiée ISO et accorde une importance particulière aux ultrasonicateurs haute performance alliant technologie de pointe et convivialité. Bien entendu, les ultrasonicateurs Hielscher sont conformes CE et répondent aux exigences UL, CSA et RoHs.
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicateurs :
| Volume du lot | Débit | Appareils recommandés |
|---|---|---|
| plaques multipuits / plaques de microtitration | n.a. | UIP400MTP |
| CupHorn pour flacons ou béchers | n.a. | CupHorn à ultrasons |
| microréacteur à circulation à ultrasons | n.a. | GDmini2 |
| jusqu’à 10 flacons de 0,5 à 1,5mL | n.a. | VialTweeter |
| 0,5 à 1,5mL | n.a. | VialTweeter |
| 1 à 500mL | 10 à 200mL/min | UP100H |
| 10 à 2000mL | 20 à 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 à 20L | 0,2 à 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 à 100L | 2 à 10L/min | UIP4000 |
| n.a. | 10 à 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | supérieur | cluster de UIP16000 |
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Protocoles supplémentaires pour la lyse d’E. coli par ultrasons
Protéines modifiées par l’allicine chez E. coli à l’aide d’un VialTweeter à ultrasons
Détermination de la teneur en groupements sulfhydryle par dosage au 5,5′-dithiobis(acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB)
Une culture de nuit d’E. coli MG1655 a été utilisée pour inoculer du milieu minimal MOPS (1:100). La culture a été cultivée en aérobiose jusqu’à atteindre une A600 de 0,4. La culture a été divisée en trois cultures de 15 ml pour le traitement de stress. Une culture non traitée a servi de témoin négatif. 0,79 mM d’allicine (128 μg ml-1) ou 1 mM de diamide ont été ajoutés respectivement à l’une des deux cultures restantes. Les cultures ont été incubées pendant 15 min. 5 ml de chaque culture ont été récoltés par centrifugation (8 525 × g, 4°C, 10 min). Les cellules ont été lavées deux fois avec 1 ml de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, conservé en anaérobiose avant utilisation) et centrifugées (13 000 × g, 4°C, 10 min). Les cellules ont été remises en suspension dans un tampon de lyse (PBS avec 6 mM de HCl de guanidinium, pH 7,4) avant leur rupture à 4°C par ultrasonication (VialTweeter : ultrasonicateur Hielscher GmbH, Allemagne) (3 × 1 min). Les débris cellulaires ont été culottés par centrifugation (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Le surnageant a été transféré dans une cuvette macro QS de 3,5 ml (10 mm) munie d’un barreau magnétique et mélangé à 1 ml de tampon de lyse. L’extinction des échantillons a été suivie à 412 nm avec un spectrophotomètre Jasco V-650 équipé du porte-cuvette thermostaté PSC-718, à température ambiante. 100μl d’une solution de dithiobis(acide 2-nitrobenzoïque) à 3 mM ont été ajoutés. L’extinction a été suivie jusqu’à saturation. Le calcul de la concentration en thiols a été effectué à l’aide du coefficient d’extinction ϵ412 = 13 700 M-1 cm-1 pour l’acide thio-2-nitrobenzoïque (TNB). Les concentrations cellulaires en thiols ont été calculées sur la base d’un volume de cellules d’E. coli de 6,7 × 10-15 litre et d’une densité cellulaire de A600 = 0,5 (équivalant à 1 × 108 cellules ml-1 de culture). (Müller et al. 2016)
Dosage in vivo du glutathion à l’aide d’un broyeur cellulaire à ultrasons
E.coli MG1655 a été cultivé dans du milieu minimal MOPS dans un volume total de 200ml jusqu’à atteindre une A600 de 0,5. La culture a été divisée en cultures de 50 ml pour le traitement de stress. Après 15 min d’incubation avec 0,79 mM d’allicine, 1 mM de diamide ou du diméthylsulfoxyde (témoin), les cellules ont été récoltées à 4 000g à 4°C pendant 10 min. Les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon KPE avant remise en suspension des culots dans 700µl de tampon KPE. Pour la déprotéinisation, 300l d’acide sulfosalicylique à 10% (w/v) ont été ajoutés avant la rupture des cellules par ultrasonication (3 x 1 min ; ultrasonicateur VialTweeter utilisé). Les surnageants ont été recueillis après centrifugation (30 min, 13 000g, 4°C). Les concentrations d’acide sulfosalicylique ont été abaissées à 1% par ajout de 3 volumes de tampon KPE. Les mesures du glutathion total et du GSSG ont été effectuées comme décrit ci-dessus. Les concentrations cellulaires en glutathion ont été calculées sur la base d’un volume de cellules d’E. coli de 6,7×10-15 litre et d’une densité cellulaire de A600 0,5 (équivalant à 1×108 cellules ml-1 de culture). Les concentrations de GSH ont été calculées en soustrayant 2[GSSG] du glutathion total. (Müller et al. 2016)
Expression de la mAspAT humaine chez E. coli à l’aide d’un homogénéisateur à ultrasons
La colonie unique d’E. coli BL21 (DE3) portant le vecteur d’expression a été ensemencée dans 30 mL de milieu Luria-Bertani (LB) contenant 100μg/mL d’ampicilline, puis cultivée à 37ºC jusqu’à ce que la densité optique (OD600) atteigne 0,6. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 4 000 × g pendant 10 min, puis remises en suspension dans 3L de milieu LB frais contenant 100μg/mL d’ampicilline.
L’expression protéique a ensuite été induite avec 1 mM d’isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pendant 20 h à 16ºC. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 8 000 × g pendant 15 min et lavées avec le tampon A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Environ 45g de cellules (poids humide) ont été obtenus à partir de 3 L de culture. Après centrifugation, les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 40 mL (pour 1 L de culture) de tampon d’extraction A glacé, puis lysés par ultrasonication à température glacée à l’aide du broyeur cellulaire à ultrasons Hielscher UP400St. Le lysat cellulaire a été centrifugé à 12 000 rpm pendant 15 min afin de séparer les fractions soluble (surnageant) et précipitée (culot). (Jiang et al. 2015)
Bon à savoir
E.coli
Escherichia coli (E. coli) est une bactérie coliforme à Gram négatif, anaérobie facultative et en forme de bâtonnet, du genre Escherichia, que l’on trouve couramment dans la partie inférieure de l’intestin des organismes à sang chaud (endothermes). Il existe un grand nombre de souches (ou sous-types) d’E. coli aux caractéristiques diverses. La plupart des souches d’E. coli sont inoffensives pour l’homme, p. ex. les souches B et K-12, couramment utilisées pour des applications de recherche en laboratoire. Certaines souches sont toutefois nocives et peuvent provoquer des maladies graves.
E. coli joue un rôle important dans le génie biologique moderne et la microbiologie industrielle, car cette bactérie est facile à manipuler. Parmi les applications de laboratoire courantes qui font souvent appel à E. coli figurent, p. ex., la création d’acide désoxyribonucléique (ADN) recombinant ou son utilisation comme organisme modèle.
E. coli est un hôte très polyvalent pour la production de protéines hétérologues, et de nombreux systèmes d’expression protéique sont disponibles pour produire des protéines recombinantes chez E. coli. À l’aide de plasmides permettant un niveau élevé d’expression protéique, des gènes peuvent être introduits dans la bactérie, ce qui permet de produire ces protéines en grandes quantités dans des procédés de fermentation industriels.
E.coli est utilisé comme usine cellulaire pour produire de l’insuline. D’autres applications comprennent l’utilisation de cellules d’E. coli modifiées pour développer et produire des vaccins et des enzymes immobilisées, pour produire des biocarburants, ainsi que pour la bioremédiation.
La souche K-12 est une forme mutante d’E. coli qui surexprime l’enzyme phosphatase alcaline (ALP). Cette mutation est due à un défaut du gène qui code en permanence pour l’enzyme. Lorsqu’un gène produit un produit sans aucune inhibition, on parle d’activité constitutive. Cette forme mutante spécifique est utilisée pour l’isolement et la purification de l’enzyme ALP.
Les bactéries E. coli sont également largement utilisées comme usines cellulaires. Des microbes modifiés (p. ex. des bactéries) et des cellules végétales peuvent être utilisés comme « usines cellulaires ». Ces cellules génétiquement modifiées produisent des molécules, des produits chimiques, des polymères, des protéines et d’autres substances, utilisés par exemple dans les industries pharmaceutique, alimentaire et chimique. Pour libérer les molécules produites à l’intérieur de ces cellules issues de la bio-ingénierie, la lyse par ultrasons est une méthode courante permettant de rompre les parois cellulaires et de transférer les substances cibles dans le liquide environnant. En savoir plus sur la lyse des cellules issues de la bio-ingénierie !
Cisaillement de l’ADN par ultrasons
Les forces de cisaillement ultrasonores sont une méthode couramment utilisée pour libérer des molécules, des organites et des protéines de l’intérieur des cellules, ainsi que pour fragmenter des brins d’ADN. La cavitation acoustique rompt les parois et membranes cellulaires afin d’extraire l’ADN des cellules et génère des fragments d’environ 600 – 800 bp de longueur, ce qui est idéal pour l’analyse.
Cliquez ici pour en savoir plus sur les homogénéisateurs à ultrasons pour la fragmentation de l’ADN !
Bibliographie / Références
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons haute performance, du laboratoire à l’échelle industrielle.