Technologie des ultrasons Hielscher

Ultrasons Lysis de E. Coli

  • bactéries E. coli sont les bactéries les plus couramment utilisés dans la microbiologie et la biotechnologie.
  • Perturbateurs cellulaires à ultrasons fournissent des résultats fiables et reproductibles pour la lyse de E. coli.
  • les forces de cavitation et de cisaillement intenses encore précisément contrôlables conduisent à une perturbation complète et les rendements d'extraction élevés (par exemple des protéines, ADN).

La perturbation de la cellule par cavitation

bactéries Escherichia coli sont lysées de manière fiable en utilisant des homogénéisateurs à ultrasons de tissus.homogénéisateurs sonde à ultrasons du type fonctionnent avec env. 20.000 cycles par seconde (à 20 kHz) et provoquer une cavitation dans des liquides ou des supsensions. les zones microscopiques de cavitation acoustiques de pression en forme de vide et des températures élevées qui déchirent les cellules d'intervalle. Bien que les températures peuvent atteindre plusieurs milliers de degrés Celsius, les volumes de cavitation sont si petits qu'ils ne chauffent pas de manière significative le processus. L'échographie cavitation acoustique générée et des forces de cisaillement perforée ou briser la membrane cellulaire de E. coli – en fonction du réglage du dispositif de l'homogénéisateur à ultrasons.

Avantages de ultrasons Lyse

  • un contrôle précis de la lyse (intensité, l'amplitude, la température)
  • adaptation optimale à des échantillons spécifiques
  • contrôle de la température
  • pour les très petits à très grands échantillons (uL de litres)
  • pur traitement mécanique
  • linéaire mise à l'échelle du laboratoire à la production
Le dispositif à ultrasons VialTweeter permet la préparation d'échantillons simultanément jusqu'à 10 flacons dans les mêmes conditions de traitement. (Cliquez pour agrandir!)

VialTweeter pour la lyse par ultrasons

Demande d'information





Alors que la lyse chimique et enzymtic peut être problématique – car la lyse chimique peut modifier les structures de protéines et d'introduire des problèmes de purification et la lyse enzymatique nécessite des temps d'incubation longue et n'est pas reproductible – rupture par ultrasons est une méthode de rupture des cellules sophistiqué, rapide.
La lyse ultrasonique est basée uniquement sur les forces mécaniques. Aucun produit chimique n'est ajouté, la sonication brise la paroi cellulaire par les forces de cisaillement. La lyse chimique peut modifier la structure des protéines et introduire des problèmes de purification. La perturbation enzymatique nécessite de longs temps d'incubation et n'est pas reproductible.

Recommandations générales

UP400St appareil à ultrasons avec réacteur à écoulementSonication est la technique la plus populaire pour lyser très petites quantités, moyennes et grandes de suspensions cellulaires – de pico-litres jusqu'à 100 litres / h (en utilisant une cellule d'écoulement à ultrasons). Les cellules sont lysées par cisaillement de liquide et la cavitation. L'ADN est également cisaillé pendant la sonication, il est donc pas nécessaire d'ajouter DNase à la suspension cellulaire.
Contrôle de la température:
En pré-refroidissement de l'échantillon et de maintien de l'échantillon au cours de la sonication sur de la glace, Exemple dégradation thermique de l'échantillon peut être facilement évité.
Idéalement, les échantillons devraient être conservés à froid pendant la lyse, mais pour la plupart des échantillons, il suffit que la température ne dépasse pas la température de la culture ou de la source tissulaire. Il est donc recommandé de garder la suspension sur la glace et de la soniquer avec plusieurs brèves impulsions ultrasonores de 5 à 10 secondes et des pauses de 10 à 30 secondes. Pendant les pauses, la chaleur peut se dissiper afin de rétablir une température basse. Pour les échantillons de plus grandes cellules, différents réacteurs à cellules d'écoulement avec chemises de refroidissement sont disponibles.

Les protocoles pour la préparation de E. Coli lysats

Analyse de l'expression et la purification de la protéine recombinante

Le culot de E. coli a été traité par ultrasons avec un système à ultrasons UP100H (Hielscher). A cet effet, culot cellulaire a été remis en suspension dans du tampon de lyse glacé (Tris-HCl 50 mM pH = 7,5, 100 mM de NaCl, 5 mM de DTT, 1 mM de PMSF) et refroidi sur de la glace pendant 10 min. Ensuite, la suspension cellulaire a été soniquée avec 10 courtes rafales de 10 s, suivi par intervalle de 30 s pour le refroidissement. Enfin, les débris cellulaires ont été éliminés par ultracentrifugation à 4 ° C pendant 15 min à 14000 rpm. Pour la confirmation d'expression rPR, le surnageant a été exécuté sur gel à 12% de polyacrylamide et analysé par SDS-PAGE et Western Blot. La purification de rPR a été fait en utilisant Ni2+résine NTA (Invitrogen, USA) selon le guide du fabricant. Dans cette étape, la méthode de purification native a été utilisée. La pureté de la protéine purifiée a été évaluée en utilisant une électrophorèse sur gel à 12% de Polyacrylamide et coloration au bleu de Coomassie ultérieur. la concentration de la protéine purifiée a été mesurée par le kit de dosage de protéine Micro BCA (Pierce, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

cellule à ultrasons disrupteur UP100H (100W) pour la lyse, la rupture des cellules et le cisaillement de l'ADN.

homogénéisateur à ultrasons UP100H (100W)

La croissance cellulaire, réticulation et E. Préparation d'extraits de cellules coli

Pour SEQA et l'ARN polymérase ChIP-Chip E. coli MG1655 ou MG1655 ΔseqA a été cultivé à 37 ° C jusqu'à une DO600 d'environ 0,15 dans 50 ml de LB (+ 0,2% de glucose) avant d'ajouter 27 ul de formaldéhyde (37%) par ml de milieu (concentration finale 1%). La reticulation a été effectuée sous agitation lente (100 tr / min) à température ambiante pendant 20 minutes, suivie d'une trempe avec 10 ml de glycine 2,5 M (concentration finale 0,5 M). Pour les expériences de choc thermique, E. coli MG1655 a été cultivé dans 65 ml de milieu LB à 30 ° C jusqu'à une DO600 d'environ 0,3. Par la suite, 30 ml de culture ont été transférés dans un ballon pré-chauffé à 43 ° C et le reste maintenu à 30 ° C. La réticulation et la trempe étaient telles que décrites ci-dessus sauf que les cellules ont été maintenues à 30 ou 43 ° C pendant 5 minutes avant d'être encore secouées lentement à température ambiante. Les cellules ont été recueillies par centrifugation et lavées deux fois avec du TBS froid (pH 7,5). Après remise en suspension dans 1 ml de tampon de lyse (Tris 10 mM (pH 8,0), saccharose 20%, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, lysozyme 10 mg / ml) et incubation à 37 ° C pendant 30 min suivie de l'addition de 4 ml IP tampon, les cellules ont été soniquées sur de la glace avec 12 fois 30 sec et 30 sec se brise à un UP400St processeur à ultrasons (Hielscher Ultrasonics GmbH) avec une puissance de 100%. Après centrifugation pendant 10 min à 9000 g, 800 ul aliquotes du surnageant ont été stockés à -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

La surproduction et la purification des enzymes.

Pour la surproduction de decahistidine (His10) -tagged protéines, E. coli BL21 (DE3) a été transformé avec les constructions pET19b. Une préculture d'une nuit a été récolté par centrifugation, et 1% a été utilisé pour inoculer une culture d'expression. Les cellules portant pET19mgtB ont été cultivées à 22 ° C jusqu'à une densité optique à 600 nm (DO600) De 0,7. La culture a été transférée à 17 ° C et induites par l'IPTG 100 uM. Après 16 heures, la culture a été récoltée par centrifugation à 7500 x g à 4 ° C. Les cellules ont été remises en suspension dans 50 mM de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec du NaCl 0,3 M à pH 7,4 et lysées par traitement aux ultrasons avec un micro-pointe sonotrode S2 à la UP200St appareil à ultrasons (Hielscher, Teltow, Allemagne) à un cycle de 0,5 et une amplitude de 75%.
La surproduction de GTFC étiqueté decahistidine-a été induite à 37 ° C, à une DO600 de 0,6 à 100 uM d'IPTG. Les cellules ont été ensuite mises en incubation pendant 4 heures, récoltées, lysées et comme indiqué ci-dessus pour MgtB.
Des extraits cellulaires bruts ont été centrifugés à 15 000 x g et 4 ° C pour sédimenter les débris cellulaires. Les extraits clarifiés ont été chargés sur 1 ml HisTrap FF colonnes brut en utilisant un système ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Les enzymes ont été purifiés selon le protocole du fabricant pour un gradient d'élution de protéines à étiquette His. des solutions de protéines éluées ont été dialysées deux fois contre 1000 volumes de 50 mM de PBS, pH 7,4, avec 0,3 M de NaCl à 4 ° C. La purification a été analysé par 12% de SDS-PAGE. La concentration en protéine a été déterminée par la méthode de Bradford en utilisant Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne). (Rabausch et al. 2013)

Extraction des protéines de la bactérie E. coli
Une protéine d'appât d'intérêt (dans ce cas, MTV1 d'Arabidopsis thaliana) est fusionnée à un marqueur GST et exprimé dans Escherichia coli BL21 cellules (E. coli).
1. Prendre une pastille de GST-MTV1 et TPS (correspondant à 50 ml de culture bactérienne) et remettre en suspension dans chaque tampon d'extraction à froid 2,5 ml de glace.
2. Utilisez un appareil à ultrasons UP100H (Équipé d'MS3 micropointe-sonotrode pour les petits volumes (2-5mL)) pour rompre les cellules bactériennes jusqu'à ce qu'ils soient lysées, ce qui est indiqué par opacité réduite et la viscosité augmentée. Ceci doit être effectué sur la glace, et il est recommandé de sonication à des intervalles (par exemple 10 sec sonication suivie de 10 secondes sur la glace et ainsi de suite). Des précautions doivent être prises pour ne pas sonication avec une intensité trop élevée. Si la formation de mousse ou la formation d'un précipité blanc est détectée, l'intensité doit être abaissée.
3. Transférer la solution de bactéries lysées à 1,5 ml des tubes de microcentrifugation et centrifuge à 4 ° C, 16 000 x g pendant 20 min.

Les protéines modifiées allicine-dans E. coli

Le VialTweeter est un appareil à ultrasons confortable pour homogénéisation petit échantillonDétermination des matières sulfhydryle par le 5,5'-dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB) Dosage
Une culture d'une nuit de E. coli MG1655 a été utilisé pour inoculer un milieu minimal MOPS (1: 100). La culture a été cultivé jusqu'à ce qu'un A600 en aérobiose de 0,4 a été atteint. La culture a été divisée en trois cultures pour le traitement du stress de 15 ml. Une culture non traitée a servi de témoin négatif. 0,79 mM allicine (128 ug ml-1) Ou 1 mM diamide a été ajouté à l'une des deux cultures restantes chacun. Les cultures ont été incubées pendant 15 min. 5 ml de chaque culture ont été récoltées par centrifugation (8525 g ×, 4 ° C, 10 min). Les cellules ont été lavées deux fois avec 1 ml de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4, 2 mM de KH2PO4pH 7,4, stocké de manière anaérobie avant utilisation) et centrifugé (13 000 x g, 4 ° C, 10 min). Les cellules ont été remises en suspension dans du tampon de lyse (PBS avec 6 mM de guanidinium HCl, pH 7,4) avant d'être perturbées à 4 ° C par ultrasonication (VialTweeter appareil à ultrasons, Hielscher GmbH, Allemagne) (3 x 1 min). Les débris cellulaires ont été sédimenté par centrifugation (13 000 x g, 4 ° C, 15 min). Le surnageant a été transféré dans une cuvette de 3,5 ml QS-macro (10 mm) avec une barre d'agitation magnétique et on mélange avec 1 ml de tampon de lyse. Extinction des échantillons a été contrôlée à 412 nm avec un spectrophotomètre Jasco V-650 équipé du porte-cuve à température contrôlée PSC-718 (Jasco) à la température ambiante. 100 ul d'une solution dithiobis 3 mM (acide 2-nitrobenzoïque) ont été ajoutés. L'extinction a été suivie jusqu'à ce qu'elle atteigne la saturation. Calcul de la concentration de thiol a été réalisée en utilisant le coefficient d'extinction ε412 = 13700 M-1 centimètres-1 pour thio-2-nitrobenzoïque (TNB). thiol concentrations cellulaires ont été calculées sur la base d'un volume de cellules de E. coli de 6,7 × 10-15 litre et une densité de cellules de A600 = 0,5 (équivalent à 1 x 108 cellules ml-1 Culture). (Müller et al., 2016)

Détermination in vivo Glutathion

E. coli MG1655 a été cultivé dans MOPS milieu minimal dans un volume total de 200 ml jusqu'à A600 de 0,5 a été atteint. La culture a été divisée en cultures de 50 ml pour le traitement du stress. Après 15 min d'incubation avec de l'allicine à 0,79 mM, du diamide à 1 mM ou du diméthylsulfoxyde (contrôle), les cellules ont été récoltées à 4 000 g à 4 ° C pendant 10 minutes. Les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon KPE avant la remise en suspension des culots dans 700 ul de tampon KPE. Pour la déprotéination, 300 ul d'acide sulfosalicylique à 10% (poids / volume) ont été ajoutés avant la rupture des cellules par ultrasonication (3 x 1 min; VialTweeter appareil à ultrasons). Les surnageants ont été recueillis après centrifugation (30 min, 13,000g, 4 ° C). les concentrations d'acide sulfosalicylique ont été réduites à 1% par addition de 3 volumes de tampon KPE. Les mesures de glutathion totale et GSSG ont été réalisées comme décrit ci-dessus. Les concentrations de glutathion cellulaire ont été calculées sur la base d'un volume de cellules de E. coli de 6,7×dix-15 litre et une densité de cellules de A600 00,5 (équivalent à 1×dix8 cellules ml-1 Culture). Les concentrations de GSH ont été calculées par soustraction de 2 [GSSG] de glutathion totale. (Müller et al. 2016)

disrupteur à ultrasons pour la lyse des cellules et l'extraction de matériel biologique (Cliquez pour agrandir!)

Sonde de type appareil à ultrasons UP400St

Expression de mAspAT humain dans E. coli

Ultrasons cellule disrupteur UP400St (400W) pour l'extraction de la matière intracellulaire (par exemple des protéines, des organelles, l'ADN, l'ARN, etc.)La colonie unique de E. coli BL21 (DE3) hébergeant le vecteur d'expression dans 30 ml de Luria-Bertani (LB) contenant 100 ug moyen / ml d'ampicilline, puis cultivé à 37 ° C jusqu'à ce que la densité optique (DO600) Atteint 0,6. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 4000 x g pendant 10 min et remises en suspension dans du milieu LB frais contenant 100 ug 3L / mL d'ampicilline.
Par la suite, l'expression des protéines a été induite avec 1 mM de β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside d'isopropyle (IPTG) pendant 20 h à 16 ° C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 8000 x g pendant 15 minutes et on les lave avec du tampon A (20 mM NaH2PO4, NaCl 0,5 M, pH 7,4). cellules approximée 45g (poids humide) ont été obtenus à partir de 3 culture L. Après centrifugation, les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 40 ml (pour 1 L de culture) de tampon d'extraction glacé A, et lysées par traitement aux ultrasons à la température de la glace en utilisant un UP400St instrument (Dr. Hielscher GmbH, Allemagne). La lyse des cellules a été centrifugé à 12 000 tpm pendant 15 minutes pour séparer soluble (surnageant) et les fractions précipitées (à granulés). (Jiang et al. 2015)

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicators:

lot Volume Débit Appareils recommandés
00,5 à 1,5 ml n / a. VialTweeter
1 à 500 ml 10 à 200 ml / min UP100H
10 à 2000mL 20 à 400 ml / min UP200Ht, UP400St
0.1 20L 00,2 à 4L / min UIP2000hdT
10 à 100l 2 à 10 L / min UIP4000
n / a. 10 à 100 litres / min UIP16000
n / a. plus grand groupe de UIP16000

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Littérature / Références



Qu'il faut savoir

E. coli

Escherichia coli (E. coli) est une bactérie coliforme gram-négative, facultativement anaérobie, en forme de bâtonnet, du genre Escherichia, que l'on trouve couramment dans l'intestin inférieur des organismes à sang chaud (endothermes). Il existe un grand nombre de souches (ou sous-types) de E. coli présentant des caractéristiques diverses. La plupart des souches d'E. Coli sont inoffensives pour l'homme, par exemple les souches B et K-12 qui sont couramment utilisées pour des applications de recherche en laboratoire. Cependant, certaines souches sont nocives et peuvent causer des maladies graves.
E. coli joue un rôle important dans l'ingénierie biologique moderne et la microbiologie industrielle car la bactérie est facile à manipuler. applications de laboratoire courantes qui impliquent souvent l'utilisation de E. coli, par exemple pour créer l'acide recombinant désoxyribonucléique (ADN) ou d'agir comme un organisme modèle.
E. coli est un hôte très polyvalent pour la production de protéines hétérologues, et des systèmes d'expression de protéines multiples sont disponibles pour produire des protéines recombinantes dans E. coli. En utilisant des plasmides qui permettent une expression élevée du niveau de la protéine, les gènes peuvent être introduits dans les bactéries, ce qui permet de produire de telles protéines en quantités élevées dans les procédés de fermentation industriels.
E. coli sont utilisés comme usines cellulaires pour produire de l'insuline. D'autres applications comprennent l'utilisation de cellules de E. coli modifiées pour développer et produire des vaccins et des enzymes immobilisées, pour produire des biocarburants, ainsi que pour la biorestauration.
La souche K-12 est une forme mutante de E. coli qui surexprime l'enzyme phosphatase alcaline (ALP). Cette mutation se produit en raison d'un défaut dans le gène qui ne cessent de code pour l'enzyme. Si un gène produit un produit sans inhibition ceci est connu comme l'activité constitutive. Cette forme mutante spécifique est utilisé pour isoler et purifier l'enzyme ALP.

ADN par ultrasons Shearing

des forces de cisaillement à ultrasons sont une méthode couramment utilisée pour séparer de la cellule et briser en morceaux brins d'ADN. cavitation acoustique brise les parois des cellules et des membranes pour en extraire l'ADN à partir de cellules et de générer des fragments d'environ 600 – 800 pb de longueur, ce qui est idéal pour l'analyse.
Cliquez ici pour en savoir plus sur homogénéisateurs à ultrasons pour la fragmentation de l'ADN!