Ultrasons Lysis de E. Coli

  • bactéries E. coli sont les bactéries les plus couramment utilisés dans la microbiologie et la biotechnologie.
  • Perturbateurs cellulaires à ultrasons fournissent des résultats fiables et reproductibles pour la lyse de E. coli.
  • les forces de cavitation et de cisaillement intenses encore précisément contrôlables conduisent à une perturbation complète et les rendements d'extraction élevés (par exemple des protéines, ADN).

Pourquoi la désintégration cellulaire d'E. coli par ultrasons est-elle la méthode préférée ?

Les homogénéisateurs à ultrasons ou les ultrasons à sonde offrent plusieurs avantages pour la lyse d'E. coli, car les ultrasons intenses détruisent efficacement les parois et les membranes cellulaires. Les ultrasons de type sonde sont largement utilisés pour la lyse d'E. coli pour les raisons suivantes :

  • Perturbation efficace des parois cellulaires : E. coli possède une paroi cellulaire semi-rigide composée de peptidoglycane, qui peut être difficile à briser à l'aide des méthodes de lyse traditionnelles. Un ultrasonateur à sonde génère des ondes ultrasoniques intenses qui créent des bulles de cavitation dans le liquide entourant les cellules. Lorsque ces bulles s'effondrent, elles génèrent des jets de liquide à grande vitesse et des ondes de choc qui entraînent une rupture mécanique des parois cellulaires, libérant ainsi efficacement le contenu cellulaire tel que les biomolécules.
  • Pénétration renforcée : Les ondes ultrasoniques générées par la sonde / sonotrode peuvent pénétrer profondément dans l'échantillon, atteindre un plus grand nombre de cellules E. coli et les traiter de manière uniforme. La lyse est ainsi plus uniforme dans l'ensemble de l'échantillon, ce qui se traduit par une plus grande efficacité de la désintégration des cellules.
  • Réduction du temps de traitement : L'énergie délivrée par l'ultrasonateur à sonde est très concentrée et localisée, ce qui permet une lyse cellulaire rapide et efficace. Comparée à d'autres méthodes telles que le battage de billes ou la lyse enzymatique, la sonication permet d'obtenir la lyse d'E. coli en quelques minutes, voire en quelques secondes. Alors que de nombreuses techniques alternatives telles que la congélation-décongélation nécessitent plusieurs cycles de traitement, la lyse ultrasonique ouvre les cellules en une seule étape.
  • Contrôle de la température: Les appareils à ultrasons les plus modernes sont équipés de capteurs de température et d'un logiciel intelligent qui permet de définir une température maximale pour le processus. L'appareil s'arrête automatiquement lorsque la limite de température est atteinte et démarre le processus de sonification lorsqu'un point de température défini est atteint. Le refroidissement des échantillons dans un bain de glace est une méthode simple pour maintenir la température de l'échantillon à un niveau bas et prévenir la dégradation de l'échantillon induite par la chaleur.
  • Évolutivité : Les ultrasons de type sonde sont disponibles en différentes tailles, depuis les appareils portatifs jusqu'aux modèles industriels à grande échelle. Ils conviennent donc au traitement de petits volumes en laboratoire ou à la mise à l'échelle pour des applications de biotraitement plus importantes, par exemple la production de vaccins ou la biosynthèse de molécules.
  • Polyvalence : Les ultrasons peuvent être utilisés pour diverses applications au-delà de la lyse cellulaire, telles que le cisaillement de l'ADN, l'extraction des protéines, l'homogénéisation des tissus, la dispersion des nanoparticules et l'émulsification. Par conséquent, l'investissement dans un appareil à ultrasons de type sonde offre une grande polyvalence dans le domaine de la recherche ou de l'industrie.
  • Les appareils à ultrasons à sonde tels que l'UP200St sont des homogénéisateurs de tissus et des broyeurs de cellules fiables, donc largement utilisés pour la préparation d'échantillons en génétique, par exemple pour la lyse d'E.coli.

    L'extraction de protéines à partir de cellules E.coli est réalisée de manière efficace avec le sonde à ultrasons UP200St

    L'ultrasoniseur à sonde offre de nombreux avantages pour la lyse d'E. coli. Le contrôle fiable et précis des paramètres du processus ultrasonique permet d'optimiser les paramètres de fonctionnement tels que la puissance, la durée et la manipulation de l'échantillon afin d'obtenir les résultats souhaités.
     

    Demande d'information





     

    Ce tutoriel explique quel type de sonicateur est le mieux adapté à vos tâches de préparation d'échantillons telles que la lyse, la désintégration cellulaire, l'isolement des protéines, la fragmentation de l'ADN et de l'ARN dans les laboratoires, l'analyse et la recherche. Choisissez le type de sonicateur idéal pour votre application, votre volume d'échantillon, votre nombre d'échantillons et votre débit. Hielscher Ultrasonics a l'homogénéisateur à ultrasons idéal pour vous !

    Comment trouver le sonicateur parfait pour la désintégration des cellules et l'extraction des protéines en science et analyse

    Vignette vidéo

    La fragmentation ultrasonique de l'ADN est fréquemment utilisée comme étape de préparation des échantillons dans le séquençage de nouvelle génération (NGS).

    Analyses électrophorétiques de l'ADN génomique de E. coli EDL933 soumis à une ultrasonication de 0 à 15 minutes. L indique l'échelle d'ADN.
    (étude et image : ©Basselet et al. 2008)

    Perturbation des cellules par cavitation ultrasonique

    Les homogénéisateurs à sonde ultrasonique fonctionnent à environ 20 000 cycles par seconde (à 20 kHz) et provoquent une cavitation dans les liquides ou les suspensions. La cavitation acoustique crée des zones microscopiques de pression sous vide et des températures élevées qui déchirent les cellules. Bien que les températures puissent atteindre plusieurs milliers de degrés Celsius, les volumes de cavitation sont si petits qu'ils ne réchauffent pas le processus de manière significative. La cavitation acoustique et les forces de cisaillement générées par les ultrasons perforent ou brisent la membrane cellulaire des cellules bactériennes telles que E.coli. Les appareils à ultrasons Hielscher permettent un contrôle précis des paramètres du processus tels que l'intensité des ultrasons, l'amplitude, l'apport d'énergie et la température. Ainsi, le processus de lyse ultrasonique peut être ajusté de manière optimale au type de cellule, à la culture cellulaire et à l'objectif du processus.
     

    Avantages de ultrasons Lyse

    • un contrôle précis de la lyse (intensité, l'amplitude, la température)
    • des résultats fiables et reproductibles
    • adaptation optimale à des échantillons spécifiques
    • contrôle de la température
    • pour les très petits à très grands échantillons (uL de litres)
    • Traitement purement mécanique
    • utilisation conviviale et sûre
    • linéaire mise à l'échelle du laboratoire à la production
    Le dispositif à ultrasons VialTweeter permet la préparation d'échantillons simultanément jusqu'à 10 flacons dans les mêmes conditions de traitement. (Cliquez pour agrandir!)

    VialTweeter pour la lyse par ultrasons

    Demande d'information





    Homogénéisateur ultrasonique et autres techniques de lyse

    Si la lyse chimique et enzymatique peut être problématique – car la lyse chimique peut modifier les structures de protéines et d'introduire des problèmes de purification et la lyse enzymatique nécessite des temps d'incubation longue et n'est pas reproductible – rupture par ultrasons est une méthode de rupture des cellules sophistiqué, rapide.
    La lyse ultrasonique est basée sur des forces mécaniques uniquement. Aucun produit chimique n'est ajouté, la sonication brise la paroi cellulaire par des forces de cisaillement. La lyse chimique peut altérer la structure des protéines et poser des problèmes de purification. La désintégration enzymatique nécessite de longs temps d'incubation et n'est pas reproductible. La désintégration cellulaire par ultrasons des cellules de la bactérie E.coli est rapide, simple, fiable et reproductible. C'est pourquoi les ultrasons Hielscher sont utilisés dans les laboratoires biologiques et biochimiques du monde entier pour la préparation des échantillons, la pré-analyse, le diagnostic in-vitro et de nombreux essais.

    Recommandations générales pour la lyse ultrasonique

    Sonication est la technique la plus populaire pour lyser très petites quantités, moyennes et grandes de suspensions cellulaires – de pico-litres jusqu'à 100 litres / h (en utilisant une cellule d'écoulement à ultrasons). Les cellules sont lysées par cisaillement de liquide et la cavitation. L'ADN est également cisaillé pendant la sonication, il est donc pas nécessaire d'ajouter DNase à la suspension cellulaire.
     

    Contrôle de la température pendant la lyse ultrasonique de E.coli
    Perturbateur cellulaire à ultrasons UP100H (100W) pour la désintégration des cellules et l'extraction des composés végétaux.En pré-refroidissement de l'échantillon et de maintien de l'échantillon au cours de la sonication sur de la glace, Exemple dégradation thermique de l'échantillon peut être facilement évité.
    Idéalement, les échantillons doivent être conservés dans la glace pendant la lyse, mais pour la plupart des échantillons, il suffit que la température ne dépasse pas celle de la culture ou de la source de tissu. Il est donc recommandé de conserver la suspension sur de la glace et de la soniquer avec plusieurs impulsions ultrasoniques courtes de 5 à 10 secondes et des pauses de 10 à 30 secondes. Pendant les pauses, la chaleur peut se dissiper afin de rétablir une température basse. Pour les échantillons cellulaires plus importants, divers réacteurs à cellules en flux avec chemises de refroidissement sont disponibles.
    Lisez ici les conseils détaillés et les recommandations pour une lyse ultrasonique réussie !

    Protocoles pour la préparation ultrasonique de lysats d'E. Coli

    Les chercheurs utilisent les homogénéisateurs ultrasoniques Hielscher pour la désintégration des cellules E.coli. Vous trouverez ci-dessous divers protocoles testés et éprouvés pour la lyse d'E.coli à l'aide d'homogénéisateurs ultrasoniques Hielscher pour diverses applications liées à E.coli.
     

    Ce clip vidéo montre l'homogénéisateur à ultrasons UP100H de Hielscher, un ultrasoniseur largement utilisé pour la préparation des échantillons dans les laboratoires.

    Homogénéisateur à ultrasons UP100H

    Vignette vidéo

    Croissance cellulaire, réticulation et préparation d'extraits cellulaires d'E. coli par ultrasons

    Pour SEQA et l'ARN polymérase ChIP-Chip E. coli MG1655 ou MG1655 ΔseqA a été cultivé à 37 ° C jusqu'à une DO600 d'environ 0,15 dans 50 ml de LB (+ 0,2% de glucose) avant d'ajouter 27 ul de formaldéhyde (37%) par ml de milieu (concentration finale 1%). La reticulation a été effectuée sous agitation lente (100 tr / min) à température ambiante pendant 20 minutes, suivie d'une trempe avec 10 ml de glycine 2,5 M (concentration finale 0,5 M). Pour les expériences de choc thermique, E. coli MG1655 a été cultivé dans 65 ml de milieu LB à 30 ° C jusqu'à une DO600 d'environ 0,3. Ensuite, 30 ml de culture ont été transférés dans un ballon préchauffé à 43°C et le reste a été conservé à 30°C. La réticulation et l'extinction ont été effectuées comme décrit ci-dessus, sauf que les cellules ont été maintenues à 30 ou 43°C pendant 5 minutes avant d'être agitées lentement à température ambiante. Les cellules ont été collectées par centrifugation et lavées deux fois avec du TBS froid (pH7,5). Après remise en suspension dans 1 ml de tampon de lyse (10 mM Tris (pH 8.0), 20% de saccharose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml de lysozyme) et incubation à 37°C pendant 30 min suivie de l'ajout de 4 ml de tampon IP, les cellules ont été soniquées sur de la glace avec 12 fois 30 sec et 30 sec de pause en utilisant le processeur ultrasonique Hielscher UP400St à 100% de puissance. Après centrifugation pendant 10 min à 9000 g, des aliquotes de 800 μl du surnageant ont été conservées à -20°C. (Waldminghaus 2010)
     

    Surproduction et purification d'enzymes à l'aide d'une sonde ultrasonique

    L'Ultrasonicator UP100H est un homogénéisateur de laboratoire souvent utilisé pour la préparation des échantillons des plaques de culture cellulaire.Pour la surproduction de protéines marquées à la décahistidine (His10), E. coli BL21(DE3) a été transformé avec des constructions pET19b. Une préculture d'une nuit a été récoltée par centrifugation et 1% a été utilisé pour inoculer une culture d'expression. Les cellules portant pET19mgtB ont été cultivées à 22°C jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm (OD600) soit de 0,7. La culture a été transférée à 17°C et induite par 100 μM IPTG. Après 16 h, la culture a été récoltée par centrifugation à 7 500 × g à 4°C. Les cellules ont été remises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 50 mM avec 0,3 M NaCl à pH 7,4 et désagrégées par ultrasons à l'aide d'une sonotrode S2 à micropointe sur l'ultrasonateur Hielscher UP200St à un cycle de 0,5 et une amplitude de 75 %.
    La surproduction de GTFC étiqueté decahistidine-a été induite à 37 ° C, à une DO600 de 0,6 à 100 uM d'IPTG. Les cellules ont été ensuite mises en incubation pendant 4 heures, récoltées, lysées et comme indiqué ci-dessus pour MgtB.
    Les extraits cellulaires bruts ont été centrifugés à 15 000 × g et à 4°C pour sédimenter les débris cellulaires. Les extraits clarifiés ont été chargés sur des colonnes HisTrap FF Crude de 1 ml à l'aide d'un système ÄKTAprime Plus. Les enzymes ont été purifiées selon le protocole du fabricant pour l'élution en gradient des protéines marquées par His. Les solutions de protéines éluées ont été dialysées deux fois dans 1 000 volumes de PBS 50 mM, pH 7,4, avec 0,3 M NaCl à 4°C. La purification a été analysée par SDS-PAGE à 12%. La concentration en protéines a été déterminée par la méthode Bradford en utilisant Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
     

    Extraction ultrasonique de protéines à partir de bactéries E. coli
    Une protéine d'appât d'intérêt (dans ce cas, MTV1 d'Arabidopsis thaliana) est fusionnée à un marqueur GST et exprimé dans Escherichia coli BL21 cellules (E. coli).

    1. Prendre un culot de GST-MTV1 et de GST (correspondant à 50 ml de culture bactérienne) et le remettre en suspension dans 2,5 ml de tampon d'extraction glacé.
    2. Utiliser un appareil à ultrasons UP100H (équipé d'une micro-pointe-sonotrode MS3 pour les petits volumes d'environ 2 à 5 ml) pour perturber les cellules bactériennes jusqu'à ce qu'elles soient lysées, ce qui est indiqué par une réduction de l'opacité et une augmentation de la viscosité. Cette opération doit être effectuée sur de la glace et il est recommandé d'effectuer la sonication par intervalles (par exemple, sonication de 10 secondes suivie d'une pause de 10 secondes sur de la glace et ainsi de suite). Il faut veiller à ne pas soniquer avec une intensité trop élevée. Si la formation de mousse ou d'un précipité blanc est détectée, l'intensité doit être réduite.
    3. Transférer la solution de bactéries lysées dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et centrifuger à 4°C, 16 000 x g pendant 20 minutes.

     

    Les sondes ultrasoniques utilisent les forces de cavitation acoustique pour perturber les cellules et extraire les molécules et l'ADN d'E.coli.

    Les ultrasons à sonde tels que l'UP400St utilisent le principe de fonctionnement de la cavitation acoustique pour la lyse efficace d'E.coli.

    Analyse de l'expression et purification de la protéine recombinante par sonication

    Le culot d'E. coli a été sonifié avec l'appareil à ultrasons Hielscher UP100H. À cette fin, le culot cellulaire a été remis en suspension dans un tampon de lyse réfrigéré (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) et refroidi sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, la suspension cellulaire a été soniquée avec 10 courtes rafales de 10 s suivies d'un intervalle de 30 s pour le refroidissement. Enfin, les débris cellulaires ont été éliminés par ultracentrifugation à 4°C pendant 15 minutes à 14000 rpm. Pour confirmer l'expression de la rPR, le surnageant a été passé sur un gel de polyacrylamide à 12% et analysé par SDS-PAGE et Western blotting. La purification de la rPR a été réalisée à l'aide de la résine Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) selon le guide du fabricant. Dans cette étape, la méthode de purification native a été utilisée. La pureté de la protéine purifiée a été évaluée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 12% et coloration au bleu de Coomassie. La concentration en protéines purifiées a été mesurée à l'aide du kit de dosage des protéines Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Cette vidéo montre le cornet à ultrasons de 200 watts pour la dispersion, l'homogénéisation, l'extraction ou le dégazage d'échantillons de laboratoire.

    Cornet à ultrasons (200 Watts)

    Vignette vidéo

    Homogénéisateurs ultrasoniques pour la lyse d'E. coli

    Hielscher Ultrasonics conçoit, fabrique et fournit des homogénéisateurs à ultrasons de haute performance pour la lyse fiable et efficace des bactéries E. coli et d'autres types de cellules, de tissus et de cultures cellulaires.
    La large gamme de sondes ultrasoniques et de systèmes de sonication indirecte nous permet de vous proposer l'homogénéisateur de tissus à ultrasons idéal pour votre application de désintégration et d'extraction cellulaires.

    Conception, fabrication et conseil – Qualité Made in Germany

    Les ultrasons Hielscher peuvent être contrôlés à distance par le biais d'un navigateur. Les paramètres de sonication peuvent être surveillés et ajustés précisément aux exigences du processus.Les appareils à ultrasons Hielscher sont réputés pour leur qualité et leurs normes de conception les plus élevées. Un logiciel intelligent, un menu intuitif, des réglages programmables et un enregistrement automatique des données ne sont que quelques-unes des caractéristiques des ultrasons Hielscher. La robustesse et la facilité d'utilisation permettent une intégration aisée de nos ultrasons dans les installations de recherche et de biotechnologie. Même les conditions difficiles et les environnements exigeants sont facilement gérés par les ultrasons Hielscher.

    Hielscher Ultrasonics est une entreprise certifiée ISO et met l'accent sur les ultrasons de haute performance, dotés d'une technologie de pointe et d'une grande convivialité. Bien entendu, les ultrasons Hielscher sont conformes à la norme CE et répondent aux exigences des normes UL, CSA et RoHs.

    Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicators:

    lot Volume Débit Appareils recommandés
    plaques multi-puits / microtitres n / a. UIP400MTP
    CupHorn pour flacons ou béchers n / a. cuphorn à ultrasons
    réacteur ultrasonique à micro-flux n / a. GDmini2
    jusqu'à 10 flacons de 0,5 à 1,5 ml n / a. VialTweeter
    00,5 à 1,5 ml n / a. VialTweeter
    1 à 500 ml 10 à 200 ml / min UP100H
    10 à 2000mL 20 à 400 ml / min UP200Ht, UP400St
    0.1 20L 00,2 à 4L / min UIP2000hdT
    10 à 100l 2 à 10 L / min UIP4000
    n / a. 10 à 100 litres / min UIP16000
    n / a. plus grand groupe de UIP16000

    Contactez nous! / Demandez nous!

    Demander plus d'informations

    Veuillez utiliser le formulaire ci-dessous pour demander des informations supplémentaires sur les homogénéisateurs de tissus et les broyeurs de cellules à ultrasons, les applications de lyse et les prix. Nous nous ferons un plaisir de discuter avec vous de votre processus et de vous proposer un homogénéisateur ultrasonique répondant à vos exigences !









    Veuillez prendre note de notre Politique de confidentialité.


    La vidéo montre le système de préparation d'échantillons par ultrasons UIP400MTP, qui permet la préparation fiable d'échantillons sur n'importe quelle plaque multi-puits standard en utilisant des ultrasons de haute intensité. Les applications typiques de l'UIP400MTP comprennent la lyse cellulaire, le cisaillement de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine ainsi que l'extraction de protéines.

    Ultrasonateur UIP400MTP pour la sonication de plaques multi-puits

    Vignette vidéo

    Protocoles supplémentaires pour la lyse ultrasonique d'E. coli

    Protéines modifiées par l'allicine dans E. coli à l'aide d'un flacon ultrasoniqueTweeter

    VialTweeter au processeur ultrasonique UP200STDétermination des matières sulfhydryle par le 5,5'-dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB) Dosage
    Une culture d'une nuit d'E. coli MG1655 a été utilisée pour inoculer le milieu minimal MOPS (1:100). La culture a été cultivée en aérobiose jusqu'à ce qu'un A600 de 0,4 soit atteint. La culture a été divisée en trois cultures de 15 ml pour le traitement du stress. Une culture non traitée a servi de contrôle négatif. 0,79 mM d'allicine (128 μg ml-1) ou 1 mM de diamide ont été ajoutés à l'une des deux cultures restantes. Les cultures ont été incubées pendant 15 minutes. 5 ml de chaque culture ont été récoltés par centrifugation (8 525 × g, 4°C, 10 min). Les cellules ont été lavées deux fois avec 1 ml de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, stocké en anaérobiose avant utilisation) et centrifugées (13 000 × g, 4°C, 10 min). Les cellules ont été remises en suspension dans un tampon de lyse (PBS avec 6 mM de chlorhydrate de guanidinium, pH 7,4) avant d'être désintégrées à 4 °C par ultrasons (VialTweeter ultrasons, Hielscher GmbH, Allemagne) (3 × 1 min). Les débris cellulaires ont été regroupés par centrifugation (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Le surnageant a été transféré dans une cuvette QS-macro de 3,5 ml (10 mm) avec une barre d'agitation magnétique et mélangé avec 1 ml de tampon de lyse. L'extinction des échantillons a été contrôlée à 412 nm avec un spectrophotomètre Jasco V-650 équipé du porte-cuvette à température contrôlée PSC-718 à température ambiante. 100μl d'une solution de 3 mM d'acide dithiobis(2-nitrobenzoïque) ont été ajoutés. L'extinction a été surveillée jusqu'à ce qu'elle atteigne la saturation. Le calcul de la concentration en thiols a été effectué en utilisant le coefficient d'extinction ϵ412 = 13700 M-1 centimètres-1 pour thio-2-nitrobenzoïque (TNB). thiol concentrations cellulaires ont été calculées sur la base d'un volume de cellules de E. coli de 6,7 × 10-15 litre et une densité cellulaire de A600 = 0,5 (équivalente à 1 × 108 cellules ml-1 Culture). (Müller et al., 2016)
     

    Détermination du glutathion in vivo à l'aide d'un broyeur cellulaire à ultrasons

    E.coli MG1655 a été cultivé dans un milieu minimal MOPS dans un volume total de 200 ml jusqu'à ce qu'un A600 de 0,5 soit atteint. La culture a été divisée en cultures de 50 ml pour le traitement de stress. Après 15 minutes d'incubation avec 0,79 mM d'allicine, 1 mM de diamide ou du sulfoxyde de diméthyle (contrôle), les cellules ont été récoltées à 4000g à 4°C pendant 10 minutes. Les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon KPE avant la remise en suspension des culots dans 700µl de tampon KPE. Pour la déprotéination, 300l d'acide sulfosalicylique à 10% (w/v) ont été ajoutés avant la dislocation des cellules par ultrasons (3 x 1 min ; VialTweeter appareil à ultrasons). Les surnageants ont été recueillis après centrifugation (30 min, 13,000g, 4 ° C). les concentrations d'acide sulfosalicylique ont été réduites à 1% par addition de 3 volumes de tampon KPE. Les mesures de glutathion totale et GSSG ont été réalisées comme décrit ci-dessus. Les concentrations de glutathion cellulaire ont été calculées sur la base d'un volume de cellules de E. coli de 6,7×dix-15 litre et une densité cellulaire de A600 0,5 (équivalant à 1×dix8 cellules ml-1 Culture). Les concentrations de GSH ont été calculées par soustraction de 2 [GSSG] de glutathion totale. (Müller et al. 2016)

    Expression du mAspAT humain dans E. coli à l'aide d'un homogénéisateur ultrasonique

    Ultrasons cellule disrupteur UP400St (400W) pour l'extraction de la matière intracellulaire (par exemple des protéines, des organelles, l'ADN, l'ARN, etc.)La colonie unique de E. coli BL21 (DE3) hébergeant le vecteur d'expression dans 30 ml de Luria-Bertani (LB) contenant 100 ug moyen / ml d'ampicilline, puis cultivé à 37 ° C jusqu'à ce que la densité optique (DO600) Atteint 0,6. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 4000 x g pendant 10 min et remises en suspension dans du milieu LB frais contenant 100 ug 3L / mL d'ampicilline.
    Ensuite, l'expression des protéines a été induite avec 1 mM d'isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pendant 20 h à 16 °C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 8 000 × g pendant 15 min. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 8 000 × g pendant 15 minutes et lavées avec le tampon A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Environ 45 g (poids humide) de cellules ont été obtenus à partir de 3 L de culture. Après centrifugation, les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 40 mL (pour 1 L de culture) de tampon d'extraction A glacé, et lysés par ultrasons à température glacée à l'aide du broyeur cellulaire ultrasonique Hielscher UP400St. La lyse cellulaire a été centrifugée à 12 000 rpm pendant 15 min pour séparer les fractions solubles (surnageant) et les fractions précipitées (culot). (Jiang et al. 2015)
     



    Qu'il faut savoir

    E. coli

    Escherichia coli (E. coli) est une bactérie coliforme gram-négative, facultativement anaérobie, en forme de bâtonnet, du genre Escherichia, que l'on trouve couramment dans l'intestin inférieur des organismes à sang chaud (endothermes). Il existe un grand nombre de souches (ou sous-types) de E. coli présentant des caractéristiques diverses. La plupart des souches d'E. Coli sont inoffensives pour l'homme, par exemple les souches B et K-12 qui sont couramment utilisées pour des applications de recherche en laboratoire. Cependant, certaines souches sont nocives et peuvent causer des maladies graves.
    E. coli joue un rôle important dans l'ingénierie biologique moderne et la microbiologie industrielle car la bactérie est facile à manipuler. applications de laboratoire courantes qui impliquent souvent l'utilisation de E. coli, par exemple pour créer l'acide recombinant désoxyribonucléique (ADN) ou d'agir comme un organisme modèle.
    E. coli est un hôte très polyvalent pour la production de protéines hétérologues, et des systèmes d'expression de protéines multiples sont disponibles pour produire des protéines recombinantes dans E. coli. En utilisant des plasmides qui permettent une expression élevée du niveau de la protéine, les gènes peuvent être introduits dans les bactéries, ce qui permet de produire de telles protéines en quantités élevées dans les procédés de fermentation industriels.
    Les E.coli sont utilisés comme usines cellulaires pour produire de l'insuline. D'autres applications comprennent l'utilisation de cellules E. coli modifiées pour développer et produire des vaccins et des enzymes immobilisées, pour produire des biocarburants, ainsi que pour la biorestauration.
    La souche K-12 est une forme mutante de E. coli qui surexprime l'enzyme phosphatase alcaline (ALP). Cette mutation se produit en raison d'un défaut dans le gène qui ne cessent de code pour l'enzyme. Si un gène produit un produit sans inhibition ceci est connu comme l'activité constitutive. Cette forme mutante spécifique est utilisé pour isoler et purifier l'enzyme ALP.
    Les bactéries E. coli sont également largement utilisées comme usines cellulaires. Les microbes (par exemple, les bactéries) et les cellules végétales modifiés peuvent être utilisés comme usines cellulaires. Ces cellules génétiquement modifiées produisent des molécules, des produits chimiques, des polymères, des protéines et d'autres substances, qui sont utilisés par exemple dans l'industrie pharmaceutique, alimentaire et chimique. Afin de libérer les molécules produites à l'intérieur de ces cellules issues du génie biologique, la lyse par ultrasons est une méthode courante pour perturber les parois cellulaires et transférer les substances cibles dans le liquide environnant. En savoir plus sur la lyse des cellules issues de la bio-ingénierie !

    ADN par ultrasons Shearing

    Les forces de cisaillement ultrasoniques sont une méthode couramment utilisée pour libérer des molécules, des organites et des protéines de l'intérieur des cellules, ainsi que pour briser des brins d'ADN en morceaux. La cavitation acoustique brise les parois et les membranes cellulaires pour extraire l'ADN des cellules et générer des fragments d'environ 600 – 800 pb de longueur, ce qui est idéal pour l'analyse.
    Cliquez ici pour en savoir plus sur homogénéisateurs à ultrasons pour la fragmentation de l'ADN!

    Littérature / Références


    Des ultrasons de haute performance ! La gamme de produits Hielscher couvre l'ensemble du spectre, depuis les ultrasons compacts de laboratoire jusqu'aux systèmes ultrasoniques industriels complets, en passant par les unités de paillasse.

    Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons de haute performance à partir d'une technologie de pointe. laboratoires à taille industrielle.


    Nous serons heureux de discuter de votre processus.

    Prenons contact.